KR20230105165A

KR20230105165A - 피부 기능 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20230105165A
Application number: KR1020220000389A
Authority: KR
Inventors: 박한오; 김명희; 연승우; 유원백; 이솔
Original assignee: (주)에이스바이옴
Priority date: 2022-01-03
Filing date: 2022-01-03
Publication date: 2023-07-11
Also published as: WO2023128728A1

Abstract

본 발명은 피부 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양액을 포함하는 피부 기능 개선용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 화장품에 관한 것이다.

Description

피부 기능 개선용 조성물 {Composition for Improving Skin Function}

화장품은 기본적으로 미용을 목적으로 하고 있지만, 이외에도 미백, 주름개선, 항산화 등 기능성 화장품들의 성장세가 두드러지고 있다. 이는 삶의 질이 향상됨에 따라 외모에 대한 관심이 높아져 미용 및 화장에 대한 일반 대중의 관심도가 급격히 높아지고 있다는 분석들이 있다. 이에 따라 기능성 화장품 개발을 위한 신소재 발굴을 위한 연구들이 진행되고 있으며, 최근에는 효소와 유산균 등의 미생물을 이용한 화장품의 개발로도 이어지고 있다. 특히 주요한 미생물로 사용되는 유산균에는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 등이 있으며, 상기 균주들은 항균 활성, 항산화 활성 및 항염증 활성을 가진다고 보고된 바 있다.

화장품의 기능성 연구로 밀접하게 관련이 있는 것은 멜라닌합성 세포인데, 멜라닌은 동물의 피부와 머리, 그리고 눈의 색을 결정하는 주요한 역할을 하며, UV 손상으로부터 피부를 보호하는 역할을 함께 수행한다. 하지만, 과량의 멜라닌 축적은 과한 색소침착을 불러일으킴으로써 주근깨, 기미와 같은 피부의 손상을 유발한다. 멜라닌의 합성과정에 있어서는 과산화수소를 비롯한 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)을 발생시킴으로써 멜라닌합성 세포를 산화스트레스 환경에 놓이게 만들 뿐만 아니라, 멜라닌 생합성을 지속적으로 유도하게 된다. 또한 생성된 과잉의 활성산소는 피부노화의 대표적인 유발원 중 하나로써, 콜라겐 분해효소를 증가시킴으로써 피부의 주름을 유발하기도 한다. 피부결합조직에는 가장 많이 존재하는 type I 콜라겐이 있으며, 그 밖에 엘라스틴, 피브로넥틴, 인테그린, 피브릴린, 프로테오글리칸 등이 있다. 새롭게 합성된 프로콜라겐은 피부세포의 세포외 공간으로 분비되어 콜라겐 섬유를 형성하는 원료로서 사용되며, 콜라겐은 기본적으로 피부의 결합력과 탄력성을 갖게 하는 중요한 역할을 수행한다. 따라서 활성산소의 억제는 멜라닌합성 세포로부터 멜라닌 생합성을 막아줌과 동시에 피부 노화를 방지할 수 있는 방법으로 제시되고 있다 (Biol Chem. 2019 Apr 24;400(5):589-612, Ageing Res Rev. 2015 May;21:16-29, Antioxidants (Basel). 2020 Jan 10;9(1):63).

멜라닌 생성은 주요하게는 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 활성에 의한 것이며, 구리이온을 함유하는 metalloprotein으로, 아미노산인 L-tyrosine을 기질로 하여 L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)로 변환시킨 뒤, 이것을 다시 산화시킴으로써 L-DOPA-quinone으로 변환시킨다. 이렇게 변환된 L-DOPA-quinone은 phospholipase C (PLC), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2) 같은 다른 단백질들에 의해 멜라닌으로 합성된다 (Science. 1982 Sep 17;217(4565):1163-5, Materials (Basel). 2012 Sep; 5(9): 1661??1685). 따라서 티로시나제 효소 활성을 저해함으로써 나타나는 멜라닌 생성 억제는 피부 미백 효과로써 나타나게 된다 (Materials (Basel). 2012 Sep; 5(9): 1661??1685, J Enzyme Inhib Med Chem. 2017 Dec;32(1):403-425).

현재 미백효과제로 이용되고 있는 물질로는 알부틴과 (arbutin)과 코직산(Kojic acid), 및 L-티로신 (L-tyrosine) 경쟁적 저해제가 있다. 이 외에도 다른 미백 효과제로 개발된 물질들이 있지만, 티로시나제의 억제 활성이 약하거나 세포 독성 등의 부작용을 나타내기도 한다. 따라서 세포 독성이 낮으면서 티로시나제를 효과적으로 억제할 수 있는 소재로부터 미백 소재의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이와 같은 연구들을 바탕으로, 항산화 효능이 있는 천연 소재들을 이용한 미백 및 주름 개선을 위한 물질을 찾고자 하는 연구가 여전히 활발히 진행되고 있다. 이에 맞추어 본 발명자들은 기능성 화장품 개발을 위한 신소재 발굴 방안을 모색하던 중, 락토바실러스 가세리 BNR17 (Lactobacillus gasseri BNR17) 배양액이 항산화 활성 효능을 포함하여, 미백, 주름개선에 도움을 줄 수 있는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 균주 배양액의 피부 기능 개선 용도를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양액을 포함하는 항산화 활성 증가, 미백 및 주름 개선으로 구성된 군에서 선택되는 피부 기능 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양액은 식약처 인증으로 안전성이 입증된 모유 유산균으로, 항산화 활성 효능을 포함하여, 미백, 주름개선에 효과가 있어, 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액에 의한 쥐 유래 흑색종 세포인 B16-F10 세포의 생존율을 분석한 결과이다.
도 2는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액이 B16-F10 세포내에서 합성된 멜라닌이 세포외로 분비에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 3은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액이 B16-F10 세포내에서 멜라닌 합성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 4는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액이 B16-F10 세포내에서 티로시나제 효소의 활성을 저해하는 정도로 미백활성을 측정한 결과이다.
도 5는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액에 의한 B16-F10 세포의 MITF, 티로시나제, TRP-1, TRP-2의 발현 영향을 mRNA 수준에서 확인한 결과이다.
도 6은 사람피부세포인 HaCaT 세포에서 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액을 세포에 처리한 경우 세포 생존도를 나타낸 결과이다.
도 7은 HaCaT 세포에 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액을 처리한 후, 실시간 중합효소연쇄반응법(qRT-PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 HaCaT 세포에 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액을 처리한 후, 실시간 중합효소연쇄반응법(qRT-PCR)을 수행하여 HO-1, catalase, collagen 및 MMP1 mRNA 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액의 항산화 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 인간의 모유에서 유래한 락토바실러스 가세리 BNR 17 배양액 특히 세포 미함유 배양상등액을 포함하는 조성물을 처리하는 경우, 멜라닌 합성 및 티로시나제 (tyrosinase) 활성 및 관련 신호전달체계와 연관된 mRNA들의 발현양이 억제되었다. 추가적으로, 콜라겐 (collagen) mRNA의 증가 및 MMP1 mRNA를 감소시키는 결과를 나타냈고, HO-1 mRNA의 증가에 따른 세포보호 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

이를 바탕으로, 본 발명은 일 관점에서 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양액을 포함하는 항산화 활성 증가, 미백 및 주름 개선으로 구성된 군에서 선택되는 피부 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.

하나의 실시예에서, 상기 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17는 KCTC 10902BP의 기탁번호를 가지는 균주를 포함할 수 있다.

상기 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17의 배양액은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 균주를 배지에 배양하여 균주가 영양분을 섭취하고 물질대사를 통해 생겨난 부산물 등이 포함된 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액의 농축액 또는 희석액, 상기 배양액을 건조하여 얻은 건조물, 상기 배양액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 또한 본 발명의 조성물 내 유효성분으로 포함될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 있어서 KCTC 10902BP의 기탁번호를 가지는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17의 배양상등액을 포함할 수 있다.

상기 배양상등액은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17을 대한민국 공개특허 10-2008-0110447호의 제조예 '2. 유산균 균말의 제조법' 방법을 이용하여 배양한 후 수득한 배양액을 원심분리하여 균주, 특히 세포 미포함 상태인 것을 의미한다.

상기 배양상등액은 구체적으로, MRS 액체 배지에 한정되지 않고 일부 성분들이 변경된 MRS 액체배지에서도 생산될 수 있으며, 기본적으로는 MRS 액체배지에 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17을 10⁶ cfu/㎖의 농도로 접종하여 37℃에서 18∼24시간 동안 30 부피％ NaOH를 중화제로 하여 pH 5.7ㅁ0.2로 pH-조절 발효(pH-control fermentation)한 후 4℃에서 10,000xg로 원심분리하여 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양액 특히, 배양상등액의 항산화 활성 증가, 미백 및 주름 개선으로 구성된 군에서 선택되는 피부 기능 개선 용도에 관한 것이다.

피부(skin)는 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하조직(subcutaneous tissue)으로 이루어진다. 피부의 바깥층인 표피는 중층편평상피(stratified squamous epithelium)로 구성되며, 외부 환경에 대한 신체의 보호 장벽으로 작용한다. 표피는 바깥에서부터 각질층(stratum corneum), 투명층(stratum lucidum), 과립층(stratum granulosum), 유극층(stratum spinosum) 및 기저층(stratum basale)으로 나뉜다. 진피는 표피와 피하조직(subcutaneous tissue) 사이의 층으로서, 유두층(papillary dermis) 및 망상층(reticular dermis)으로 나뉘며, 표피에는 없는 혈관, 콜라겐, 엘라스틴 섬유, 모공, 입모근, 피지선, 한선, 여러 가지 감각신경, 섬유아세포 및 대식세포 등이 존재하며 피부 중 가장 많은 부위를 차지한다.

상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있고, 화장수, 스킨, 토너, 에센스, 앰플, 유액, 젤, 워터, 고체, 현탁액, 포말, 에어로졸, 폼, 팩, 패치 또는 크림 등의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경우에 따라서, 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 또는 냉감제 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 화장품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화장품은 특히, 항산화 활성 증가, 미백 및 주름 개선으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 피부 기능 개선을 위한 기능성 화장품일 수 있다.

상기 화장품은 일반 피부 화장품 제조에 사용되는 일반적인 성분, 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 필요한 만큼 적용 배합할 수 있다. 또한, 상기 화장품은 미스트, 세럼, 영양화장수, 유연화장수, 유연수, 유액, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 파우더, 메이크업베이스, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치, 분무제, 입욕제, 선스크린제, 선오일 및 헤어제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있으며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 담체와 첨가제를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예

실시예 1. 실험방법 및 준비

1. 미백 효능 평가

1-1. 세포 배양

본 실험에서는 쥐 유래 흑색종 세포인 B16-F10 세포를 ATCC에서 구매하여 배양하였다. 기본적인 B16-F10 세포의 배양은 10% FBS (Hyclon, Logan, UT, USA) 와 1% Antibiotic/Antimycotic Solution (Hyclon, Logan, UT, USA)을 포함하는 DMEM (Hyclon, Logan, UT, USA) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였고, 세포외 멜라닌 측정을 위한 실험조건에서는 phenol red free DMEM (Hyclon, Logan, UT, USA)을 사용하였다.

1-2. 세포생존율 평가

KCTC 10902BP의 기탁번호를 가지는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양상등액 (이하, BNR17 배양상등액)의 처리 농도를 결정하기 위해 다양한 농도로 B16-F10 세포에 처리하고, 세포생존율을 WST (AbFrontier, Seoul, Korea) 세포생존율 측정 kit를 이용하여 확인하였다. 세포생존율 확인을 위해 B16-F10을 96웰 플레이트에 1X10⁴cells/well 로 접종한 후, 5% CO₂, 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 바꿔주고 각 well에 BNR17 배양상등액을 0, 0.1, 0.5, 1, 2.5 및 5 (v/v %)로 처리하여 37 ℃에서 24시간 뒤 WST kit를 사용설명서의 방법으로 측정하였다. 요약하면, WST 시약을 10 μl씩 각 well에 첨가한 뒤, 1시간 반 동안 37 ℃에서 배양한 후, 생성된 포르마잔 (formazan)을 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. BNR17 배양상등액을 처리하지 않은 군을 100%로 하여 세포 생존율을 나타내었다.

1-3. 세포외 멜라닌 농도 측정

미백 활성 분석을 위하여 B16-F10 세포를 10% FBS를 포함하는 페놀 레드 미포함 (phenol red free) DMEM 배지 3ml에 현탁시켜 6웰 플레이트에 1X10⁵cells/well로 접종한 후, 5% CO₂, 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 이후, α-MSH (Sigma, CA, USA)를 200 nM 농도로 처리하고 BNR17 배양상등액을 농도 별 (0.5 v/v % 및 1 v/v %)로 처리하여 37 ℃에서 48시간 동안 배양하며 멜라닌 생성을 유도하였다. 대조군으로 arbutin (Sigma, CA, USA) 200 μM을 BNR17 배양상등액 처리와 같은 실험 방법으로 처리하였다. 추가 배양 후, 세포가 제거된 배양배지만을 취하여 마이크로플레이트 리더로 492nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료가 처리되지 않은 대조군을 100%로 놓고 상대적인 값으로 비교되었다.

1-4. 세포내 멜라닌 농도 측정

미백 활성 분석은 세포내 멜라닌 함량을 피부의 미백에 도움을 주는 기능성화장품 유효성평가 가이드라인 (2020. 9)의 방법을 이용하여 측정되었다. 실시예 1-3인 세포외 멜라닌 농도 측정과 동일한 조건으로 세포를 처리한 뒤, 세포를 회수하여 계수해 동일한 세포 수를 모아 원심 분리하여 세포만 얻었다. 회수된 세포를 10% DMSO가 포함된 1 N NaOH (Sigma, CA, USA) 용액 100 μl를 넣어 60 ℃에서 2시간동안 용해하여 세포 내의 멜라닌을 포함하는 용액을 얻어 마이크로플레이트 리더로 492nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료가 처리되지 않은 대조군을 100%로 놓고 상대적인 값으로 비교되었다.

1-5. 세포 내 티로시나제 (Tyrosinase) 활성 측정

본 실험예에서는 실시예 1-4에서 확인된 시료들의 미백 활성을 확인하기 위하여 L-DOPA (Sigma, CA, USA)를 기질로 사용한 매뉴얼 (manual) 방식과 Tyrosinase Activity Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 tyrosinase 저해 실험을 하기와 같이 수행하였다. B16-F10 세포를 60 mm 플레이트에 접종한 후, 5% CO₂, 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 이후, α-MSH (Sigma, CA, USA)를 200 nM 농도로 처리하고 BNR17 배양상등액을 농도 별 (0.5 v/v % 및 1 v/v %)로 처리하여 37 ℃에서 40시간 동안 배양하며 멜라닌 생성을 유도하였다. 대조군으로 arbutin (Sigma, CA, USA) 200 μM을 BNR17 배양상등액 처리와 같은 실험 방법으로 처리하였다. 40시간 후 세포를 PBS (phosphate buffered saline)로 씻어주고 원심분리를 활용하여 세포를 회수하였다. 수득한 세포는 Tyrosinase Activity Assay Kit (Abcam)내의 buffer로 용해시킨 후 13,000rpm, 15분, 4℃에서 원심분리 하여 세포가 제거된 세포배양액을 사용하였다. BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 단백질 양을 정량한 뒤, 2 mg/ml L-DOPA 80 μl에 단백질 시료(20 μg/well)를 처리하여 37 ℃에서 1시간 반응시키고 마이크로플레이트 리더를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 같은 단백질 시료(5 μg/well)는 Tyrosinase Activity Assay Kit (Abcam)내의 Tyrosinase Activity Assay Kit reaction mix에 혼합되어 37℃에서 10분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 흡광도 510 ㎚에서 측정하였다. 대조군으로 알부틴 (arbutin)을 사용하여 상기와 동일한 실험을 수행한 후, BNR17 배양상등액 처리군의 티로시나제 억제정도를 비교하였다.

1-6. 세포 내 멜라닌 합성 효과

BNR17 배양상등액 처리 시 멜라닌 합성 관련 mRNA 수준의 변화는 실시간 중합효소연쇄반응 (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR) 방법을 이용하여 측정하였다. B16-F10 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지 1ml에 현탁시켜 12웰 플레이트에 5X10⁴cells/well로 접종한 후, 5% CO₂, 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후, α-MSH를 200 nM 농도로 처리하고 BNR17 배양상등액을 1 (v/v %)로 처리하여 37 ℃에서 6시간 및 40시간 배양하며 멜라닌 생성을 유도하였다. 대조군으로 arbutin 200 μM을 사용하였다. 해당 시간만큼 추가 배양 후 인산염완충식염수 (Dulbecco's phosphate buffered saline; DPBS, WELGENE)로 세척하고, 1 mL 트리졸 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 회수하였다. 그 다음, 트리졸의 1/5 비율에 해당하는 0.2 mL 클로로포름(Chloroform, Sigma, CA, USA)을 넣어 교반하고, 4℃에서 14000 rpm, 15 분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 동 상층액에 0.5 mL 이소프로판올 (Isopropanol, Darmstadt, Germany)을 넣고 10 분간 반응시킨 후, 14000rpm, 15 분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 상층액을 제거하고, 1mL 75% 에탄올(Ethanol, Darmstadt, Germany)을 이용하여 2 회 세척하였다. 세척한 침전물을 상온에서 완전히 건조시킨 후, 물 20 μL에 녹였다. 녹인 RNA를 정량 후, 각 그룹 당 RNA 동량을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 타겟으로 시아닌 염료인 2X GreenStar qPCR Master Mix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 실시하였다. 실시간 중합효소연쇄반응을 통하여, 최종적으로 MITF, tyrosinase, tyrosinase related protein-1, tyrosinase related protein-2 mRNA 발현 정도를 평가하였다.

2. 사람피부세포를 이용한 주름개선 및 항산화 효과 측정

2-1. 세포배양

본 실험에 사용한 사람피부세포인 HaCaT 세포는 Accegen Biotechnology (Fairfield, NJ, USA)에서 구매하여 배양하였다. HaCaT 세포는 10% FBS (Hyclon, Logan, UT, USA) 와 1% Antibiotic/Antimycotic Solution (Hyclon, Logan, UT, USA)을 포함하는 DMEM (Hyclon, Logan, UT, USA) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

2-1. 세포생존율 평가

시료를 농도별로 처리하고 24시간 동안 변화되는 세포생존율을 WST (AbFrontier, Seoul, Korea) 세포생존율 측정 kit를 이용하여 확인하였다. 세포생존율 확인을 위해 HaCaT 세포를 96웰 플레이트에 1X10⁴cells/well 로 접종한 후, 5% CO₂, 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 바꿔주고 각 well에 BNR17 배양상등액을 0, 1, 2.5 및 5 (v/v %)로 처리하여 37 ℃에서 24시간 뒤 WST kit를 사용설명서의 방법으로 측정하였다. 요약하면, WST 시약을 10 μl씩 각 well에 첨가한 뒤, 1시간 반 동안 37 ℃에서 배양한 후, 생성된 포르마잔 (formazan)을 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. BNR17 배양상등액을 처리하지 않은 군을 100%로 하여 세포 생존율을 나타내었다.

2-2. 세포 내 주름개선 및 항산화 효과

HaCaT 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지 1ml에 현탁시켜 12웰 플레이트에 5X10⁴cells/well로 접종한 후, 5% CO₂, 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 이후 새로운 배양액으로 바꿔주고 BNR17 배양상등액 시료를 각 농도별로 처리하였다. 24시간 추가 배양 후, 실시예 1-6에서와 같은 방법으로 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였고 실시간 중합효소연쇄반응을 통하여 최종적으로 heme oxygenase-1 (HO-1), catalase, glutathione peroxidase 1 (GPx1), superoxide dismutase 1 (SOD1), collagen type 1a (Col1a1), metalloproteinase 1 (MMP1) mRNA 발현 정도를 평가하였다. 산화스트레스 유도에 따른 BNR17의 기능을 분석하기 위하여, 세포를 12웰 플레이트에 5X10⁴cells/well로 접종한 후, 24시간 배양하였다. 이후 새로운 배양액으로 바꿔주고 BNR17 배양상등액 시료를 각 농도별(1 v/v % 및 3 v/v %) 30분 전처리 한 후, 산화스트레스를 유도하기 위하여 과산화수소 (H₂O₂, Sigma, St Louis, MO, USA)를 100 μM 농도로 처리하였다. 24시간 추가 배양 후 실시예 1-6에서와 같은 방법으로 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였고 실시간 중합효소연쇄반응을 통하여 최종적으로 HO-1, catalase, Col1a1, MMP1 mRNA 발현 정도를 평가하였다.

2-3. 수퍼옥사이드 애나이온 라디칼 (Superoxide anion radical) 소거능 평가

BNR17 배양상등액의 수퍼옥사이드 애나이온 라디칼 소거능을 평가하기 위하여 OxiTec™ DPPH Antioxidant Assay Kit (BIOMAX, Seoul, Korea)를 이용하여 사용설명서의 방법으로 측정하였다. 요약하면, BNR17 배양상등액을 농도별로 제조하여 DPPH working solution과 Assay buffer를 첨가하고 30분간 반응시켜 microplate reader로 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 수퍼옥사이드 애나이온 라디칼 (superoxide anion radical) 소거능을 trolox standard (0, 40, 60, 80, 100 μg/mL)에 대입하여 평가하였다. BNR17 배양상등액의 수퍼옥사이드 애나이온 라디칼 소거능은 trolox 100 μg/mL 기준으로 평가되었다.

실시예 2. 결과

2-1. B16-F10 세포의 세포생존율

본 발명에 따른 BNR17 배양상등액이 세포 활성에 미친 영향을 평가하기 위하여, B16-F10 세포를 이용하여 세포생존율 측정하였다. BNR17 배양상등액 시료를 0, 0.1, 0.5, 1, 2.5 및 5 (v/v %)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포생존율을 관찰한 결과는 아래 도1에 그래프로 나타내었다. 도 1에 도시된 바와 같이, BNR17 배양상등액에 의한 세포의 생존율은 최고 1 (v/v %) 처리 시까지 유의할 만한 차이가 관찰되지 않았다.

2-2. BNR17 배양상등액에 의한 멜라닌 합성 억제효과

본 발명에 따른 BNR17 배양상등액이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 평가한 결과를 도 2와 도 3에 도시하였다.

도 2에 도시된 바와 같이 배양상등액의 합성된 멜라닌의 분비 정도를 B16-F10 세포배양액에서 측정한 결과, 비교군으로 미백 기능성물질로써 잘 알려진 arbutin의 결과에는 미치지 못했으나, 배양상등액 농도가 증가함에 따라 멜라닌 분비량이 α-MSH 처리군에 비교하여 약 25% 이상 억제되는 것으로 나타났다. 또한 도 3에 도시된 바와 같이 배양상등액의 B16-F10 세포내의 멜라닌 합성 억제 정도를 측정한 결과, 배양상등액 농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성량이 α-MSH 처리군에 비교하여 약 30% 이상 감소되었다. 이는 비교군인 arbutin과 α-MSH동반 처리된 군과 비교하여 동등 이상의 억제 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 이에 따라, 본 발명에 따른 BNR17 배양상등액의 미백 효과가 현저히 우수한 것을 알 수 있다.

2-3. 티로시나제 활성 저해 효과

본 발명에 따른 BNR17 배양상등액이 B16-F10 세포내에서 티로시나제 효소의 활성을 저해하는 정도로 미백활성을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. '실시예 1-5. 세포 내 Tyrosinase 활성 측정' 방법으로 얻은 세포내 단백질을 활용하여 L-DOPA를 기질로 한 티로시나제의 활성을 측정한 결과, 비교군인 arbutin 처리된 샘플 대비 BNR17 배양상등액 처리 샘플에서 동등 이상의 효소 활성이 감소하였다. 동일 단백질 샘플은 티로시나제 활성화 측정 키트로 반복하여 검증해본 결과, 유사한 수준으로 효소 활성이 감소됨이 확인되었다.

2-4. B16-F10의 세포내 멜라닌 합성 관여 유전자 발현 측정

다양한 멜라닌 합성 관련 유전자들을 직접적으로 전사조절인자로 알려진 MITF (microphthalmia-associated transcription factor)와 MITF 의존적으로 멜라닌을 합성하는데 관여하는 티로시나제, TRP (tyrosinase-related protein)-1, TRP-2의 mRNA 발현에 미치는 BNR17 배양상등액의 효과를 알아보기 위하여 실험을 수행하였다. 실시예 1-6과 동일한 방법으로 세포를 준비하고, MITF, 티로시나제, TRP-1, TRP-2의 발현을 mRNA 수준에서 확인하였다.

도 5에서 나타낸 바와 같이, B16-F10세포에서 α-MSH 자극으로 유도된 MITF의 mRNA 발현 수준이 자극 유도 6시간 때 BNR17 배양상등액 처리에 의해 저해되는 것을 확인할 수 있다. α-MSH 자극이 충분히 유도되어 멜라닌 합성이 충분히 일어날 수 있는 40시간 때에 농도 의존적으로 티로시나제, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현이 감소하였다. 특히 대조군인 알부틴 (arbutin) 처리 그룹보다 동등 이상의 효과적인 결과값을 보였으며, 이를 통해 BNR17 배양상등액이 멜라닌 합성 키 전사조절자인 MITF의 발현을 억제함과 동시에, MITF에 의해 조절 받는 티로시나제, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현을 억제함으로써 피부 미백에 효과적일 수 있음을 확인하였다.

2-5. HaCaT 세포의 세포생존율

도 6에 나타난 바와 같이, 사람피부세포에서 BNR17 배양상등액을 화합물을 5 (v/v %)의 높은 농도로 세포에 처리할 경우에도 높은 세포 생존도를 나타냈다. 이것은, 아무런 처리를 하지 않은 무처리군과 비슷한 세포 생존도를 나타내는 것으로, BNR17 배양상등액은 해당 농도 범위 내에서 사람피부세포에 독성이 거의 없음을 나타내는 것이다.

2-6. HaCaT 세포의 세포보호, 항산화 및 주름개선 관여 유전자 발현 측정

Heme oxygenase-1 (HO-1)은 다양한 종류의 세포에서 ultraviolet radiation, 과산화수소, cytokine, 저산소 상태, glutathione (GSH)소모 등에 의해 유도되고, 다양한 조직/세포에 있어, 항염증, 항산화, 능동적 세포사멸 억제 작용을 갖는 것으로 알려져 있다. 산화적 손상에 대표적으로 관여하는 효소적 항산화제로는 카탈라아제(catalase, CAT), glutathione peroxidase (GPx1) 및 superoxide dismutase 1(SOD1)가 있으며, 주된 역할로는 인체 내에서 세포 및 조직에서의 산화스트레스를 감소시켜 산화적 손상을 방어한다.

콜라겐 (Collagen)은 피부 세포의 결합조직을 구성하는 성분들 중 피부 건조중량의 약 90%에 달하는 주요 구성 단백질로써, 콜라겐의 분해는 곧 결합조직의 탄력 저하와 피부의 주름 및 처짐에 직접적인 영향을 미치는 것으로 평가할 수 있다. 체내에서 생성되는 수십 종의 금속단백질분해효소(metalloproteinase, MMP)중, MMP-1은 콜라겐에 특이적으로 작용하는 단백질 분해효소로서 MMP-1의 활성을 억제하여 콜라겐을 보호하면 피부조직의 탄력을 유지하고 주름의 생성을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다.

BNR17 배양상등액 자체의 효능을 평가하기 위하여, HaCaT 세포에 BNR17 배양상등액을 1 및 3 (v/v %)의 농도로 처리한 후, 실시간 중합효소연쇄반응법(qRT-PCR)을 수행하였다. 그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, HaCaT 세포에서 세포보호(HO-1), 항산화 (Catalase, GPx1, SOD1) 및 주름개선 (Col1a1) 관여하는 mRNA 발현이 BNR17 배양상등액 처리에 의해 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다. 콜라겐에 특이적으로 작용하는 단백질 분해요소인 MMP-1은 유의하지는 않았으나, 감소하는 경향을 보여주었다.

BNR17 배양상등액을 처리한 HaCaT 세포 내의 항산화 현상을 관찰하기 위하여, 실시예 2-2의 방법으로 BNR17 배양상등액을 1 및 3 (v/v %)의 농도로 전처리한 후, 과산화수소를 처리하였다. 이후, 실시간 중합효소연쇄반응법(qRT-PCR)을 수행하여 HO-1, catalase, collagen 및 MMP1을 확인하였다.

그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, BNR17 배양상등액을 처리한 군에서 HO-1 mRNA 발현이 현저하게 증가하였으며, 과산화수소에 의해 증가된 MMP1의 mRNA 발현은 BNR17 배양상등액 농도 의존적으로 감소하였다.

이상으로 BNR17 배양상등액은 그 자체뿐만 아니라, 과산화수소로 유도된 산화스트레스에 대하여 세포보호효과 및 항산화, 및 주름개선에 효과적일 수 있음이 확인되었다.

2-7. 수퍼옥사이드 애나이온 라디칼 (Superoxide anion radical) 소거능 측정

상기 실시예에서 얻은 BNR17 배양상등액의 수퍼옥사이드 애나이온 라디칼 소거능을 DPPH assay를 수행하였고, 확인하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이 BNR17 배양상등액의 경우 0.625 (v/v %) 에서부터 수퍼옥사이드 애나이온 라디칼 소거능을 보였고 BNR17 배양상등액의 용량이 높아짐에 따라 대조군인 Trolox 대비 68%까지 증가하는 것으로 확인됨으로써, 수퍼옥사이드 애나이온 라디칼 소거에 따른 항산화 효과가 있음이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC10902BP

수탁일자 : 20060123

Claims

락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 배양액을 포함하는 항산화 활성 증가, 미백 및 주름 개선으로 구성된 군에서 선택되는 피부 기능 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17는 KCTC 10902BP의 기탁번호를 가지는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배양액은 배양상등액인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 화장품.