CN113136350A

CN113136350A - 短乳杆菌tci988及短乳杆菌tci988及/或其代谢产物的用途

Info

Publication number: CN113136350A
Application number: CN202110053731.2A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 黄琡涵
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2021-07-20
Also published as: TW202128205A; CN113134027A; TWI761032B; TWI789686B; CN113134024A; TWI774195B; TW202128202A; CN113134056A; TW202128983A; CN113134070A; TWI764520B; TW202128029A; TW202128206A

Abstract

本发明涉及一种短乳杆菌TCI988，其中短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM 33484。基此，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物可用以制备神经保健的组合物、助眠及抗忧郁的组合物、减脂的组合物或其组合。

Description

短乳杆菌TCI988及短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物的用途

技术领域

本发明关于一种短乳杆菌及其用途，特别是关于一种短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988)，其可用于制备神经保健的组合物、助眠及抗忧郁的组合物、减脂的组合物或其组合。

背景技术

益生菌(Probiotics)一般认为是指食入后对宿主(或称受体，如动物或人类)有正面效益的食入性微生物。其命名源于希腊语「for life」(对生命有益)，又称为「原生保健性菌种」；并且，益生菌主要是指乳酸菌和部分酵母菌。

一般而言，「乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)」是指能利用碳水化合物进行发酵生产多量乳酸的细菌总称，为一相当庞杂的菌群。在诸多乳酸菌的菌种中，部分乳酸菌菌种的菌株经研究发现其对于受体健康有益，故此些菌株被视为益生菌。换言之，益生菌大部分是乳酸菌，但乳酸菌中只有少数经研究证明对受体健康有益的菌株能被称为益生菌。

举例来说，常见的可作为益生菌的乳酸菌的菌种包括肠球菌属 (Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双岐杆菌属 (Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)等，而可作为益生菌的酵母菌的菌种包括酵母菌属(Saccharomyces)。

乳杆菌属是一群具有发酵能力、兼性厌氧、不会产生孢子的革兰氏阳性杆菌。乳杆菌因能够将碳水化合物发酵成乳酸而得名，可用于制造液态酸奶、固态奶酪、德国酸菜、啤酒、葡萄酒、泡菜、腌渍食品和其他发酵食品。

发明内容

在一些实施例中，一种短乳杆菌TCI988，其中短乳杆菌TCI988 (Lactobacillusbrevis TCI988)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为 DSM 33484。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988具有生成γ-胺基丁酸(γ- Aminobutyricacid,GABA)的能力。

在一些实施例中，一种短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物用以制备神经保健的组合物的用途，其中短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988) 寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM 33484。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有促进受体的神经细胞的粒线体活性的能力。

在一些实施例中，一种短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物用以制备助眠及抗忧郁的组合物的用途，其中短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM 33484。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有提升受体的褪黑激素合成相关基因的能力。

在一些实施例中，褪黑激素合成相关基因为SIRT1基因、TPH1基因、 DDC基因或其组合。

在一些实施例中，一种短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物用以制备减脂的组合物的用途，其中短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM 33484。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有降低脂肪累积的能力。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有促进脂肪分解的能力。

综上所述，任一实施例的短乳杆菌TCI988，具有生成γ-胺基丁酸的能力。在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有促进受体的神经细胞的粒线体活性的能力，并可用以制备神经保健的组合物。在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有提升受体的褪黑激素合成相关基因(如SIRT1基因、TPH1基因、DDC基因或其组合)的能力，并可用以制备助眠及抗忧郁的组合物。在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有降低脂肪累积及/或促进脂肪分解的能力，并可用以制备减脂的组合物。

附图说明

图1是短乳杆菌TCI988于胃肠模拟环境中的存活率的实验结果图；

图2是短乳杆菌TCI988所分泌的γ-胺基丁酸(GABA)浓度的检测实验结果图；

图3是粒线体活性测试的实验结果图；

图4是褪黑激素合成相关基因的表现量的实验结果图；

图5是脂肪累积实验的实验结果图；

图6是脂肪分解实验的实验结果图。

生物材料的保藏

短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988)，于2020年3月27日寄存于德国微生物保藏中心，DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，地址：德国布伦瑞克市因霍芬大街 7B，寄存编号为DSM 33484。

具体实施方式

短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988)是分离自天贝的的乳杆菌属的菌株。短乳杆菌TCI988以寄存编号BCRC 910975寄存于财团法人食品工业发展研究所。短乳杆菌TCI988以寄存编号DSM 33484寄存于德国微生物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures， DSMZ)。

短乳杆菌TCI988为格兰氏阳性菌，可于厌氧环境下生长，为厌氧细菌。短乳杆菌TCI988生长的温度为35℃至37℃，且可于酸碱值(pH值) 为3至7的环境下生存。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988具有耐胃酸胆盐的功能。举例来说，短乳杆菌TCI988于胃模拟环境(pH值3-4)的存活率为99.1％，且于肠道模拟环境(pH值7-8)的存活率为100％。因此，短乳杆菌TCI988可在人体肠胃道环境定殖，进而在人体中产生可供人体吸收的活性成分，如γ-胺基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA；以下称GABA)。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988具有生成GABA的能力，进而提高受体体内的GABA含量。换言之，当受体服用短乳杆菌TCI988后，短乳杆菌TCI988能提升受体体内的GABA含量。在一些实施例中，受体可为人。

在一些实施例中，透过培养短乳杆菌TCI988，并透过离心分离短乳杆菌TCI988的菌体及其上清液后，将上清液经过滤后可取得短乳杆菌TCI988 的代谢产物。换言之，短乳杆菌TCI988的代谢产物包括短乳杆菌TCI988 进行代谢后分泌至培养液中的物质。在一些实施例中，短乳杆菌TCI988的代谢产物更包括用以培养短乳杆菌TCI988的培养液，且此培养液为已培养过短乳杆菌TCI988，但此培养液不包含短乳杆菌TCI988的菌体。在一示范例中，将短乳杆菌TCI988以乳杆菌MRS培养基(BD Difco^TM Lactobacilli MRS Broth)于37℃厌氧环境(即培养环境中氧气浓度为1体积％)下培养 16小时以得到含有短乳杆菌TCI988的菌体及其代谢产物的菌液。接着，将菌液以转速5000rpm离心15分钟以分离短乳杆菌TCI988的菌体及含有短乳杆菌TCI988的代谢产物的上清液。并且，取此上清液以0.22微米(μm)的滤网过滤上清液以得到短乳杆菌TCI988的代谢产物。

于此，用语「代谢产物」意为培养短乳杆菌时，经此短乳杆菌代谢后所分泌至培养液中的物质，或者为经此短乳杆菌代谢后所分泌至培养液中的物质与培养此短乳杆菌的乳杆菌培养液，但不包含此短乳杆菌的本体。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物能用以促进受体的神经细胞的粒线体活性。换言之，当受体服用短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物时，可维持受体的神经细胞的健康，进而达成受体保健神经的功能。

基此，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物可用以制备神经保健的组合物。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物能用以提升受体的褪黑激素合成相关基因。于此，褪黑激素合成相关基因包括SIRT1基因 (Gene ID：23411)、TPH1基因(Gene ID：7166)、DDC基因(Gene ID：1644)或其组合。其中，SIRT1基因为神经突触功能障碍相关联的基因；TPH1基因与DDC基因为一种血清素合成基因，亦为褪黑激素合成相关基因。换言之，当受体服用短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物时，可提升 SIRT1基因的表现量，进而有助于改善突触可塑性的抑郁症，且达成抗忧郁的功能。并且，当受体服用短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物时，亦可提升 TPH1基因与DDC基因的表现量，进而升血清素的表现及促进褪黑激素生成，并改善受体的睡眠及达成助眠的功能。

基此，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物可用以制备用助眠及抗忧郁的组合物。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物能用以降低脂肪累积。换言之，当受体服用短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物时，可避免受体体内的脂肪细胞以油滴(Lipid droplet)的形式贮存脂肪，进而达成减脂的功能。

在一些实施例中，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物能用以促进脂肪分解。换言之，当受体服用短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物时，可促进受体的脂肪细胞内所贮存的三酸甘油酯(triglyceride,TG)被逐步降解为脂肪酸 (fatty acid,FA)与甘油(Glycerol)，进而达成减脂的功能。

基此，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物可用以制备用减脂的组合物。

在一些实施例中，前述的任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物。

在一些实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠道地、非经肠道地(parenterally)、口服的、或局部地 (topically)投药剂型。

在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂 (tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊 (capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂 (elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。举例来说，当组合物为固态(如锭剂、胶囊或粉末状等)时，组合物的剂量为每日100毫克的短乳杆菌 TCI988及/或其代谢产物。

在一些实施例中，非经肠道地或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)或病灶内注射(intralesional injection)。

在一些实施例中，前述的医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体 (liposome)以及类似之物。关于选用的载剂的种类与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solutioncontaining alcohol)。

在一些实施例中，前述的任一组合物可为食品。换言之，食品包含特定含量的短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物。在一些实施例中，前述的食品可为食用产品或食品添加物(food additive)。在一些实施例中，食用产品可为但不限于：饮料(beverages)、乳制品(dairy products)、发酵食品 (fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及饮食补充品(dietary supplements)。

在一些实施例中，前述的任一组合物可为化妆品或保养品。换言之，化妆品或保养品包含特定含量的短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物。

在一些实施例中，前述的化妆品或保养品可为下列任一种型态：化妆水、凝胶、冻膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉饼、蜜粉、卸妆油、卸妆乳、洗面奶、沐浴乳、洗发精、护发乳、防晒乳、护手霜、指甲油、香水、精华液及面膜。在一些实施例中，前述的化妆品或保养品可视需要更包含外用品可接受成分。在一些实施例中，外用品可接受成分可例如为乳化剂、渗透促进剂、软化剂、溶剂、赋型剂、抗氧化剂、或其组合。

例1：菌种鉴定

首先，将分离自天贝的分离菌株以乳酸菌的16S核醣体基因 (16SrDNA)序列进行菌种鉴定。透过聚合酶连锁反应(PCR)得到此分离菌株的16SrDNA序列(即SEQID NO:1)。接着，利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站，将SEQID NO:1所示的基因序列分别与其他短乳杆菌亚种的16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他短乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似度如表1所示。因此，将此分离菌株命名为短乳杆菌TCI988。并且，将此短乳杆菌TCI988以寄存编号 BCRC 910975寄存于财团法人食品工业发展研究所，并以寄存编号DSM 33484寄存于德国微生物保藏中心。

表1

短乳杆菌亚种	相似度
		Lactobacillus brevis strain RL826	97.12％
Lactobacillus brevis strain 8546	97.11％
		Lactobacillus brevis IMAU 10206	97.11％
Lactobacillus brevis strain PS 7305	97.19％
		Lactobacillus brevis strain 1992	96.95％
Lactobacillus brevis strain elastic001	97.03％
		Lactobacillus brevis strain 6525	97.03％

例2：耐胃酸胆盐试验

于此，将短乳杆菌TCI988以缓冲液、人工胃液(pH 3)及人工小肠液 (pH 8)进行测试，以确认短乳杆菌TCI988于生物体肠胃消化道中的酸碱耐受性。其中，缓冲液为0.2摩尔浓度(M)氯化钾(KCL,品牌Sigma- Aldrich)且pH值为7。人工胃液为0.2M氯化钾且pH值为3。人工小肠液为0.1M三羟甲基氨基甲烷(品牌Sigma)且pH值为8。

以一活化程序将短乳杆菌TCI988活化。首先，将短乳杆菌TCI988的冻菌以10体积％的菌量培养于液态乳杆菌MRS培养基(BD Difco^TM Lactobacilli MRS Broth)中，并于28℃下培养16小时，以活化短乳杆菌 TCI988。

接着，将活化后的短乳杆菌TCI988毒菌液取1体积％的浓度接种至20 毫升的待测溶液中，然后以转速50rpm于37℃下震荡培养3小时。其中，三个组别的待测溶液分别为人工胃液(人工胃液组)、人工小肠液(人工小肠液组)及氯化钾缓冲液(控制组)。从培养后的菌液取100微升(μL) 的菌液涂盘，并于28℃下静置培养3天，并于3天后以肉眼计数各组别的活菌数(计算固态乳杆菌MRS培养基上的菌落数)。

请参阅图1。图式中短乳杆菌TCI988的存活率为计数后的活菌数，并以log CFU/mL表示。其中，log CFU/mL代表每毫升菌液含有的菌落形成单位(CFU，colony-forming unit)并以对数(log₁₀)表示。由图1可知，控制组的短乳杆菌TCI988的菌数为8.477log CFU/mL、人工胃液组的短乳杆菌 TCI988的菌数为8.398log CFU/mL，及人工小肠液组的短乳杆菌TCI988的菌数为8.477log CFU/mL。由此可知，人工胃液组的存活率为控制组的 99.1％，且人工小肠液组的存活率为控制组的100％。

基此，短乳杆菌TCI988具有耐胃酸胆盐的功能，代表短乳杆菌TCI988 可通过宿主肠胃道的酸碱值压力，定殖于宿主肠道中。

例3：短乳杆菌TCI988所分泌的GABA浓度的检测实验

于此，以前述活化程序将短乳杆菌TCI988活化后，将10体积％的活化后的短乳杆菌TCI988接种于液态乳杆菌MRS培养基中，并于37℃厌氧环境下进行培养，并分别于培养0小时(接种前)、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、61小时、66 小时及72小时分别收集不同时间点的短乳杆菌TCI98的菌液，并测量其 OD₆₀₀的吸光值。接着，将各组菌液以转速5000rpm离心15分钟以分离短乳杆菌TCI988的菌体及含有短乳杆菌TCI988的代谢产物的各组上清液。然后，将各组上清液以GABA浓度检测套组(品牌CLOUD- CLONE CORP；产品编号CEA900Ge ELISA Kit for Gamma-Aminobutyric Acid(GABA))测量其含有的GABA浓度。

请参阅图2。短乳杆菌TCI988分泌至培养基中的GABA浓度随着培养时间增加。当短乳杆菌TCI988培养至42小时后，短乳杆菌TCI988的吸光值达到最高，代表其菌数达到最大。并且，于培养42小时至72小时之间，短乳杆菌TCI988的菌数以达到停滞期(Stationaryphase)，期间短乳杆菌 TCI988的菌数达到稳定的动态平衡。再者，于培养42小时至61小时之间，虽然短乳杆菌TCI988的吸光值略微下将，但其检测到的GABA浓度显著上升，代表短乳杆菌TCI988分泌的GABA浓度提高。

基此，短乳杆菌TCI988具有生成GABA的能力。

例4：短乳杆菌TCI988、短乳杆菌L816及短乳杆菌L846的代谢产物的制备及GABA含量检测

于此，短乳杆菌L816是分离自泡菜的分离菌株，其16SrDNA序列 (即SEQID NO:2)与其他短乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似度如表2 所示。短乳杆菌L846是分离自天贝的分离菌株，16SrDNA序列(即 SEQID NO:3)与其他短乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似度如表2所示。基此，可知短乳杆菌L816及短乳杆菌L846与短乳杆菌TCI988皆为短乳杆菌菌种，但为不同的短乳杆菌菌株。

表2

短乳杆菌L816比对之短乳杆菌亚种	相似度
		Lactobacillus brevis strain M4-1	98.13％
Lactobacillus brevis strain 7898	97.22％
		Lactobacillus brevis strain NWAFU1156	97.62％
Lactobacillus brevis strain 14G	97.62％
		Lactobacillus brevis strain 3043	97.53％
短乳杆菌L846比对之短乳杆菌亚种	相似度
		Lactobacillus brevis strain KLDS 1.0726	98.55％
Lactobacillus brevis strain 1976	98.55％
		Lactobacillus brevis strain 2654	98.55％
Lactobacillus brevis strain 2644	98.55％
		Lactobacillus brevis strain 2641	98.55％
Lactobacillus brevis strain 2095	98.55％

短乳杆菌的代谢产物的制备方法：首先，以前述活化程序将短乳杆菌 TCI988、短乳杆菌L816及短乳杆菌L846分别活化后，各别取10体积％的各组活化后的菌液接种于液态乳杆菌MRS培养基中，并于37℃厌氧环境下进行培养16小时。接着，将各组菌液以转速5000rpm离心15分钟以分离短乳杆菌的菌体及含有短乳杆菌的代谢产物的各组上清液。

GABA含量检测方法：将各组上清液委托检测单位(检测公司：欧陆食品检验股份有限公司行检测)进行GABA含量的检测。

GABA含量检测结果：

短乳杆菌TCI988中含有0.199％的GABA。

短乳杆菌L816中含有0.177％的GABA。

短乳杆菌L846中含有0.014％的GABA。

由此可知，短乳杆菌TCI988所分泌的GABA量显著高于短乳杆菌 L816及短乳杆菌L846。

例5：神经细胞粒线体活性测试

于此，所使用培养基为添加有10体积％胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1体积％盘尼西林-链霉素 (penicillin/streptomycin，品牌：Gibco)的DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco)，以下称细胞培养基。所使用的粒线体活性测试方法为利用粒线体膜电位检测套组(BDTM MitoScreen(JC-1) kit，型号551302)测定粒线体的膜电位，并进行粒线体活性分析。其中，粒线体膜电位检测套组具有JC-1染料(冻干)及10X分析缓冲液。于使用前，以1X PBS将10X分析缓冲液稀释10倍，以形成1X分析缓冲液。加入 130μL DMSO至JC-1染剂(冻干)中，以形成JC-1储备溶液。然后，再以1X分析缓冲液稀释JC-1储备溶液，以形成JC-1工作试剂(JC-1working solution；即JC-1粒线体特异性染剂)。JC-1储备溶液与1X分析缓冲液的稀释倍率为1:100。

首先，取1x10⁵个小鼠神经母细胞瘤细胞(ATCC CCL-131；以下称 Neuro2a细胞)至每孔含有2毫升细胞培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。

待各孔的Neuro2a细胞分别贴附于六孔细胞培养盘底部后，将Neuro2a 细胞分为实验组及控制组。接着，将各组的细胞培养基更换为实验培养基，然后置于37℃下接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25 体积％例4所制备的短乳杆菌TCI988的代谢产物的细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含例4所制备的短乳杆菌TCI988的代谢产物)。

接着，移除各组实验培养基后，以1mL的1X DPBS溶液润洗2次各组 Neuro2a细胞。然后，将200μL胰蛋白酶加至每孔中反应5分钟。反应后，于各孔中添加6mL细胞培养基以终止反应。将各孔中的Neuro2a细胞与细胞培养基收集至个别对应的1.5mL微量离心管内，并将含有Neuro2a 细胞与细胞培养基的微量离心管以400xg离心5分钟。于离心后移除各组微量离心管中的上清液，再以1X DPBS溶液重新回溶Neuro2a细胞的沉淀物，并以400xg离心5分钟。再次于离心后移除各组微量离心管中的上清液，并加入100μL的JC-1工作试剂至各微量离心管，使Neuro2a细胞的沉淀物与JC-1工作试剂均匀混合后壁光静置15分钟。于静置15分钟后将含有Neuro2a细胞与JC-1工作试剂的微量离心管以400xg离心5分钟。接着，去除各组微量离心管中的上清液，并加入1X分析缓冲液回溶Neuro2a 细胞的沉淀物，再以400xg离心5分钟，并重复二次。去除各组微量离心管中的上清液，以含有2体积％胎牛血清蛋白的1XDPBS溶液重新悬浮 Neuro2a细胞的沉淀物，以得到待测细胞液。

以流式细胞仪量测各组的待检测细液中细胞粒线体的膜电位，以进行粒线体活性分析。其中流式细胞仪设定的激发光的波长为488nm、散射光的波长为527nm及590nm。并将控制组量测到具有高膜电位的细胞的数值视为100％，如图3所示。在图3中，「***」代表在与控制组比较下其p值小于0.001。

请参阅图3。以控制组作为100％的参照基准，实验组经短乳杆菌 TCI988的代谢产物处理后，其具有高膜电位的细胞的相对数值为133.4％。换言之，与控制组相较之下，实验组的Neuro2a细胞的粒线体活性有显著提升(约1.33倍)。显示短乳杆菌TCI988的代谢产物可提升神经细胞的粒线体活性，而达到维持神经细胞的健康的效果。

基此，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物能用以达成保健神经的功能。

例6：褪黑激素合成相关基因测试

于此，褪黑激素合成相关基因为SIRT1基因(Gene ID：23411)、 TPH1基因(GeneID：7166)、DDC基因(Gene ID：1644)。

于此，所使用的细胞培养基为添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，编号10437-028)、1％抗生素-抗霉菌素 (Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，Cat.15240-062)的DMEM培养基 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Gibco公司，编号11965-092)。

首先，取1x10⁶个人类神经母细胞瘤细胞(

CRL-2266^TM；以下称SHSY-5Y细胞)至每孔含有2毫升细胞培养基的六孔细胞培养盘中，于 37℃下培养24小时。

将SHSY-5Y细胞分为实验组及控制组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔0.1mL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25％的例4所制备的短乳杆菌TCI988的代谢产物的细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含例4所制备的短乳杆菌TCI988的代谢产物)。

收集各组的SHSY-5Y细胞，并以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)萃取出各组的RNA。接着，各组取 1000纳克(ng)的RNA作为模板，透过

III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将RNA反转录为相应之cDNA。再藉由ABI StepOnePlus^TM实时PCR系统(ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCRsystem(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPA SYBR FAST (购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表3的引子(SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:9)对各组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction)以观察SHSY-5Y细胞内SIRT1基因、TPH1基因及DDC基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量，如图4所示。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量基因的mRNA表现量，进而推断基因编码的蛋白质的表现量。

需要特别说明的是，图4中的基因表现是以相对表现倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。在图4中，「*」代表在与控制组比较下其 p值小于0.05。

表3

于表3中，F为顺向引子(Forward primer)，而R为反向引子 (Reverse primer)。

请参阅图4。将控制组的各组SIRT1基因、TPH1基因及DDC基因的相对表现量视为1.00(即控制组的各组基因的表现量为100％)。相较于控制组，实验组的组SIRT1基因的相对表现量为1.30，实验组的组TPH1基因的相对表现量为1.23，以及实验组的组DDC基因的相对表现量为1.05。由此可知，实验组的SIRT1基因、TPH1基因及DDC基因的表现量显著的提升，代表短乳杆菌TCI988的代谢产物能有效地提高SIRT1基因、TPH1基因及DDC基因的表现量。

基此，当受体服用短乳杆菌TCI988的代谢产物或/及短乳杆菌TCI988 时，能提高TPH1基因及DDC基因的表现量，进而促进血清素及褪黑激素生成，以改善受体的睡眠质量。当受体服用短乳杆菌TCI988的代谢产物或/ 及短乳杆菌TCI988时，能提高SIRT1基因的表现量，进而改善忧郁症并具有抗忧郁的功效。

例7：脂肪累积实验

于此，所使用的细胞培养基为添加有20vol％FBS(品牌：Gibco)及1vol％盘尼西林-链霉素的最低必需培养基α(Minimum Essential Medium Alpha，MEMα，品牌：Gibco)。并且，将油-红O染色试剂(品牌： Sigma)彻底溶解于100％异丙醇(isopropanol，供货商：ECHO)以配制 3mg/mL的油-红O染色试剂的储备溶液。为获得可供使用的油-红O工作溶液(oil-red O working solution)，于使用前实时将油-红O染色试剂的储备溶液以二次水(ddH₂O)稀释至浓度1.8mg/mL，即为60％油-红O染色试剂的储备溶液。

首先，以每孔8×10⁴个细胞的细胞数，将小鼠骨髓基质细胞株OP9 (购自BCRC，编号6566)接种于含有500μL细胞培养基的24孔培养盘的各孔中，并置于37℃下培养7天。于7天的培养期间，每3天更换一次新鲜的500μL细胞培养基。于培养7天后，使用显微镜(厂牌：ZEISS) 观察各孔中的细胞内的油滴(lipid droplet)形成以确认细胞完全分化成脂肪细胞，供后续实验使用。

将脂肪细胞分成2个组别：实验组及控制组。移除各组别的细胞培养基，并更换成每孔500μL实验培养基，然后置于37℃下接续培养7天。于7天的培养期间，每3天更换一次新鲜的500μL实验培养基。其中，实验组的实验培养基为含有0.0156vol％例4所制备的短乳杆菌TCI988的代谢产物的细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含例4所制备的短乳杆菌TCI988的代谢产物)。

接着，移除各孔中的实验培养基并以1xDPBS润洗二次。继而，于各孔内添加1mL的10％甲醛(formaldehyde，供货商：ECHO)并于室温下培养 30分钟，藉以固定细胞。之后，移除各孔内的甲醛并以1X DPBS对各孔润洗二次。于再次润洗后，添加1mL的60％异丙醇至每孔中并作用1分钟。接着，移除异丙醇，再添加1mL油-红O工作溶液并于室温下作用1小时。

于作用1小时后，移除油-红O工作溶液并以1mL的60％异丙醇快速退染5秒。接着，加入100％异丙醇至各孔中，并置于振荡器(shaker)上反应10分钟以溶解染剂。然后，从各孔中取100μL前述的染剂-异丙醇溶液至96孔培养盘并于510nm的波长下以ELISA读取仪(厂牌：BioTek)读取各孔的吸光值(OD₅₁₀)。

于量测后，藉由所测得的吸光值计算出脂肪细胞内的邮递数量，并进而推算脂肪累积量(％)。换言之，于此，是将控制组的脂肪累积量视为1 (即控制组的脂肪累积量为100％)来计算各组别的脂肪累积量(％)。并且，各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析，如图5所示。在图5中，「***」代表在与控制组比较下其p值小于0.001。

请参阅图5。控制组的脂肪累积量为100％，而实验组的脂肪累积量为 92.5％。于此，相较于控制组，实验组的脂肪细胞内的油滴数量明显减少。由此可知，短乳杆菌TCI988的代谢产物能有效地抑制脂肪累积，具有减少受体的脂肪形成的功能。

基此，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物能用以减少受体的脂肪累积，进而达成减脂的效果。

例8：脂肪分解实验

于此，将脂肪细胞中甘油(Glycerol)的含量作为量化指标，以观察是否有产生脂肪分解作用。

于此，所使用的细胞培养基为添加有20％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，编号10438-026)、1％的抗生素-抗霉菌素 (Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，编号15240-062)的α-最低限度必需培养基(α-Minimum essential medium，简称α-MEM)(Gibco公司，编号12000-022)。

首先，取8×10⁴个小鼠骨髓基质细胞OP9(购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，

)，编号ATCC CRL- 2749；以下称OP9细胞)至每孔含有500μL细胞培养基的24孔培养盘中，于37℃下培养7天。于7天的细胞培养期间中，每隔3天更换细胞培养基。并于培养7天后，以显微镜(ZEISS；放大倍率400x)观察OP9细胞内的油滴形成，藉以确认OP9细胞已完全分化为脂肪细胞，供后续实验使用。

然后，将分化完成的脂肪细胞分为实验组、控制组及空白组。移除各组别的细胞培养基，并更换成每孔500μL实验培养基，然后置于37℃下接续培养7天。于7天的培养期间，每3天更换一次新鲜的500μL实验培养基。其中，实验组的实验培养基为含有0.03125vol％的例4所制备的短乳杆菌TCI988的代谢产物的细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的分化培养基(即不含例4所制备的短乳杆菌TCI988的代谢产物)。

接着，以细胞甘油基检测试剂套组(Glycerol cell-based assay kit，购自Cayman，美国，产品编号10011725)依据下列步骤测量甘油含量。收集各组的实验培养基(即已培养过脂肪细胞的实验培养基，但不包括脂肪细胞)，并各取其中的25μL转移到新的96孔培养盘中，并于各孔中加入 100μL的重构游离甘油测定试剂(Reconstituted freeglycerol assay reagent)，再于室温下作用15分钟后，将96孔培养盘以ELISA读数器读取各组之OD_540nm的吸亮度，以量化各组脂肪细胞分解并释放至实验培养基中的甘油量。

请参阅图6。于此，将控制组的甘油量释放量视为100％。实验组的甘油量释放为158.1％。于此，相较于控制组，实验组的脂肪细胞内的脂肪细胞分解成甘油并释放出的含量明显提升。由此可知，短乳杆菌TCI988的代谢产物能有效地促进脂肪分解。

基此，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有促进脂肪分解，并提升受体的脂肪代谢的功能，进而达成减脂的功能。

综上所述，根据本发明任一实施例的短乳杆菌TCI988，其可生成 GABA。并且，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物可用于制备以下至少一项组合物：神经保健的组合物、助眠及抗忧郁的组合物及减脂的组合物。前述的组合物具有下列一种或多种功能：促进受体的神经细胞的粒线体活性、提升受体的褪黑激素合成相关基因(如SIRT1基因、TPH1基因、DDC基因或其组合)、降低脂肪累积及促进脂肪分解。藉此，短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物可用于舒眠纾压，并用以改善压力型肥胖。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

【序列表】

<110> 大江生医股份有限公司

<120> 短乳杆菌TCI988及短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物的用途

<130> NA

<150> US 62/961,742

<151> 2020-01-16

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1172

<212> DNA

<213> Lactobacillus brevis TCI988

<400> 1

gcggggcggg ctgcctaata catgcaagtc gaacgagctt ccgttgaatg acgtgcttgc 60

actgatttca acaatgaagc gagtggcgaa ctggtgagta acacgtgggg aatctgccca 120

gaagcagggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt ataacaacaa aatccgcatg 180

gattttgttt gaaaggtggc ttcggctatc acttctggat gatcccgcgg cgtattagtt 240

agttggtgag gtaaaggccc accaagacga tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg 300

gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360

cacaatggac gaaagtctga tggagcaatg ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt 420

aaaactctgt tgttaaagaa gaacaccttt gagagtaact gttcaagggt tgacggtatt 480

taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540

gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa 600

gccttcggct taaccggaga agtgcatcgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggac 660

agtggaactc catgtgtagc ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720

ggcggctgtc tagtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt 780

agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840

ttcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg gagtacgacc gcaaggttga 900

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catggtggtt taattcgaag 960

ctacgcgaag aaccttacca gttcttgaca ttcttctgca tcttagaaga ataagaacgt 1020

tcccttcggg acagaatgaa caggtgggtg caatgttgtc gtcagctccg tgtcgtgaga 1080

attgttgggt agtccgccac gaggcgcaac ccttattatc agtgcagcat cagtgggcac 1140

ctctgggtgg aactgcgtga caaacccgag ta 1172

<210> 2

<211> 1142

<212> DNA

<213> Lactobacillus brevis

<400> 2

gggcaatctc tactgaagtg ctacatcaca agtaaccacg agcttccgtt gaatgacgtg 60

cttgcactga tttcaacaat ggagcgagtg gcgaactggt gagtaacacg tggggaatct 120

gcccagagca ggggataaca cttggaaaca ggtgctaata ccgtataaca acaaaatccg 180

catggatttt gtttgaaagg tggcttcggc tatcacttct ggatgatccc gcggcgtatt 240

agttagttgg tgagtaaagg cccaccaaga cgatgatacg tagccgacct gagagggtaa 300

tcggccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 360

ttccacaatg gacgaaagtc tatggagcaa tgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc 420

gtaaaactct gttgttaaag aagaacacct ttgagagtaa ctgttcaagg gttgacggta 480

tttaaccaga aagccacggc taactacggc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540

cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 600

agccttcggc ttaaccggag aagtgcatcg gaaacgggag acttgagtgc agaagaggac 660

agtggaactc catgtgtagc ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720

ggcggctgtc tagtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag cagggtagcg aacaggatta 780

gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct 840

tcagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccga aagttgaaac 900

tcaaaggatt tgacgggggc ccgcacaagc ggtgagcatg tggtttaatt cgaagctacg 960

cgaagaacct taccagtctg acatcttctg ccaatctaga gatagacgtt cccttcggac 1020

agaatgacag tgtgcatgtg tcgtcagctc tgtctgagat gtgggtagtc ccgcacgacg 1080

caacccttat atcagttgca gcatcagtgg cactctggtg agaactgccg ggtgaacaaa 1140

cc 1142

<210> 3

<211> 938

<212> DNA

<213> Lactobacillus brevis

<400> 3

atagccgacg ttcgtggatg acacagcatt cgtagtaggg acccgaccgt ggaagccgtg 60

cttgcactga tttcaacgtg aagcgagtgg cgaactggtg agtaacacgt gggaaatctg 120

cccagaacag gggataacac ttggaaacag gtgctaatac cgtataacaa caaaatccgc 180

atggattttg tttgaaaggt ggcttcggct atcacttctg gatgatcccg cggcgtatta 240

gttagttggt gaggaaaggc ccaccaagac gatgatacgt agccgacctg agagggtaat 300

cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360

tccacaatgg acgaaagtct gtggagcaat gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 420

taaaactctg ttgttaaaga agaacacctt tgagagtaac tgttcaaggg ttgacggtat 480

ttaaccagaa agccacggct aactacgtcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540

gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa 600

gccttcggct taaccggaga agtgcatcgg aaactggaga cttgagtgca gaagaggaca 660

gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgagg 720

cggctgtcta gtctgtaact gacgctgagg ctcaaaagca tggtagcgaa caggattaga 780

taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaagtg ttggagggtt tcccgccctt 840

cagtgctgca gcttaacgca ttaagcactc ccgcctggga ggagtacgac gcaaggttga 900

aactcaaagg attgacgggg gcccgcacaa gctgttgg 938

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SIRT1-F

<400> 4

tagccttgtc agataaggaa gga 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SIRT1-R

<400> 5

ctcagcgcca tggaaaatgt 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> THP1-F

<400> 6

aaatattgtg gatatcggga ggataa 26

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> THP1-R

<400> 7

aggacggatg gaaaaacctg ta 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DDC-F

<400> 8

accacaacat gctgctcctt t 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DDC-R

<400> 9

atcaacgtgc agccatatgt ct 22

Claims

1.一种短乳杆菌TCI988，其特征在于，短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevisTCI988)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM 33484。

2.如权利要求1所述的短乳杆菌TCI988，其中该短乳杆菌TCI988具有生成γ-胺基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)的能力。

3.一种短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物用以制备神经保健的组合物的用途，其特征在于，短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM 33484。

4.如权利要求3所述的用途，其中该短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有促进受体的神经细胞的粒线体活性的能力。

5.一种短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物用以制备助眠及抗忧郁的组合物的用途，其特征在于，短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM 33484。

6.如权利要求5所述的用途，其中该短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有提升一受体的褪黑激素合成相关基因的能力。

7.如权利要求6所述的用途，其中该褪黑激素合成相关基因为SIRT1基因、TPH1基因、DDC基因或其组合。

8.一种短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物用以制备减脂的组合物的用途，其特征在于，短乳杆菌TCI988(Lactobacillus brevis TCI988)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM 33484。

9.如权利要求8所述的用途，其中该短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有降低脂肪累积的能力。

10.如权利要求8所述的用途，其中该短乳杆菌TCI988及/或其代谢产物具有促进脂肪分解的能力。