CN113134027A

CN113134027A - 青钱柳提取液用于提升减脂基因表现量、提升基础代谢率及/或抑制脂肪堆积的用途

Info

Publication number: CN113134027A
Application number: CN202011489297.4A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 李姿仪
Original assignee: Bayote Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Bayote Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2021-07-20
Also published as: TW202128202A; CN113134056A; TW202128205A; TWI789686B; TW202128206A; TWI761032B; CN113136350A; CN113134024A; TWI764520B; TWI774195B; CN113134070A; TW202128983A; TW202128029A

Abstract

本发明提供一种青钱柳提取液用于制备提升减脂基因表现量、提升基础代谢率及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途。本发明的青钱柳提取液能有效促进代谢脂肪的活性及提升肌肉细胞丙酮酸生成，并减少脂肪细胞中脂肪油滴的堆积，进而达到包括减少体重、全身体脂、躯干体脂及腰围的功效，所述青钱柳提取液是以一溶剂对一青钱柳提取所得，所述溶剂为含水的溶剂。

Description

青钱柳提取液用于提升减脂基因表现量、提升基础代谢率及/ 或抑制脂肪堆积的用途

技术领域

本发明涉及青钱柳(Cyclocarya paliurus)提取液的用途，特别是用于制备提升减脂基因表现量、提升基础代谢率及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途。

背景技术

近年来，肥胖症的发生率逐年增加，已达到全球流行的趋势，并被视为一种慢性疾病，截至2016年，世界卫生组织估计有39％的人口超重(约19亿人)，且约有13％的人口是属于肥胖的(约6亿人)，且于2019年公布数据指出共有 3800万名5岁以下儿童为超重或肥胖。

肥胖的患者常伴随其他的健康问题，并会导致相关疾病风险的增加，包含：胰岛素抗性、第二型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病、阻塞性呼吸暂停、高血压、骨关节炎及癌症等，以至于过重与肥胖成为现今全球死亡的第五大风险。

综上所述，因应现代人所面临的肥胖及因肥胖造成的衍生健康问题，且基于现代人生活水平提高并对于保健概念的注重，因此，研发一种能有效降低体重并减少身体脂肪含量的有效成分组成的组合物，着实有其必要性。

青钱柳的学名为Cyclocarya paliurus，又被称为摇钱树，是第四季冰河期孑遗下来的珍稀树种，目前科学家仍十分不解为何青钱柳得以挺过冰河时期而幸运幸存至今，青钱柳仅零星分布于中国少数区域，更被中国列为国家第二级保护树种，其成份远古加上分布十分稀少的缘故，而有「植物界的大熊猫」的美称，然其成分功效及实际用途还未被广泛了解与应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的一目的在于提供一种青钱柳(Cyclocarya paliurus)提取液用于用于制备提升减脂基因表现量、提升基础代谢率及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途。

在本发明的一实施例中，所述青钱柳提取液系以一溶剂对一青钱柳提取所得。

在本发明的一实施例中，所述溶剂是由为含水的溶剂。

在本发明的一实施例中，青钱柳提取液所使用的所述溶剂与所述青钱柳的重量比范围为50：1至1：1，且所述提取系于55℃至100℃进行0.5至2 小时。

在本发明的一实施例中，青钱柳提取液的浓度为至少0.0156mg/mL。

在本发明的一实施例中，其中所述减脂基因包括三酸甘油酯脂解酶 (Adiposetriglyceride lipase,ATGL)基因、脂肪酶E(lipase E,LIPE)基因、体解偶联蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)基因、及/或体解偶联蛋白2(Uncoupling Protein 2,UCP2)基因中至少一项基因。

在本发明的一实施例中，其中所述青钱柳提取液系透过包括促进肌肉细胞生成、降低脂肪细胞生成、及/或提升糖解作用的效率以达到所述提升基础代谢率的功效。

在本发明的一实施例中，所述提升基础代谢率系为提升肌肉细胞丙酮酸生成。

在本发明的一实施例中，所述青钱柳提取液系促进代谢脂肪的活性。

在本发明的一实施例中，所述促进代谢脂肪的活性包括减少体重、减少全身体脂、减少躯干体脂及减少腰围。

在本发明的一实施例中，所述青钱柳提取液能有效促进代谢脂肪的活性及提升肌肉细胞丙酮酸生成，并减少脂肪细胞中脂肪油滴的堆积，进而达到包括减少体重、全身体脂、躯干体脂及腰围的功效。

在本发明的一实施例中，所述组合物为医药组合物、食品组合物、或保健食品组合物。

在本发明的一实施例中，青钱柳提取液的Brix值为10±0.5以上。

综上所述，任一实施例的青钱柳提取液可用于制备提升减脂基因表现量、提升基础代谢率及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途。任一实施例的青钱柳提取液可用于提升肌肉细胞丙酮酸生成。任一实施例的青钱柳提取液可用于制备减少体重、全身体脂、躯干体脂及腰围的组合物。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1是为实施例二中实验组及控制组的相对丙酮酸生成结果比较图；

图2是为实施例三中实验组及控制组的显微照片图；

图3是为实施例三中实验组及控制组的相对脂肪油滴含量比较图；

图4是为实施例四中实验组及控制组的相对基因(ATGL、LIPE、UCP1及 UCP2)表现比较图；

图5是为试验者饮用青钱柳提取饮2周及4周后的体重变化图；

图6是为试验者饮用青钱柳提取饮2周及4周后的腰围变化图；

图7是为试验者饮用青钱柳提取饮2周及4周后的全身体脂变化图；

图8是为试验者饮用青钱柳提取饮2周及4周后的躯干体脂变化图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明该泡叶藻萃取物对前述基因群组的调控作用及其提升皮肤纤维母细胞对紫外线抵抗力的效果，以证明该基因调控作用对维护皮肤健康的重要性。以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。

本案使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组的间的差异以学生t检验(student’s t-test)进行分析。图式中「*」代表 p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。

本文中的「wt％」是指重量百分比，而「vol％」是指体积百分比。

如本文中所使用，术语「提取液」是指藉由提取作用所制备的产物。所述提取液可以溶于溶剂中的溶液形式呈现，或提取液可为不含或大体上不含溶剂的浓缩物或精华呈现，亦可以干燥后的粉体呈现。

本文所述的「有效浓度」或「有效量」是表示能能有效提升减脂基因表现量、提升基础代谢率、及/或抑制脂肪堆积所需本发明的青钱柳提取液的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(Dose escalation)以实验决定其有效浓度。

如本文所用「青钱柳」通常是指青钱柳的叶片，其中所述青钱柳的叶片可包含原始、经干燥或以其他物理方式加工以利于处理的青钱柳，其可进一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式经加工以影响原物料的大小及实体完整性的型态。

在本发明的一实施例中，一种青钱柳提取液，其是由一种含水的溶剂对青钱柳原料进行提取。在一些实施例中，青钱柳提取液是将青钱柳原料依序进行粉碎程序、加热程序、过滤程序、及浓缩程序后得到。

在本发明的一实施例中，青钱柳原料可以是粉碎或完整的青钱柳。在一些实施例中，青钱柳原料可以是新鲜或干燥的青钱柳。

在本发明的一实施例中，青钱柳是来自于中国部分的产区。

在本发明的一实施例中，粉碎程序是指将青钱柳原料搅打至平均粒径小于 20mm。举例而言，粉碎可以采用果汁机、调理机或均质机。

在本发明的一实施例中，加热程序是指将碎裂的青钱柳原料与含水的溶剂混合后加热一段固定时间。在一些实施例中，加热是指将青钱柳原料与含水的溶剂的温度提升到55℃～100℃。在一些实施例中，一段固定时间是指0.5小时到2小时。举例而言，将青钱柳原料与含水的溶剂的温度提升到85℃进行提取 1小时。

在本发明的一实施例中，加热程序中的重量比例(含水的溶剂：青钱柳原料)为1：1至50：1。举例而言，含水的溶剂：青钱柳原料为30:1。

在本发明的一实施例中，含水的溶剂可以是纯水或含有有机酸的水溶剂。在一些实施例中，有机酸的浓度为0.05％到2.00％。在一些实施例中，有机酸可是可食用酸。在一些实施例中，可食用酸可以是柠檬酸(Citric Acid)、苹果酸、酒石酸、乳酸、葡萄糖酸、醋酸等，并不以此为限。

举例而言，采用90公斤重的青钱柳原料、900公斤重的水及0.63公斤重的柠檬酸混合后持续加热到100℃，并维持100℃持续0.5小时。举例而言，采用 90公斤重的青钱柳原料、900公斤重的水及0.7公斤重的柠檬酸混合后持续加热到85℃，并维持85℃持续1小时。

在本发明的一实施例中，过滤程序是指将加热后(或降温后)的青钱柳原料及溶剂通过筛网以将溶剂内的固体滤除形成过滤液。举例而言，筛网可以是 400网目(mesh)的筛网。

在本发明的一实施例中，加热程序与过滤程序的间还包括一降温程序，其中降温程序是指将加热后的青钱柳原料及溶剂静置以自然降温至室温。

在本发明的一实施例中，浓缩程序是指将过滤程序所得到的过滤液进行减压浓缩(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)以得到初萃液。在一些实施例中，浓缩程序所得的初萃液即可为青钱柳提取液。在浓缩程序的一些实施例中，在40℃～70℃的间进行减压浓缩。举例而言，青钱柳提取液是将青钱柳原料依序进行粉碎程序、加热程序、过滤程序及浓缩程序后得到。

在本发明的一实施例中，经浓缩程序所得的青钱柳提取液亦可再进行过滤。举例而言，以400网目(mesh)的筛网进行再过滤。

在本发明的一实施例中，青钱柳提取液用于制备提升减脂基因表现量、提升基础代谢率及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途，所述青钱柳提取液是以一溶剂对一青钱柳提取所得。

在本发明的一实施例中，青钱柳提取液是由含水的溶剂进行提取。

在本发明的一实施例中，所述溶剂与所述青钱柳的重量比范围为50：1至 1：1，其中所述提取是于55℃至100℃进行0.5至2小时。

在本发明的一实施例中，所述青钱柳提取液的浓度至少为0.0156mg/mL。

其中，ATGL基因与LIPE基因分别转录脂肪甘油三酯脂肪酶(adiposetriglyceride lipase，简称ATGL)与荷尔蒙敏感性脂解酶(Hormone-Sensitive Lipase，简称HSL)。具体而言，ATGL可将细胞储存的三酸甘油脂水解成游离的脂肪酸以及双酸甘油脂，而HSL则将双酸甘油脂进一步水解成单酸甘油脂，两者均于脂肪上扮演举足轻重的角色。

其中，UCP1(Uncoupling Protein 1)基因及UCP2(Uncoupling Protein 2)基因的表现量上升，被认为能够促进脂肪的分解，并使脂肪的累积量降低。

换言的，青钱柳提取液可藉由提高上述基因表现量，提升脂肪分解相关基因的表现量以达到所述促进脂肪分解的功效。

在本发明的一实施例中，所述青钱柳提取液是透过包括促进肌肉细胞生成、降低脂肪细胞生成、及/或提升糖解作用的效率以达到所述提升基础代谢率的功效。

基础代谢率是维持人体正常运作不可或缺的燃料，用于维持体内各细胞器官生理运作所需消耗的基础能量，换言的，基础代谢率增加意味着肌肉细胞生成率提升，且脂肪细胞堆积降低，以致细胞提升糖解作用的效率，而身体所需消耗的基础能量越多，越容易拥有易瘦体质，可有效帮助预防及改善肥胖。

在本发明的一实施例中，提升基础代谢率是为提升肌肉细胞丙酮酸生成。

在本发明的一实施例中，所述青钱柳提取液是促进代谢脂肪的活性。

在本发明的一实施例中，其中所述促进代谢脂肪的活性包括减少体重、减少全身体脂、减少躯干体脂及减少腰围。

在本发明的一实施例中，前述的组合物可为医药品。换言的，此医药品包含有有效含量的青钱柳提取液。

在本发明的一实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于经肠道或口服的投药剂型。这些投药剂型包括，但不限于：锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似的物。

在本发明的一实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这些投药剂型包括，但不限于：注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似的物。在一些实施例中，所述医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermalinjection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

在本发明的一实施例中，医药品可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含下列的试剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液 (buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂 (wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似的物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

在本发明的一实施例中，医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水 (phosphate bufferedsaline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。

在本发明的一实施例中，前述的组合物可为可食用组合物。在一些实施例中，此可食用组合物可以制成食品产品或可为食品添加物(food additive)，意即藉由习知方法于食材制备时添加而制得食品产品，或是于食品产品的制作过程中添加。于此，食品产品可以是与可食性材料配制成供人类或动物摄食的产品。

在本发明的一实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods) 以及膳食补充品(dietary supplements)。

以下将详细说明本发明的青钱柳提取液的提取方法；所述青钱柳提取液提升基础代谢率的功效测试；所述青钱柳提取液提升减脂基因表现量的功效测试；所述青钱柳提取液减少脂肪细胞中脂肪堆积的功效测试；以及所述青钱柳提取饮对于减少体重、减少全身体脂、减少躯干体脂及减少腰围的功效测试，以证实本发明的青钱柳提取液确实具有效提升基础代谢率及抑制脂肪堆积，并能同时有效促进减脂基因的表现量，进而减少体重、全身体脂、躯干体脂及腰围，以达到减脂、预防及改善肥胖的功效。

实施例1.青钱柳提取液的制备方法

在此实施例中，青钱柳提取液的制备步骤如下：

1.首先，进行粉碎程序。将青钱柳(产地：中国)的叶片进行粗碎(Osterizer 品牌的10speed blender)并以孔径为12mm的筛网将其过筛，去除过大颗粒后取得青钱柳粗碎物。

2.接着，加热程序中，以水为溶剂与青钱柳粗碎物以30:1(液固比)的重量比混合，并于85±5℃下提取约60分钟以形成一提取液。在此实施例中，溶剂与青钱柳粗碎物的重量比为20:1，浸泡时的温度为80℃，提取时间为60分钟。若溶剂过少或提取时间过短，则提取效率将会明显下降；若提取时间过长，则提取液中的有效成分可能会产生降解。

3.冷却前述提取液至室温(20℃-30℃)。

4.将提取液以400目数的滤网进行过滤，去除细微固体。

5.将前述提取液以浓缩机(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)，在60 ℃±5℃下进行减压浓缩至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)为10±0.5时停止浓缩，得到本发明的青钱柳提取液。在另一些实施例中，可于45℃-70℃下进行减压浓缩。

在另一些实施例中，可将上述青钱柳提取液再于400目数的滤网进行过滤，去除细微固体。

在另一些实施例中，前述的溶剂除水的外，另加一有机酸，而其中所述有机酸为柠檬酸。其比例占整体溶剂的0.05％。

实施例2.细胞基础代谢率试验

基础代谢率指的是身体维持基本机能所需耗费的能量，基础代谢率越高，身体消耗的能量越多，越容易拥有易瘦体质，即提升基础代谢率，可有效帮助预防及改善肥胖。

为探讨青钱柳提取液对细胞基础代谢率的影响，本实施例于此，透过代谢最终产物丙酮酸(Pyruvate)量以判断小鼠肌母细胞C2C12以青钱柳提取液处理后的基础代谢率变化。

材料与仪器

1.细胞株：小鼠肌母细胞C2C12，取自生物资源保存及研究中心BCRC； Cat.60083。

2.培养基：将Dulbecco改良培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle’sMedium， DMEM，购自Gibco，12100-046)添加额外成分使其含有10vol％FBS(fetal bovine Serum，购自Gibco，10437-028)及1％抗生素(购自Gibco，Cat. 15240-062)。

3.磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)：购自Gibco，产品编号10437-028。

4.马血清：购自Gibco，产品编号Cat.16050-122。

5.10X DPBS：购自Gibco，产品编号Cat.14200-075。

6.台盼蓝死细胞染色剂：购自Lonza，产品编号Cat.17-942E。

7.胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)：10X Trypsin-EDTA(购自SIGMA，产品编号Cat.59427C)以1X PBS溶液稀释10倍。

8.Bradford protein assay reagent(购自Bio-Rad，产品编号Cat.500-0006)。

9.Pyruvate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(购自BioVision，产品编号Cat.K609)。

10.青钱柳提取液：此实验中所使用的青钱柳提取液，是以实施例1的方式制备而成。

实验步骤

实验将会分为实验组以及控制组(未添加青钱柳提取液的组别)二组进行，各组分别进行三重复试验：

1.将小鼠肌母细胞C2C12以每孔1×10⁶个的方式，接种于每孔含2ml培养基的6孔培养盘中。

2.将培养盘置于5％CO2、37℃下，培养至八成满。

3.更换培养液为分化培养液(DMEM)，诱导细胞分化为肌小管。

4.加入待测样本于实验组，所述样本为透过实施例1所制备得到的青钱柳提取液，而控制组即不含青钱柳提取液，培养48小时。

5.培养完毕后，每孔以1mL的1X PBS溶液润洗2次。

6.以100μL/well Pyruvate Assay Buffer裂解细胞。

7.以10,000g于4℃离心10分钟，并收集上清液。

8.制作比色法所需的标准曲线：将丙酮酸标准品浓度稀释至1nmol/μL，以每孔50μL体积制备浓度0、2、4、6、8、10nmol/孔的标准曲线。

9.每孔待测样本加入50μL反应混合物(来自Pyruvate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit)置于室温反应30分钟。

10.进行Pyruvate含量的测定(测定570nm的吸光值)。

实验结果

参阅图1，其为经本发明的青钱柳提取液处理的实验组与未经本发明的青钱柳提取液处理的控制组的丙酮酸生成含量结果。由所述图可知，实验组的 C2C12细胞的丙酮酸生成有显著提升，其提升约78％，显示青钱柳提取液可有效提升细胞的基础代谢率，而基础代谢率增加意味着肌肉细胞生成率提升，且脂肪细胞堆积降低，以致细胞提升糖解作用的效率，进而可有效增进预防及改善肥胖的效率，同时减低因减肥造成的基础代谢降低易复胖的问题。

糖解作用(glycolysis)是将葡萄糖转化成丙酮酸(CH3COCOO-+H+)的代谢途径，在这个过程中所释放的自由能被用于形成高能量化合物ATP和 NADH，细胞中的丙酮酸生成量提升意味着糖解作用的效率上升，使细胞更有效率的产生能量，同时造成基础代谢率上升，故青钱柳提取液可有效提升糖解作用的效率，其有益于预防及改善肥胖相关症状。

基础代谢率是维持人体正常运作不可或缺的燃料，用于维持体内各细胞器官生理运作所需消耗的基础能量，正常人体中一公斤的脂肪能消耗约4-10卡的热量，而一公斤的肌肉则消耗约75-125卡热量，两者相差十倍的多，换言的，基础代谢率增加同时意味着肌肉细胞生成率提升，且脂肪细胞堆积降低，而身体消耗的能量越多，越容易拥有易瘦体质，可有效帮助预防及改善肥胖，故青钱柳提取液可有效促进肌肉细胞生成且降低脂肪细胞堆积，以达到提升基础代谢率的功效。

实施例3.青钱柳提取液抑制脂肪堆积功效试验

脂肪细胞内以油滴(Lipid droplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以观察细胞内油滴的数量，藉以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。

本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，OP9细胞购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，

)的OP9 细胞株(ATCC CRL-2749)。

首先，取24孔培养盘将每孔接种8×10⁴个OP9细胞及500μL培养基 (Medium)，所述培养基为MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，购自Gibco，产品编号Cat.12000-022)细胞培养液加入20％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，产品编号Cat.10437-028)及0.1％的青霉素/链霉素(Penicillin-streptomycin，购自Gibco，产品编号Cat.15240-062)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(ZEISS；放大倍率400x)观察细胞内油滴形成，藉以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。

然后，将分化完成的脂肪细胞分为二组：实验组与控制组。

实验组：依照每孔500μL培养基含有62.5μL的由本案实施例1的方式制备而成的青钱柳提取液(即，浓度为0.125％)将青钱柳提取液添加至含分化后的培养基中，在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。

控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。

接下来，依据下列步骤进行油红O的染色。于7天细胞处理后，将培养基移除，以1mL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗脂肪细胞两次，再加入1mL的10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1mL的PBS轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1mL的60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1mL的油红O作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红 O作用溶液并迅速地以1mL的60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟，再使用显微镜观察并拍摄细胞，如图2所示。

参考图2。实验组经由青钱柳提取液的处理的后可见油滴数量明显少于控制组。换言的，在脂肪细胞的成长过程中，经由青钱柳提取液的作用可以有效降低脂肪细胞堆积油脂。

后续，将染色后的各组再依下列步骤进行油红O的定量。加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μL 至96孔培养盘中，以测量ELISA读取仪(BioTek)读取各组的OD510nm读值。其中，利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体的间是否在统计上具有显著差异，如图3所示(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表 p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。

参考图3。将控制组的脂肪油滴含量视为1(即100％)时，实验组的脂肪油滴含量为70％。意即经由青钱柳提取液处理的后能显著地减少约30％的脂肪堆积量。此结果显示，青钱柳提取液能有效阻断脂肪细胞的增大，以减少脂肪细胞中油滴的含量，而达到抑制脂肪堆积的功效。

实施例4.脂肪代谢基因的细胞实验

本实施例以RNA提取套组、反转录酶、KAPA

FAST qPCR试剂组配合定量PCR仪，测定小鼠骨髓基质细胞OP9受经青钱柳提取液处理后，细胞中脂肪代谢基因的变化。

本实施例中以脂肪代谢基因(减脂基因)：ATGL基因、LIPE(HSL)基因、 UCP1基因及UCP2基因作为分析标的。

材料与仪器

细胞株：小鼠骨髓基质细胞OP9(购自BCRC，编号6566)。

培养基：含有20％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，编号 10438-026，美国)、1％抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，编号15240-062)的α-最低限度必需培养基(α-Minimum essential medium，简称α-MEM)(Gibco公司，编号12000-022)。

RNA提取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)

反转录酶(

III Reverse Transcriptase)(Invitrogen公司，美国，编号18080-051)。

测量标的基因引子，其中包含IL-8基因，另包括内部控制组(m-ACTB基因)。

KAPA

FAST qPCR试剂组(购自Sigma公司，美国，编号 38220000000)。

ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))。

青钱柳提取液：此实验中所使用的青钱柳提取液是透过如上述实施例1所获得。

实验步骤

首先，取1.5x10⁵个小鼠骨髓基质细胞至每孔含有2毫升上述培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时；将每孔培养后的小鼠骨髓基质细胞依据下列测试条件分为控制组(A组)以及实验组(B组)(共二组)来处理每孔培养后的小鼠骨髓基质细胞。

测试条件

组别	添加成分	细胞实验浓度	处理时间
				A组	无	无	无
B组	青钱柳提取液	青钱柳提取液0.0156mg/ml	6小时

详细来说，A组是单纯使用2毫升培养液来培养小鼠骨髓基质细胞，未再加入其他添加成分，用于做为实验控制组。

B组是将如上实施例所制备的青钱柳提取液以0.0156mg/ml浓度的培养基 2ml，培养小鼠骨髓基质细胞6小时。

以上A组及B组，每组进行三重复。

将处理后的小鼠骨髓基质细胞(即A组及B组)以细胞裂解液分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。接着，以RNA提取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，LotNo.FC24015-G)分别提取二组细胞溶液内的RNA。接着，每组取1000奈克(ng)的提取出的RNA作为模板，透过

III反转录酶 (购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将提取出的RNA反转录为相应的cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABIStepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPASYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表1的引子(SEQ ID NO:1 及SEQ IDNO:8)对二组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应 (quantitative real-timereverse transcription polymerase chain reaction)以观察二组的小鼠骨髓基质细胞内的ATGL基因、LIPE(HSL)基因、UCP1基因及UCP2 基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应 20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用 2-ΔCt方法进行基因定量。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量ATGL基因、LIPE(HSL)基因、UCP1基因及UCP2基因的mRNA 表现量，进而推断ATGL基因、LIPE(HSL)基因、UCP1基因及UCP2基因编码的蛋白质的表现量。

表1

*R为REVERSE反向，F为FORWARD顺向。

需要特别说明的是，下文述及的图式中显示的ATGL基因、LIPE(HSL)基因、UCP1基因及UCP2基因的相对基因表现是以相对倍率呈现，其中使用Excel 软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

请参阅图4，将控制组(A组)的ATGL基因、LIPE(HSL)基因、UCP1基因及UCP2基因的表现量视为1(即100％)时，实验组(B组)相对于控制组的ATGL基因的表现量为4.48(即448％)、LIPE(HSL)基因的表现量为3.19 (即319％)、UCP1基因的表现量为2.12(即212％)、且UCP2基因的表现量为3.08(即308％)，代表实验组的ATGL基因的表现量上升为控制组的4.48 倍、LIPE(HSL)基因的表现量上升为控制组的3.19倍、UCP1基因的表现量上升为控制组的2.12倍、且UCP2基因的表现量上升为控制组的3.08倍。

换言的，实验组相较于控制组的ATGL基因的表现量上升448％、LIPE(HSL) 基因的表现量上升308％、UCP1基因的表现量上升212％，及UCP2基因的表现量上升308％。

由此可知，当小鼠骨髓基质细胞以含有青钱柳提取液处理后，小鼠骨髓基质细胞的ATGL基因、LIPE(HSL)基因、UCP1基因及UCP2基因的表现量皆有上升的现象。

ATGL(Adipose triglyceride lipase)基因所编码的蛋白质为三酸甘油脂水解酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)。三酸甘油酯为脂肪细胞的脂滴或脂肪体中的主要构造成分，亦为脂肪细胞中储存能量的主要来源，而三酸甘油脂水解酶主要作用即为分解三酸甘油酯，三酸甘油酯水解酶存在于脂滴表面，被激活后三酸甘油脂水解酶会分解甘油三酯，为个体提供能量。因此，ATGL基因表现量上升，会促进脂肪细胞中脂肪的分解，并使其中脂肪累积量降低。

LIPE(lipase E)基因所编码的蛋白质为脂肪酶，其具有长形(Long form)与短形(Short form)。长形主要表达在类固醇生成组织(例如睾丸中)，其主要功能为将胆固醇酯(Cholesteryl esters)转化为游离的胆固醇，以利后续产生类固醇类激素。短形则主要表达在脂肪组织中，其主要功能为将存储的三酸甘油酯水解成游离的脂肪酸。因此，LIPE基因表达量上升，会促进脂肪细胞中脂肪的分解，并使其中脂肪累积量降低。

其中，UCP1(Uncoupling Protein 1)基因及UCP2(Uncoupling Protein 2)基因所编码的蛋白质为体解偶联蛋白(UCP)，其为线粒体阴离子载体蛋白 (Mitochondrial anioncarrier proteins,MACP)家族的成员的一，主要功能为将三磷酸腺核苷(Adenosinetriphosphate,ATP)还原，并促进阴离子从线粒体的内膜向外转移，及促进质子从外部到线粒体内膜的返回转移，并将过程中产生的能量以热能释放出来；其中，UCP1基因仅在棕色脂肪细胞中表达，所述棕色脂肪细胞含有大量的粒线体，能够燃烧脂肪油滴以产生热能；而UCP2基因则在许多组织中表达，且以骨骼肌表达量最高，被认为与非颤抖性生热(Nonshivering thermogenesis)有关。因此，UCP1基因及UCP2基因的表现量上升，能够促进脂肪的分解，并使脂肪的累积量降低。

如图4所示，所述结果显示本发明的青钱柳提取液能藉由显著提升ATGL 基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因四种与脂肪代谢相关基因的表现量，而使青钱柳提取液具有促进代谢脂肪的活性，以对脂肪分解具有促进的效果，更有效于预防及改善肥胖的症状。

实施例5.减重减脂人体实验-以内服方式使用青钱柳提取液

使用样品：含本发明的青钱柳提取液的饮品50g/瓶(以水以及本发明的青钱柳提取液所配制成每50g的饮品中含有4g的青钱柳提取液，即占8％)。其中，此青钱柳提取液是由实施例1的方法所制备而成。

受试者人数：8位20-55岁的受试者。

实验方式：受试者每日饮用一瓶含本发明的青钱柳提取液的饮品(每瓶含有4g的青钱柳提取液)，共饮用28日(即4周)。并于开始饮用前(第0周) 以及饮用14及28日后，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录体重与体脂的数值。(于饮用前、后进行检测时，受试者的饮食与运动习惯均保持不变，以避免影响检测的结果)。

体重与腰围：

使用体重机TANITA四肢与躯干体组成计，型号BC-545F。对同一受试者在饮用前与饮用后进行测量，并透过量尺测量受试者腰围数值。

体脂检测：

使用体脂测量仪器TANITA四肢与躯干体组成计，型号BC-545F进行全身体脂测量以及躯干体脂测量。

实验结果：

请参阅图5及图6。其分别为受试者在饮用含本案青钱柳提取液的饮品2 周及4周后的体重与腰围的平均变化量。其中，饮用4周后，受试者平均体重减轻0.4公斤，腰围减少2.5公分，其中，腰围改善人数高达78％。

请参阅图7及图8。其分别为饮用含本案青钱柳提取液的饮品2周及4周后的全身体脂量与躯干体脂的平均变化量(以百分比计算)。其中，饮用4周后，受试者全身体脂减少0.4％，躯干体脂有效减少0.4％。由此可见，本发明的青钱柳提取液具减少体重、减少全身体脂、减少躯干体脂及减少腰围的效果，即可达到瘦身、减重以及减体脂的功效。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

【序列表】

<110>百岳特生物技术（上海）有限公司

<120>青钱柳提取液用于提升减脂基因表现量、提升基础代谢率及/或抑制脂肪堆积的用途

<160> 10

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> ATGL-F

<400> 1

ggatggcggcatttcagaca 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> ATGL-R

<400> 2

caaagggttgggttggttcag 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> LIPE-F

<400> 3

tggcacaccattttgacctg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> LIPE-R

<400> 4

ttgcggttagaagccacatag 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> UCP1-F

<400> 5

aggcttccagtaccattaggt 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> UCP1-R

<400> 6

ctgagtgaggcaaagctgattt 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> UCP2-F

<400> 7

atggttggtttcaaggccaca 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> UCP2-R

<400> 8

cggtatccagagggaaagtgat 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> ACTB-F

<400> 9

ggctgtattcccctccatcg 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> ACTB-R

<400> 10

ccagttggtaacaatgccatgt 22

Claims

1.一种青钱柳提取液用于制备提升减脂基因表现量、提升基础代谢率及/或抑制脂肪堆积的组合物的用途，其特征在于，所述青钱柳提取液是以一溶剂对一青钱柳提取所得，所述溶剂为含水的溶剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述溶剂与所述青钱柳的重量比范围为50：1至1：1。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述提取是于55℃至100℃进行0.5至2小时。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述青钱柳提取液的浓度至少为0.0156mg/mL。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述减脂基因包括三酸甘油酯脂解酶基因、脂肪酶E基因、体解偶联蛋白1基因、及/或体解偶联蛋白2基因中至少一项基因。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述青钱柳提取液是通过包括促进肌肉细胞生成、降低脂肪细胞生成、及/或提升糖解作用的效率以达到所述提升基础代谢率之功效。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述提升基础代谢率是为提升肌肉细胞丙酮酸生成。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述青钱柳提取液是促进代谢脂肪的活性。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述促进代谢脂肪的活性包括减少体重、减少全身体脂、减少躯干体脂及减少腰围。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为医药组合物、食品组合物、或保健食品组合物。