TWI761032B

TWI761032B - 蒲公英萃取物用於製備促進脂肪代謝的組合物之用途

Info

Publication number: TWI761032B
Application number: TW110101352A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 張蓉
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2022-04-11
Also published as: TW202128205A; CN113134027A; TWI789686B; CN113134024A; TWI774195B; TW202128202A; CN113136350A; CN113134056A; TW202128983A; CN113134070A; TWI764520B; TW202128029A; TW202128206A

Abstract

蒲公英(Taraxacum mongolicum)萃取物用於製備促進生理代謝活性的組合物之用途，其中該生理代謝包含脂肪代謝及水份代謝，其中該蒲公英萃取物係由蒲公英以一溶劑萃取而得，其中該溶劑為水。本發明之蒲公英萃取物能降低PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因之表現量及提升UCP1基因、CETP基因之表現量進而達到降低脂肪堆積、促進膽固醇代謝、提升肌肉量、保護腎小管細胞存活於高鹽溶液、促進水通道蛋白表現及/或提升排尿量之功效。

Description

蒲公英萃取物用於製備促進脂肪代謝的組合物之用途

本發明涉及一種蒲公英(Taraxacum mongolicum)萃取物之用途，特別是用於製備促進生理代謝活性的組合物之用途。

肥胖已逐漸成為一不可忽視之社會問題，其一般被視為體脂肪累積過多而對健康造成負面影響的身體狀態，而水腫亦屬於肥胖的一種型態，以致於人體中的生理代謝能力強弱容易影響一個人之肥胖程度，該生理代謝能力包含脂質代謝與水份代謝。

肥胖的患者常伴隨其他的健康衍生問題，並會導致罹患高血壓、心血管障礙、高脂血症、動脈硬化及糖尿病等各種相關疾病的風險增加，亦會併發血管障礙、視力障礙、神經障礙、抵抗力降低等併發症。截至2016年，世界衛生組織估計有39%的人口超重(約19億人)，且約有13%的人口屬於肥胖(約6億人)，肥胖症的發生率逐年增加。

因應現代人所面臨的肥胖問題，近年來社會對於保健、瘦身及減脂等概念更為注重，因此，研發一種能有效促進生理代謝活性以解決肥胖及因肥胖而衍生之健康問題，著實有其必要性。

蒲公英之學名為Taraxacum mongolicum，其為多年生草本植物，花莖是空心的，折斷之後有白色的乳汁。歐洲傳統以草本食療為上，早期即會使用蒲公英作為花草茶飲用提神、幫助身體代謝，因此，具有多種療效的蒲公英擁有「藥草皇后」的美譽，其具有抗氧化的功效，直至現今，歐洲人甚至會將蒲公英曬乾，用來取代咖啡豆，製成「蒲公英咖啡」，不僅沒有咖啡因的副作用，還具有提神醒腦與提升代謝的功效。然其是否具有更多功效及其實際作用方式還有待確認。

有鑑於此，本發明之一目的在於提供一種蒲公英萃取物用於製備促進生理代謝活性的組合物之用途，其中該生理代謝包含脂肪代謝及水份代謝，其中該蒲公英萃取物係由蒲公英以一溶劑萃取而得，其中該溶劑為水。

在一些實施例中，蒲公英萃取物用於調控脂肪代謝相關基因，包含過氧化物酶體增殖物活化受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2,PPARG2)基因、CCAAT增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha,C/EBP-α)基因、葡萄糖轉運蛋白(Glucose transporter type 4,GLUT4)基因、體解偶聯蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)基因及/或膽固醇酯轉移蛋白(Cholesteryl Ester Transfer Protein,CETP)基因。

在一些實施例中，其中該蒲公英萃取物係透過降低過氧化物酶體增殖物活化受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2,PPARG2)基因、降低CCAAT增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha,C/EBP-α)基因、降低葡萄糖轉運蛋白(Glucose transporter type 4,GLUT4)基因、提升體解偶聯蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)基因及/或提升膽固醇酯轉移蛋白(Cholesteryl Ester Transfer Protein,CETP)基因之表現量，以達到該促進生理代謝活性之用途。

在一些實施例中，該脂肪代謝包含降低脂肪堆積、促進膽固醇代謝及提升肌肉量之功效。

在一些實施例中，該降低脂肪堆積包含減少全身體脂肪、減少軀幹體脂肪、減少皮下脂肪、減少內臟脂肪、減少腰圍及減少臀圍。

在一些實施例中，該促進膽固醇代謝包含降低血液總膽固醇及降低低密度脂蛋白膽固醇。

在一些實施例中，該水份代謝包含保護腎小管細胞存活於高鹽溶液、促進水通道蛋白表現及提升排尿量。

在一些實施例中，該溶劑與該蒲公英之重量比範圍為50：1至1：1。

在一些實施例中，該萃取係於75℃至100℃進行0.5至2小時。

在一些實施例中，該蒲公英萃取物之濃度至少為0.0125mg/mL，較佳為至少0.125mg/mL。

在一些實施例中，該組合物為醫藥組合物、食品組合物、或保健食品組合物。

在一些實施例中，該蒲公英萃取物之Brix值為10±0.5以上。

綜上所述，任一實施例的蒲公英萃取物可用於製備促進生理代謝活性的組合物之用途。任一實施例的蒲公英萃取物透過調控脂肪代謝相關基因以達到降低脂肪堆積、促進膽固醇代謝、提升肌肉量及/或提升排尿量之功效。任一實施例的蒲公英萃取物可用於製備減少全身體脂肪、減少軀幹體脂肪、減少皮下脂肪、減少內臟脂肪、減少腰圍、減少臀圍、降低血液總膽固醇、降低低密度脂蛋白膽固醇、保護細胞存活於高鹽溶液及促進水通道蛋白的組合物。

圖1係為本發明之實施例二中的實驗組及控制組的相對PPARG2基因表現量比較圖。

圖2係為本發明之實施例二中的實驗組及控制組的相對C/EBP-α基因表現量比較圖。

圖3係為本發明之實施例二中的實驗組及控制組的相對GLUT4基因表現量比較圖。

圖4係為本發明之實施例二中的實驗組及控制組的相對UCP1基因表現量比較圖。

圖5係為本發明之實施例二中的實驗組及控制組的相對CETP基因表現量比較圖。

圖6係為本發明之實施例三的實驗組及控制組之相對脂肪油滴含量比較圖。

圖7係為本發明之實施例四的實驗組、控制組及對照組之相對細胞存活率比較圖。

圖8係為本發明之實施例五的實驗組及控制組之螢光顯微影像圖。

圖9係為試驗者飲用蒲公英萃取飲0週及4週後之血液總膽固醇變化圖。

圖10係為試驗者飲用蒲公英萃取飲0週及4週後之血液低密度脂蛋白膽固醇變化圖。

圖11係為試驗者飲用蒲公英萃取飲0週及4週後之全身體脂變化圖。

圖12係為試驗者飲用蒲公英萃取飲0週及4週後之軀幹體脂變化圖。

圖13係為試驗者飲用蒲公英萃取飲0週及4週後之皮下脂肪變化圖。

圖14係為試驗者飲用蒲公英萃取飲0週及4週後之內臟脂肪變化圖。

圖15係為試驗者飲用蒲公英萃取飲0週及4週後之臀圍變化圖。

圖16係為試驗者飲用蒲公英萃取飲0週及4週後之腰圍變化圖。

圖17係為試驗者飲用蒲公英萃取飲0週及4週後之肌肉量變化圖。

圖18係為試驗者飲用蒲公英萃取飲前及後之排尿量變化圖。

以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。

本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，各組之間的差異以學生t檢驗(student’s t-test)進行分析。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。

本文中之「wt%」係指重量百分比，而「vol%」係指體積百分比。

如本文中所使用，術語「萃取物」係指藉由萃取作用所製備之產物。該萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現，亦可以乾燥後之粉體呈現。

本文所述之「有效濃度」或「有效量」係表示能能有效調控脂肪代謝相關基因及/或抗水腫所需本發明之蒲公英萃取物的濃度。有效濃度依所作用的對象而可能不同，但可藉由例如劑量遞增試驗(Dose escalation)以實驗決定其有效濃度。

如本文所用「蒲公英」通常係指蒲公英全株，其中該蒲公英之全株可包含原始、經乾燥或以其他物理方式加工以利於處理之蒲公英，其可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之型態。

在一些實施例中，該蒲公英萃取物係由蒲公英以一溶劑萃取而得，其中該溶劑為水。在一些實施例中，蒲公英萃取物係將蒲公英原料依序進行粉碎程序、加熱程序、過濾程序、及濃縮程序後得到。

在一些實施例中，蒲公英原料可以是粉碎或完整的蒲公英。在一些實施例中，蒲公英原料可以是新鮮或乾燥的蒲公英。

在一些實施例中，蒲公英全株係購自臺灣屏東。

在一些實施例中，粉碎程序是指將蒲公英原料攪打至平均粒徑小於20mm。舉例而言，粉碎可以採用果汁機、調理機或均質機。

在一些實施例中，加熱程序是指將碎裂之蒲公英原料與含水之溶劑混合後加熱一段固定時間。在一些實施例中，加熱是指將蒲公英原料與水的溫度提升到75℃~100℃。在一些實施例中，一段固定時間是指0.5小時到2小時。在一些實施例中，加熱完成後可進行回流幫浦(3.0±0.5kg/cm²)。舉例而言，將蒲公英原料與水的溫度提升到85℃進行萃取90分鐘。

在一些實施例中，加熱程序中的重量比例(水：蒲公英原料)為1：1至50：1。舉例而言，水：蒲公英原料為10：1。

舉例而言，採用80公斤重的蒲公英原料、1600公斤重的水混合後持續加熱到90℃，並持續120分鐘。

在一些實施例中，過濾程序是指將加熱後(或降溫後)的蒲公英原料及溶劑通過篩網以將溶劑內的固體濾除形成過濾液。舉例而言，篩網可以是400網目(mesh)的篩網。

在一些實施例中，加熱程序與過濾程序之間還包括一降溫程序，其中降溫程序是指將加熱後的蒲公英原料及溶劑靜置以自然降溫至室溫。

在一些實施例中，濃縮程序是指將過濾程序所得到的過濾液進行減壓濃縮(廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100)以得到初萃液。在一些實施例中，濃縮程序所得的初萃液即可為蒲公英萃取物。在濃縮程序的一些實施例中，在40℃~70℃之間進行減壓濃縮。舉例而言，蒲公英萃取物是將蒲公英原料依序進行粉碎程序、加熱程序、過濾程序及濃縮程序後得到。

在一些實施例中，經濃縮程序所得的蒲公英萃取物降溫後可再進行粗過濾。舉例而言，以400網目(mesh)的篩網進行粗過濾。

在一些實施例中，蒲公英萃取物用於製備促進生理代謝活性的組合物之用途，其中該生理代謝包含脂肪代謝及水份代謝，其中該蒲公英萃取物係由蒲公英以一溶劑萃取而得，其中該溶劑為水。

其中，PPARG2與C/EBP-α基因被視為脂肪生成的重要基因，故降低PPARG2與C/EBP-α基因表現有助於減少脂肪形成。另外，GLUT4是細胞轉運葡萄糖的載體，胰島素刺激細胞表現GLUT4並轉移到細胞膜上，促進葡萄糖分子進入細胞代謝，但若GLUT4基因過度表達，則會導致脂肪組織增加。UCP1在棕色脂肪中含量較多，已知可協助脂肪燃燒產熱。CETP基因的表現與膽固醇的代謝有關，其可有效提升膽固醇代謝活性。

在一些實施例中，該水份代謝包含保護腎小管細胞存活於高鹽溶液、促進水通道蛋白表現及提升排尿量。提升腎小管細胞於高鹽環境中之存活率，可有助於提升腎臟功能，而水通道蛋白表現亦有助於水分的運輸，其可達到提升抗水腫能力。

在一些實施例中，該萃取係於75℃至100℃進行0.5至2小時。

在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有有效含量的蒲公英萃取物。

在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品(injection)、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。在一些實施例中，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

在一些實施例中，醫藥品可進一步包含有被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。

在一些實施例中，前述之組合物可為可食用組合物。在一些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或可為食品添加物(food additive)，意即藉由習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。

在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

以下將詳細說明本發明之蒲公英萃取物之萃取方法；該蒲公英萃取物調控脂肪代謝相關基因PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP基因表現量之功效；該蒲公英萃取物提升腎小管上皮細胞於高鹽之存活率功效測試；該蒲公英萃取物促進水通道蛋白表現之功效測試；以及該蒲公英萃取飲對於降低血液總膽固醇、降低低密度脂蛋白膽固醇、減少全身體脂肪、減少軀幹體脂肪、減少皮下脂肪、減少內臟脂肪、減少腰圍、減少臀圍、提升肌肉量及/或提升排尿量之功效測試，以證實本發明之蒲公英萃取物確實具有促進生理代謝活性之功效，並能同時有效降低脂肪堆積、提升肌肉量及提升排尿量，進而減少體脂、全身體脂、軀幹體脂、腰圍及臀圍，以達到減脂、抗水腫、預防及改善肥胖的功效。

實施例一、蒲公英萃取物之製備方法

在此實施例中，蒲公英萃取物的製備步驟如下：

1.首先，進行粉碎程序。將蒲公英(產地：臺灣屏東)進行粗碎(Osterizer品牌的10 speed blender)並以孔徑為12mm的篩網將其過篩，去除過大顆粒後取得蒲公英粗碎物。

2.接著，加熱程序中，以水為溶劑與蒲公英粗碎物以10：1(液固比)的重量比混合，並於85±5℃下萃取約90分鐘以形成一萃取液。若溶劑過少或萃取時間過短，則萃取效率將會明顯下降；若萃取時間過長，則萃取物中的有效成分可能會產生降解。

3.將萃取液以400目數的濾網進行過濾，去除細微固體。

4.將前述萃取液以濃縮機(廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100)，在60℃±5℃下進行減壓濃縮。在另一些實施例中，可於45℃-70℃下進行減壓濃縮。

5.將前述萃取液降溫至80℃。

6.再將萃取液以400目數的濾網進行粗過濾，去除細微固體，得到本發明之蒲公英萃取物。

於此，將上述蒲公英萃取物進行檢測規格，確認其白利糖度值(Degrees Brix)為10±0.5，以確保其品質。

實施例二、脂肪代謝相關基因的細胞實驗

本實施例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定小鼠骨髓基質細胞OP9受經蒲公英萃取物處理後，細胞中脂肪代謝基因的變化。

本實施例中以脂肪代謝相關基因(減脂相關基因)：PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP基因作為分析標的。

材料與儀器

1. 細胞株：小鼠骨髓基質細胞OP9(購自BCRC，編號6566)。

2. 培養基：含有20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，編號10438-026，美國)、1%抗生素-抗黴菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，編號15240-062)的α-最低限度必需培養基(α-Minimum essential medium，簡稱α-MEM)(Gibco公司，編號12000-022)。

3. RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)。

4. 反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase)(Invitrogen公司，美國，編號18080-051)。

5. 測量標的基因引子，其中包含PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP基因，另包括內部控制組(m-ACTB 基因)。

6. KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)。

7. ABI StepOnePlus^TM即時PCR系統(ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國))。

8. 蒲公英萃取物：此實驗中所使用的蒲公英萃取物是透過如上述實施例1所獲得。

實驗步驟

首先，取1.5x10⁵個小鼠骨髓基質細胞至每孔含有2毫升上述培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時；將每孔培養後的小鼠骨髓基質細胞依據下列測試條件分為控制組以及實驗組(共二組)來處理每孔培養後的小鼠骨髓基質細胞。

測試條件

詳細來說，控制組是單純使用2毫升培養液來培養小鼠骨髓基質細胞，未再加入其他添加成分，用於做為實驗控制組。

實驗組是將如上實施例所製備的蒲公英萃取物以0.125mg/ml濃度的培養基2ml，培養小鼠骨髓基質細胞24小時。

以上控制組及實驗組，每組進行三重複。

將處理後的小鼠骨髓基質細胞以細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。接著，以RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)分別萃取二組細胞溶液內的RNA。接著，每組取1000奈克(ng)的萃取出的RNA作為模板，透過SuperScript^® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)將萃取出的RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlus^TM即時PCR系統(ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國))、KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)及表1的引子(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：12)對二組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)以觀察二組的小鼠骨髓基質細胞內的PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應20秒，接著95℃反應3秒，60℃反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2^-△Ct方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP基因的mRNA表現量，進而推斷PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP基因編碼的蛋白質的表現量。

需要特別說明的是，下文述及之圖式中顯示的PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。

請參閱圖1，將控制組的PPARG2基因的表現量視為1(即100%)時，實驗組相對於控制組的PPARG2基因的表現量為0.63 (即63%)，代表實驗組的PPARG2基因的表現量相較控制組下降37%。

請參閱圖2，將控制組的C/EBP-α基因的表現量視為1(即100%)時，實驗組相對於控制組的C/EBP-α基因的表現量為0.44(即44%)，代表實驗組的C/EBP-α基因的表現量相較控制組下降56%。

請參閱圖3，將控制組的GLUT4基因的表現量視為1(即100%)時，實驗組相對於控制組的GLUT4基因的表現量為0.79(即79%)，代表實驗組的GLUT4基因的表現量相較控制組下降21%。

請參閱圖4，將控制組的UCP1基因的表現量視為1(即100%)時，實驗組相對於控制組的UCP1基因的表現量為1.71(即171%)，代表實驗組的UCP1基因的表現量相較控制組上升171%。

請參閱圖5，將控制組的CETP基因的表現量視為1(即100%)時，實驗組相對於控制組的CETP基因的表現量為5.99(即599%)，代表實驗組的CETP基因的表現量相較控制組上升599%。

換言之，實驗組相較於控制組的PPARG2基因的表現量下降37%、C/EBP-α基因的表現量下降56%、GLUT4基因的表現量下降21%、UCP1基因的表現量上升171%，及CETP基因的表現量上升599%。

由圖1至圖3可知，當小鼠骨髓基質細胞以含有蒲公英萃取物處理後，小鼠骨髓基質細胞的PPARG2基因、C/EBP-α基因及GLUT4基因的表現量皆有下降的現象。

PPARG2(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2)基因所編碼的蛋白質為過氧化物酶體增殖物活化受體γ，亦稱為胰島素增敏劑受體，是脂肪細胞分化和葡萄糖穩態的關鍵調節器，其被廣泛認為與脂肪的合成有關，因對脂肪細胞和胰島素有重要的作用，故被列為治療糖尿病的重點研究基因之一。當其表現量上升時，會導致脂肪之生成速率上升，促進脂肪之堆積；反之，當其表現量下降時，會抑制脂肪的形成。另外，該PPARG2具有抑制NF-κB介導的發炎反應功效，可作為腸道穩態的關鍵調節劑，且可調節血管中ARNTL/BMAL1的轉錄，在心血管晝夜節律的調節中亦可發揮作用。

C/EBP-α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha)基因所編碼的蛋白質為CCAAT增強子結合蛋白α，多數被認為與脂肪合成有關的蛋白之基因編碼上常具有CCAAT增強子的序列，以致於C/EBP蛋白家族係脂肪生成(形成新的脂肪細胞的過程)和肝臟中葡萄糖和脂質代謝中的關鍵調節劑。另外，其亦是參與血細胞分化的重要轉錄因子，C/EBP蛋白家族調節包括肝臟代謝、脂肪生成、血細胞生成、炎症過程及腫瘤發生等多項重要生理功能。

GLUT4(Glucose transporter type 4)基因所編碼的蛋白質為葡萄糖轉運蛋白，係細胞轉運葡萄糖的關鍵載體，其主要作用係在胰島素刺激之下，脂肪和骨骼肌細胞內會合成GLUT-4蛋白，並從細胞質內的儲存位置移動到細胞膜上將葡萄糖帶進細胞內，因此被認為係脂肪細胞合成和葡萄糖穩態的重要調控蛋白，當其表現量下降時，會達到抑制脂肪生成的效果。

由圖4及圖5可知，當小鼠骨髓基質細胞以含有蒲公英萃取物處理後，小鼠骨髓基質細胞的UCP1基因及CETP基因的表現量皆有上升的現象。

UCP1(Uncoupling Protein 1)基因所編碼的蛋白質為體解偶聯蛋白(UCP)，其為線粒體陰離子載體蛋白(Mitochondrial anion carrier proteins,MACP)家族的成員之一，主要功能為將三磷酸腺核苷(Adenosine triphosphate,ATP)還原，並促進陰離子從線粒體的內膜向外轉移，及促進質子從外部到線粒體內膜的返迴轉移，並將過程中產生的能量以熱能釋放出來；其中，UCP1基因僅在棕色脂肪細胞中表達，該棕色脂肪細胞含有大量的粒線體，能夠燃燒脂肪油滴以產生熱能。因此，UCP1基因的表現量上升，能夠促進脂肪的分解，並使脂肪的累積量降低。

CETP(Cholesteryl Ester Transfer Protein)基因所編碼的蛋白質為膽固醇酯轉移蛋白，亦稱為血漿脂質轉移蛋白，其作用主要係促進膽固醇酯和甘油三酸酯在脂蛋白之間的運輸，被廣泛認知為膽固醇代謝與運輸的重要調節蛋白，當其表現量上升時，可有效促進膽固醇的代謝。

綜上所述，如圖1至圖5所示，該結果顯示本發明之蒲公英萃取物能顯著降低PPARG2基因、C/EBP-α基因及GLUT4基因的表現量，上述三個脂肪代謝相關基因係與脂肪合成有關，因此蒲公英萃取物具有抑制脂肪合成之功效。另外，本發明之蒲公英萃取物可顯著提升UCP1基因的表現量，以達到促進脂肪燃燒分解的效果；而CETP基因的顯著上升，顯示蒲公英萃取物亦可有效促進膽固醇之代謝。上述五個基因皆與脂肪代謝相關，而使蒲公英萃取物具有降低脂肪堆積及促進脂肪分解的活性，且亦有促進膽固醇代謝之功效，本發明之蒲公英萃取物具有促進生理代謝活性之功效，且能有效預防及改善肥胖之症狀。

實施例三、蒲公英萃取物抑制脂肪堆積功效試驗

脂肪細胞內以油滴(Lipid droplet)的形式貯存脂肪。基此，本次試驗分析染色後的油滴，以觀察細胞內油滴的數量，藉以確認脂肪堆積的狀態。後續，再將染劑溶出並分析以作為量化的數值指標。

本次試驗採用小鼠骨髓基質細胞(後續簡稱OP9細胞)，OP9細胞購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC^®)之OP9細胞株(ATCC CRL-2749)。

首先，取24孔培養盤將每孔接種8×10⁴個OP9細胞及500μL培養基(Medium)，該培養基為MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，產品編號Cat.12000-022)細胞培養液加入20%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號Cat.10437-028)及0.1%之青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin，購自Gibco，產品編號Cat.15240-062)，在37℃下培養7天。此7天的細胞培養期間每隔3天更換培養基。7天後，以顯微鏡(ZEISS；放大倍率400x)觀察細胞內油滴形成，藉以確認細胞已完全分化為脂肪細胞。

然後，將分化完成的脂肪細胞分為二組：實驗組與控制組。

實驗組：添加由本案實施例一之方式製備而成的蒲公英萃取物，使其培養基濃度為0.0125mg/mL，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。

控制組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至含分化後的脂肪細胞的分化培養基中，在37℃下培養7天。此7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。

接下來，依據下列步驟進行油紅O的染色。於7天細胞處理後，將培養基移除，以1mL之磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗脂肪細胞兩次，再加入1mL之10%甲醛並於室溫下反應30分鐘以固定脂肪細胞。接著移除甲醛後以1mL之PBS輕輕地清洗脂肪細胞兩次，接著於每孔細胞內加入1mL之60%異丙醇，反應1分鐘後，移除異丙醇並加入1mL之油紅O作用溶液與脂肪細胞反應，於室溫下反應1小時，接著移除與脂肪細胞作用的油紅O作用溶液並迅速地以1mL之60%異丙醇進將脂肪細胞行脫色5秒鐘，再使用顯微鏡觀察並拍攝細胞。

後續，將染色後的各組再依下列步驟進行油紅O的定量。加入100%異丙醇於染色之細胞中，並置於振盪器上反應10分鐘以溶解油滴，接著取100μL至96孔培養盤中，以測量ELISA讀取儀(BioTek)讀取各組之OD_510nm讀值。其中，利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異(圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著)。

參考圖6。將控制組的脂肪油滴含量視為1(即100%)時，實驗組的脂肪油滴含量為57%。意即經由蒲公英萃取物處理之後能顯著地減少約42%的脂肪堆積量。此結果顯示，蒲公英萃取物能有效阻斷脂肪細胞的增大，以減少脂肪細胞中油滴的含量，而達到抑制脂肪堆積之功效。

實施例四、腎小管細胞於高滲透壓之存活率檢測

高滲透壓是引起細胞損傷的生理壓力之一，在哺乳動物中，腎臟細胞及其衍生的細胞機制為主要調控生理滲透壓的方式，本實施例探討經蒲公英萃取物處理後，其是否具備保護細胞免受高濃度電解質的干擾作用，並提升對抗高滲透壓的能力。於此，藉由檢測腎小管細胞的存活率來了解蒲公英萃取物對於保護細胞於高鹽環境的功效。

材料與儀器：

1. 細胞株：哺乳動物腎小管上皮細胞MDCK(Madin Darby canine kidney cells)，購自美國典型培養物保存中心(American Type CμLtureCollection，ATCC^®，CCL-34^TM)，以下簡稱MDCK細胞。

2. 培養基：將DMEM改良培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，購自Gibco，Cat.12100-038)添加額外成分使其含有10vol% FBS(fetal bovine Serum，購自Gibco，10438-026)及1%青黴素-鏈黴素(購自Gibco，Cat.15140122)。

3.酵素免疫分析儀(ELISA reader，購自BioTek，產品編號FLx 800)。

4.蒲公英萃取物：由本案實施例一之製備方式所製得。

實驗步驟：

於每一孔中加入100μL上述培養基，並將MDCK細胞以3 x 10³的每孔密度種入一96孔盤中，培養24小時。

本實驗分為控制組、對照組及實驗組。其中，各組加入100μL的新鮮DMEM培養液。而對照組及實驗組之培養液額外加入氯化鈉(NaCl)，使其滲透壓為500mOsm/kg；實驗組之培養液額外加入蒲公英萃取物，使其濃度為1mg/mL。各組進行三重複，並於37℃下，培養24小時。

培養完畢後於每孔中加入15μL的MTT細胞凋亡檢測溶液(3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)，反應3小時。

使用ELISA讀盤機測量細胞溶液在570nm的吸光值，以探討各組別之細胞存活率。所得數值再以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定進行統計分析。

實驗結果：

由圖7所示，對照組相對控制組之腎小管細胞存活率為38.9%，由此可知，高滲透壓會導致細胞凋亡之現象。然而，實驗組(經蒲公英萃取物處理之組別)相對控制組之腎小管細胞存活率為52.6%。實驗組與對照組相比腎小管細胞存活率提升約13.7%，由此可知，蒲公英萃取物具有保護腎小管細胞於高鹽溶液下存活之功效。因此，藉由本發明實施例所製備之蒲公英萃取物具有保護腎小管細胞抵抗高滲透壓之生理壓力，以致於可應用於抗水腫相關組合物的成分中。

實施例五、水通道蛋白表現試驗

於此，藉由抗體標定蛋白質之特性，以螢光的方式，觀察水通道蛋白之表現，測定人類初代皮膚角質細胞HPEK-50經蒲公英萃取物處理後，其細胞之水通道蛋白的表現變化。

材料與儀器：

1. 細胞株：人類初代皮膚角質細胞(Human primary epidermal keratinocytes，購自CELLnTEC公司(瑞士)，HPEK-50)。

2. 培養基：無血清之角質細胞培養液(keratinocyte-SFM)：購自Thermo公司，美國，編號為Cat.17005042。

3.磷酸緩衝鹽溶液(PBS溶液)：購自Gibco，產品編號10437-028。

4. 10x DPBS：購自Gibco，產品編號14200-075。

5. 台盼藍死細胞染色劑：購自Lonza，產品編號Cat.17-942E。

6.胰蛋白酶：10X Trypsin-EDTA(購自Gibco)以1X PBS溶液稀釋10倍。

7.抗AQP3抗體(Anti-AQP3 antibody)：購自Boster，產品編號Cat.PA1488。

8.抗老鼠alexa 488抗體(Anti-mouse-alexa 488 antibody)：購自Thermo，產品編號Cat.A28175。

9.曲拉通X-100(Triton X-100)：購自Merck，產品編號Cat.9002-93-1。

10.牛血清白蛋白(Bovine serum albumins,BSA)：購自Sigma，產品編號Cat.A9418。

11.赫斯特染色劑(Hoechst 33342)：購自Thermo，產品編號Cat.62249。

12.甲醛(Formaldehyde)：購自景明，產品編號Cat.119690010。

13.螢光封片劑(Mounting medium)：購自HarSet，產品編號Cat.H-1500-NB。

14. 蒲公英萃取物：由本案實施例一之製備方式所製得。

實驗步驟：

實驗將會分為實驗組A、實驗組B及控制組(未添加蒲公英萃取物)三組進行：

1. 將人類初代皮膚角質細胞以每孔5×10³個的密度，接種於每孔含100μL培養基之96孔培養盤中，並於實驗組A之培養液額外加入蒲公英萃取物，使其濃度為0.5mg/mL；於實驗組B之培養液額外加入蒲公英萃取物，使其濃度為1mg/mL。各組進行三重複，並於37℃下，培養24小時。

2. 培養完畢後，移除培養基，並加入10%甲醛，於室溫下固定15分鐘。

3. 移除各孔培養基，並以1X DPBS沖洗細胞3次後，加入0.5% Triton X-100，並於室溫下固定10分鐘。

4. 移除各孔培養基，並加入固定溶液(Blocking solution，100mg BSA溶於10ml 1X DPBS)，於室溫下作用1小時。

5. 加入抗AQP3抗體，於37℃作用2小時。

6. 移除各孔培養基，並以1X DPBS沖洗細胞3次後，加入抗老鼠alexa 488抗體，於37℃作用1小時。

7. 移除各孔培養基，並以1X DPBS沖洗細胞3次後，加入Hoechst 33342染劑，於室溫下作用3-5分鐘。

8. 移除各孔培養基，並以1X DPBS沖洗細胞3次。

9. 以螢光顯微鏡觀察並拍照紀錄。

實驗結果：

如圖8所示，偵測到的水通道蛋白於螢光顯微照片下會呈現綠色螢光，由此可知，與對照組相較之下，經本發明蒲公英萃取物處理後之實驗組A及實驗組B的水通道蛋白皆有生成之趨勢，其中，實驗組B偵測到之水通道蛋白與實驗組A相比又有更多之生成量，由此可知，本發明之蒲公英萃取物具有促進水通道蛋白生成的功效，藉此有益於增加細胞含水量，並可達到抗水腫之功效。

實施例六、人體試驗-以內服方式施用蒲公英萃取物

使用樣品：含本發明之蒲公英萃取物之飲品50g/瓶(以水以及本發明之蒲公英萃取物所配製成每50g的飲品中含有4g的蒲公英萃取物，即佔8%)。其中，此蒲公英萃取物係由實施例一之方法所製備而成。

受試者人數：7位(BMI>24或體脂≧25%之受試者)。

實驗方式：受試者每日飲用一瓶含本發明之蒲公英萃取物之飲品(每瓶含有4g的蒲公英萃取物)，共飲用28日(即4週)。並於開始飲用前(第0週)以及飲用28日後，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，進行血液採集及體組成量測。(於飲用前、後進行檢測時，受試者之飲食與運動習慣均保持不變，以避免影響檢測之結果)。

體脂、臀圍及腰圍檢測：

使用體脂測量儀器TANITA四肢與軀幹體組成計，型號BC-545F進行皮下體脂、內臟體脂、全身體脂、軀幹體脂及肌肉量測量，並透過量尺測量受試者臀圍及腰圍數值。

實驗結果：

請參閱圖9及圖10。其分別為受試者在飲用含本案蒲公英萃取物之飲品0周及4周後之總膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇之平均變化量。其中，受試者平均總膽固醇於飲用前為201mg/dl，而飲用4周後，平均總膽固醇降為187mg/dl，約降低7%；另外，受試者平均低密度脂蛋白膽固醇於飲用前為123.1mg/dl，而飲用4周後，平均低密度脂蛋白膽固醇降為113.4mg/dl，約降低7.9%。

請參閱圖11。該圖係受試者飲用含本發明之蒲公英萃取物之飲品0周及4周後之平均全身體脂量。其中，受試者於飲用前之平均全身體脂量為17.6公斤，而於飲用4週後之平均全身體脂量為17.2公斤，平均減少約0.4公斤，達統計上之顯著。

請參閱圖12。該圖係受試者飲用含本發明之蒲公英萃取物之飲品0周及4周後之平均軀幹體脂量。其中，受試者於飲用前之平均軀幹體脂量為9公斤，而於飲用4週後之平均軀幹體脂量為8.8公斤，平均減少約0.2公斤，達統計上之顯著。

請參閱圖13。該圖係受試者飲用含本發明之蒲公英萃取物之飲品0周及4周後之平均皮下體脂量。其中，受試者於飲用前之平均皮下體脂量為15.7公斤，而於飲用4週後之平均皮下體脂量為15.3公斤，平均減少約0.4公斤，達統計上之顯著。

請參閱圖14。該圖係受試者飲用含本發明之蒲公英萃取物之飲品0周及4周後之平均內臟體脂量(以百分比計算)。其中，受試者於飲用前之平均內臟體脂量定為100%，而於飲用4週後之平均內臟體脂量為93.9%，平均降低約6.1%，達統計上之顯著。

請參閱圖15及圖16。其分別為受試者在飲用含本案蒲公英萃取物之飲品0周及4周後之臀圍及腰圍之平均變化量。其中，受試者之平均臀圍及腰圍於飲用前分別為97.4公分及80.6公分；於飲用4周後，受試者之平均臀圍及腰圍分別為95.2公分及78.3公分，受試者平均臀圍減少約2.2公分，平均腰圍減少約2.3公分。

請參閱圖17。該圖係受試者飲用含本發明之蒲公英萃取物之飲品0周及4周後之平均肌肉量。其中，受試者於飲用前之平均肌肉量為38.1公斤，而於飲用4週後之平均肌肉量為38.7公斤，平均增加約0.6公斤。

參照圖9至圖17，相比飲用前(第0週)，持續4週飲用蒲公英萃取物飲可使平均總膽固醇減少約7%、平均低密度脂蛋白膽固醇降低約7.9%、平均全身體脂量降低約0.4公斤、平均軀幹體脂降低約0.2公斤、平均皮下體脂0.4公斤、平均內臟體脂降低約6.1%、平均臀圍減少約2.2公分、平均腰圍減少約2.3公分、及平均肌肉量增加約0.6公斤。由此可知，長期使用蒲公英萃取物飲可減少全身體脂肪、減少軀幹體脂肪、減少皮下脂肪、減少內臟脂肪、減少腰圍、減少臀圍、提升肌肉量、降低血液總膽固醇及降低低密度脂蛋白膽固醇，即蒲公英萃取物具有降低脂肪堆積、提升肌肉量、及促進膽固醇代謝之功效。

實施例七、人體試驗-排尿量測試

受試者人數：5位

實驗方式：受試者飲用一瓶含本發明之蒲公英萃取物之飲品(每瓶含有4g的蒲公英萃取物)，並於飲用前及飲用後，測量其排尿量之改變。(於飲用前、後進行檢測時，受試者之飲食與運動均保持不變，以避免影響檢測之結果)。

實驗結果：

請參閱圖18。該圖係受試者飲用含本發明之蒲公英萃取物之飲品前及印飲用後之平均尿液量(以百分比計算)。其中，受試者於飲用前之平均尿液量定為100%，而於飲用後之平均尿液量為189.8%，平均提升約89.8%。由此可知，使用蒲公英萃取物飲能有效增加排尿量，加速排出體內多餘水分。

<110> 大江生醫股份有限公司

<120> 蒲公英萃取物用於製備促進脂肪代謝的組合物之用途

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> PPARG2-F

<400> 1

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> PPARG2-R

<400> 2

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> C/EBP-α-F

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> C/EBP-α-R

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> GLUT4-F

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> UCP1-F

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<210> 8

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<223> ACTB-F

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<210> 12

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<223> ACTB-R

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Claims

一種蒲公英(Taraxacum mongolicum)萃取物用於製備促進脂肪代謝的組合物之用途，其中該蒲公英萃取物係由蒲公英以一溶劑萃取而得，其中該溶劑為水，且該萃取係於75℃至100℃進行0.5至2小時；該蒲公英萃取物作用於細胞實驗的濃度為0.0125mg/mL。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該脂肪代謝包含降低脂肪堆積、促進膽固醇代謝及提升肌肉量之功效。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該降低脂肪堆積包含減少全身體脂肪、減少軀幹體脂肪、減少皮下脂肪、減少內臟脂肪、減少腰圍及減少臀圍。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該促進膽固醇代謝包含降低血液總膽固醇及降低低密度脂蛋白膽固醇。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該蒲公英萃取物係透過降低過氧化物酶體增殖物活化受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2,PPARG2)基因、降低CCAAT增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha,C/EBP-α)基因、降低葡萄糖轉運蛋白(Glucose transporter type 4,GLUT4)基因、提升體解偶聯蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)基因及/或提升膽固醇酯轉移蛋白(Cholesteryl Ester Transfer Protein,CETP)基因之表現量，以達到該促進生理代謝活性之用途。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該溶劑與該蒲公英之重量比範圍為50：1至1：1。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物為醫藥組合物、食品組合物、或保健食品組合物。