TW202409268A - 新穎乳酸菌以及含有乳酸菌之組成物、飲食品及醫藥品 - Google Patents

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Abstract

提供可藉由增強IL-12p70以及IFN-λ產生，提高對感染性微生物或病毒所致感染之抵抗力，緩和壓力，抑制作為症狀惡化之原因的過度炎症反應之乳酸菌、含有該乳酸菌之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，以及含有此等之飲食品及醫藥品。 清酒乳酸桿菌(Lactobacillus sakei)MG-LAB279株(寄存編號：NITE BP-03645)、含有該株或其菌體成分作為有效成分的免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，以及含有此等之飲食品及醫藥品。

Description

新穎乳酸菌以及含有乳酸菌之組成物、飲食品及醫藥品
本發明係關於新穎乳酸菌之清酒乳酸桿菌MG-LAB279株(寄存編號：NITE BP-03645)以及含有該乳酸菌之組成物、飲食品及醫藥品。
干擾素為細胞激素家族之一種，被鑑定為抑制病毒感染的因子。目前已知除了包含抗病毒之免疫調節作用以外，也顯示抗腫瘤或抗癌、細胞增殖抑制等之各種活性。於人類係分類為I型干擾素、II型干擾素及III型干擾素。IFN-λ為在2003年被發現的細胞激素，被分類為III型干擾素。作為同功型(isoform)，已知有IFN-λ1(別名IL-29)、IFN-λ2(別名IL-28A)、IFN-λ3(別名IL-28B)。IFN-λ已確認會由樹狀細胞、肝細胞、腸道上皮細胞、肺上皮細胞等產生，與I型干擾素同樣地係有活化用以守護生物體免受細菌或病毒等威脅的系統即自然免疫之作用。
IFN-λ與I型干擾素同樣地會誘導IFN誘導基因群(ISG)之表現而抑制病毒感染。進一步地，已知IFN-λ會與I型干擾素協調而作用，藉以增強抗病毒效果。以往，認為IFN-λ具有與I型干擾素重複的功能。近年來得知此等係藉由獨立作用來顯示抗病毒活性，而受到注目。I型干擾素之受體係於所有的細胞表現，因此伴隨免疫反應而於全身誘發炎症，故有時產生過度的炎症反應。伴隨病毒感染之過度的炎症反應，會成為引起多重器官衰竭等嚴重症狀的原因，故抑制全身之過度炎症反應是重要的。另一方面，IFN-λ之受體僅限存在於上述肝細胞、腸道上皮細胞、肺上皮細胞等，故亦可期待對攝取者賦予抑制了副作用之選擇性的生理活性作用。
於生物體內之免疫反應，被炎症性及抗炎症性物質之平衡所大幅影響。例如，炎症性細胞激素之介白素-6(IL-6)或腫瘤壞死因子(TNFα)係與對感染性微生物之初期反應相關，使炎症反應放大。另一方面，IL-10等之抗炎症性細胞激素係有抑制炎症反應的作用。通常，於感染解除時等，免疫反應會停止，但若調節功能喪失，則引起免疫性細胞激素的過度產生，有時對於宿主細胞會引起系統性的傷害(免疫風暴)。作為免疫風暴產生的要因而被確定者當中，已知有IL-6、TNFα、干擾素等。為了維持免疫反應之恆定性，必需調節炎症性細胞激素以及抗炎症性細胞激素的產生。
介白素-12p70(IL-12p70)，具有由輔助T前驅細胞(Th0)分化誘導為輔助T細胞類型1(Th1)，或自然殺手細胞(NK細胞)之活性化等的作用。Th1細胞係藉由產生介白素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)等，提高T細胞或單核球等之巨噬細胞的活性，以提高對病毒或細菌等之感染的抵抗。又，NK細胞具有特異性殺死癌細胞或病毒感染細胞等之能力。因此，藉由增強IL-12p70之產生，提高對病毒感染之抵抗力，可期待癌的預防等。提高對病毒感染之抵抗力，係指改善、緩和或治療將來的病毒性疾病之症狀，或預防、抑制，或延遲成為罹患病毒性疾病之狀態。
壓力狀態亦會影響對病毒感染之抵抗力。壓力係藉由對各種對生物體有害之刺激(壓力源)反應而產生，現代人係暴露於生活環境或勞動環境之變化、複雜的人際關係、身體/精神性疲勞等之各種壓力下。已知生物體對壓力反應時，交感神經-副腎髓質系或視丘下部-腦下垂體-副腎皮質系之活動會提高。藉由交感神經-副腎髓質系的提高，會產生血壓上昇、發汗、唾液分泌、覺醒等症狀。已知藉由視丘下部-腦下垂體-副腎皮質系的提高，例如會促進從腦下垂體前葉分泌副腎皮質刺激激素(ACTH)，血中的糖皮質素例如皮質醇、皮質固酮，及皮質酮濃度會上昇。此等之糖皮質素，一般稱為壓力激素。糖皮質素之作用，多與對壓力之身體反應(能量代謝之活性化、心臓功能之促進)相關，於維持恆定性扮演重要角色。但是另一方面，已知糖皮質素會使免疫細胞之增殖能力或功能降低等，對生物體造成不良影響。因此，可認為為了維持免疫功能，緩和壓力係重要的。
欲為了預防病毒感染而提高免疫功能，係使用具有免疫活化作用之免疫活化用組成物。作為免疫活化用組成物，期望是天然來源者。特別是就能夠日常攝取，且副作用之顧慮少之觀點，期望為食品。作為具有免疫活化作用之食品，已知有以香菇或巴西蘑菇為代表的擔子菌類之多糖類等或乳酸菌、麴黴菌或酵母等之食用微生物或該等之細胞壁成分等。
專利文獻1中記載乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis subspecies lactis)JCM5805株會促進樹狀細胞pDC之IFN-λ產生。又，專利文獻2中，記載嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcus halophilus)KK221株會促進樹狀細胞BDCA3DC之IFN-λ產生。專利文獻3中，記載以雙岐桿菌屬細菌為有效成分之IFN-λ產生促進作用。專利文獻4中，記載副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)MCC1375株會促進IL-12產生，活性化NK細胞，藉以具有流感病毒之感染預防效果。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 日本特開2017-201984號公報 [專利文獻2] 國際公開第2017/175774號 [專利文獻3] 日本特開2019-167327號公報 [專利文獻4] 國際公開第2012/133827號
[發明所欲解決之課題]
但是，雖有揭示以包含乳酸桿菌屬(Lactobacillus)或乳球菌屬(Lactococcus)等的乳酸菌為有效成分之調節免疫功能的藥劑或醫藥品等，另一方面並未揭示以乳酸菌或源自乳酸菌之組成物為主成分，而具有增強IL-12p70以及IFN-λ產生並充分提高對病毒感染之抵抗力的作用之株，尚未達到病毒感染預防效果較高的飲食品之開發。
本發明之課題為提供藉由增強IL-12p70以及IFN-λ產生，使自然免疫活性化，而有效於改善、緩和或治療病毒性疾病之症狀，或預防、抑制，或延遲成為罹患病毒性疾病之狀態的免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等。 [用以解決課題之手段]
本發明者等人為了解決上述課題，而重複深入研究的結果，發現清酒乳酸桿菌MG-LAB279株會增強IL-12p70以及IFN-λ產生，具有優良的病毒感染預防效果等，而完成本發明。
本發明為了達成上述目的，而提供下述之乳酸菌以及含有該乳酸菌之組成物、飲食品及醫藥品。
[1] 一種清酒乳酸桿菌(Lactobacillus sakei)MG-LAB279株(寄存編號：NITE BP-03645)。 [2] 一種組成物，其含有如前述[1]之菌株及/或其菌體成分。 [3] 一種免疫活化用組成物，其含有如前述[1]之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。 [4] 如前述[3]之免疫活化用組成物，其不誘發炎症。 [5] 一種病毒感染預防用或治療用組成物，其含有如前述[1]之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。 [6] 一種NK細胞活性化用組成物，其含有如前述[1]之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。 [7] 一種干擾素λ產生促進用組成物，其含有如前述[1]之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。 [8] 一種介白素-12p70產生促進用組成物，其含有如前述[1]之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。 [9] 一種壓力緩和用組成物，其含有如前述[1]之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。 [10] 一種炎症抑制用組成物，其含有如前述[1]之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。 [11] 一種皮膚改善用組成物，其含有如前述[1]之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。 [12] 一種飲食品，其含有如前述[1]之MG-LAB279株或如前述[2]~[11]中任一項之組成物。 [13] 一種醫藥品，其含有如前述[1]之MG-LAB279株或如前述[2]~[11]中任一項之組成物。 [發明之效果]
依照本發明，可提供可藉由增強IL-12p70以及IFN-λ產生，而提高對感染性微生物或病毒之感染的抵抗力，緩和壓力，抑制成為症狀惡化之原因之過度的炎症反應之乳酸菌、含有該乳酸菌之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，以及含有此等之飲食品及醫藥品。
以下詳細說明本發明之實施形態(以下稱「本實施形態」)，但本發明不限定於此，於不脫離其要旨的範圍內可進行各種變化。
屬本實施形態之清酒乳酸桿菌(Lactobacillus sakei)之MG-LAB279株(以下亦僅稱「菌體」)，為於獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心2022年5月2日所寄存的寄存編號：NITE BP-03645之乳酸菌。
MG-LAB279株其特徵為促進干擾素λ(IFN-λ)產生以及介白素-12p70(IL-12p70)產生。 MG-LAB279株可作為含有其之組成物而提供。組成物可列舉免疫活化用組成物(例如病毒感染預防用或治療用組成物、NK細胞活性化用組成物、干擾素λ產生促進用組成物、介白素-12p70產生促進用組成物)、壓力緩和用組成物、炎症抑制用組成物、皮膚改善用組成物，但不限定於此等。此等可作為飲食品、醫藥品、飼料等使用。以下予以詳述。
本實施形態之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，含有清酒乳酸桿菌(Lactobacillus sakei)MG-LAB279株作為有效成分。本實施形態之組成物中使用的清酒乳酸桿菌MG-LAB279株，可為活菌體亦可為死菌體，亦可合併使用，較佳為死菌體。
本發明者等人，於植物或發酵食品、人類來源的之多數乳酸菌中，進行應用於食品時香味或物性亦優良的菌株之選定，而達成選擇清酒乳酸桿菌MG-LAB279株。本發明者等人經探討後，得知藉由攝取清酒乳酸桿菌MG-LAB279株，會提高IL-12p70以及IFN-λ產生。藉此，期待藉由攝取清酒乳酸桿菌MG-LAB279株，自然免疫經活性化，提高對病毒等所致疾病之抵抗。
又，本實施形態之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，為使用存在於自然界且天然來源的乳酸菌之清酒乳酸桿菌MG-LAB279株者，因此具有安全性極高之效果。
培養清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之培養基，可使用乳培養基或含有乳成分之培養基、不含其之半合成培養基等各種培養基。如此之培養基，可例示將脫脂乳還原並經加熱殺菌之還原脫脂乳培養基。
此等清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之培養法，係藉由靜置培養或將pH控制為一定的中和培養來進行，只要是菌良好地生長的條件，則培養法無特別限制。菌體可直接使用遵照乳酸菌培養之常規方法培養，並由所得之培養物藉由離心分離等之集菌手段而經分離者。
又，死菌體通常可藉由將菌體加熱而得到。加熱條件只要是殺死菌體的條件則不特別限定，一般而言以90℃、30分鐘左右的加熱即可得到充分的結果。
本實施形態之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物中含有的清酒乳酸桿菌MG-LAB279株，不限於作為菌體而經純粹分離之菌體，亦可為其培養物或懸浮物、其他之菌體含有物。又，亦可為將菌體使用酵素或物理手段處理而得到的核酸等之細胞質成分或細胞壁區分等之菌體成分。此等可單獨使用亦可合併使用。因而，就清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之死菌體而言，亦可為培養物或其中所含有的菌體本身。此時，含有本實施形態之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物的飲食品或醫藥品等中，可摻合培養物或其中所含有的菌體本身。
又，本實施形態之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物中，亦可將菌體與糊精混合而使容易操作。此時，本實施形態之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，可作為含有清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之死菌體0.1~99質量%，與糊精1~99.9質量%的組成物使用。
清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之活菌體及/或其死菌體，作為免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，不管摻合於何種飲食品均可，亦可於飲食品之製造步驟中添加於原料中。飲食品之例子，可列舉乳飲料、發酵乳、果汁飲料、清涼飲料、果凍、糖果、巧克力、乳製品、美乃滋等之蛋加工品、白脫餅等之甜點/麵包類等。
又，清酒乳酸桿菌MG-LAB279株及/或其死菌體或培養物，作為家畜用飼料中所含有的免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，不管摻合於何種飼料均可，亦可於飼料之製造步驟中添加於原料中。
本實施形態之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，於其製劑化時，於以清酒乳酸桿菌MG-LAB279株(死菌體等)為有效成分以外並不特別限制，可適當混合製劑上許可的賦形劑、安定劑、調味劑等，如既定方法進行製劑化。
又，本實施形態之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，在不妨礙菌體或培養物之作用的範圍內亦可混合賦型劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、調味調臭劑、懸浮劑、塗覆劑、其他之任意藥劑來製劑化。
本實施形態之免疫活化用組成物、壓力緩和用組成物及炎症抑制用組成物等之組成物，可使用於醫藥品、準醫藥品、化粧品、飲食料品等之廣泛用途。作為此等之組成物，可為錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、粉劑、糖漿劑等，較期望將此等經口投予。
為了發揮免疫活化作用、壓力緩和作用、炎症抑制作用等，成人的情況時，只要調整摻合量等，使可攝取清酒乳酸桿菌MG-LAB279株死菌體0.1~10g、較佳為0.5~5g/每1日即可。乳酸菌之含有比例不特別限定，只要配合其用途、製造之容易性或較佳的一日投予量等而適當調節即可。
本實施形態之免疫活化用組成物，於可不誘發炎症地進行免疫活化之觀點，為顛覆在免疫活化時會伴隨誘發炎症的技術常識者，相較於伴隨誘發炎症的以往之免疫活化用組成物，為有用性更高者。再者，本實施形態中之「不誘發炎症」，包含不誘發炎症至於攝取了免疫活化用組成物之人類或動物中見不到炎症所伴隨的副作用之程度的情況。「不誘發炎症」，例如可藉由如後述試驗例8般，於使用了以病理組織學檢査等為代表之炎症參數的試驗中，相較於進行病毒感染處置之對照群(控制群)而言，未見到顯示炎症程度之分數的上昇(無統計上顯著差)來確認。 [實施例]
以下顯示實施例及試驗例，來更詳細說明本發明，但此等僅為例示，並非藉此等對本發明進行任何限定。
[菌株之鑑定] 菌株之鑑定，可遵照「乳酸菌及雙叉乳酸桿菌(bifidus)的科學」日本乳酸菌學會編(京都大學學術出版會)所記載的方法而解析16SrRNA基因來進行(亦可利用委託解析)。 針對MG-LAB279株之16SrRNA基因，藉由公知之上述手法來進行解讀。經解讀之MG-LAB279株之16SrRNA基因，具有與Lactobacillus sakei subsp.sakei DSM20017株99.9%之同源性(homology)，故顯示出本菌株為屬於清酒乳酸桿菌之菌株。
[試驗例1] [小鼠脾細胞之IL-12p70之產生促進試驗] 將由6週齡之BALB/c雄小鼠之脾臓所採取的脾臓細胞以成為5.0×10 4個細胞/孔的方式以含有10%胎牛血清(FBS、BIOWEST)抗生素(盤尼西林/鏈黴素)100單位/mL(GIBCO)、50μM巰基乙醇之RPMI1640(GIBCO)培養基(以下稱RPMI1640培養基)調整，播種於96孔盤(IWAKI)。添加含有清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之非公知的21種各乳酸菌株為20μg/mL，分別進行培養(控制組為未添加乳酸菌株)。培養係於37℃、5%CO 2進行。
(ELISA分析) 將經48小時培養的源自小鼠之脾細胞的上清液100μL由各96孔培養盤中回收，以ELISA法進行分析。ELISA分析中之洗淨係使用含有0.05%Tween20之PBS緩衝液，且使用微孔盤清洗器(BIO-RAD、Immuno Wash 1575)來進行。於96孔免疫培養盤(Thermo)中添加0.8μg/mL之抗小鼠IL-12B單株抗體(SIN Sino Biological)100μL，於4℃靜置一晩予以固相化。洗淨後，添加5%脫脂乳(Wako)350μL，於4℃靜置一晩進行遮蔽(blocking)。洗淨後，添加培養上清液50μl，於37℃反應2小時，洗淨後，添加0.8μg/mL生物素標誌抗小鼠IL-12(p35)單株抗體(MAB MabtechAB) 100μL，於37℃標誌2小時。洗淨後，添加0.8μg/mL之HRP-鏈黴親生物素蛋白複合體(Amersham公司製)100μL，於室溫反應1小時。洗淨後，添加TMB基質(Sera Care) 100μL，進行酵素反應後，添加0.3M硫酸100μL，停止反應。藉由微孔盤讀取儀(Perkin Elmer、ARVO X3)由450nm之吸收來檢測IL-12p70。又，IL-12之產生量，係由使用IL-12p70樣本(Pepro Tech)所製成的檢量線算出。測定結果示於下述表1(僅顯示含有IL-12p70之產生量最多的MG-LAB279株之3種乳酸菌株之結果。亦一併顯示試驗例3之防護(shield)乳酸菌之結果)。再者，表1所示之MG-LAB279株以外的剩餘2種乳酸菌，為於2022年5月2日在獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心中寄存的MG-LAB302株(寄存編號：NITE BP-03646)及MG-LAB533株(寄存編號：NITE BP-03647)。
結果，得知所評價之乳酸菌株21種當中，清酒乳酸桿菌MG-LAB279株係最強力地誘導IL-12p70產生。
[試驗例2] [人類上皮細胞之IFN-λ之產生促進試驗] (乳酸菌核酸萃取檢體之調製) 將經冷凍保存之各乳酸菌株(與試驗例1相同之21種)接種於5mL之MRS培養基(BD Difco)，於30℃分別靜置培養一晚。由此等之乳酸菌培養液中藉由離心分離而集菌之後，添加水予以再懸浮，進行離心分離而得到菌體沈澱物。由此等之菌體沈澱物中使用市售之核酸萃取套組(Takara公司製NucleoBond AXG管柱)進行核酸成分之萃取。具體而言，將上述之菌體沈澱物以緩衝液懸浮，由proteinase K、Lysozyme(和光純藥)、Labiase(大關酒造)中添加至少1種溶菌酵素，於37℃處理一晩。於此等之酵素處理液中添加溶菌緩衝液，於50℃處理30分鐘，然後提供至管柱而得到核酸溶出液。於此等之核酸溶出液中添加等量的異丙醇，並反轉混合，然後進行離心分離。將上清液廢棄，於所得之沈澱物中添加70%乙醇進行離心分離。藉由將去除了上清液之沈澱物以Nuclease Free Water (QIAGEN)溶解，得到各乳酸菌株之核酸萃取檢體。
(IFN-λ產生試驗) 將從ECACC(European Collection of Cell Cultures)接受了分讓的HT-29細胞株，於10cm培養皿中，使用含有10%胎牛血清(FBS、BIOWEST)、盤尼西林-鏈黴素100單位/mL(Gibco)之McCoy 5A(HyClone)培養基(以下稱McCoy培養基)10mL進行培養。培養係於37℃、5%CO 2進行。將培養至70-80%滿盤(confluent)狀態的HT-29細胞於96孔組織培養用平底盤(IWAKI)中，以每孔4.0×10 4個細胞/孔之濃度播種，培養一晩。去除培養液之後，添加McCoy培養基50μL、含1%Lipofectamin 2000(invitrogen)之McCoy培養基50μL、含調整為核酸濃度15μg/mL之前述核酸萃取檢體之McCoy培養基50μL，每1孔共添加150μL，培養20小時。於未添加檢體的樣品中，僅添加含0.33% Lipofectamin 2000之McCoy培養基150μL，以其為控制組。添加含Poly(：IC) (R&D Systems Inc.)0.6μg/mL以取代源自乳酸菌之核酸的McCoy培養基50μL，以其為陽性控制組。試驗係以3重複實施。
(ELISA分析) 由各96孔培養盤中回收經20小時培養之HT-29細胞的上清液100μL，使用ELISA分析套組(DuoSet ELISA Development System Human IL-29/IFN-λ1、R&D Systems Inc.)定量各檢體之產生量。具體而言，遵照添附之實驗指南調製檢體後，於450nm波長測定各檢體之吸光度，使用以分析套組所添附的樣本所製成之檢量線，定量IFN-λ產生量。測定結果示於圖1(僅顯示IFN-λ之產生量多的前3種乳酸菌株之結果。亦一併顯示試驗例3之防護(Shield)乳酸菌的結果)。測定值係以3重複的平均表示，誤差槓以標準誤差表示。
如圖1所示，可知被評價之乳酸菌株21種當中，清酒乳酸桿菌MG-LAB279株最強力地誘導IFN-λ產生。
[病毒感染預防效果之確認] (MX1及OAS1之表現量解析) 試驗係使用由清酒乳酸桿菌MG-LAB279株及Pediococcus pentosaceus MG-LAB533株、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)MG-LAB302株調製的核酸萃取檢體。陽性對照係使用Poly(：IC)(R&D Systems Inc.)。以與IFN-λ產生試驗相同之方法進行培養，去除上清液後，將經CellAmp Direct RNA Prep Kit for RT-PCR (TAKARA)調製的total RNA檢體使用解析。以定量PCR所進行的表現量解析係使用One Step PrimeScript TMRT-PCR Kit(TAKARA)與定量PCR裝置(TAKARA、TP-600)。MX1之測定係使用表2之序列1及2、OAS1之測定係使用序列3及4、GAPDH之測定係使用序列5及6之引子。以表現量所進行的評價，係測定MX1及OAS1、參考基因之GAPDH的基因表現量，藉由將上述基因表現量除以參考基因表現量而得之相對值來進行。測定結果示於圖2A及圖2B。測定值係以4重複的平均表示，誤差槓以標準誤差表示。
如圖2A及圖2B所示，可知清酒乳酸桿菌MG-LAB279株會強力地促進MX1及OAS1之表現。已知MX1及OAS1為具有干擾素誘導性之蛋白質，具備源自病毒之RNA的分解或阻礙病毒之RNA複製的作用。由此，可認為清酒乳酸桿菌MG-LAB279株具有病毒感染預防效果。
[試驗例3] [與防護乳酸菌(註冊商標)之比較] 試驗例1及試驗例2中，使用在市場具備大市佔率的防護乳酸菌(註冊商標)於比較例，以相同之方法試驗。測定結果示於表1、表3及圖1。
由表1、表3及圖1可知，乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株會強力誘導IL-12p70及IFN-λ產生，其活性較在市場具備大市佔率的防護乳酸菌(註冊商標) (Lactobacillus paracasei MCC1849株)更高。由此可知，乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株死菌體，可作為細胞性免疫活化劑使用。
[試驗例4] [使用束縛壓力小鼠之腸道膜淋巴節所致之IFN-λ表現量解析] (小鼠之飼養) 試驗係使用預備飼養1週後，8週齡之雌性C57BL/6J小鼠(日本Charles River公司)。於維持在管理溫度：20~26℃、管理濕度：40~70%RH、明暗各12小時(照明：7時~19時)的飼養室中飼養動物。自預備飼養期間中起使用置入有褥墊(Pulsoft、Oriental酵母工業)的經滅菌之聚碳酸酯製平底籠(213mm×324mm×131mm)。又，為了考量飼養環境，褥墊係每週交換2次。
(小鼠之分群) 小鼠係於給予一般食物之群(以下稱「控制群」)、給予一般食物且進行束縛負荷之群(以下稱「壓力群」)，與投予乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株且進行束縛負荷之群(以下稱「279株投予群」)的3群各分群為3隻、5隻、4隻。
(試驗食品與投予方法) 控制群及壓力群之試驗食品為粉末飼料(MF、Oriental酵母工業股份有限公司)。株投予群之試驗食品，為混合有乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之死菌體0.5%的上述粉末飼料。分群後係將粉末飼料(MF)或被試驗物質混合飼料置入給餌器(MF-4S、SHINFACTORY股份有限公司)中使自由攝取。飼料係每週2次進行補充或換新。試驗食品之投予係持續進行至試驗結束時。
(壓力處置之方法) 使各群之8週齡C57BL/6J小鼠自由攝食上述飼料，飼養12日。將壓力群與279株投予群於飼養第13日置入50mL容積錐形管，並使用脫脂綿及矽插塞束縛使其身體無法移動。又，考慮到飼養環境，於用來束縛的錐形管設置有用以不妨礙呼吸的氣孔及用以去除糞尿之排泄口。束縛係進行18小時，其間係以絕水及絕食狀態飼養。控制群除了不進行束縛以外，係與其他群同樣地進行飼養。
(血清中之皮質固酮測定) 束縛結束後，於異氟烷麻醉下進行剖檢，由後大靜脈進行全採血。將所得之血液分注至Capiject II(Terumo)，進行8~10次反轉混合。於室溫靜置30分鐘後，以3000g離心分離10分鐘，採取血清。使用Corticosterone ELISA Kit (Cayman Chemical Company)測定所得血清中之皮質固酮濃度。檢定係藉由在壓力群與279株投予群之間的2群間比較(無對應之t檢定)來進行。顯著水準為風險率5%(圖3中之「*」)。
(使用腸道膜淋巴節之表現量解析) 束縛結束後，於異氟烷麻醉下進行剖檢，採取腸道膜淋巴節。將腸道膜淋巴節置入含1mL之TRIzol TMReagent (Invitrogen)與氧化鋯珠(TOMY)的2mL容積之管中。將其以珠式細胞破碎裝置(TOMY)予以破碎，於所得之細胞液中添加氯仿0.2mL並攪拌。回收水層後，藉由異丙醇沈澱法，得到源自腸道膜淋巴節之RNA。以定量PCR所進行的表現量解析係使用One Step PrimeScript TMRT-PCR Kit (TAKARA)與定量PCR裝置(TAKARA、TP-600)。IFN-λ之測定係使用表4之序列7及8、RPL19之測定係使用序列9及10之引子。表現量之評價係測定IFN-λ及參考基因之RPL19的基因表現量，藉由將前者除以後者而得的相對值來進行。
(血清中之炎症性細胞激素TNFα測定) 束縛結束後，於異氟烷麻醉下進行剖檢，由後大靜脈進行全採血，使用MouseTNFα ELISA Kit(Proteintech)測定所調製之血清中之炎症性細胞激素TNFα。
(結果1：試驗食品對血清皮質固酮濃度之作用) 如圖3所示，控制群中，相較於未處置群而言，藉由束縛壓力處置而血清皮質固酮濃度上昇。另一方面，於279株投予群雖亦觀察到血清皮質固酮濃度之上昇，但相較於控制群係統計上顯著地改善。由此可知乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株係有緩和(減低)由身體或精神的疲勞所產生，成為免疫功能降低之原因的壓力的作用。
(結果2：試驗食品之對腸道膜淋巴節中之IFN-λ表現量的作用) 測定結果示於圖4。279株攝取群中，相較於控制群及壓力群，確認到於腸間膜淋巴節之IFN-λ基因的表現量較高。亦即，顯示即使於因壓力而擔憂免疫功能降低的狀態下，藉由清酒乳酸桿菌MG-LAB279株菌體之經口攝取，亦會使腸道膜淋巴節中之干擾素-λ的表現亢進。
(結果3：試驗食品對血清中TNFα之作用) 血清中之炎症性細胞激素TNFα測定結果示於圖5。 如圖5所示，控制群中，相較於未處置群而言，藉由束縛壓力處置而血清TNFα濃度上昇。另一方面，於279株投予群雖亦觀察到血清皮質固酮濃度之上昇，但相較於控制群其上昇被抑制。由此可知乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株除了具有緩和(減低)成為免疫功能降低之原因的壓力之作用，亦可期待抑制伴隨著壓力之全身的炎症。又，得知由於可緩和壓力及抑制炎症，故可期待起因於壓力或炎症之皮膚的蓬鬆、乾燥、皮膚粗糙等之皮膚問題的改善效果。
[試驗例5] [對流感感染小鼠之狀態分數及存活率之評價(其1)] (小鼠之飼養) 試驗係使用1週之預備飼養後，5週齡之雌性BALB/c系(BALB/c Cr Slc)(日本SLC股份有限公司)。於維持在管理溫度：18~28℃、管理濕度：30~80%RH、明暗各12小時(照明：6時~18時)的飼養室中飼養動物。自預備飼養期間中起使用置入有褥墊之經滅菌之塑膠籠(W：175mm×D：245mm×H：125mm)。又，考慮到飼養環境，故於各籠導入環境豐富化(築巢片、Animec股份有限公司)。
(小鼠之分群) 小鼠係於流感病毒感染未處置群(以下稱「未處置群」)、進行流感病毒感染處置之對照群(以下稱「控制群」)、於流感病毒感染處置前投予乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之群(以下稱「279株投予群」)、於流感病毒感染處置前投予Pediococcus pentosaceus MG-LAB533株之群(以下稱「533株投予群」)、於流感病毒感染處置前投予胚芽乳酸桿菌MG-LAB302株之群(以下稱「302株投予群」)的5群，分群為每群各8隻。
(試驗食品與投予方法) 未處置群及控制群之試驗食品為粉末飼料(MF、Oriental酵母工業股份有限公司)。279株投予群之試驗食品為混合有乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之死菌體0.5%之粉末飼料。533株投予群之試驗食品為混合有乳酸菌Pediococcus pentosaceus MG-LAB533株之死菌體0.5%之粉末飼料。302株投予群之試驗食品為混合有乳酸菌胚芽乳酸桿菌MG-LAB302株之死菌體0.5%之粉末飼料。分群後係將粉末飼料(MF)或被試驗物質混合飼料置入給餌器使其自由攝取。飼料係每週2次換新，吃剩的飼料係廢棄。試驗食品之投予係持續進行至試驗結束時。
(流感病毒之感染方法) 對小鼠之流感病毒之感染處置係使用流感病毒PR8 [A/PR/8/34 (H1N1)]。於使用時，將冷凍保存的接種病毒原液融解，調製為2×10 3PFU/mL，使用其為接種病毒液。於病毒接種日(試驗開始第15日)使用微量吸管將接種病毒液以每一個體0.05mL(1×10 2PFU/mouse)對鼻腔滴下。再者，接種病毒液係每次接種時攪拌來使用。
(體重之測定) 自試驗食品之攝食開始日起，至病毒接種前一日(試驗開始第14日)為止係1週1次，病毒接種日(試驗開始第15日)以後係每日以電子天秤測定體重。以病毒接種日之測定體重為基準，當觀察到20%以上之體重減少時，係於異氟烷麻醉下由腹部大動脈放血使其安樂死。經安樂死之動物係由測定對象除外。
(一般狀態分數之測定) 一般狀態之觀察係於病毒攝取日以後1日實施1次。一般狀態分數，係使用表5之一般狀態分數表，作為各表現部位之合計分數而算出。於一般狀態分數中觀察到2個以上的分數3的表現部位時，即在異氟烷麻醉下由腹部大動脈放血使其安樂死。經安樂死之動物係由測定對象除外。圖6為以流感病毒之感染處置日為0日，經時性表示至感染後7日為止之一般狀態分數者。再者，值係以平均±標準誤差表示，於與控制群之比較中，使用Wilcoxon之等級和檢定時之P值未達0.05時判定為有統計上顯著差而給予「*」、P值未達0.01時給予「**」。
(存活率之測定) 觀察到20%以上之體重減少或於一般狀態分數中觀察到2個以上的分數3之表現部位時，就人道的觀點係於異氟烷麻醉下由腹部大動脈放血使其安樂死。經安樂死之動物，於算出存活率時視為該日之死亡例。圖7為以流感病毒之感染處置日為0日，經時性表示至感染後7日為止之存活率者。再者，值係以平均±標準誤差表示，於與控制群之比較中使用對數秩檢定時之P值未達0.05時判定為有統計上顯著差而給予「*」、P值未達0.01時給予「**」。
(結果1：試驗食品之對一般狀態分數的作用) 如圖6所示，控制群中，自流感病毒感染後第3日起一般狀態分數上昇。另一方面，279株投予群亦觀察到流感病毒感染所致之一般狀態分數的上昇，但較控制群改善。又，302株投予群、533株投予群中亦較控制群改善，但未見如279株投予群程度的改善。
(結果2：試驗食品之對存活率的作用) 如圖7所示，控制群中，自流感病毒感染後第6日起可見死亡的個體，感染後第8日全部的個體死亡。另一方面，279株投予群中未見到死亡的個體。又，533株投予群、302株投予群中相對於控制群觀察到存活率的上昇，但未見如279株投予群程度的改善。
[試驗例6] [對流感感染小鼠之肺中病毒數及NK活性之評價(其1)] 與試驗例5同樣地進行小鼠之飼養及試驗食品、試驗食品之投予方法、流感病毒之感染方法。小鼠之分群，除了使用每群各5隻之小鼠以外係與試驗例5同樣地進行。自病毒接種日(試驗開始第15日)起5日後(試驗開始第20日)，係於異氟烷麻醉下由腹部大動脈放血使其安樂死，進行肺中病毒數之測定及NK活性之評價。
(肺中之病毒數測定) 將由小鼠所摘出的肺予以碎片化後，以HBSS(Hank’s Balanced Salt Solution、Life Technologies Corporation) 2mL，經攪拌機(PHYSCOTRON(註冊商標)、NS-51、Microtec股份有限公司)均質化。將萃取液以經過滅菌之網目(100μm、細胞過濾器；FALCONTM)過濾，去除細胞塊及雜質，使用離心機(AX-310、TOMY精工股份有限公司)離心分離(190×g、5分鐘)，以上清液為組織液，各約1mL分注於血清管，進行冷凍保存。
將肺組織液解凍，使用MEM(Minimum Essential Medium Eagle、SIGMA)適當製作稀釋液。於播種有MDCK細胞之12孔盤中，於1孔中各添加原液及經稀釋之肺組織液0.1mL，使病毒吸附於細胞1小時。
將病毒原液之濃度測定時所用的培養基A(10×MEM 10 mL、7.5%碳酸氫鈉3mL、200 mmol/L L-麩醯胺2mL、1%DEAE葡聚糖1mL、15%葡萄糖1mL、10%BSA 1mL、2.5%胰蛋白酶40μL、抗菌藥1mL、滅菌蒸餾水31mL)與培養基B(瓊脂糖 0.8g、蒸餾水50mL)予以等量混合，各1.5mL重疊於細胞，瓊脂糖液凝固後以碳酸氣培養裝置培養2日。之後，堆疊上於混合有培養基A與培養基B之培養基中添加有中性紅的培養基，於翌日測量病毒溶菌斑數。採用由可測量溶菌斑數之最大稀釋倍率所算出的溶菌斑數，算出病毒數。全部的樣品為無法測量時則再度調製。
圖8為顯示流感病毒感染處置後第5日(試驗開始第20日)之肺組織中之病毒數(PFU/Lungs)者。再者，值係以平均±標準誤差表示，於與控制群之比較中，使用Wilcoxon之等級和檢定時之P值未達0.01時判定為有統計上顯著差而給予「**」。
(NK活性之評價) 對自小鼠摘出的脾臓添加HBSS並予以細切，於塑膠培養皿中以塑膠注射器內筒的橡膠部分輕輕壓碎，製作2mL之單細胞懸浮液。通過細胞過濾器去除組織殘渣後，將細胞懸浮液置入50mL離心管，進行離心(1000rpm、190×g、5分鐘)。去除上清液後，添加2mL之紅血球溶解液(注射用水：日本藥典、大塚蒸餾水、大塚製藥工廠股份有限公司)充分混合3秒，添加等量的2×PBS。以不要取到沈澱物的方式採取上清液並進行離心(1000rpm、190×g、5分鐘)，將細胞以培養液洗淨後，以添加有10%FBS之RPMI1640再懸浮為1mL，以台盼藍(trypan blue)液計算活細胞，調製為適切的細胞數(效應物細胞(effector cells))。
將YAC-1細胞之細胞懸浮液移至15mL離心管，進行離心(1000rpm、190×g、5分鐘)，去除上清液後，添加1mL之RPMI1640並充分混合，使用血球計算盤調製為適切的細胞數(標靶細胞)。
使用所調製的效應物細胞與標靶細胞，評價藉由LDH Cytotoxicity Detection Kit(Takara Bio股份有限公司)所測定的細胞毒性率作為NK活性。
圖9為顯示流感病毒感染處置後第5日(試驗開始第20日)之小鼠脾臓細胞中之NK活性者。橫軸表示效應物細胞數與標靶細胞數之比。亦即，將小鼠脾臓細胞與YAC-1細胞以10：1、20：1、40：1之比混合，測定細胞傷害率，顯示測定結果作為NK活性。再者，值係以平均±標準誤差表示，於與控制群之比較中，使用Wilcoxon之等級和檢定時的P值未達0.05時判定為有統計上顯著差而給予「*」。
(結果3：試驗食品之對肺中病毒數的作用) 如圖8所示，未處置群中未檢測出病毒，相對於此，控制群中病毒數上昇。另一方面，279株投予群中亦觀察到流感病毒感染所致之肺中病毒數的上昇，但較控制群減少。又，302株投予群、533株投予群中未見到肺中病毒數之減少。由此可知279株具有使體內之病毒數減少的抗病毒作用，藉此提高了存活率。
(結果4：試驗食品之對NK活性的作用) 如圖9所示，相較於控制群，279株投予群中，於脾臓細胞之NK活性上昇。另一方面，533株投予群、302株投予群中，相對於控制群未見到NK活性之上昇。由此可知279株具有使NK細胞活性化之作用。
[試驗例7] [對流感感染小鼠的狀態分數及存活率之評價(其2)] (小鼠之飼養) 以與試驗例5相同之方法進行。
(小鼠之分群) 小鼠係於流感病毒感染未處置群(以下稱「未處置群」)、進行流感病毒感染處置的對照群(以下稱「控制群」)、於流感病毒感染處置前投予乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之群(以下稱「279株投予群」)、於流感病毒感染處置前投予乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis subspecies lactis)JCM5805株之群(以下稱「JCM5805株投予群」)、於流感病毒感染處置前投予防護乳酸菌之群(以下稱「防護乳酸菌投予群」)的5群，分群為每群各8隻。
(試驗食品與投予方法) 未處置群及控制群之試驗食品為粉末飼料(MF、Oriental酵母工業股份有限公司)。279株投予群之試驗食品為混合有乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之死菌體0.5%的粉末飼料。JCM5805株投予群之試驗食品為混合有乳酸菌之乳酸鏈球菌JCM5805株之死菌體0.5%的粉末飼料。防護乳酸菌投予群之試驗食品，為(以乳酸菌死菌體計成為0.5%的方式)混合有防護乳酸菌3.3%的粉末飼料。投予方法係與試驗例5同樣地進行。
(流感病毒之感染方法) 對小鼠的流感病毒之感染處置係與試驗例5同樣地進行。
(體重之測定) 體重之測定係以與試驗例5相同之方法進行。
(一般狀態分數之測定) 一般狀態分數之測定係與試驗例5同樣地進行。一般狀態分數係使用表5之一般狀態分數表，作為各表現部位之合計分數而算出。一般狀態分數中觀察到2個以上的分數3之表現部位時，係於異氟烷麻醉下由腹部大動脈放血使其安樂死。經安樂死之動物係由測定對象除外。圖10為以流感病毒之感染處置日為0日，經時性表示至感染後8日為止之一般狀態分數者。再者，值係以平均±標準誤差表示，於與控制群之比較中，使用Wilcoxon之等級和檢定時的P值未達0.05時判定為有統計上顯著差而給予「*」、P值未達0.01時給予「**」。
(存活率之測定) 存活率之測定係與試驗例5同樣地進行。圖11為以流感病毒之感染處置日為0日，經時性表示至感染後13日為止之存活率者。再者，值係以平均±標準誤差表示，於與控制群之比較中，使用對數秩檢定時之P值未達0.05時判定為有統計上顯著差而給予「*」、P值未達0.01時給予「**」。
(結果1：試驗食品之對一般狀態分數的作用) 如圖10所示，控制群中自流感病毒感染後第4日起一般狀態分數上昇。另一方面，279株投予群中亦觀察到流感病毒感染所致之一般狀態分數的上昇，但較控制群改善。又，JCM5805株投予群投予群、防護乳酸菌投予群中亦較控制群改善，但未見如279株投予群程度的改善。
(結果2：試驗食品之對存活率的作用) 如圖11所示，控制群中，自流感病毒感染後第6日起可見死亡的個體，於感染後第7日全部的個體死亡。又，於JCM5805株投予群及防護乳酸菌投予群中自感染後第6日起亦可見死亡的個體，感染後第8日全部的個體死亡。另一方面，279株投予群中，雖於感染第8日可見死亡的個體，但於感染第13日亦有半數的個體存活。279株投予群中，相較於控制群，可見統計上顯著的存活率提高。又，防護乳酸菌投予群中，相對於控制群，觀察到存活率之統計上顯著的上昇，但未見如279株投予群程度的改善。
[試驗例8] [對流感感染小鼠的肺中病毒數及NK活性之評價(其2)] 小鼠之飼養及試驗食品、試驗食品之投予方法、流感病毒之感染方法係與試驗例5及試驗例6同樣地進行。小鼠之分群，除了使用每群各5之的小鼠以外，係與試驗例7同樣地進行。自病毒接種日(試驗開始第15日)起5日後(試驗開始第20日)，係於異氟烷麻醉下由腹部大動脈放血使其安樂死，進行肺中病毒數之測定及NK活性之評價。
(肺中之病毒數測定) 肺中之病毒數測定係使用由小鼠採取的右肺。病毒數測定係以與試驗例6相同之方法進行。
圖12為顯示流感病毒感染處置後第5日(試驗開始第20日)之肺組織中的病毒數(PFU/Lungs)者。再者，值係以平均±標準誤差表示，於與控制群之比較中，使用Wilcoxon之等級和檢定時之P值未達0.01時判定為有統計上顯著差而給予「**」。
(NK活性之評價) NK活性之評價係以與試驗例6相同之方法進行。圖13為顯示流感病毒感染處置後第5日(試驗開始第20日)之小鼠脾臓細胞中的NK活性者。橫軸表示效應物細胞數與標靶細胞數之比。亦即，將小鼠脾臓細胞與YAC-1細胞以10：1、20：1、40：1之比混合，測定細胞傷害率，顯示測定結果作為NK活性。再者，值係以平均±標準誤差表示，於與控制群之比較中，使用Wilcoxon之等級和檢定時的P值未達0.05時判定為有統計上顯著差而給予「*(279株投予群)」及「#(JCM5805株投予群)」。
(肺之病理組織學檢査) 病理組織學檢査係使用由小鼠採取的左肺。將左肺固定後，遵照常規方法，於各群的全部例子製作石蠟切片，將石蠟切片進行HE染色。實施光學顯微鏡學的檢査，於各群之代表例中，以數位相機將石蠟切片進行照片攝影。病理組織之各觀察所見，以於石蠟切片全體之染色比例計，計分為0；無變化(-、全體之0%)、1；極輕度(±、0%＜~≦25%)、2；輕度(+、25%＜~≦50%)、3；中等度(++、50%＜~≦75%)、4；重度(+++、75%＜~≦100%)之5階段。 再者，於支氣管，係算出黏膜上皮之過度形成/肥大、黏膜上皮之變性/壞死，及單核/多形核白血球之浸潤的3項目之合計分數。又，於肺泡，係算出肺不張、水腫、出血、單核/多形核白血球之浸潤(肺泡中隔)，及單核/多形核白血球之滲出的5項目之合計分數。
圖14為顯示流感病毒感染處置後第5日(試驗開始第20日)之於左肺中之病理組織學檢査中算出的分數者。再者，值係以平均±標準誤差表示，於與控制群之比較中，使用Wilcoxon之等級和檢定時的P值未達0.05時判定為有統計上顯著差而給予「*」。
(結果3：試驗食品之對肺中病毒數的作用) 如圖12所示，未處置群中未檢測出病毒，相對於此，控制群中病毒數上昇。另一方面，279株投予群中，觀察到流感病毒感染所致之肺中病毒數的上昇，但較控制群減少。又，防護乳酸菌投予群中，相較於控制群亦可見病毒數之減少，但未見如279株投予群程度的改善。JCM5805株投予群中，相較於控制群，未見到肺中病毒數之減少。由此可知，279株及防護乳酸菌具有使體內之病毒數減少的抗病毒作用，藉此提高了存活率。
(結果4：試驗食品之對NK活性的作用) 如圖13所示，相較於控制群，279株投予群中，與小鼠脾臓細胞及YAC-1細胞之細胞比無關地，脾臓細胞中之NK活性上昇。又，JCM5805株投予群中，當小鼠脾臓細胞及YAC-1細胞之細胞比為10：1及20：1時，脾臓細胞中之NK活性上昇。另一方面，防護乳酸菌投予群中，相對於控制群，未見到NK活性之上昇。由此可知279株及JCM5805株具有使NK細胞活性化之作用。
(結果5：試驗食品之對肺病變的作用) 如圖14A及14B所示，未處置群中，不管於支氣管及肺泡均未見到肺病變，相對於此，控制群中於支氣管及肺泡分數均上昇，產生肺病變。又，279株投予群中亦觀察到流感病毒感染所致之分數上昇，但相較於控制群未見到統計上顯著的變化。另一方面，JCM5805株投予群及防護乳酸菌投予群中，相較於控制群，於支氣管之分數雖未見到統計上顯著差，但於肺泡之分數觀察到統計上顯著的上昇。由此可知JCM5805株及防護乳酸菌在活化免疫的同時，使流感病毒感染所致之肺病變惡化，相對於此，279株即使活化免疫，亦不誘發支氣管或肺泡中之炎症。
[試驗例9] [小鼠脾細胞之IFN-γ之產生促進試驗] 將由9週齡之雌性C57BL/6J小鼠之脾臓所採取的脾臓細胞，以成為3.0×10 4個細胞/孔的方式以含有10%胎牛血清(FBS、BIOWEST)抗生素(盤尼西林/鏈黴素)100單位/mL(GIBCO)、50μM巰基乙醇的RPMI1640(GIBCO)培養基(以下稱RPMI1640培養基)調製，播種於96孔盤(IWAKI)。添加清酒乳酸桿菌MG-LAB279株、Pediococcus pentosaceus MG-LAB533株及胚芽乳酸桿菌 MG-LAB302株成為10μg/mL，進行培養。培養係於37℃、5%CO 2進行。控制組係使用未添加乳酸菌之RPMI培養基。
(ELISA分析) 將經20小時培養之小鼠脾細胞的上清液100μL由各96孔培養盤回收，使用ELISA MAX TMDeluxe Set Mouse IFN-γ(Biolegend)定量各檢體之產生量。具體而言，係遵照添附的實驗指南調製檢體後，於450nm波長測定各檢體之吸光度，使用以分析套組所添附的樣本所製成之檢量線定量IFN-γ產生量。測定結果示於圖15。測定值係以3重複的平均表示，誤差槓以標準誤差表示。
如圖15所示，可知清酒乳酸桿菌MG-LAB279株會強力誘導IFN-γ產生。可認為藉由IL-12p70，由輔助T前驅細胞(Th0)分化誘導而得的輔助T細胞類型1(Th1)使IFN-γ的產生亢進，藉以提高T細胞或單核球等之巨噬細胞的活性，進而使NK細胞活性化。
[試驗例10] [人類單核球系白血病細胞之IL-10之產生促進試驗] 將經JCRB細胞銀行分讓的人類單核球系白血病細胞THP-1以含有10%胎牛血清(FBS、BIOWEST)抗生素(盤尼西林/鏈黴素)100單位/mL(GIBCO)之RPMI1640(GIBCO)培養基(以下稱RPMI1640培養基)以成為1.0×10 6個細胞/mL的方式於37℃、5%CO 2之條件下培養。之後，為了分化為巨噬細胞，添加PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)使終濃度成為5ng/mL，進行24小時培養。藉由顯微鏡確認分化為巨噬細胞，去除培養上清液進行洗淨後，添加新的PRMI培養基培養24小時。以0.25w/v% 胰蛋白酶-1mmol/L EDTA･4Na溶液(和光純藥)回收細胞，調整為2.0×10 4個細胞/孔，播種於96孔盤(IWAKI)。播種1小時後，將清酒乳酸桿菌MG-LAB279株、Pediococcus pentosaceus MG-LAB533株及胚芽乳酸桿菌 MG-LAB302株之乾燥菌體粉末以RPMI1640培養基懸浮，以成為終濃度100ug/mL的方式添加並培養。24小時培養後，回收培養基，使用IL-10 Human Uncoated ELISA Kit(Invitrogen)測定培養基中之IL-10濃度。測定結果示於圖16。測定值係以3重複的平均表示，誤差槓以標準偏差表示。
如圖16所示，MG-LAB279株會促進人類單核球系白血病細胞所致之IL-10之產生。因此，可知MG-LAB279株具有高的抗炎症性細胞激素產生誘導能力。由此，認為係有對於對包含原因為病毒感染的疾病之炎症性的疾病之預防、治療為有效的可能性。
[試驗例11] [使用葡聚糖硫酸鈉所致之大腸炎模式小鼠的抗炎症試驗] (小鼠之飼養) 試驗係使用1週之預備飼養後，8週齡之雌性C57BL/6J小鼠(日本Charles River公司)。於維持在管理溫度：20~26℃、管理濕度：40~70%RH、明暗各12小時(照明：7時~19時)的飼養室中飼養動物。自預備飼養期間中起使用置入有褥墊(Pulsoft、Oriental酵母工業)的經滅菌之聚碳酸酯製平底籠(213mm×324mm×131mm)。又，考慮到飼養環境，故褥墊係每週交換2次。
(小鼠之分群) 小鼠係於給予一般食物之群(以下稱「控制群」)、給予一般食物且進行葡聚糖硫酸鈉(DSS)所致之炎症誘導之群(以下稱「DSS群」)，與投予乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株且進行炎症誘導之群(以下稱「279株投予群」)之3群各分群為4隻、8隻、8隻。
(試驗食品與投予方法) 控制群及DSS群之試驗食品為粉末飼料(MF、Oriental酵母工業股份有限公司)。279株投予群之試驗食品為混合有乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株之死菌體0.5%的上述粉末飼料。分群後將粉末飼料(MF)或被試驗物質混合飼料置入給餌器(MF-4S、SHINFACTORY股份有限公司)中使其自由攝取。飼料係每週2次補充或換新。試驗食品之投予係持續進行至試驗結束時為止。
(炎症誘導與體重測定之方法) 使各群之8週齡C57BL/6J小鼠自由攝食上述飼料至試驗結束時為止。DSS群與279株投予群係於飼養第8日將飲用水交換為2.5%DSS水溶液使其自由攝取水以誘發大腸炎。各小鼠之體重係於DSS投予開始前(第8日)及第11日、第13日、第14日測定。圖12顯示第11日、第13日、第14日之相對於DSS攝取開始前(第8日)的體重變化率。
(大腸之長度及大腸炎症狀分數之測定) 於試驗開始第14日，於異氟烷麻醉下進行剖檢，測定大腸(盲腸遠位部末端~肛門)之長度。大腸炎症狀分數之測定係於炎症誘導開始時(第8日)及第11日、第13日實施。圖19所示的大腸炎症狀分數，係使用表6之大腸炎症狀分數表，作為所觀察到的糞便之下痢症狀及血便症狀之合計分數而算出。圖19為經時性表示炎症誘導開始時(第8日)及第11日、第13日之大腸炎症狀分數者。分數值係以平均±標準誤差表示。檢定係藉由在DSS群與279株投予群之間的2群間比較(無對應之t檢定)來進行。顯著水準為風險率5%(圖中之「*」)。
(結果1：對體重變化率的作用) 如圖17所示，控制群中體重增加，相對於此，DSS群中體重減少。另一方面，279株投予群中亦觀察到DSS攝取所致的體重減少，但較DSS群緩和。
(結果2：對大腸之長度及大腸炎症狀分數之作用) 如圖18所示，觀察到DSS群之大腸相較於控制群更縮短。279株投予群中亦觀察到DSS攝取所致的大腸縮縮，但相較DSS群被抑制。又，如圖19所示，於炎症誘導開始時(第8日)未出現大腸炎症狀，相對於此，於第11日、第13日，DSS群之大腸炎症狀分數上昇。另一方面，279株投予群亦觀察到DSS攝取所致之大腸炎症狀分數的上昇，但較DSS群緩和。由此確認到乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株可延遲並緩和由DSS所誘導之大腸炎症狀的發病。
[製造例1] (乳酸菌之培養) 將乳酸菌清酒乳酸桿菌MG-LAB279株以市售培養基培養。藉由離心分離而集菌後，加水進行再懸浮，離心分離而得到濃縮菌體溶液。將其於105℃以上殺菌處理30分鐘。然後將濃縮菌體溶液噴霧乾燥而得到死菌體粉末。將該粉末與糊精(San-ei糖化公司製NSD300)混合而得到10質量%死菌體粉末。
[圖1]將試驗例2及3之測定結果(IFN-λ產生量)以圖表示者。 [圖2A]將試驗例2之測定及計算結果(MX1基因表現量)以圖表示者。 [圖2B]將試驗例2之測定及計算結果(OAS1基因表現量)以圖表示者。 [圖3]將試驗例4之測定結果(結果1：血清中之皮質固酮濃度)以圖表示者。 [圖4]將試驗例4之測定及計算結果(結果2：IFN-λ基因表現量)以圖表示者。 [圖5]將試驗例4之測定結果(結果3：血清中之TNFα濃度)以圖表示者。 [圖6]將試驗例5之觀察結果(結果1：流感病毒感染後之一般狀態分數)以圖表示者。 [圖7]將試驗例5之觀察結果(結果2：流感病毒感染後之存活率)以圖表示者。 [圖8]將試驗例6之測定結果(結果3：肺中病毒數)以圖表示者。 [圖9]將試驗例6之測定結果(結果4：NK活性)以圖表示者。 [圖10]將試驗例7之觀察結果(結果1：流感病毒感染後之一般狀態分數)以圖表示者。 [圖11]將試驗例7之觀察結果(結果2：流感病毒感染後之存活率)以圖表示者。 [圖12]將試驗例8之測定結果(結果3：肺中病毒數)以圖表示者。 [圖13]將試驗例8之測定結果(結果4：NK活性)以圖表示者。 [圖14A]將試驗例8之觀察結果(結果5：支氣管中之肺病變)以圖表示者。 [圖14B]將試驗例8之觀察結果(結果5：肺泡中之肺病變)以圖表示者。 [圖15]將試驗例9之測定結果(IFN-λ產生量)以圖表示者。 [圖16]將試驗例10之測定結果(IL-10濃度)以圖表示者。 [圖17]將試驗例11之測定結果(結果1：大腸炎誘導後之體重變化率)以圖表示者。 [圖18]將試驗例11之測定結果(結果2：大腸炎誘導後之大腸之長度)以圖表示者。 [圖19]將試驗例11之觀察結果(結果2：大腸炎誘導後之大腸炎症狀分數)以圖表示者。
國外寄存資訊 1.日本 ; NPMD ; 2022/05/02 ; NITE BP-03645 2.日本 ; NPMD ; 2022/05/02 ; NITE BP-03646 3.日本 ; NPMD ; 2022/05/02 ; NITE BP-03647
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Claims (13)

  1. 一種清酒乳酸桿菌(Lactobacillus sakei) MG-LAB279株(寄存編號：NITE BP-03645)。
  2. 一種組成物，其含有如請求項1之菌株及/或其菌體成分。
  3. 一種免疫活化用組成物，其含有如請求項1之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。
  4. 如請求項3之免疫活化用組成物，其不誘發炎症。
  5. 一種病毒感染預防用或治療用組成物，其含有如請求項1之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。
  6. 一種NK細胞活性化用組成物，其含有如請求項1之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。
  7. 一種干擾素λ產生促進用組成物，其含有如請求項1之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。
  8. 一種介白素-12p70產生促進用組成物，其含有如請求項1之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。
  9. 一種壓力緩和用組成物，其含有如請求項1之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。
  10. 一種炎症抑制用組成物，其含有如請求項1之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。
  11. 一種皮膚改善用組成物，其含有如請求項1之菌株及/或其菌體成分作為有效成分。
  12. 一種飲食品，其含有如請求項1之MG-LAB279株或如請求項2~11中任一項之組成物。
  13. 一種醫藥品，其含有如請求項1之MG-LAB279株或如請求項2~11中任一項之組成物。
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