KR20140128675A - 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 가세리 ｈｙ７０２５ 유산균 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 - Google Patents

피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 가세리 ｈｙ７０２５ 유산균 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 Download PDF

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김용태
김유진
정지웅
이정희
장성식
허철성
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Abstract

본 발명은 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025는 세포 내 히알루론산 생성량 증가, 자외선에 의해 유도된 MMP-1 발현억제, c-Jun 인산화 및 발현억제, 무모생쥐를 이용한 광 손상 동물모델에서 피부주름 개선, 피부표피 두께 회복 및 보습 효과가 탁월하여 자연 노화 또는 광 손상에 의해 유도되는 피부 주름 개선 및 보습 효과를 나타내므로 주름 개선 및 보습 효능을 목적으로 한 약제, 식품, 화장료로 이용될 수 있다.

Description

피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 가세리 ＨＹ７０２５ 유산균 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품{Probiotics of Lactobacillus gasseri HY7025 for skin wrinkle inhibitory and moisturizing effects and use of thereof as skin anti-wrinkle or moisturizing products}
본 발명은 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 내 히알루론산 생성량 증가, 자외선에 의해 증가된 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 발현억제, c-Jun 인산화 및 발현억제, 무모생쥐를 이용한 광 손상 동물모델에서 피부주름 개선, 피부표피 두께 회복 및 수분함유량 증진효과를 나타냄으로써 자연 노화 또는 광 손상에 의해 유도되는 피부 주름 개선 및 보습 효능이 우수한 신규의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것이다.
의술의 발달로 평균수명이 연장됨에 따라 가능한 젊음을 길게 유지하고자 하는 욕구는 남녀노소의 공통 관심사가 되었으며 가장 쉽게 드러나는 피부 노화 방지에 대한 열망이 높아지고 있다. 이에 따라 피부 노화의 발생 원인을 찾고 이를 억제 할 수 있는 소재 개발 연구가 활발히 이어지고 있다. 피부 노화는 원인에 따라 크게 두 가지로 구분된다. 하나는 자연노화(Intrinsic aging)로 나이가 듦에 따라 생체 면역체계 및 생리활성 기능이 떨어져 히알루론산, 콜라겐 등 피부 구성요소를 원활히 회복하지 못하여 피부의 탄력이 감소되고 건조 현상이 일어나 잔주름 등이 형성된다. 히알루론산은 세포외기질 성분 중의 하나로 건조중량으로는 불과 0.1~0.2%를 차지하고 있지만 진피의 타 구성성분들과 그물망을 이루어 세포를 서로 연결하고 영양분을 전달하는 역할을 담당하며 피부의 수분 증발을 막는 동시에 물 분자와의 강력한 결합으로 피부가 일정한 량의 수분을 유지할 수 있도록 한다. 피부 내 히알루론산의 감소는 18~20세부터 시작하여 나이가 듦에 따라 또는 환경오염이나 자외선 노출에 의해 분해가 가속화 되어 진피 내 히알루론산의 감소는 피부탄력 저하, 주름생성 및 건조피부의 원인이 되기도 한다. 이러한 이유로 나이가 들어감에 따라 감소한 피부 내 히알루론산을 보충하여 노화를 예방하고자 하는 접근이 이루어져 왔다. 또한 콜라겐은 진피 전체의 70~80%를 차지하고 있어 콜라겐의 분해는 피부 내 탄력 감소 및 주름 형성과 밀접히 관련되어 있다. 피부 노화의 다른 한 종류는 외인성 노화(Extrinsic aging)라 하여 자외선 등 외부 스트레스로 인해 발생하는 노화이다. 자외선은 체내에서 비타민 D를 합성하고, 살균작용의 역할이 있으나, 피부염, 피부암, 일광 화상, 피부노화, 건조, 잔주름 등을 생기게도 한다. 자외선(Ultraviolet, UV)은 파장 길이에 따라 A, B, C의 3가지로 나뉘는데, 이 중 UVC는 오존층에서 차단되고 UVA와 UVB가 피부에 영향을 미친다.
특히, 중간 파장인 UVB(290~320nm)는 급성이나 만성적으로 노출되었을 경우, 심각한 피부 손상을 야기하는데, 피부 진피 내 구성성분인 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히알루론산(hyaluronic acid) 등을 파괴하여 피부의 탄력 소실을 유도하고 그 결과 굵은 주름이 생성된다. 또한 자외선에 의해 생성되는 활성산소는 세포내 신호전달 체계를 손상시켜 피부에서 콜라겐(collagen) 분해효소인 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 발현을 증가시켜 콜라겐을 파괴한다. 이러한 특징적인 변화들은 광 노화를 유도하며 피부홍반, 거칠기, 깊은 주름 및 흑화를 유도하는 것으로 알려져 있어 MMP-1 발현을 억제시킬 수 있는 물질의 개발이 요구된다.
유산균은 장내 유해 미생물을 억제시키고 장에서 대사되어 장 연동작용 증진, 면역체계 조절, 항염증 등의 생리활성을 가진다고 알려져 있으며, 최근에는 경구섭취 하였을 때 피부세포의 면역 조절 및 자외선에 의한 염증 억제 및 광보호 효과를 나타낸다는 보고들이 있다. 더불어 인체에 유해하거나 화학성 물질의 사용을 자제하고자 하는 사회적 분위기와 친환경적이고 안전한 물질을 선호하는 추세가 강해져 유산균 배양액, 또는 식물 추출물 등을 특정 속의 유산균으로 발효시켜 얻어진 발효액의 개발이 활발하다. 하지만 유산균의 발효액, 배양액이 아닌 유산균 자체의 섭취와 관련된 피부 주름 개선 및 보습 효과에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.
대한민국 출원공개 제10-2010-0066754호(발명의 명칭:피부 보습용 화장용 조성물, 출원공개일: 2010.06.18.) 대한민국 출원공개 제10-2010-0025500호(발명의 명칭:콜라겐 펩티드를 함유하는 피부미용 개선용 조성물, 출원공개일: 2010.03.09.)
본 발명은 상기 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품, 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인체 피부 섬유아세포 내 히알루론산의 생성 증가, 자외선에 의해 증가된 MMP-1 발현억제, c-Jun 인산화 및 발현을 억제시키는 동시에 무모생쥐를 이용한 광 손상 동물모델에서 피부주름 개선, 피부표피 두께 회복 및 수분함유량 증가 활성을 가짐으로써 피부 주름 개선 및 보습 효능을 가지는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품, 화장료 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 균주를 분리하기 위하여 한국인 신생아 분변을 0.02% 소디움 아지드(Sodium azide)가 포함된 MRS 액체 배지에 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 10㎕ 백금이를 사용하여 배양액을 취하여 다시 0.02% 소디움 아지드가 포함된 MRS 한천평판배지에 도말하고 37℃에서 2일간 배양하였다. 이렇게 형성된 균락 중에서 히알루론산(Hyaluronic acid) 생성 증진능을 시험하여 본 발명의 균주를 분리하였다.
즉, 히알루론산의 감소는 피부탄력 저하, 주름생성 및 건조피부의 원인이 된다는 사실에 근거하여 상기 균락 중에 있는 여러 유산균 중에서 인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포 주 내에 있는 히알루론산(Hyaluronic acid)의 생성량을 증가시키는 활성을 갖는 균주를 분리하였다.
이렇게 분리한 신균주를 동정하고자 16S rDNA 분석을 통한 분자유전학적인 방법을 실시하여 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
상기의 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 16S rDNA 유전자는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)의 16S rDNA 유전자와 100% 일치하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이를 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)로 HY7025로 명명하고, 2013년 4월 9일자로 한국생명공연구원(기탁번호: KCTC12399BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)로 HY7025의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 간균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)균락의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태
①형상: 원형
②융기: 볼록
③표면: 매끄러움(Smooth)
3)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 15~40℃
최적 생장온도 36~38℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 5.0~7.5
최적 pH 6.0~6.5
③산소에 대한 영향: 통성혐기성
4)카탈라제: -
5)가스형성여부: -
6)15℃에서 생육: +
7)45℃에서 생육: -
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
10)당 발효 실험 및 동정
Biomerieux 사의 api 50 CH kit를 이용하여 당 발효 실험을 한 결과를 표 2에 나타내었다.
당 0-24 사용 여부 당 25-49 사용 여부
0 Control - 25 에스큘린 +
1 글리세롤 - 26 살리신 +
2 Erythritol - 27 셀로비오스 +
3 D 아라비노스 - 28 말토스 +
4 L 아라비노스 - 29 유당 +
5 리보스 - 30 멜리비오스 -
6 D 크실로스 - 31 자당 +
7 L 크실로스 - 32 트레할로스 +
8 아도니톨 - 33 이눌린 -
9 β 메틸-D-크실로시드 - 34 멜레지토스 -
10 갈락토스 + 35 라피노스 -
11 포도당 + 36 전분 +
12 과당 + 37 글리코겐 -
13 만노스 + 38 크실리톨 -
14 소르보스 - 39 겐티오비오스 +
15 람노스 - 40 D 투라노스 +
16 둘시톨 - 41 D 라이소스 -
17 시노시톨 - 42 D 타가토스 +
18 만니톨 - 43 D 푸코스 -
19 소르비톨 - 44 L 푸코스 -
20 α-메틸-D-만노시드 - 45 D 아라비톨 -
21 α-메틸-D-클루코시드 - 46 L 아라비톨 -
22 N-아세틸-글루코사민 + 47 글루코나테 -
23 아미그달린 + 48 2-케토-글루코나테 -
24 아르부틴 + 49 5-케토-글루코나테 -
한편, 본 발명의 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선 및 보습 효능을 갖는 약학적 조성물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 정제, 캡슐제 등과 같은 제재형태로 제제화 하여 사용될 수 있다.
사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1~30mg/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
물론, 본 발명의 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 약학조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명의 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 포함하는 조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유, 건강기능식품 등으로 사용될 수 있다. 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 또는 건강기능식품으로 사용되는 경우, 각종 식품류, 발효유, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 발효유는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 유산균, 유산균 배양액, 또는 유산균 초음파 파쇄액 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 발효유를 제조한다.
또한, 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조한다.
또한, 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 건강기능식품은 상기 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 포함하는 것 이외에 영양보조 성분으로 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로 사용할 수 있다. 상기 화장료 조성물로 사용하는 경우에는 본 발명에 따른 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 외에 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 임의로 선정한 물질을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알코올, 증저점제, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH 조절제, 향료 등이 첨가될 수 있다.
또한 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되는 바가 없으며, 예를 들면, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤, 마사지 크림, 마스크 팩 등의 제형을 가질 수 있다.
한편, 상기와 같이 최종적으로 제조된 약학적 조성물, 건강기능식품, 기능성 음료, 발효유, 건강기능식품, 화장료 조성물 중에 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 함량은 총 조성물 100중량%를 기준으로 0.01~50중량% 범위로 포함될 수 있다. 이때, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 함량이 0.01 중량% 미만이면 피부 주름 개선 및 보습 효과가 미비할 수 있고, 50중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 피부 주름 개선 및 보습 효과 증가가 미비하여 비경제적이다.
본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025는 인체 피부 세포 주에서 세포 내 히알루론산 생성 증가, 자외선에 의해 증가된 MMP-1 발현억제, c-Jun 인산화 및 발현억제, 무모생쥐를 이용한 광 손상 동물모델에서 피부주름 개선, 피부표피 두께 회복 및 보습 효과가 우수하여 자연 노화 또는 광 손상에 의해 유도되는 피부 주름 개선 효과를 가지므로 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 보습 효과를 목적으로 한 약제, 발효식품, 음료, 건강기능식품, 화장료 조성물 등으로 이용될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 히알루론산 생성 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 자외선에 의해 증가된 MMP-1 발현의 억제 효과를 나타낸 사진이다.
도 3은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 자외선에 의해 유도된 c-Jun의 인산화 및 발현의 억제 효과를 나타낸 사진이다.
도 4는 광 손상 동물모델에서 자외선 조사에 의해 두꺼워진 표피 두께에 대해 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 경구섭취에 의한 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 광 손상 동물모델에서 자외선 조사에 의해 마우스 등에 생성된 굵고 깊은 주름에 대해 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 경구섭취에 의한 피부 주름 수, 피부주름 깊이 개선 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 광 손상 동물모델에서 자외선 조사에 의해 건조화 된 마우스 피부 조직에서 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 경구섭취에 의해 수분함유량 증가 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025를 포함한 동결건조분말의 제조
식품원료용 Proteose peptone #3, Yeast Extract, Beef Extract, 그리고 포도당을 첨가한 액체배지를 제조한 후 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 37℃에서 약 24시간 배양한 후 배양액을 원심분리하고 멸균된 생리식염수로 세척한 다음 멸균유에 분산시켰다. 그런 다음, 다시 동결 건조하여 동결건조 분말 그램(g)당 약 1010CFU 균수를 얻었다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025는 상기와 같이 동결 건조된 분말 형태 외에 배양물 형태로 제공될 수 있다.
<실시예 2>
락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조
본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 약학조성물의 제제 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
정제의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 포함한 동결건조 분말 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 폴리비닐피롤리돈 97㎎을 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 2㎎을 가하여 혼합한 후 1정이 400㎎이 되도록 타정하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 포함한 동결건조 분말 100㎎, 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 3>
락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025를 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
유산균 배양액과 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 및 혼합과즙시럽으로 구성된 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brixo)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP 배지에서의 총 유산균수가 1.0 ⅹ 109 cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.
그 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 포함한 동결건조 분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유한 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025를 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 및 혼합과즙시럽으로 구성된 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 5>
락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 동결건조 분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 동결건조 분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물 100중량부에 대하여 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<실시예 6>
락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025를 유효성분으로 함유하는 화장료의 제조
유연화장수
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 동결건조 분말 0.01중량%, 글리세린 3중량%, 부틸렌 글리콜 2중량%, 프로필렌 글리콜 2중량%, 카복시비닐폴리머 0.1중량%, 에탄올 10중량%, 트리에탄올아민 0.1중량% 및 잔량의 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수를 혼합하여 통상의 유연화장수 제조방법에 따라 제조하였다.
영양화장수
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 동결건조분말 0.01중량%, 밀납 4중량%, 폴리소르베이트 60 1.5중량%, 소르비탄세스퀴올레이트 0.5중량%, 유동파라핀 5중량%, 스쿠알란 5중량%, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5중량%, 글리세린 3중량%, 부틸렌 글리콜 3중량%, 프로필렌 글리콜 3중량%, 카복시비닐폴리머 0.1중량%, 트리에탄올아민 0.2중량%, 잔량의 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수를 혼합하여 통상의 영양화장수 제조방법에 따라 제조하였다.
영양크림
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 동결건조분말 0.01중량%, 밀납 10중량%, 폴리소르베이트 60 1.5중량%, 소르비탄세스퀴올레이트 0.5중량%, 유동파라핀 10중량%, 스쿠알란 5중량%, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5중량%, 글리세린 5중량%, 부틸렌 글리콜 3중량%, 프로필렌 글리콜 3중량%, 트리에탄올아민 0.2중량% 및 잔량의 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수를 혼합하여 통상의 영양크림 제조방법에 따라 제조하였다.
맛사지 크림
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 동결건조분말 0.01중량%, 밀납 10중량%, 폴리소르베이트 60 1.5중량%, 소르비탄세스퀴올레이트 0.8중량%, 유동파라핀 40중량%, 스쿠알란 5중량%, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 4중량%, 글리세린 5중량%, 부틸렌 글리콜 3중량%, 프로필렌 글리콜 3중량%, 트리에탄올아민 0.2중량% 및 잔량의 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수를 혼합하여 통상의 맛사지 크림 제조방법에 따라 제조하였다.
팩
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 동결건조분말 0.01중량%, 폴리비닐알콜 13중량%, 소듐카복시메틸셀룰로스 0.2중량%, 알란토인 0.1중량%, 에탄올 5중량%, 노닐페닐에테르 0.3중량% 및 잔량의 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수를 혼합하여 통상의 팩 제조방법에 따라 제조하였다.
<시험예 1>
인간 피부 섬유아세포에서 락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025의 히알루론산 생성 촉진 효과측정
인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포[입수처: 미국세포주은행(ATCC)]를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)에 페니실린 7.5mg/L, 스트렙토마이신 7.5mg/L를 함유하고 있는 DMEM 배지를 사용하여 5% 농도의 CO2 배양기에서 37℃로 24시간 배양하였다. 배지 조성물들은 모두 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA)사 제품을 사용하였다.
인간 피부 섬유아세포에서 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025가 세포내 히알루론산(Hyaluronic acid) 생성을 증가시키는지 측정하기 위해서 Hyaluronic acid (HA) ELISA kit(Echelon, K-1200)를 이용하여 히알루론산(Hyaluronic acid)의 생성량을 정량하였다.
본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 균주 5ⅹ108CFU/㎖를 인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포에 처리하고 24시간 배양한 세포의 배지로부터 100㎕을 취하여 배지로 분비된 히알루론산의 양을 측정하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
'Control'는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 처리하지 않은 무처리군을 나타내고, 'LAB'는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 5ⅹ108CFU/㎖ 처리군을 나타낸다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 정상 상태에 존재하는 히알루론산의 생성량이 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 처리에 의해 더욱 증가된 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 2>
락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025의 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1 발현 억제 효과 측정
인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포에서 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025가 자외선 조사에 의해 유도된 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 발현을 억제시키는지 측정하기 위해서 웨스턴 블랏팅 분석법(western blotting analysis)[Upham, B. L., Kang, K. S., Cho, H. Y., & Trosko, J. E. Carcinogenesis 18:37-42, 1997]을 이용하여 분석하였다.
본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 균주(LAB)를 5ⅹ108CFU/㎖(레인 3) 처리하고 1시간 후 UVB 50mJ/cm2를 조사하고 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포로부터 단백질을 추출하기 위하여 RIPA buffer를 사용하였다. 단백질 함량은 DC assay kit[Bio-Rad Corp., Richmond, CA, USA]를 이용하여 결정하였다. 상기 각각의 단백질 추출물들로부터 약 10㎍에 해당하는 단백질을 10% SDS-PAGE에 넣어 전기영동하여 분리하여 MMP-1 발현을 측정하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
레인 1(Lane 1)은 무처리 대조군,
레인 2(Lane 2)는 자외선(UVB 50mJ/cm2)조사 군,
레인 3(Lane 3)은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 5ⅹ108CFU/㎖과 자외선(50mJ/cm2) 처리군,
베타액틴(β-actin)은 동일한 양의 세포로 실험했음을 나타낸다.
MMP-1/β-actin ratio는 MMP-1 또는 β-actin을 image J 프로그램을 이용하여 각각의 밴드 인텐시티(band intensity)를 측정하여 비율로 나타낸 것이다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 무처리 군인 레인 1에 비하여 레인 2에서는 자외선 조사에 의해 세포 내 MMP-1의 발현이 현저히 증가한 반면, 레인 3에서와 같이 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 처리한 군에서는 자외선에 의해 증가한 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 3>
락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025의 자외선 조사에 의해 증가된 c-Jun 인산화 및 발현억제 효과 측정
콜라겐 분해효소인 MMP-1은 AP-1(activator protein 1) 전사인자에 의해 발현이 조절된다고 알려져 있다. 특히 AP-1 서브유닛(subunit) 중 하나인 c-Jun은 자외선에 의해 인산화(phospho-c-Jun, 이하, 'p-c-Jun'이라 함)되거나 c-Jun 자체의 발현이 높아져 세포내 MMP-1 발현을 증가시킬 수 있으므로 c-Jun 단백질의 인산화 및 발현에 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025가 미치는 영향을 확인하였다.
인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포에서 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025가 자외선 조사에 의해 유도된 c-Jun의 인산화 및 발현을 억제시키는지 측정하기 위해서 웨스턴 블랏팅 분석법(western blotting analysis)[Upham, B. L., Kang, K. S., Cho, H. Y., & Trosko, J. E. Carcinogenesis 18:37-42, 1997]을 이용하여 분석하였다
본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 균주 5ⅹ108CFU/㎖(레인 3)를 인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포에 처리하고 1시간 후 UVB 50mJ/cm2를 조사하고 15분 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포로부터 RIPA buffer를 사용하여 단백질을 추출하였고, 단백질 함량은 DC assay kit[Bio-Rad Corp., Richmond, CA, USA]로 정량하였다. 약 10㎍에 해당하는 단백질을 10% SDS-PAGE에 넣어 전기영동하여 분리 한 후 c-Jun, p-c-Jun, 또는 β-actin 1차 항체를 처리하여 각각의 발현을 측정하였다.
그 결과를 도 3 에 나타내었다.
레인 1(Lane 1)은 무처리 대조군,
레인 2(Lane 2)는 자외선(UVB 50mJ/cm2)조사 군,
레인 3(Lane 3)은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 5ⅹ108CFU/㎖과 자외선(50mJ/cm2) 처리군을 나타낸다.
베타액틴(β-actin)은 동일한 양의 세포로 실험했음을 나타낸다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 무처리 군인 레인 1에 비하여 레인 2에서는 자외선 조사에 의해 세포 내 c-Jun이 인산화되어 p-c-Jun의 발현이 증가한 반면, 레인 3에서와 같이 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 처리한 군에서는 c-Jun의 인산화가 감소하였다.
또한, 무처리 군인 레인 1에 비하여 레인 2에서는 자외선 조사에 의해 세포 내 c-Jun 발현이 증가한 반면, 레인 3에서와 같이 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 처리한 군에서는 c-Jun의 발현이 현저히 억제된 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 이상의 본 시험결과를 종합하여 보면 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025는 c-Jun의 인산화 및 발현을 억제함으로써 AP-1 전사인자의 활성을 억제하여 MMP-1 발현을 저해하는 것으로 추론할 수 있다.
<시험예 4>
무모생쥐의 광 손상 동물모델에서 락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025의 경구투여를 통한 피부 두께 억제 효과 측정
본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 균주의 경구섭취가 자외선에 의해 형성되는 피부주름 및 피부건조에 미치는 영향을 조사하고자 무모생쥐(hairless mouse)를 동물모델로 선정하여 실험하였다.
6주령의 암컷 무모생쥐(SKH, HR-1)를 비교예 1(Cont), 비교예 2(UVB), 시험예 4(UVB+LAB)로 그룹당 8마리씩으로 나누어 실험기간 동안 사육하였다.
비교예 1(Cont)은 무모생쥐 1마리당 0.1㎖의 생리식염수만을 경구투여 하였고, 비교예 2(UVB)는 무모생쥐 1마리당 생리식염수 0.1㎖ 경구투여 30분 후 자외선(UVB)을 조사하였다.
시험예 4(UVB+LAB)는 무모생쥐 1마리당 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 1ⅹ109CFU/㎖을 0.1㎖ 생리식염수에 섞어 경구투여 30분 후 자외선(UVB)을 조사하였다.
상기 비교예 1 및 2와 시험예 4의 생리식염수 또는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 투여기간은 총 12주로 주 5일 투여하였으며, 비교예 2 및 시험예 4의 자외선(UVB) 조사 강도는 1주차는 1MED(Minimal Erythemal Dose, 최소홍반량)인 25mJ/cm2를 조사하고 2주차는 2MED, 3주차에는 3MED, 4 내지 12주차까지는 4MED의 강도로 조사하였다.
자외선의 반복적인 조사는 표피층의 비후가 일어나 자외선 각화증을 유발하고 진피 내 탄력섬유의 분해 및 무정형의 탄력섬유 증가로 탄력섬유증이 발생하게 된다. 본 시험에서는 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 섭취가 자외선 각화증에 따른 표피층 두께의 증가를 예방하는 효과를 가지는지 평가하기 위해 상기 비교예 1(Cont), 비교예 2(UVB), 시험예 4(UVB+LAB)의 실험동물의 등 피부 조직을 채취하여 10% 포르말린(formalin) 용액에 24시간 고정하였다. 수세 과정을 거쳐 제작한 슬라이드에 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 염색을 하여 사진 촬영을 하고 표피 두께를 측정하였다(도 4의 A 참조).
또한, 상기 비교예 1(Cont), 비교예 2(UVB), 시험예 4(UVB+LAB)의 그룹당 8마리의 무모생쥐의 등 피부조직 슬라이드를 모두 현미경(ZEISS AX10, X100)으로 관찰 후 대표성 있는 부위를 사진 촬영한 후, 표피 두께를 1마리당 3부위에서 software(AxioVison. Rel. 4.6)를 이용하여 측정하고 이의 평균값을 구한 뒤, 8마리의 평균치를 다시 구하여 유의성을 평가하였다(도 4의 B 참조).
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 A는 비교예 1(Cont), 비교예 2(UVB), 시험예 4(UVB+LAB)의 등 피부 조직의 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 염색을 한 후 찍은 사진이고, 도 4의 B는 비교예 1(Cont), 비교예 2(UVB), 시험예 4(UVB+LAB)의 등 피부 조직의 표피 두께의 유의성을 평가한 그래프이다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 무모생쥐에 자외선을 만성적으로 처리하였을 때 비교예 1(Cont)의 표피 두께에 비해 비교예 2(UVB)의 표피 두께가 2배 이상 증가하였으나, 시험예 4(UVB+LAB)의 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 경구 투여로 비교예 2에 비하여 표피 두께가 약 42% 억제되었음을 알 수 있었다.
<시험예 5>
무모생쥐의 광 손상 동물모델에서 락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025의 경구투여를 통한 피부 주름 개선 효과 측정
주름 개선 효과의 정량적 판정을 위하여 상기 시험예 4와 동일한 실험동물[비교예 1(Cont), 비교예 2(UVB), 시험예 4(UVB+LAB)] 무모생쥐의 등 쪽에서 실리콘 폴리머를 이용하여 피부 주형(replica)을 채취하였고, 피부 주름 측정 장치(VisioLine VL650, CK electronic GmbH, Germany)를 이용하여 사진 결과를 얻어 도 5의 A에 그 결과를 나타내었으며, 피부주름의 수 및 피부주름의 깊이를 수치화하여 각각 도 5의 B(피부주름의 수) 및 도 5의 C(피부주름의 깊이)에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 시험예 4(UVB+LAB)의 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025를 경구 투여한 무모생쥐의 피부 주름 정도가 비교예 2(UVB)의 자외선만을 조사한 무모생쥐에 비하여 피부주름 수(No. of Wrinkles), 피부주름 깊이(Total Wrinkle depth) 모두에서 현저히 완화되어 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025 균주가 자외선으로 유발된 피부 주름을 개선시키는 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
<시험예 6>
무모생쥐의 광 손상 동물모델에서 락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7025의 경구투여에 의한 보습 효과 측정
만성적인 자외선 조사는 수분손실을 가져와 피부를 건조하게 하므로 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 보습효능을 측정하기 위하여 실험 종료 시점인 12주차에 상기 시험예 4와 동일한 실험동물[비교예 1(Cont), 비교예 2(UVB), 시험예 4(UVB+LAB)]의 무모생쥐의 등 피부로부터 Corneometer CM825(CK electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부표면의 수분 함유량을 측정하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 자외선 조사시 표피의 수분 함유량을 나타내는 corneometer measurement values는 비교예 1(Cont)에 비해 비교예 2(UVB)에서와 같이 자외선 조사시 현저히 억제되었으며, 시험예 4(UVB+LAB)에서와 같이 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025의 경구 투여시 비교예 2에 비하여 수분 함유량을 약 24% 회복하는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025는 자외선에 의해 건조화된 피부에 보습 효능을 가짐을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC12399BP 20130409

Claims (14)

  1. 피부주름 개선 및 보습 효능을 가지는 신규의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 세포내 히알루론산 생성증가, 자외선에 의해 증가된 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 발현억제, c-Jun 인산화 억제 및 c-Jun 발현억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 무모생쥐를 이용한 광 손상 동물모델에서 피부주름 개선, 피부표피 두께 회복 및 피부보습 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 보습용 약학조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 총 조성물에 대하여 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 0.01~50중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선 및 보습용 약학조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 유효성분으로 함유하는 발효유.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 발효유는 총 조성물에 대하여 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 0.01~50중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 발효유.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 유효성분으로 함유하는 기능성 음료.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 기능성 음료는 총 조성물에 대하여 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 0.01~50중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 음료.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 건강기능식품은 총 조성물에 대하여 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 0.01~50중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤, 립스틱, 파운데이션, 아이쉐도우, 팻취, 마스트 쉬트, 마사지 크림 및 마스크 팩 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 총 조성물에 대하여 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7025(기탁번호: KCTC 12399BP)를 0.01~50중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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