TWI789686B - 短乳桿菌tci988及短乳桿菌tci988及/或其代謝產物的用途 - Google Patents
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Abstract
一種短乳桿菌TCI988，其中短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis
TCI988）寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910975。基此，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物可用以製備神經保健的組合物、助眠及抗憂鬱的組合物、減脂的組合物或其組合。
Description
本發明關於一種短乳桿菌及其用途，特別是關於一種短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis
TCI988），其可用於製備神經保健的組合物、助眠及抗憂鬱的組合物、減脂的組合物或其組合。
益生菌（Probiotics）一般認為是指食入後對宿主（或稱受體，如動物或人類）有正面效益的食入性微生物。其命名源於希臘語「for life」（對生命有益），又稱為「原生保健性菌種」；並且，益生菌主要是指乳酸菌和部分酵母菌。
一般而言，「乳酸菌（Lactic Acid Bacteria）」是指能利用碳水化合物進行發酵生產多量乳酸之細菌總稱，為一相當龐雜的菌群。在諸多乳酸菌的菌種中，部分乳酸菌菌種的菌株經研究發現其對於受體健康有益，故此些菌株被視為益生菌。換言之，益生菌大部分是乳酸菌，但乳酸菌中只有少數經研究證明對受體健康有益的菌株能被稱為益生菌。
舉例來說，常見的可作為益生菌的乳酸菌的菌種包括腸球菌屬（Enterococcus
）、乳桿菌屬（Lactobacillus
）、雙岐桿菌屬（Bifidobacterium
）、芽孢桿菌屬（Bacillus
）等，而可作為益生菌的酵母菌的菌種包括酵母菌屬（Saccharomyces
）。
乳桿菌屬是一群具有發酵能力、兼性厭氧、不會產生孢子的革蘭氏陽性桿菌。乳桿菌因能夠將碳水化合物發酵成乳酸而得名，可用於製造液態優酪乳、固態奶酪、德國酸菜、啤酒、葡萄酒、泡菜、醃漬食品和其他發酵食品。
在一些實施例中，一種短乳桿菌TCI988，其中短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis
TCI988）寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910975。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988具有生成γ-胺基丁酸（γ-Aminobutyric acid, GABA）之能力。
在一些實施例中，一種短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物用以製備神經保健的組合物之用途，其中短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis
TCI988）寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910975。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有促進受體的神經細胞的粒線體活性之能力。
在一些實施例中，一種短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物用以製備助眠及抗憂鬱的組合物之用途，其中短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis
TCI988）寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910975。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有提升受體的褪黑激素合成相關基因的能力。
在一些實施例中，褪黑激素合成相關基因為SIRT1基因、TPH1基因、DDC基因或其組合。
在一些實施例中，一種短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物用以製備減脂的組合物之用途，其中短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis
TCI988）寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910975。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有降低脂肪累積的能力。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有促進脂肪分解的能力。
綜上所述，任一實施例的短乳桿菌TCI988，具有生成γ-胺基丁酸之能力。在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有促進受體的神經細胞的粒線體活性之能力，並可用以製備神經保健的組合物。在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有提升受體的褪黑激素合成相關基因（如SIRT1基因、TPH1基因、DDC基因或其組合）的能力，並可用以製備助眠及抗憂鬱的組合物。在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有降低脂肪累積及/或促進脂肪分解的能力，並可用以製備減脂的組合物。
短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis
TCI988）是分離自天貝的的乳桿菌屬的菌株。短乳桿菌TCI988以寄存編號BCRC 910975寄存於財團法人食品工業發展研究所。短乳桿菌TCI988以寄存編號DSM 33484寄存於德國微生物保藏中心（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ）。
短乳桿菌TCI988為格蘭氏陽性菌，可於厭氧環境下生長，為厭氧細菌。短乳桿菌TCI988生長的溫度為35℃至37℃，且可於酸鹼值（pH值）為3至7的環境下生存。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988具有耐胃酸膽鹽之功能。舉例來說，短乳桿菌TCI988於胃模擬環境（pH值3-4）的存活率為99.1%，且於腸道模擬環境（pH值7-8）的存活率為100%。因此，短乳桿菌TCI988可在人體腸胃道環境定殖，進而在人體中產生可供人體吸收的活性成分，如γ-胺基丁酸（γ-Aminobutyric acid, GABA；以下稱GABA）。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988具有生成GABA的能力，進而提高受體體內的GABA含量。換言之，當受體服用短乳桿菌TCI988後，短乳桿菌TCI988能提升受體體內的GABA含量。在一些實施例中，受體可為人。
在一些實施例中，透過培養短乳桿菌TCI988，並透過離心分離短乳桿菌TCI988的菌體及其上清液後，將上清液經過濾後可取得短乳桿菌TCI988的代謝產物。換言之，短乳桿菌TCI988的代謝產物包括短乳桿菌TCI988進行代謝後分泌至培養液中的物質。在一些實施例中，短乳桿菌TCI988的代謝產物更包括用以培養短乳桿菌TCI988的培養液，且此培養液為已培養過短乳桿菌TCI988，但此培養液不包含短乳桿菌TCI988的菌體。在一示範例中，將短乳桿菌TCI988以乳桿菌MRS培養基（BD Difco™ Lactobacilli MRS Broth）於37℃厭氧環境（即培養環境中氧氣濃度為1體積%）下培養16小時以得到含有短乳桿菌TCI988的菌體及其代謝產物的菌液。接著，將菌液以轉速5000rpm離心15分鐘以分離短乳桿菌TCI988的菌體及含有短乳桿菌TCI988的代謝產物的上清液。並且，取此上清液以0.22微米（μm）的濾網過濾上清液以得到短乳桿菌TCI988的代謝產物。
於此，用語「代謝產物」意為培養短乳桿菌時，經此短乳桿菌代謝後所分泌至培養液中之物質，或者為經此短乳桿菌代謝後所分泌至培養液中之物質與培養此短乳桿菌的乳桿菌培養液，但不包含此短乳桿菌的本體。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物能用以促進受體的神經細胞的粒線體活性。換言之，當受體服用短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物時，可維持受體的神經細胞的健康，進而達成受體保健神經的功能。
基此，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物可用以製備神經保健的組合物。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物能用以提升受體的褪黑激素合成相關基因。於此，褪黑激素合成相關基因包括SIRT1基因（Gene ID：23411）、TPH1基因（Gene ID：7166）、DDC基因（Gene ID：1644）或其組合。其中，SIRT1基因為神經突觸功能障礙相關聯的基因；TPH1基因與DDC基因為一種血清素合成基因，亦為褪黑激素合成相關基因。換言之，當受體服用短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物時，可提升SIRT1基因的表現量，進而有助於改善突觸可塑性的抑鬱症，且達成抗憂鬱的功能。並且，當受體服用短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物時，亦可提升TPH1基因與DDC基因的表現量，進而升血清素的表現及促進褪黑激素生成，並改善受體的睡眠及達成助眠的功能。
基此，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物可用以製備助眠及抗憂鬱的組合物。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物能用以降低脂肪累積。換言之，當受體服用短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物時，可避免受體體內的脂肪細胞以油滴（Lipid droplet）的形式貯存脂肪，進而達成減脂的功能。
在一些實施例中，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物能用以促進脂肪分解。換言之，當受體服用短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物時，可促進受體的脂肪細胞內所貯存的三酸甘油酯（triglyceride, TG）被逐步降解為脂肪酸（fatty acid, FA）與甘油（Glycerol），進而達成減脂的功能。
基此，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物可用以製備減脂的組合物。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。舉例來說，當組合物為固態（如錠劑、膠囊或粉末狀等）時，組合物的劑量為每日100毫克的短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物。
在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）、或含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食品。換言之，食品包含特定含量的短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物。在一些實施例中，前述之食品可為食用產品或食品添加物（food additive）。在一些實施例中，食用產品可為但不限於：飲料（beverages）、乳製品（dairy products）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及飲食補充品（dietary supplements）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為化妝品或保養品。換言之，化妝品或保養品包含特定含量的短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物。
在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可為下列任一種型態：化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可視需要更包含外用品可接受成分。在一些實施例中，外用品可接受成分可例如為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。
例
1
：菌種鑑定
首先，將分離自天貝的分離菌株以乳酸菌之16S核醣體基因（16SrDNA）序列進行菌種鑑定。透過聚合酶連鎖反應（PCR）得到此分離菌株的16SrDNA序列（即SEQID NO:1）。接著，利用美國國家生物技術資訊中心（NCBI）網站，將SEQID NO:1所示的基因序列分別與其他短乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後，可知分離菌株的16SrDNA序列與其他短乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似度如表1所示。因此，將此分離菌株命名為短乳桿菌TCI988。並且，將此短乳桿菌TCI988以寄存編號BCRC 910975寄存於財團法人食品工業發展研究所。
表1
| 短乳桿菌亞種 | 相似度 |
| Lactobacillus brevis strain RL826 | 97.12% |
| Lactobacillus brevis strain 8546 | 97.11% |
| Lactobacillus brevis IMAU 10206 | 97.11% |
| Lactobacillus brevis strain PS 7305 | 97.19% |
| Lactobacillus brevis strain 1992 | 96.95% |
| Lactobacillus brevis strain elastic001 | 97.03% |
| Lactobacillus brevis strain 6525 | 97.03% |
例
2
：耐胃酸膽鹽試驗
於此，將短乳桿菌TCI988以緩衝液、人工胃液（pH 3）及人工小腸液（pH 8）進行測試，以確認短乳桿菌TCI988於生物體腸胃消化道中的酸鹼耐受性。其中，緩衝液為0.2莫爾濃度（M）氯化鉀（KCL, 品牌Sigma-Aldrich）且pH值為7。人工胃液為0.2 M氯化鉀且pH值為3。人工小腸液為0.1 M三羥甲基氨基甲烷（品牌Sigma）且pH值為8。
以一活化程序將短乳桿菌TCI988活化。首先，將短乳桿菌TCI988的凍菌以10體積%的菌量培養於液態乳桿菌MRS培養基（BD Difco™ Lactobacilli MRS Broth）中，並於28℃下培養16小時，以活化短乳桿菌TCI988。
接著，將活化後的短乳桿菌TCI988毒菌液取1體積%的濃度接種至20毫升的待測溶液中，然後以轉速50rpm於37℃下震盪培養3小時。其中，三個組別的待測溶液分別為人工胃液（人工胃液組）、人工小腸液（人工小腸液組）及氯化鉀緩衝液（控制組）。從培養後的菌液取100微升（μL）的菌液塗盤，並於28℃下靜置培養3天，並於3天後以肉眼計數各組別的活菌數（計算固態乳桿菌MRS培養基上的菌落數）。
請參閱圖1。圖式中短乳桿菌TCI988的存活率為計數後的活菌數，並以log CFU/mL表示。其中，log CFU/mL代表每毫升菌液含有的菌落形成單位（CFU，colony-forming unit）並以對數（log10
）表示。由圖1可知，控制組的短乳桿菌TCI988的菌數為8.477 log CFU/mL、人工胃液組的短乳桿菌TCI988的菌數為8.398 log CFU/mL，及人工小腸液組的短乳桿菌TCI988的菌數為8.477 log CFU/mL。由此可知，人工胃液組的存活率為控制組的99.1%，且人工小腸液組的存活率為控制組的100%。
基此，短乳桿菌TCI988具有耐胃酸膽鹽之功能，代表短乳桿菌TCI988可通過宿主腸胃道的酸鹼值壓力，定殖於宿主腸道中。
例
3
：
短
乳桿菌
TCI988
所分泌的
GABA
濃度的檢測實驗
於此，以前述活化程序將短乳桿菌TCI988活化後，將10體積%的活化後的短乳桿菌TCI988接種於液態乳桿菌MRS培養基中，並於37℃厭氧環境下進行培養，並分別於培養0小時（接種前）、6小時、12小時、18小時、24小時、30小時、36小時、42小時、48小時、54小時、61小時、66小時及72小時分別收集不同時間點的短乳桿菌TCI98的菌液，並測量其OD600
的吸光值。接著，將各組菌液以轉速5000rpm離心15分鐘以分離短乳桿菌TCI988的菌體及含有短乳桿菌TCI988的代謝產物的各組上清液。然後，將各組上清液以GABA濃度檢測套組（品牌CLOUD-CLONE CORP；產品編號CEA900Ge ELISA Kit for Gamma-Aminobutyric Acid （GABA））測量其含有的GABA濃度。
請參閱圖2。短乳桿菌TCI988分泌至培養基中的GABA濃度隨著培養時間增加。當短乳桿菌TCI988培養至42小時後，短乳桿菌TCI988的吸光值達到最高，代表其菌數達到最大。並且，於培養42小時至72小時之間，短乳桿菌TCI988的菌數以達到停滯期（Stationary phase），期間短乳桿菌TCI988的菌數達到穩定的動態平衡。再者，於培養42小時至61小時之間，雖然短乳桿菌TCI988的吸光值略微下將，但其檢測到的GABA濃度顯著上升，代表短乳桿菌TCI988分泌的GABA濃度提高。
基此，短乳桿菌TCI988具有生成GABA的能力。
例
4
：
短
乳桿菌
TCI988
、短乳桿菌
L816
及短乳桿菌
L846
的代謝產物的製備及
GABA
含量檢測
於此，短乳桿菌L816是分離自泡菜的分離菌株，其16SrDNA序列（即SEQID NO:2）與其他短乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似度如表2所示。短乳桿菌L846是分離自天貝的分離菌株， 16SrDNA序列（即SEQID NO:3）與其他短乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似度如表2所示。基此，可知短乳桿菌L816及短乳桿菌L846與短乳桿菌TCI988皆為短乳桿菌菌種，但為不同的短乳桿菌菌株。
表2
| 短乳桿菌L816比對之短乳桿菌亞種 | 相似度 |
| Lactobacillus brevis strain M4-1 | 98.13% |
| Lactobacillus brevis strain 7898 | 97.22% |
| Lactobacillus brevis strain NWAFU1156 | 97.62% |
| Lactobacillus brevis strain 14G | 97.62% |
| Lactobacillus brevis strain 3043 | 97.53% |
| 短乳桿菌L846比對之短乳桿菌亞種 | 相似度 |
| Lactobacillus brevis strain KLDS 1.0726 | 98.55% |
| Lactobacillus brevis strain 1976 | 98.55% |
| Lactobacillus brevis strain 2654 | 98.55% |
| Lactobacillus brevis strain 2644 | 98.55% |
| Lactobacillus brevis strain 2641 | 98.55% |
| Lactobacillus brevis strain 2095 | 98.55% |
短乳桿菌的代謝產物的製備方法：首先，以前述活化程序將短乳桿菌TCI988、短乳桿菌L816及短乳桿菌L846分別活化後，各別取10體積%的各組活化後的菌液接種於液態乳桿菌MRS培養基中，並於37℃厭氧環境下進行培養16小時。接著，將各組菌液以轉速5000rpm離心15分鐘以分離短乳桿菌的菌體及含有短乳桿菌的代謝產物的各組上清液。
GABA含量檢測方法：將各組上清液委託檢測單位（檢測公司：歐陸食品檢驗股份有限公司行檢測）進行GABA含量的檢測。
GABA含量檢測結果：
短乳桿菌TCI988中含有0.199%的GABA。
短乳桿菌L816中含有0.177%的GABA。
短乳桿菌L846中含有0.014%的GABA。
由此可知，短乳桿菌TCI988所分泌的GABA量顯著高於短乳桿菌L816及短乳桿菌L846。
例
5
：神經細胞
粒線體活性測試
於此，所使用培養基為添加有10體積%胎牛血清蛋白（fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco）及1體積%盤尼西林-鏈黴素（penicillin/streptomycin，品牌：Gibco）的DMEM培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco），以下稱細胞培養基。所使用的粒線體活性測試方法為利用粒線體膜電位偵測套組（BDTM MitoScreen (JC-1) kit，型號551302）測定粒線體的膜電位，並進行粒線體活性分析。其中，粒線體膜電位偵測套組具有JC-1染料（凍乾）及10X分析緩衝液。於使用前，以1X PBS將10X分析緩衝液稀釋10倍，以形成1X分析緩衝液。加入130 μL DMSO至JC-1染劑（凍乾）中，以形成JC-1儲備溶液。然後，再以1X分析緩衝液稀釋JC-1儲備溶液，以形成JC-1工作試劑（JC-1 working solution；即JC-1粒線體特異性染劑）。JC-1儲備溶液與1X分析緩衝液的稀釋倍率為1:100。
首先，取1x105
個小鼠神經母細胞瘤細胞（ATCC CCL-131；以下稱Neuro2a細胞）至每孔含有2毫升細胞培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。
待各孔的Neuro2a細胞分別貼附於六孔細胞培養盤底部後，將Neuro2a細胞分為實驗組及控制組。接著，將各組的細胞培養基更換為實驗培養基，然後置於37℃下接續培養24小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.25體積%例4所製備的短乳桿菌TCI988的代謝產物的細胞培養基。控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含例4所製備的短乳桿菌TCI988的代謝產物）。
接著，移除各組實驗培養基後，以1 mL的1X DPBS溶液潤洗2次各組Neuro2a細胞。然後，將200 μL胰蛋白酶加至每孔中反應5分鐘。反應後，於各孔中添加6 mL細胞培養基以終止反應。將各孔中之Neuro2a細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5 mL微量離心管內，並將含有Neuro2a細胞與細胞培養基之微量離心管以400 xg離心5分鐘。於離心後移除各組微量離心管中的上清液，再以1X DPBS溶液重新回溶Neuro2a細胞的沉澱物，並以400 xg離心5分鐘。再次於離心後移除各組微量離心管中的上清液，並加入100 μL的JC-1工作試劑至各微量離心管，使Neuro2a細胞的沉澱物與JC-1工作試劑均勻混合後壁光靜置15分鐘。於靜置15分鐘後將含有Neuro2a細胞與JC-1工作試劑之微量離心管以400 xg離心5分鐘。接著，去除各組微量離心管中的上清液，並加入1X分析緩衝液回溶Neuro2a細胞的沉澱物，再以400 xg離心5分鐘，並重複二次。去除各組微量離心管中的上清液，以含有2體積%胎牛血清蛋白的1X DPBS溶液重新懸浮Neuro2a細胞的沉澱物，以得到待測細胞液。
以流式細胞儀量測各組的待檢測細液中細胞粒線體的膜電位，以進行粒線體活性分析。其中流式細胞儀設定的激發光的波長為488 nm、散射光的波長為527nm及590nm。並將控制組量測到具有高膜電位之細胞的數值視為100%，如圖3所示。在圖3中，「***」代表在與控制組比較下其p值小於0.001。
請參閱圖3。以控制組作為100%的參照基準，實驗組經短乳桿菌TCI988的代謝產物處理後，其具有高膜電位之細胞的相對數值為133.4%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的Neuro2a細胞的粒線體活性有顯著提升（約1.33倍）。顯示短乳桿菌TCI988的代謝產物可提升神經細胞之粒線體活性，而達到維持神經細胞的健康之效果。
基此，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物能用以達成保健神經的功能。
例
6
：褪黑激素合成相關基因測試
於此，於此，褪黑激素合成相關基因為SIRT1基因（Gene ID：23411）、TPH1基因（Gene ID：7166）、DDC基因（Gene ID：1644）。
於此，所使用的細胞培養基為添加有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，編號10437-028）、1%抗生素-抗黴菌素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，Cat.15240-062）的DMEM培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Gibco公司，編號11965-092）。
首先，取1x106
個人類神經母細胞瘤細胞（ATCC® CRL-2266™；以下稱SHSY-5Y細胞）至每孔含有2毫升細胞培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。
將SHSY-5Y細胞分為實驗組及控制組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔0.1mL實驗培養基，然後置於37℃下分別接續培養24小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.25%的例4所製備的短乳桿菌TCI988的代謝產物的細胞培養基。控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含例4所製備的短乳桿菌TCI988的代謝產物）。
收集各組的SHSY-5Y細胞，並以RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）萃取出各組的RNA。接著，各組取1000奈克（ng）的RNA作為模板，透過SuperScript®
III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM
即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM
Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表3的引子（SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:9）對各組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察SHSY-5Y細胞內SIRT1基因、TPH1基因及DDC基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，接著95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量，如圖4所示。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量基因的mRNA表現量，進而推斷基因編碼的蛋白質的表現量。
需要特別說明的是，圖4中的基因表現是以相對表現倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖4中，「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05。
表3
| 目標基因 | 引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
| SIRT1 | SIRT1-F | SEQ ID NO:4 | TAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGA |
| SIRT1-R | SEQ ID NO:5 | CTCAGCGCCATGGAAAATGT | |
| TPH1 | TPH1-F | SEQ ID NO:6 | AAATATTGTGGATATCGGGAGGATAA |
| TPH1-R | SEQ ID NO:7 | AGGACGGATGGAAAAACCTGTA | |
| DDC | DDC-F | SEQ ID NO:8 | ACCACAACATGCTGCTCCTTT |
| DDC-R | SEQ ID NO:9 | ATCAACGTGCAGCCATATGTCT |
於表3中，F為順向引子（Forward primer），而R為反向引子（Reverse primer）。
請參閱圖4。將控制組的各組SIRT1基因、TPH1基因及DDC基因的相對表現量視為1.00（即控制組的各組基因的表現量為100%）。相較於控制組，實驗組的組SIRT1基因的相對表現量為1.30，實驗組的組TPH1基因的相對表現量為1.23，以及實驗組的組DDC基因的相對表現量為1.05。由此可知，實驗組的SIRT1基因、TPH1基因及DDC基因的表現量顯著的提升，代表短乳桿菌TCI988的代謝產物能有效地提高SIRT1基因、TPH1基因及DDC基因的表現量。
基此，當受體服用短乳桿菌TCI988的代謝產物或/及短乳桿菌TCI988時，能提高TPH1基因及DDC基因的表現量，進而促進血清素及褪黑激素生成，以改善受體的睡眠品質。當受體服用短乳桿菌TCI988的代謝產物或/及短乳桿菌TCI988時，能提高SIRT1基因的表現量，進而改善憂鬱症並具有抗憂鬱的功效。
例
7
：脂肪累積實驗
於此，所使用的細胞培養基為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之最低必需培養基α（Minimum Essential Medium Alpha，MEMα，品牌：Gibco)。並且，將油-紅O染色試劑（品牌：Sigma）徹底溶解於100%異丙醇（isopropanol，供應商：ECHO）以配製3mg/mL之油-紅O染色試劑的儲備溶液。為獲得可供使用的油-紅O工作溶液（oil-red O working solution），於使用前即時將油-紅O染色試劑的儲備溶液以二次水（ddH2
O）稀釋至濃度1.8mg/mL，即為60%油-紅O染色試劑的儲備溶液。
首先，以每孔8×104
個細胞的細胞數，將小鼠骨髓基質細胞株OP9（購自BCRC，編號6566）接種於含有500μL細胞培養基的24孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL細胞培養基。於培養7天後，使用顯微鏡（廠牌：ZEISS）觀察各孔中的細胞內的油滴（lipid droplet）形成以確認細胞完全分化成脂肪細胞，供後續實驗使用。
將脂肪細胞分成2個組別：實驗組及控制組。移除各組別的細胞培養基，並更換成每孔500μL實驗培養基，然後置於37°C下接續培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL實驗培養基。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.0156vol%例4所製備的短乳桿菌TCI988的代謝產物的細胞培養基。控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含例4所製備的短乳桿菌TCI988的代謝產物）。
接著，移除各孔中的實驗培養基並以1xDPBS潤洗二次。繼而，於各孔內添加1mL的10%甲醛（formaldehyde，供應商：ECHO）並於室溫下培養30分鐘，藉以固定細胞。之後，移除各孔內的甲醛並以1X DPBS對各孔潤洗二次。於再次潤洗後，添加1mL的60%異丙醇至每孔中並作用1分鐘。接著，移除異丙醇，再添加1mL油-紅O工作溶液並於室溫下作用1小時。
於作用1小時候，移除油-紅O工作溶液並以1mL的60%異丙醇快速退染5秒。接著，加入100%異丙醇至各孔中，並置於振盪器（shaker）上反應10分鐘以溶解染劑。然後，從各孔中取100μL前述之染劑-異丙醇溶液至96孔培養盤並於510nm的波長下以ELISA讀取儀（廠牌：BioTek）讀取各孔的吸光值（OD510
）。
於量測後，藉由所測得的吸光值計算出脂肪細胞內的郵遞數量，並進而推算脂肪累積量（%）。換言之，於此，是將控制組的脂肪累積量視為1（即控制組的脂肪累積量為100%）來計算各組別的脂肪累積量（%）。並且，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖5所示。在圖5中，「***」代表在與控制組比較下其p值小於0.001。
請參閱圖5。控制組的脂肪累積量為100%，而實驗組的脂肪累積量為92.5%。於此，相較於控制組，實驗組的脂肪細胞內的油滴數量明顯減少。由此可知，短乳桿菌TCI988的代謝產物能有效地抑制脂肪累積，具有減少受體的脂肪形成的功能。
基此，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物能用以減少受體的脂肪累積，進而達成減脂之效果。
例
8
：脂肪分解實驗
於此，將脂肪細胞中甘油（Glycerol）的含量作為量化指標，以觀察是否有產生脂肪分解作用。
於此，所使用的細胞培養基為添加有20%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，編號10438-026）、1%的抗生素-抗黴菌素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，編號15240-062）的α-最低限度必需培養基（α-Minimum essential medium，簡稱α-MEM）（Gibco公司，編號12000-022）。
首先，取8×104
個小鼠骨髓基質細胞OP9（購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC®
），編號ATCC CRL-2749；以下稱OP9細胞）至每孔含有500μL細胞培養基的24孔培養盤中，於37℃下培養7天。於7天的細胞培養期間中，每隔3天更換細胞培養基。並於培養7天後，以顯微鏡（ZEISS；放大倍率400x）觀察OP9細胞內的油滴形成，藉以確認OP9細胞已完全分化為脂肪細胞，供後續實驗使用。
然後，將分化完成的脂肪細胞分為實驗組、控制組及空白組。移除各組別的細胞培養基，並更換成每孔500μL實驗培養基，然後置於37°C下接續培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL實驗培養基。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.03125vol%之例4所製備的短乳桿菌TCI988的代謝產物的細胞培養基。控制組的實驗培養基為單純的分化培養基（即不含例4所製備的短乳桿菌TCI988的代謝產物）。
接著，以細胞甘油基檢測試劑套組（Glycerol cell-based assay kit，購自Cayman，美國，產品編號10011725）依據下列步驟測量甘油含量。收集各組的實驗培養基（即已培養過脂肪細胞的實驗培養基，但不包括脂肪細胞），並各取其中的25μL轉移到新的96孔培養盤中，並於各孔中加入100μL之重構游離甘油測定試劑（Reconstituted free glycerol assay reagent），再於室溫下作用15分鐘後，將96孔培養盤以ELISA讀數器讀取各組之OD540nm
的吸光度，以量化各組脂肪細胞分解並釋放至實驗培養基中的甘油量。
請參閱圖6。於此，將控制組的甘油量釋放量視為100%。實驗組的甘油量釋放為158.1%。於此，相較於控制組，實驗組的脂肪細胞內的脂肪細胞分解成甘油並釋放出的含量明顯提升。由此可知，短乳桿菌TCI988的代謝產物能有效地促進脂肪分解。
基此，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有促進脂肪分解，並提升受體的脂肪代謝的功能，進而達成減脂之功能。
綜上所述，根據本發明任一實施例的短乳桿菌TCI988，其可生成GABA。並且，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物可用於製備以下至少一項組合物：神經保健的組合物、助眠及抗憂鬱的組合物及減脂的組合物。前述之組合物具有下列一種或多種功能：促進受體的神經細胞的粒線體活性、提升受體的褪黑激素合成相關基因（如SIRT1基因、TPH1基因、DDC基因或其組合）、降低脂肪累積及促進脂肪分解。藉此，短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物可用於舒眠紓壓，並用以改善壓力型肥胖。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是短乳桿菌TCI988於胃腸模擬環境中的存活率的實驗結果圖；
圖2是短乳桿菌TCI988所分泌的γ-胺基丁酸（GABA）濃度的檢測實驗結果圖；
圖3是粒線體活性測試的實驗結果圖；
圖4是褪黑激素合成相關基因的表現量的實驗結果圖；
圖5是脂肪累積實驗的實驗結果圖；
圖6是脂肪分解實驗的實驗結果圖。
財團法人食品工業發展研究所 （台灣）；民國109年3月12日；寄存編號：BCRC 910975。
Claims (10)
- 一種短乳桿菌TCI988，其中短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis TCI988）寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910975。
- 如請求項1所述之短乳桿菌TCI988，其中該短乳桿菌TCI988具有生成γ-胺基丁酸（γ-Aminobutyric acid, GABA）之能力。
- 一種短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物用以製備神經保健的組合物之用途，其中短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis TCI988）寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910975。
- 如請求項3所述之用途，其中該短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有促進受體的神經細胞的粒線體活性之能力。
- 一種短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物用以製備助眠及抗憂鬱的組合物之用途，其中短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis TCI988）寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910975。
- 如請求項5所述之用途，其中該短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有提升一受體的褪黑激素合成相關基因的能力。
- 如請求項6所述之用途，其中該褪黑激素合成相關基因為SIRT1基因、TPH1基因、DDC基因或其組合。
- 一種短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物用以製備減脂的組合物之用途，其中短乳桿菌TCI988（Lactobacillus brevis TCI988）寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910975。
- 如請求項8所述之用途，其中該短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有降低脂肪累積的能力。
- 如請求項8所述之用途，其中該短乳桿菌TCI988及/或其代謝產物具有促進脂肪分解的能力。
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| 期刊 Yakovlieva et al. "Influence of Lactobacillus brevis 15 and Lactobacillus plantarum 13 on blood glucose and body weight in rats after high-fructose diet", Beneficial microbes, Vol. 6, Issue 4, Apr 22 2015, pages 505-512. |
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