TW202128205A - 植物發酵汁液用於製備提升新陳代謝組合物的用途 - Google Patents
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Abstract
一種植物發酵汁液用於製備提升新陳代謝的組合物之用途。其中，植物發酵汁液是由黃精（Polygonatum kingianum
）、芡實（Euryale ferox
）及枸杞（Lycium chinense
）的水浸提液經酵母菌及乳酸桿菌初發酵後，再以醋酸菌次發酵而製得。
Description
本發明關於一種發酵液，特別是關於一種黃精、芡實及枸杞發酵液用於製備提升新陳代謝組合物的用途。
基於消費者對於人工化合物或添加物的疑慮日益增加，故而有機及天然的飲食概念更為受到歡迎。生技公司及食品業者積極投入關於天然產物的相關產品之研發。
在各項對身體健康有助益的科學驗證基礎上，針對不同植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。產品開發的主要方向是藉由天然植物改善或提升身體機能，如減重、美白、腸胃保健、生酮飲食等。
其中，新陳代謝過低、身體慢性發炎、水腫更是現代人常見的健康危害，而新陳代謝過低則可能進一步導致腎臟方面的疾病、脂肪肝、動脈硬化/或心肌無力等多種病變。
在一些實施例中，植物發酵汁液用於製備提升新陳代謝的組合物之用途。其中，植物發酵汁液是由黃精（Polygonatum kingianum
）、芡實（Euryale ferox
）及枸杞（Lycium chinense
）的水浸提液經酵母菌及乳酸桿菌初發酵後，再以醋酸菌次發酵而製得。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以提升粒線體活性相關基因表現量。在一些實施例中，粒線體活性相關基因包括為CCT5基因、SIRT1基因及FOXO基因其中至少一種。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以降低抗發炎反應相關基因表現量。在一些實施例中，抗發炎反應相關基因為IL-1β基因、IL-8基因、IL-6基因、IL-18基因及TNF-α基因其中至少一種。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以增加水分代謝量。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以增加排尿量。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以減少水腫。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以改善手腳冰冷。
在一些實施例中，植物發酵汁液的有效用量為7mL/day。
綜上所述，根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以提升細胞內粒線體活性，藉由提升細胞活性達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以降低體內發炎反應，藉由維持細胞正常機能達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以增加排尿量，藉由提升體內水分代謝達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以提升體內水分代謝而減少水腫，維持身體循環達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其提升肢體末稍溫度，達到改善手腳冰冷的用途。並且，根據任一實施例的植物發酵汁液，在每日服用植物發酵汁液7mL的情況下即能有效達到提升新陳代謝的用途。
在一些實施例中，植物發酵汁液是由黃精（Polygonatum kingianum
）、芡實（Euryale ferox
）及枸杞（Lycium chinense
）的水浸提液經酵母菌及乳酸桿菌初發酵後，再以醋酸菌次發酵而製得。在一些實施例中，水浸提液是由黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水所製得。在一些實施例中，水浸提液是由黃精原料、芡實原料、枸杞原料、水及葡萄糖所製得。
在一些實施例中，黃精（Polygonatum kingianum
）植株是百合科（Liliaceae
）黃精屬（Polygonatum
）的落葉灌木。在一些實施例中，黃精原料為黃精植株的根莖部位。在一些實施例中，黃精原料為黃精乾燥根莖。舉例而言，黃精原料可以為市售。
在一些實施例中，芡實（Euryale ferox
）植株是睡蓮科（Nymphaeaceae
）芡屬（Euryale
）的水生植物，別名雞頭蓮。在一些實施例中，芡實原料是指芡實果實，別名芡米或雞頭米。在一些實施例中，芡實原料是指芡實種仁。在一些實施例中，芡實種仁是將芡實果實除去果皮，取出種仁，再將種仁除去硬殼後曬乾而製得。在一些實施例中，芡實原料是指芡實種仁經熱炒製而得。舉例而言，芡實原料可以為市售的芡實種仁。
在一些實施例中，枸杞（Lycium chinense
）植株是茄科（Solanaceae
）枸杞屬（Lycium
）的落葉灌木，其果實為常稱的枸杞或枸杞子，其嫩葉稱枸杞頭，其根皮稱為地骨皮。在一些實施例中，枸杞原料為枸杞果實。在一些實施例中，枸杞原料為枸杞乾燥果實。舉例而言，枸杞原料可以為市售的枸杞乾燥果實。
在一些實施例中，水浸提液是由重量比2：2：0.5~1.5：38~40的黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水所製得。在一些實施例中，水浸提液是由重量比2：2：1：40的黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水所製得。在一些實施例中，水浸提液是將黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水依據2：1：80的比例混合後進行持續60分鐘到70分鐘的高溫浸提（如，90±5℃）所製得。在一些實施例中，水浸提液是將黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水依據2：2：1：40的比例混合後進行持續60分鐘的高溫浸提（如，95℃）所製得。在一些實施例中，水浸提液的白利糖度（Brix°）大於或等於9。
在一些實施例中，水浸提液是由黃精原料、芡實原料、枸杞原料、水及葡萄糖所製得。其中，山黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水的重量比為2：2：1：40，而葡萄糖的含量為相對於黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水的總重的11%（V/V）。在一些實施例中，水浸提液是將黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水依據2：2：1：40的比例混合後，再加入11%的葡萄糖，然後進行持續1小時的高溫浸提（如，95℃）所製得。在一些實施例中，水浸提液是將黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水依據2：2：1：40的比例混合後，再加入添加葡萄糖，使其白利糖度（Brix°）大於或等於9的葡萄糖的量。意即，在添加葡萄糖的過程中同步量測溶液的白利糖度，並且於其糖度達到9或超過9時，則停止添加葡萄糖。
在一些實施例中，水浸提液不另濾除其內部的固形物（即黃精原料/或芡實原料/或枸杞原料）直接加入菌種進行發酵，以利用菌種進一步提取固形物中的活性成分，進而得到植物發酵汁液。
在一些實施例中，於高溫浸提後，將水浸提液降溫以供後續發酵程序使用。在一些實施例中，於高溫浸提後，將水浸提液降溫到小於40℃以供後續發酵程序使用。在一些實施例中，於高溫浸提後，將水浸提液降溫到35℃±2以供後續發酵程序使用。
在一些實施例中，水浸提液接種菌株之後進行發酵程序以製得植物發酵汁液，並且發酵程序分為初發酵程序及次發酵程序。首先，初發酵程序是在水浸提液內加入0.05wt%~0.15wt%的酵母菌以及0.025%~0.01wt%的乳酸菌並且於室溫下靜置發酵2天~5天以形成初發酵液。在一些實施例中，初發酵程序是在水浸提液內加入0.1wt%的酵母菌以及0.05wt%的乳酸菌並且於25℃到28℃下靜置發酵3天以形成初發酵液。
在一些實施例中，酵母菌可以是啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae
）。舉例來說，乳酸菌可為寄存於食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（BCRC）且寄存編號BCRC 20271菌株啤酒酵母菌（且國際寄存編號ATCC26602）或其他市售啤酒酵母。
在一些實施例中，乳酸菌可以是胚芽乳酸菌（Lactobacillus plantarum
）。舉例來說，乳酸菌可為寄存於食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心且寄存編號BCRC 910805菌株的TCI028菌株，並且此菌株亦寄存於德國國家菌種保藏中心（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ）且其國際寄存編號為DSM33108。
接著，將初發酵程序中所製得的初發酵液進行次發酵程序。在一些實施例中，次發酵程序是在初發酵液內加入5wt%的醋酸菌靜置並檢測其白利糖度小於4，且其酸鹼值（pH值）為3.8±0.5時即完成發酵，形成植物發酵原液。在一些實施例中，次發酵程序是在初發酵液內加入5wt%的醋酸菌室溫下靜置發酵3天到6天以形成植物發酵原液。在一些實施例中，次發酵程序是在初發酵液內加入5wt%的醋酸菌於25℃到28℃下靜置發酵4天以形成植物發酵原液。在一些實施例中，採用寄存編號BCRC11688(國際寄存ATCC15973)菌株的醋酸菌。
在一些實施例中，發酵程序所得的植物發酵原液即為植物發酵汁液。在另一些實施例中，發酵程序之後所得的植物發酵原液可以再進行下列至少一再處理程序：過濾程序、減壓濃縮程序、調味程序、填充程序及滅菌程序，以形成植物發酵汁液。於此，過濾程序、減壓濃縮程序、調味程序、填充程序或滅菌程序係用以延長植物發酵汁液的保存期限、口感並且避免變質。
在一些實施例中，過濾程序是將植物發酵原液以400目數（mesh）的網孔的濾網過濾以形成植物發酵汁液。於此，藉由適當目數的濾網將固形物去除。
在一些實施例中，減壓濃縮程序是將植物發酵原液在55℃到65℃下減壓濃縮以形成植物發酵汁液。舉例來說，減壓濃縮的溫度設定值為60℃。在一些實施例中，減壓濃縮的壓力設定值為150巴（Bar）。於此，透過減壓濃縮能去除植物發酵汁液內酒精成分，並且減少植物發酵汁液的存放體積。
在一些實施例中，調味程序是將植物發酵原液添加寡糖以形成植物發酵汁液。於此，寡糖係指由3~10個單醣分子聚合而成的低聚糖。在一些實施例中，寡糖可為果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、異麥芽寡糖等等。在一實施例中，添加相對於植物發酵原液40%~70%的寡糖。在一實施例中，添加相對於植物發酵原液60%的寡糖。在一實施例中，添加寡糖使植物發酵原液的白利糖度（Brix°）達到42±2時，則停止添加寡糖以製得植物發酵汁液。於此，添加寡糖是為調整植物發酵汁液的滲透壓，使植物發酵汁液內的水活性下降而避免其他微生物的滋長而影響植物發酵汁液的品質。
在一些實施例中，填充程序是將植物發酵汁液/或植物發酵原液分裝於適當尺寸的保存容器。在一些實施例中，填充程序是將植物發酵汁液/或植物發酵原液分裝於7mL的保存容器。
在一些實施例中，滅菌程序是將植物發酵汁液/或植物發酵原液加熱到95℃±5至少60分鐘。在一些實施例中，滅菌程序是將植物發酵汁液/或植物發酵原液加熱到100℃持續70分鐘。
在一些實施例中，植物發酵汁液/或植物發酵原液的總多酚含量達62ppm。多酚具有抗氧化功能，藉以幫助提升人體新陳代謝。
在一些實施例中，植物發酵汁液用於提升粒線體活性相關基因表現量。學界普遍認為粒線體活性愈高，則細胞生理年齡愈低。意即，粒線體活性相關基因表現量愈高，則代表身體機能愈高，其新陳代謝能力愈強。故亦有將粒線體活性相關基因稱為抗老基因，粒線體活性高亦可以輔助細胞達到調節電解質(如鈉、鉀、鈣)平衡的功能。
在一些實施例中，粒線體活性相關基因包括為CCT5基因（GeneID: 22948）、SIRT1基因（GeneID: 23411）及FOXO基因（GeneID: 2308）其中至少一種。其中，CCT5基因表現量提升表示細胞回復年輕狀態，SIRT1基因用以協助粒線體修護受損DNA以延緩老化的發生，FOXO基因恢復粒線體活性以使細胞保持青春狀態。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以降低抗發炎反應相關基因表現量。在一些實施例中，抗發炎反應相關基因為IL-1β基因（GeneID: 3553）、IL-8基因（GeneID: 3576）、IL-6基因（GeneID: 3569）、IL-18基因（GeneID: 3606）及TNF-α基因（GeneID: 7124）其中至少一種。
其中，IL-1β基因是一種抗發炎反應的細胞激素，可以活化血管內皮細胞、淋巴細胞，破壞局部組織使免疫細胞更容易進入。
其中，IL-8基因的表現會使中性白血球、巨噬細胞、嗜鹼性白血球及T細胞進行趨化作用，並且向發炎處移動。
其中，IL-6基因過度表現會引起發炎反應並刺激肝細胞製造急性期蛋白。
其中，IL-18基因可以誘使T細胞生產的干擾素-γ（IFNγ）。
其中，TNF-α基因（腫瘤壞死因子-α）具有調節免疫細胞的功能，更涉及到系統性炎症的細胞因子，同時也是屬於引起急相反應的眾多細胞因子中的一員。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以增加水分代謝量。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以增加排尿量。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以減少水腫。
在一些實施例中，植物發酵汁液用以改善手腳冰冷。
在一些實施例中，植物發酵汁液的有效用量為7mL/day。
綜上所述，根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以提升細胞內粒線體活性，藉由提升細胞活性達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以降低體內發炎反應，藉由維持細胞正常機能達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以增加排尿量，藉由提升體內水分代謝達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以提升體內水分代謝而減少水腫，維持身體循環達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其提升肢體末稍溫度，達到改善手腳冰冷的用途。並且，根據任一實施例的植物發酵汁液，在每日服用植物發酵汁液7mL的情況下即能有效達到提升新陳代謝的用途。於此，在一些實施例中，植物發酵汁液能用於製備提升新陳代謝的組合物。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的植物發酵汁液。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、或含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用產品（即食品組合物）。換言之，食用產品包含特定含量的植物發酵汁液。在一些實施例中，食用產品可為一般食品、保健食品、膳食補充品或食品添加物（food additive）。
在一些實施例中，前述之食用產品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）或調味料。
在一些實施例中，能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的植物發酵汁液（即作為食品添加物），或是於食品的製作過程中添加任一實施例的植物發酵汁液（即作為食品添加物），而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品。
例
1
：
植物發酵汁液的製備
首先，準備重量比為2：2：1：40的黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水。其中，黃精原料使用採購自新世紀漢方生技股份有限公司的乾燥黃精根莖，芡實原料使用採購自新世紀漢方生技股份有限公司的芡實炒製種仁，枸杞原料使用採購自新世紀漢方生技股份有限公司的乾燥枸杞果實。
接著，將黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水混合並加入相對於黃精原料、芡實原料、枸杞原料及水總重的11%的葡萄糖，以形成植物基液。於此，植物基液的白利糖度大於9。
將植物基液加熱至95℃，並於加熱環境達到95℃後持續加熱60分鐘，以得到水浸提液。並且，待水浸提液的溫度降溫至小於40℃後，即可作為後續發酵程序的培養液使用。
於培養液中加入0.1wt%的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以及0.05wt%的胚芽乳酸菌（Lactobacillus plantarum），並靜置培養三天以形成初發酵液。於此，啤酒酵母是採用寄存編號BCRC 20271的啤酒酵母，胚芽乳酸菌採用寄存編號BCRC 910805的TCI028菌株。
接著，在初發酵液內加入5wt%的醋酸菌靜置發酵四天以形成植物發酵原液。於此，醋酸菌是採用寄存編號BCRC11688的醋酸菌。植物發酵原液的白利糖度小於4，且其酸鹼值（pH值）為4.5±0.5。
將植物發酵原液以孔徑400目數的篩網進行過濾，將過濾後的植物發酵原液於60℃下及150巴下進行減壓濃縮程序，添加相對於植物發酵原液60%的異麥芽寡糖後以得到植物發酵汁液。
例
2
：總多酚含量測試
2.1. 測試流程
分別以前述例1所得的水浸提液為對照組樣本及植物發酵原液為實驗組樣本。將各樣本以水稀釋後取100μL到離心管中。接著，加入500μL之Folin-Ciocalteu酚試劑（Folin-Ciocalteu's phenol reagent, Merck 1.09001.0100）至離心管中與稀釋後的樣本混合並靜置3分鐘，然後再加入400μL之7.5%（W/V）碳酸鈉（Sigma 31432）混勻靜置30分鐘，以得到待測反應溶液。於確認待測反應溶液中無氣泡存在後，取200μL之待測反應溶液至96孔盤中，並測量待測反應溶液於750nm下之吸光度。以上各樣品進行三重複試驗並取其四捨五入後的平均值。
並且，以沒食子酸（Gallic acid）作為標準品製作標準曲線。於此，以沒食子酸（粉末，Sigma G7384）與純水配置0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、及100μL/mL之沒食子酸的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至10mL離心管中。加入500μL之Folin-Ciocalteu酚試劑至離心管內與標準溶液混合並靜置3分鐘，然後再加入400μL之7.5%碳酸鈉混合並靜置30分鐘，以得到標準反應溶液。取200μL之標準反應溶液至96孔盤中，並測量其在750nm下之吸光度。然後，以沒食子酸的濃度與其對應的吸光值繪製標準曲線。
接著，利用標準曲線將待測反應溶液的吸光值以內差法換算成濃度後，在回乘稀釋倍率，以得到各樣品的總多酚含量。
2.2. 測試結果
於此，可得到水浸提液的總多酚含量僅有6ppm及植物發酵汁液的總多酚含量為62ppm，如圖1所示。
由實驗結果可知，植物發酵汁液的總多酚含量較水浸提液的總多酚含量提升近10倍。基此，可知藉由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌的發酵能更有利於有效成分的提取。
例
3
：細胞粒線體活性測試
粒線體（mitochondrion）是細胞內的一種胞器，其主要合成三磷酸腺苷（ATP）以為細胞能量的來源，當細胞內粒線體充足時通常代表細胞較為年輕有彈性，並且代表細胞的代謝率高。再，由於血管遍佈全身，單核球細胞產生於骨髓並散佈於血管內，亦可隨需求進入其他身體細胞內，因此以單核球細胞做為實驗細胞株進行相關基因表現量的試驗，以延伸提升基礎代謝之效。
3.1 材料、儀器及溶液配置
實驗細胞：人類單核球細胞THP-1（後續簡稱單核球細胞，採購向ATCC公司，寄存編號為TBI202）。
培養基：RPMI1640培養基（品牌Gibco型號RPMI medium 1640，採購自Thermo Fisher Scientific，編號31800-022)並添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，品牌Gibco編號10438-026)及1%抗生素-抗黴菌素(Antibiotic-Antimycotic，品牌Gibco編號15240-062）。
試劑：RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）、KAPA SYBR®
FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)。
反轉錄酶：採用SuperScript®
III Reverse Transcriptase品牌Invitrogen公司，美國，編號18080-051。
檢測儀器：ABI StepOnePlusTM
即時PCR系統（Real-Time PCR system，購自Thermo Fisher Scientific公司，美國）。
3.2. 測試流程
在六孔板中各孔分別加入2mL上述培養基並接種1x106
的單核球細胞隔夜培養。
將隔夜培養的細胞分為二組（控制組及實驗組）。其中，控制組不添加任何測試樣本。實驗組添加的測試樣本為例1的所製得的植物發酵原液。於此，實驗組的培養基內的測試樣本濃度為1.0%(v/v)。
將控制組及實驗組在37℃下培養24小時。於24小時後，以400xg離心5分鐘，去除上清液後以1Xdpbs緩衝沖洗後並以400xg離心5分鐘，再次移除上清液，加入600µL的RB緩衝液將細胞裂解。
接著，使用RNA萃取試劑套組分別收集二組細胞溶液內之RNA。接著，每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由反轉錄酶以表一中之引子黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。後續利用即時PCR系統，以及qPCR試劑組將二組反轉錄後產物分別以表一之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應 （quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction） 以觀察實驗組和控制組的單核球細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應1秒，60°C反應20秒，總共40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量各基因的mRNA表現量，進而推斷各基因編碼的蛋白質的表現量。
表一
| 基因 | SEQ ID NO. | 引子名稱 | 序列（5’→3’） | 引子 長度 |
| CCT5 | 1 | CCT5-F | ATAAATGTGAGGCTGAATC | 19 |
| 2 | CCT5-R | ACTTGTCACTTGTGGCAC | 18 | |
| SIRT1 | 3 | SIRT1-F | TGCTGGCCTAATAGAGTGGCA | 21 |
| 4 | SIRT1-R | CTCAGCGCCATGGAAAATGT | 20 | |
| FOXO | 5 | FOXO-F | CGGACAAACGGCTCACTCT | 19 |
| 6 | FOXO-R | GGACCCGCATGAATCGACTAT | 21 |
並且，圖2中顯示的各基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
3.3. 測試結果
請參閱圖2。將控制組的CCT5基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組相對於控制組的CCT5基因的表現量為1.65（即120%），代表實驗組的CCT5基因的表現量為控制組的1.65倍。
將控制組的SIRT1基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組相對於控制組的SIRT1基因的表現量為1.32（即130%），代表實驗組的SIRT1基因的表現量為控制組的1.32倍。
將控制組的FOXO基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組相對於控制組的FOXO基因的表現量為1.21（即150%），代表實驗組的FOXO基因的表現量為控制組的1.21倍。
由圖2可見，單核球細胞經過黃精、芡實及枸杞所製得的植物發酵汁液處理過後，可以有效達到提升粒線體活性，進而提升新陳代謝的功效。
例
4
：細胞抗發炎測試
醫學界已逐漸有共識認為慢性發炎是新陳代謝症候群的原因之一。單核球細胞產生於骨髓並散佈於血管內，在發炎情況下會作出對應的全身性免疫反應，因此以單核球細胞做為實驗細胞株進行相關抗發炎基因表現量的試驗，體現出在降低發炎相關基因的表現下係指身體處於正常狀態，延伸可提升新陳代謝效率之效。
4.1 材料、儀器及溶液配置
實驗細胞：人類單核球細胞THP-1（後續簡稱單核球細胞，採購向ATCC公司，寄存編號為TBI202）。
培養基：RPMI1640培養基（品牌Gibco型號RPMI medium 1640，採購自Thermo Fisher Scientific，編號31800-022)並添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，品牌Gibco編號10438-026)及1%抗生素-抗黴菌素(Antibiotic-Antimycotic，品牌Gibco編號15240-062）。
試劑：RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）、KAPA SYBR®
FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)。
反轉錄酶：採用SuperScript®
III Reverse Transcriptase品牌Invitrogen公司，美國，編號18080-051。
檢測儀器：ABI StepOnePlusTM
即時PCR系統（Real-Time PCR system，購自Thermo Fisher Scientific公司，美國）。
4.2. 測試流程
在六孔板中各孔分別加入2mL上述培養基並接種1x106
的單核球細胞隔夜培養。
將隔夜培養的細胞分為二組（控制組及實驗組）。其中，控制組不添加任何測試樣本。實驗組添加的測試樣本為例1的所製得的植物發酵原液。於此，實驗組的培養基內的測試樣本濃度為1.0%(v/v)。
將控制組及實驗組在37℃下培養24小時。於24小時後，以400xg離心5分鐘，去除上清液後以1Xdpbs緩衝沖洗後並以400xg離心5分鐘，再次移除上清液，加入600µL的RB緩衝液將細胞裂解。
接著，使用RNA萃取試劑套組分別收集二組細胞溶液內之RNA。接著，每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由反轉錄酶以表二中之引子黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。後續利用即時PCR系統，以及qPCR試劑組將二組反轉錄後產物分別以表二之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應 （quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction） 以觀察實驗組和控制組的單核球細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應1秒，60°C反應20秒，總共40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量各基因的mRNA表現量，進而推斷各基因編碼的蛋白質的表現量。
表二
| 基因 | SEQ ID NO. | 引子名稱 | 序列（5’→3’） | 引子 長度 |
| IL-1β | 7 | IL-1β-F | AGCTACGAATCTCCGACCAC | 20 |
| 8 | IL-1β-R | CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA | 22 | |
| IL-8 | 9 | IL-8-F | TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA | 22 |
| 10 | IL-8-R | AACCCTCTGCACCCAGTTTTC | 21 | |
| IL-6 | 11 | IL-6-F | ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG | 23 |
| 12 | IL-6-R | CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG | 23 | |
| IL-18 | 13 | IL-18-F | TCTTCATTGACCAAGGAAATCGG | 23 |
| 14 | IL-18-R | TCCGGGGTGCATTATCTCTAC | 21 | |
| TNF-α | 15 | TNF-α-F | GAGGCCAAGCCCTGGTATG | 19 |
| 16 | TNF-α-R | CGGGCCGATTGATCTCAGC |
並且，圖3中顯示的各基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
4.3. 測試結果
請參閱圖3。將控制組的IL-1β基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組相對於控制組的IL-1β基因的表現量為0.58（即58%），代表實驗組的IL-1β基因的表現量較控制組降低了42%。
將控制組的IL-8基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組相對於控制組的IL-8基因的表現量為0.59（即59%），代表實驗組的IL-8基因的表現量較控制組降低了41%。
將控制組的IL-6基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組相對於控制組的IL-6基因的表現量為0.25（即25%），代表實驗組的IL-6基因的表現量較控制組降低了75%。
將控制組的IL-18基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組相對於控制組的IL-18基因的表現量為0.73（即73%），代表實驗組的IL-18基因的表現量較控制組降低了27%。
將控制組的TNF-α基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組相對於控制組的TNF-α基因的表現量為0.48（即48%），代表實驗組的TNF-α基因的表現量較控制組降低了52%。
由圖3可見，單核球細胞經過黃精、芡實及枸杞所製得的植物發酵汁液處理過後，可以有效達降低全身發炎的情況，進而提升新陳代謝的功效。
例
5
：人體測試一
5-1. 樣品製備
植物發酵汁液：採用例1所製備的植物發酵汁液。
5-2. 受試者：4位受試者（受試者年齡在25~30之間的女性）。其中，各受試者皆是易產生水腫症狀的患者。意即，本次測試挑選水分代謝狀況及新陳代謝率較差的受試者。
5-3. 測試項目：排尿量
5-4. 測試方式：
第一天令4位受試者於上午9時將體內尿液排空之後開始飲水50mL，接下在每個小時再飲水180 mL，並且統計上午9時到下午1時之間的各受試者的總排尿量，此為控制組。
第二天令相同的4位受試者於上午9時將體內尿液排空之後開始飲用7mL植物發酵汁液及43mL的水，接下在每個小時再喝水180 mL，同樣統計上午9時到下午1時之間的各受試者的總排尿量，此為實驗組。
5-5. 測試結果
請參閱圖4，在飲用植物發酵汁液的情況下，4位受試者的平均總排尿量從465mL上升至785mL，其平均總排尿量的其前後差距達到40%。意即，飲用7mL植物發酵汁液可以有效增加排尿量，提升身體的水分代謝率。
例
6
：人體測試二
6-1. 樣品製備
植物發酵汁液：採用例1所製備的植物發酵汁液。
6-2. 受試者：3位受試者（受試者年齡在25~30之間的女性）。其中，各受試者皆是易產生水腫症狀的患者。意即，本次測試挑選水分代謝狀況及新陳代謝率較差的受試者。
6-3. 測試項目：下肢水腫指數、腳踝圍及身體感覺問卷。
6-4. 測試方式：
令3位受試者每日飲用7mL植物發酵汁液，並連續飲用8周。於飲用前（即第0周，又稱控制組）及飲用8周後（即第8周，又稱為實驗組）分別進行量測。
其中，下肢水腫指數是分別以人體成分分析儀X-SCAN對受試者的下肢進行量測，其係應用生物電阻抗分析法（Bioelectrical Impedance Analysis, BIA），利用微電流對人體下肢進行測量。水腫指數為細胞外水分（ECW）/身體總水分（TBW）之比值。於此，水腫指數越高，表示水腫狀況越嚴重。
其中，腳踝圍係於臨床上醫師常用於判別病患是否水分代謝不良的常見方法。於此，利用皮尺分別量測受試者的腳踝圍。
其中，分別於第0周及第8周由受試者填寫身體感覺問卷，問卷中對於新陳代謝相關的各種狀況進行調查，其調查及計分方式如下表三。其中，第一部分的各分數代表各種症狀的嚴重程度，1分為無異狀，2分為輕微，3分為普通，4分為有些嚴重，5分為嚴重。
表三
| 症狀/分數 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 第1題. 長久坐或站立易水腫 | |||||
| 第2題. 容易覺得晚上褲子或鞋子較緊繃 | |||||
| 第3題. 容易覺得手部腫脹 | |||||
| 第4題. 經常感覺倦怠疲憊 | |||||
| 第5題. 氣血循環差或手腳冰冷 |
下面圖式中顯示的以受試者的平均腳踝圍呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」是指其p值小於0.05，代表統計上具有顯著差異。
6-5. 測試結果
請參閱圖5。經過8周的每日飲用植物發酵汁液後，3位受試者的平均水腫指數從0.387ECW/TBW（第0周）下降至0.369ECW/TBW（第8周）。並且，依據水腫指數參考值為＜0.40屬於正常，0.40-0.41屬於水腫臨界，＞0.41屬於已產生水腫現象。由上述參考值可知，水腫指數差距0.01即意謂從水腫臨界到產生水腫，而飲用本發明之植物發酵汁液8周，其實前後的平均水腫指數差異高達0.018。換算後，其平均水腫指數其前後差距達到4.5%。意即，每日飲用7mL植物發酵汁液可以有效降水腫，提升新陳代謝。
請參閱圖6。經過8周的每日飲用植物發酵汁液後，3位受試者其平均腳踝圍從21.25cm（第0周）降低至20.82cm（第8周），其前後差距達0.43cm。意即，每日飲用7mL植物發酵汁液可以顯著減少腳踝水腫情況。其中，一位受試者的在第0周時按壓腳踝水腫處，其回復凹陷的皮膚至復至原位約費時3分鐘，而其在第8周時按壓腳踝水腫處，其回復凹陷的皮膚至復至原位僅費時4秒。
參考圖7。其中，對於第1題所述長久坐或站立易水腫的情況，受試者的平均評分由4.17分降到0.67分，意即受試者自評已回到無異狀的情況。其中，對於第2題所述容易覺得晚上褲子或鞋子較緊繃的情況，受試者的平均評分由3分降到1.67分。其中，對於第3題所述容易覺得手部腫脹的情況，受試者的平均評分由2.67分降到1分，意即受試者自評已回到無異狀的情況。其中，對於第4題所述經常感覺倦怠疲備的情況，受試者的平均評分由4.33分降到2分，意即受試者自評已回到輕微的情況。其中，對於第5題所述氣血循環差或手腳冰冷的情況，受試者的平均評分由4.67分降到3分，意即受試者自評由接近最高分嚴重的情況，已回到普通的情況。
由上述可知，各題目的平均分數都有減少，意即各受試者平均而言，對於上述症狀都有明顯的改善。整體新陳代謝低落的感受度下降，受試者均能明顯感受到其新陳代謝能力的提升。
由此可知，長期使用植物發酵汁液可提升粒線體活性、降低發炎反應、增加排尿量、減少水腫症狀、改善手腳冰冷等，即植物發酵汁液具明顯的提升新陳代謝之功效。
綜上所述，根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以提升細胞內粒線體活性，藉由提升細胞活性達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以降低體內發炎反應，藉由維持細胞正常機能達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以增加排尿量，藉由提升體內水分代謝達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其可以提升體內水分代謝而減少水腫，維持身體循環達到提升新陳代謝的用途。根據任一實施例的植物發酵汁液，其提升肢體末稍溫度，達到改善手腳冰冷的用途。並且，根據任一實施例的植物發酵汁液，在每日服用植物發酵汁液7mL的情況下即能有效達到提升新陳代謝的用途。於此，在一些實施例中，植物發酵汁液能用於製備用於提升新陳代謝的組合物。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是水浸提液及植物發酵汁液的總多酚含量圖。
圖2是細胞粒線體活性相關基因表現量實驗結果圖
圖3是細胞抗發炎相關基因表現量實驗結果圖。
圖4是人體實驗排尿量檢測結果圖。
圖5是人體實驗水腫指數結果圖。
圖6是人體實驗腳踝圍量測結果圖。
圖7是人體實驗問卷調查結果圖。
Claims (10)
- 一種植物發酵汁液的用途，其是用於製備提升新陳代謝的組合物，其中該植物發酵汁液由一黃精(Polygonatum kingianum)、芡實(Euryale ferox)及枸杞(Lycium chinense)的水浸提液經酵母菌及乳酸桿菌初發酵後，再以醋酸菌次發酵而製得。
- 如請求項1所述的用途，其中該植物發酵汁液用以提升粒線體活性相關基因表現量。
- 如請求項2所述的用途，其中該粒線體活性相關基因為CCT基因、SIRT1基因及FOXO基因其中至少一種。
- 如請求項1所述的用途，其中該植物發酵汁液用以降低抗發炎反應相關基因表現量。
- 如請求項4所述的用途，其中該抗發炎反應相關基因為IL-1β基因、IL-8基因、IL-6基因、IL-18基因及TNF-α基因其中至少一種。
- 如請求項1所述的用途，其中該植物發酵汁液用以增加水分代謝量。
- 如請求項6所述的用途，其中該植物發酵汁液用以增加排尿量。
- 如請求項1所述的用途，其中該植物發酵汁液用以減少水腫。
- 如請求項1所述的用途，其中該植物發酵汁液用以改善手腳冰冷。
- 如請求項1到9其中任一項所述的用途，其中該植物發酵汁液的有效用量為7mL/day。
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