CN113134024A

CN113134024A - 蒲公英水提取液用于制备促进脂肪代谢及水份代谢的组合物的用途

Info

Publication number: CN113134024A
Application number: CN202110043486.7A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 张蓉
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2021-07-20
Also published as: TWI789686B; TW202128983A; CN113134056A; CN113134027A; TW202128029A; CN113136350A; CN113134070A; TWI764520B; TW202128206A; TWI761032B; TW202128202A; TWI774195B; TW202128205A

Abstract

本发明提供一种蒲公英水提取液用于制备促进生理代谢活性的组合物的用途，其中所述生理代谢包含脂肪代谢及水份代谢，其中所述蒲公英水提取液是由蒲公英以一溶剂提取而得，其中所述溶剂为水。本发明的蒲公英水提取液能降低PPARG2基因、C/EBP‑α基因、GLUT4基因的表现量及提升UCP1基因、CETP基因的表现量进而达到降低脂肪堆积、促进胆固醇代谢、提升肌肉量、保护肾小管细胞存活于高盐溶液、促进水通道蛋白表现及/或提升排尿量的功效。

Description

蒲公英水提取液用于制备促进脂肪代谢及水份代谢的组合物的用途

技术领域

本发明涉及一种蒲公英(Taraxacum mongolicum)水提取液的用途，特别是用于制备促进生理代谢活性的组合物的用途。

背景技术

肥胖已逐渐成为一不可忽视的社会问题，其一般被视为体脂肪累积过多而对健康造成负面影响的身体状态，而水肿亦属于肥胖的一种型态，以致于人体中的生理代谢能力强弱容易影响一个人的肥胖程度，所述生理代谢能力包含脂质代谢与水份代谢。

肥胖的患者常伴随其他的健康衍生问题，并会导致罹患高血压、心血管障碍、高脂血症、动脉硬化及糖尿病等各种相关疾病的风险增加，亦会并发血管障碍、视力障碍、神经障碍、抵抗力降低等并发症。截至2016年，世界卫生组织估计有39％的人口超重(约19亿人)，且约有13％的人口属于肥胖(约6亿人)，肥胖症的发生率逐年增加。

因应现代人所面临的肥胖问题，近年来社会对于保健、瘦身及减脂等概念更为注重，因此，研发一种能有效促进生理代谢活性以解决肥胖及因肥胖而衍生的健康问题，着实有其必要性。

蒲公英的学名为Taraxacum mongolicum，其为多年生草本植物，花茎是空心的，折断之后有白色的乳汁。欧洲传统以草本食疗为上，早期即会使用蒲公英作为花草茶饮用提神、帮助身体代谢，因此，具有多种疗效的蒲公英拥有「药草皇后」的美誉，其具有抗氧化的功效，直至现今，欧洲人甚至会将蒲公英晒干，用来取代咖啡豆，制成「蒲公英咖啡」，不仅没有咖啡因的副作用，还具有提神醒脑与提升代谢的功效。然其是否具有更多功效及其实际作用方式还有待确认。

发明内容

有鉴于此，本发明的一目的在于提供一种蒲公英水提取液用于制备促进生理代谢活性的组合物的用途，其中所述生理代谢包含脂肪代谢及水份代谢，其中所述蒲公英水提取液系由蒲公英以一溶剂提取而得，其中所述溶剂为水。

在一些实施例中，蒲公英水提取液用于调控脂肪代谢相关基因，包含过氧化物酶体增殖物活化受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2,PPARG2)基因、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha,C/EBP-α)基因、葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter type 4,GLUT4)基因、体解偶联蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)基因及/或胆固醇酯转移蛋白 (Cholesteryl EsterTransfer Protein,CETP)基因。

在一些实施例中，其中所述蒲公英水提取液系通过降低过氧化物酶体增殖物活化受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2,PPARG2)基因、降低CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha, C/EBP-α)基因、降低葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter type 4,GLUT4)基因、提升体解偶联蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)基因及/或提升胆固醇酯转移蛋白(Cholesteryl EsterTransfer Protein,CETP)基因的表现量，以达到所述促进生理代谢活性的用途。

在一些实施例中，所述脂肪代谢包含降低脂肪堆积、促进胆固醇代谢及提升肌肉量的功效。

在一些实施例中，所述降低脂肪堆积包含减少全身体脂肪、减少躯干体脂肪、减少皮下脂肪、减少内脏脂肪、减少腰围及减少臀围。

在一些实施例中，所述促进胆固醇代谢包含降低血液总胆固醇及降低低密度脂蛋白胆固醇。

在一些实施例中，所述水份代谢包含保护肾小管细胞存活于高盐溶液、促进水通道蛋白表现及提升排尿量。

在一些实施例中，所述溶剂与所述蒲公英的重量比范围为50：1至1：1。

在一些实施例中，所述提取系于75℃至100℃进行0.5至2小时。

在一些实施例中，所述蒲公英水提取液的浓度至少为0.0125mg/mL，较佳为至少0.125mg/mL。

在一些实施例中，所述组合物为医药组合物、食品组合物、或保健食品组合物。

在一些实施例中，所述蒲公英水提取液的Brix值为10±0.5以上。

综上所述，任一实施例的蒲公英水提取液可用于制备促进生理代谢活性的组合物的用途。任一实施例的蒲公英水提取液通过调控脂肪代谢相关基因以达到降低脂肪堆积、促进胆固醇代谢、提升肌肉量及/或提升排尿量的功效。任一实施例的蒲公英水提取液可用于制备减少全身体脂肪、减少躯干体脂肪、减少皮下脂肪、减少内脏脂肪、减少腰围、减少臀围、降低血液总胆固醇、降低低密度脂蛋白胆固醇、保护细胞存活于高盐溶液及促进水通道蛋白的组合物。

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1为本发明的实施例二中的实验组及控制组的相对PPARG2基因表现量比较图；

图2为本发明的实施例二中的实验组及控制组的相对C/EBP-α基因表现量比较图；

图3为本发明的实施例二中的实验组及控制组的相对GLUT4基因表现量比较图；

图4为本发明的实施例二中的实验组及控制组的相对UCP1基因表现量比较图；

图5为本发明的实施例二中的实验组及控制组的相对CETP基因表现量比较图；

图6为本发明的实施例三的实验组及控制组的相对脂肪油滴含量比较图；

图7为本发明的实施例四的实验组、控制组及对照组的相对细胞存活率比较图；

图8为本发明的实施例五的实验组及控制组的荧光显微影像图；

图9为试验者饮用蒲公英提取饮0周及4周后的血液总胆固醇变化图；

图10为试验者饮用蒲公英提取饮0周及4周后的血液低密度脂蛋白胆固醇变化图；

图11为试验者饮用蒲公英提取饮0周及4周后的全身体脂变化图；

图12为试验者饮用蒲公英提取饮0周及4周后的躯干体脂变化图；

图13为试验者饮用蒲公英提取饮0周及4周后的皮下脂肪变化图；

图14为试验者饮用蒲公英提取饮0周及4周后的内脏脂肪变化图；

图15为试验者饮用蒲公英提取饮0周及4周后的臀围变化图；

图16为试验者饮用蒲公英提取饮0周及4周后的腰围变化图；

图17为试验者饮用蒲公英提取饮0周及4周后的肌肉量变化图；

图18为试验者饮用蒲公英提取饮前及后的排尿量变化图。

具体实施方式

以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。

本案使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student’s t-test)进行分析。图式中「*」代表 p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。

本文中的「wt％」系指重量百分比，而「vol％」系指体积百分比。

如本文中所使用，术语「水提取液」系指藉由提取作用所制备的产物。所述水提取液可以溶于溶剂中的溶液形式呈现，或水提取液可为不含或大体上不含溶剂的浓缩物或精华呈现，亦可以干燥后的粉体呈现。

本文所述的「有效浓度」或「有效量」系表示能能有效调控脂肪代谢相关基因及/或抗水肿所需本发明的蒲公英水提取液的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(Dose escalation)以实验决定其有效浓度。

如本文所用「蒲公英」通常系指蒲公英全株，其中所述蒲公英的全株可包含原始、经干燥或以其他物理方式加工以利于处理的蒲公英，其可进一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式经加工以影响原物料的大小及实体完整性的型态。

在一些实施例中，所述蒲公英水提取液系由蒲公英以一溶剂提取而得，其中所述溶剂为水。在一些实施例中，蒲公英水提取液系将蒲公英原料依序进行粉碎程序、加热程序、过滤程序、及浓缩程序后得到。

在一些实施例中，蒲公英原料可以是粉碎或完整的蒲公英。在一些实施例中，蒲公英原料可以是新鲜或干燥的蒲公英。

在一些实施例中，蒲公英全株系购自中国台湾屏东。

在一些实施例中，粉碎程序是指将蒲公英原料搅打至平均粒径小于20mm。举例而言，粉碎可以采用果汁机、调理机或均质机。

在一些实施例中，加热程序是指将碎裂的蒲公英原料与含水的溶剂混合后加热一段固定时间。在一些实施例中，加热是指将蒲公英原料与水的温度提升到75℃～100℃。在一些实施例中，一段固定时间是指0.5小时到2小时。在一些实施例中，加热完成后可进行回流帮浦(3.0±0.5kg/cm2)。举例而言，将蒲公英原料与水的温度提升到85℃进行提取90分钟。

在一些实施例中，加热程序中的重量比例(水：蒲公英原料)为1：1至 50：1。举例而言，水：蒲公英原料为10：1。

举例而言，采用80公斤重的蒲公英原料、1600公斤重的水混合后持续加热到90℃，并持续120分钟。

在一些实施例中，过滤程序是指将加热后(或降温后)的蒲公英原料及溶剂通过筛网以将溶剂内的固体滤除形成过滤液。举例而言，筛网可以是400网目(mesh)的筛网。

在一些实施例中，加热程序与过滤程序之间还包括一降温程序，其中降温程序是指将加热后的蒲公英原料及溶剂静置以自然降温至室温。

在一些实施例中，浓缩程序是指将过滤程序所得到的过滤液进行减压浓缩 (厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)以得到初萃液。在一些实施例中，浓缩程序所得的初萃液即可为蒲公英水提取液。在浓缩程序的一些实施例中，在40℃～70℃之间进行减压浓缩。举例而言，蒲公英水提取液是将蒲公英原料依序进行粉碎程序、加热程序、过滤程序及浓缩程序后得到。

在一些实施例中，经浓缩程序所得的蒲公英水提取液降温后可再进行粗过滤。举例而言，以400网目(mesh)的筛网进行粗过滤。

在一些实施例中，蒲公英水提取液用于制备促进生理代谢活性的组合物的用途，其中所述生理代谢包含脂肪代谢及水份代谢，其中所述蒲公英水提取液系由蒲公英以一溶剂提取而得，其中所述溶剂为水。

其中，PPARG2与C/EBP-α基因被视为脂肪生成的重要基因，故降低 PPARG2与C/EBP-α基因表现有助于减少脂肪形成。另外，GLUT4是细胞转运葡萄糖的载体，胰岛素刺激细胞表现GLUT4并转移到细胞膜上，促进葡萄糖分子进入细胞代谢，但若GLUT4基因过度表达，则会导致脂肪组织增加。 UCP1在棕色脂肪中含量较多，已知可协助脂肪燃烧产热。CETP基因的表现与胆固醇的代谢有关，其可有效提升胆固醇代谢活性。

在一些实施例中，所述水份代谢包含保护肾小管细胞存活于高盐溶液、促进水通道蛋白表现及提升排尿量。提升肾小管细胞于高盐环境中的存活率，可有助于提升肾脏功能，而水通道蛋白表现亦有助于水分的运输，其可达到提升抗水肿能力。

在一些实施例中，所述提取系于75℃至100℃进行0.5至2小时。

在一些实施例中，前述的组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有有效含量的蒲公英水提取液。

在一些实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于经肠道或口服的投药剂型。这些投药剂型包括，但不限于：锭剂 (tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似的物。

在一些实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这些投药剂型包括，但不限于：注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)以及类似的物。在一些实施例中，所述医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermalinjection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

在一些实施例中，医药品可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含下列的试剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂 (wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似的物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

在一些实施例中，医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。

在一些实施例中，前述的组合物可为可食用组合物。在一些实施例中，此可食用组合物可以制成食品产品或可为食品添加物(food additive)，意即藉由习知方法于食材制备时添加而制得食品产品，或是于食品产品的制作过程中添加。于此，食品产品可以是与可食性材料配制成供人类或动物摄食的产品。

在一些实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods) 以及膳食补充品(dietary supplements)。

以下将详细说明本发明的蒲公英水提取液的提取方法；所述蒲公英水提取液调控脂肪代谢相关基因PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1 基因及CETP基因表现量的功效；所述蒲公英水提取液提升肾小管上皮细胞于高盐的存活率功效测试；所述蒲公英水提取液促进水通道蛋白表现的功效测试；以及所述蒲公英提取饮对于降低血液总胆固醇、降低低密度脂蛋白胆固醇、减少全身体脂肪、减少躯干体脂肪、减少皮下脂肪、减少内脏脂肪、减少腰围、减少臀围、提升肌肉量及/或提升排尿量的功效测试，以证实本发明的蒲公英水提取液确实具有促进生理代谢活性的功效，并能同时有效降低脂肪堆积、提升肌肉量及提升排尿量，进而减少体脂、全身体脂、躯干体脂、腰围及臀围，以达到减脂、抗水肿、预防及改善肥胖的功效。

实施例1.蒲公英水提取液的制备方法

在此实施例中，蒲公英水提取液的制备步骤如下：

1.首先，进行粉碎程序。将蒲公英(产地：中国台湾屏东)进行粗碎(Osterizer 品牌的10speed blender)并以孔径为12mm的筛网将其过筛，去除过大颗粒后取得蒲公英粗碎物。

2.接着，加热程序中，以水为溶剂与蒲公英粗碎物以10:1(液固比)的重量比混合，并于85±5℃下提取约90分钟以形成一提取液。若溶剂过少或提取时间过短，则提取效率将会明显下降；若提取时间过长，则水提取液中的有效成分可能会产生降解。

3.将提取液以400目数的滤网进行过滤，去除细微固体。

4.将前述提取液以浓缩机(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)，在60 ℃±5℃下进行减压浓缩。在另一些实施例中，可于45℃-70℃下进行减压浓缩。

5.将前述提取液降温至80℃。

6.再将提取液以400目数的滤网进行粗过滤，去除细微固体，得到本发明的蒲公英水提取液。

于此，将上述蒲公英水提取液进行检测规格，确认其白利糖度值(Degrees Brix)为10±0.5，以确保其质量。

实施例2.脂肪代谢相关基因的细胞实验

本实施例以RNA提取套组、反转录酶、KAPA

FAST qPCR试剂组配合定量PCR仪，测定小鼠骨髓基质细胞OP9受经蒲公英水提取液处理后，细胞中脂肪代谢基因的变化。

本实施例中以脂肪代谢相关基因(减脂相关基因)：PPARG2基因、C/EBP- α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP基因作为分析标的。

材料与仪器

1.细胞株：小鼠骨髓基质细胞OP9(购自BCRC，编号6566)。

2.培养基：含有20％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，编号10438-026，美国)、1％抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，编号15240-062)的α-最低限度必需培养基(α-Minimum essential medium，简称α-MEM)(Gibco公司，编号12000-022)。

3.RNA提取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)。

4.反转录酶(

III Reverse Transcriptase)(Invitrogen公司，美国，编号18080-051)。

5.测量标的基因引子，其中包含PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4 基因、UCP1基因及CETP基因，另包括内部控制组(m-ACTB基因)。

6.KAPA

FAST qPCR试剂组(购自Sigma公司，美国，编号 38220000000)。

7.ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))。

8.蒲公英水提取液：此实验中所使用的蒲公英水提取液是通过如上述实施例1所获得。

实验步骤

首先，取1.5x10⁵个小鼠骨髓基质细胞至每孔含有2毫升上述培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时；将每孔培养后的小鼠骨髓基质细胞依据下列测试条件分为控制组以及实验组(共二组)来处理每孔培养后的小鼠骨髓基质细胞。

测试条件

组别	添加成分	细胞实验浓度	处理时间
				控制组	无	无	无
实验组	蒲公英水提取液	蒲公英水提取液0.125mg/ml	24小时

详细来说，控制组是单纯使用2毫升培养液来培养小鼠骨髓基质细胞，未再加入其他添加成分，用于做为实验控制组。

实验组是将如上实施例所制备的蒲公英水提取液以0.125mg/ml浓度的培养基2ml，培养小鼠骨髓基质细胞24小时。

以上控制组及实验组，每组进行三重复。

将处理后的小鼠骨髓基质细胞以细胞裂解液分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。接着，以RNA提取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No. FC24015-G)分别提取二组细胞溶液内的RNA。接着，每组取1000奈克(ng) 的提取出的RNA作为模板，通过

III反转录酶(购自Invitrogene 公司，美国，编号18080-051)将提取出的RNA反转录为相应的cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTMReal-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表1的引子(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:12)对二组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reversetranscription polymerase chain reaction)以观察二组的小鼠骨髓基质细胞内的PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP 基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应 20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用 2-ΔCt方法进行基因定量。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及 CETP基因的mRNA表现量，进而推断PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4 基因、UCP1基因及CETP基因编码的蛋白质的表现量。

表1

*R为REVERSE反向，F为FORWARD顺向。

需要特别说明的是，下文述及的图式中显示的PPARG2基因、C/EBP-α基因、GLUT4基因、UCP1基因及CETP基因的相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p 值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

请参阅图1，将控制组的PPARG2基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的PPARG2基因的表现量为0.63(即63％)，代表实验组的 PPARG2基因的表现量相较控制组下降37％。

请参阅图2，将控制组的C/EBP-α基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的C/EBP-α基因的表现量为0.44(即44％)，代表实验组的 C/EBP-α基因的表现量相较控制组下降56％。

请参阅图3，将控制组的GLUT4基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的GLUT4基因的表现量为0.79(即79％)，代表实验组的 GLUT4基因的表现量相较控制组下降21％。

请参阅图4，将控制组的UCP1基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的UCP1基因的表现量为1.71(即171％)，代表实验组的UCP1 基因的表现量相较控制组上升171％。

请参阅图5，将控制组的CETP基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的CETP基因的表现量为5.99(即599％)，代表实验组的CETP 基因的表现量相较控制组上升599％。

换言之，实验组相较于控制组的PPARG2基因的表现量下降37％、C/EBP- α基因的表现量下降56％、GLUT4基因的表现量下降21％、UCP1基因的表现量上升171％，及CETP基因的表现量上升599％。

由图1至图3可知，当小鼠骨髓基质细胞以含有蒲公英水提取液处理后，小鼠骨髓基质细胞的PPARG2基因、C/EBP-α基因及GLUT4基因的表现量皆有下降的现象。

PPARG2(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2)基因所编码的蛋白质为过氧化物酶体增殖物活化受体γ，亦称为胰岛素增敏剂受体，是脂肪细胞分化和葡萄糖稳态的关键调节器，其被广泛认为与脂肪的合成有关，因对脂肪细胞和胰岛素有重要的作用，故被列为治疗糖尿病的重点研究基因的一。当其表现量上升时，会导致脂肪的生成速率上升，促进脂肪的堆积；反之，当其表现量下降时，会抑制脂肪的形成。另外，所述PPARG2具有抑制NF-κB 介导的发炎反应功效，可作为肠道稳态的关键调节剂，且可调节血管中ARNTL /BMAL1的转录，在心血管昼夜节律的调节中亦可发挥作用。

C/EBP-α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha)基因所编码的蛋白质为CCAAT增强子结合蛋白α，多数被认为与脂肪合成有关的蛋白的基因编码上常具有CCAAT增强子的序列，以致于C/EBP蛋白家族系脂肪生成(形成新的脂肪细胞的过程)和肝脏中葡萄糖和脂质代谢中的关键调节剂。另外，其亦是参与血细胞分化的重要转录因子，C/EBP蛋白家族调节包括肝脏代谢、脂肪生成、血细胞生成、炎症过程及肿瘤发生等多项重要生理功能。

GLUT4(Glucose transporter type 4)基因所编码的蛋白质为葡萄糖转运蛋白，系细胞转运葡萄糖的关键载体，其主要作用系在胰岛素刺激之下，脂肪和骨骼肌细胞内会合成GLUT-4蛋白，并从细胞质内的储存位置移动到细胞膜上将葡萄糖带进细胞内，因此被认为系脂肪细胞合成和葡萄糖稳态的重要调控蛋白，当其表现量下降时，会达到抑制脂肪生成的效果。

由图4及图5可知，当小鼠骨髓基质细胞以含有蒲公英水提取液处理后，小鼠骨髓基质细胞的UCP1基因及CETP基因的表现量皆有上升的现象。

UCP1(Uncoupling Protein 1)基因所编码的蛋白质为体解偶联蛋白(UCP)，其为线粒体阴离子载体蛋白(Mitochondrial anion carrier proteins,MACP)家族的成员的一，主要功能为将三磷酸腺核苷(Adenosine triphosphate,ATP)还原，并促进阴离子从线粒体的内膜向外转移，及促进质子从外部到线粒体内膜的返回转移，并将过程中产生的能量以热能释放出来；其中，UCP1基因仅在棕色脂肪细胞中表达，所述棕色脂肪细胞含有大量的粒线体，能够燃烧脂肪油滴以产生热能。因此，UCP1基因的表现量上升，能够促进脂肪的分解，并使脂肪的累积量降低。

CETP(Cholesteryl Ester Transfer Protein)基因所编码的蛋白质为胆固醇酯转移蛋白，亦称为血浆脂质转移蛋白，其作用主要系促进胆固醇酯和甘油三酸酯在脂蛋白之间的运输，被广泛认知为胆固醇代谢与运输的重要调节蛋白，当其表现量上升时，可有效促进胆固醇的代谢。

综上所述，如图1至图5所示，所述结果显示本发明的蒲公英水提取液能显著降低PPARG2基因、C/EBP-α基因及GLUT4基因的表现量，上述三个脂肪代谢相关基因系与脂肪合成有关，因此蒲公英水提取液具有抑制脂肪合成的功效。另外，本发明的蒲公英水提取液可显著提升UCP1基因的表现量，以达到促进脂肪燃烧分解的效果；而CETP基因的显著上升，显示蒲公英水提取液亦可有效促进胆固醇的代谢。上述五个基因皆与脂肪代谢相关，而使蒲公英水提取液具有降低脂肪堆积及促进脂肪分解的活性，且亦有促进胆固醇代谢的功效，本发明的蒲公英水提取液具有促进生理代谢活性的功效，且能有效预防及改善肥胖的症状。

实施例3.蒲公英水提取液抑制脂肪堆积功效试验

脂肪细胞内以油滴(Lipid droplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以观察细胞内油滴的数量，藉以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。

本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，OP9细胞购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，

)的OP9 细胞株(ATCC CRL-2749)。

首先，取24孔培养盘将每孔接种8×10⁴个OP9细胞及500μL培养基 (Medium)，所述培养基为MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，购自Gibco，产品编号Cat.12000-022)细胞培养液加入20％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，产品编号Cat.10437-028)及0.1％的青霉素/链霉素(Penicillin-streptomycin，购自Gibco，产品编号Cat.15240-062)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(ZEISS；放大倍率400x)观察细胞内油滴形成，藉以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。

然后，将分化完成的脂肪细胞分为二组：实验组与控制组。

实验组：添加由本案实施例一的方式制备而成的蒲公英水提取液，使其培养基浓度为0.0125mg/mL，在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3 天更换培养基。

控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。

接下来，依据下列步骤进行油红O的染色。于7天细胞处理后，将培养基移除，以1mL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗脂肪细胞两次，再加入1mL的10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1mL的PBS轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1mL的60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1mL的油红O作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红 O作用溶液并迅速地以1mL的60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟，再使用显微镜观察并拍摄细胞。

后续，将染色后的各组再依下列步骤进行油红O的定量。加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μL 至96孔培养盘中，以测量ELISA读取仪(BioTek)读取各组的OD510nm读值。其中，利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显著差异(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。

参考图6。将控制组的脂肪油滴含量视为1(即100％)时，实验组的脂肪油滴含量为57％。意即经由蒲公英水提取液处理之后能显著地减少约42％的脂肪堆积量。此结果显示，蒲公英水提取液能有效阻断脂肪细胞的增大，以减少脂肪细胞中油滴的含量，而达到抑制脂肪堆积的功效。

实施例4.肾小管细胞于高渗透压的存活率检测

高渗透压是引起细胞损伤的生理压力之一，在哺乳动物中，肾脏细胞及其衍生的细胞机制为主要调控生理渗透压的方式，本实施例探讨经蒲公英水提取液处理后，其是否具备保护细胞免受高浓度电解质的干扰作用，并提升对抗高渗透压的能力。于此，藉由检测肾小管细胞的存活率来了解蒲公英水提取液对于保护细胞于高盐环境的功效。

材料与仪器：

1.细胞株：哺乳动物肾小管上皮细胞MDCK(Madin Darby canine kidney cells)，购自美国典型培养物保存中心(American Type CμLtureCollection，

CCL-34^TM)，以下简称MDCK细胞。

2.培养基：将DMEM改良培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium， DMEM，购自Gibco，Cat.12100-038)添加额外成分使其含有10vol％FBS(fetal bovine Serum，购自Gibco，10438-026)及1％青霉素-链霉素(购自Gibco， Cat.15140122)。

3.酵素免疫分析仪(ELISA reader，购自BioTek，产品编号FLx800)。

4.蒲公英水提取液：由本案实施例一的制备方式所制得。

实验步骤：

于每一孔中加入100μL上述培养基，并将MDCK细胞以3x10³的每孔密度种入一96孔盘中，培养24小时。

本实验分为控制组、对照组及实验组。其中，各组加入100μL的新鲜 DMEM培养液。而对照组及实验组的培养液额外加入氯化钠(NaCl)，使其渗透压为500mOsm/kg；实验组的培养液额外加入蒲公英水提取液，使其浓度为1 mg/mL。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。

培养完毕后于每孔中加入15μL的MTT细胞凋亡检测溶液(3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)，反应3小时。

使用ELISA读盘机测量细胞溶液在570nm的吸光值，以探讨各组别的细胞存活率。所得数值再以微软EXCEL软件，利用Student t检定进行统计分析。

实验结果：

由图7所示，对照组相对控制组的肾小管细胞存活率为38.9％，由此可知，高渗透压会导致细胞凋亡的现象。然而，实验组(经蒲公英水提取液处理的组别) 相对控制组的肾小管细胞存活率为52.6％。实验组与对照组相比肾小管细胞存活率提升约13.7％，由此可知，蒲公英水提取液具有保护肾小管细胞于高盐溶液下存活的功效。因此，藉由本发明实施例所制备的蒲公英水提取液具有保护肾小管细胞抵抗高渗透压的生理压力，以致于可应用于抗水肿相关组合物的成分中。

实施例5.水通道蛋白表现试验

于此，藉由抗体标定蛋白质的特性，以荧光的方式，观察水通道蛋白的表现，测定人类初代皮肤角质细胞HPEK-50经蒲公英水提取液处理后，其细胞的水通道蛋白的表现变化。

材料与仪器：

1.细胞株：人类初代皮肤角质细胞(Human primary epidermal keratinocytes，购自CELLnTEC公司(瑞士)，HPEK-50)。

2.培养基：无血清的角质细胞培养液(keratinocyte-SFM)：购自Thermo公司，美国，编号为Cat.17005042。

3.磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)：购自Gibco，产品编号10437-028。

4. 10xDPBS：购自Gibco，产品编号14200-075。

5.台盼蓝死细胞染色剂：购自Lonza，产品编号Cat.17-942E。

6.胰蛋白酶：10X Trypsin-EDTA(购自Gibco)以1X PBS溶液稀释10倍。

7.抗AQP3抗体(Anti-AQP3 antibody)：购自Boster，产品编号Cat.PA1488。

8.抗老鼠alexa 488抗体(Anti-mouse-alexa 488antibody)：购自Thermo，产品编号Cat.A28175。

9.曲拉通X-100(Triton X-100)：购自Merck，产品编号Cat.9002-93-1。

10.牛血清白蛋白(Bovine serum albumins,BSA)：购自Sigma，产品编号Cat.A9418。

11.赫斯特染色剂(Hoechst 33342)：购自Thermo，产品编号Cat.62249。

12.甲醛(Formaldehyde)：购自景明，产品编号Cat.119690010。

13.荧光封片剂(Mounting medium)：购自HarSet，产品编号Cat.H-1500-NB。

14.蒲公英水提取液：由本案实施例一的制备方式所制得。

实验步骤：

实验将会分为实验组A、实验组B及控制组(未添加蒲公英水提取液)三组进行：

1.将人类初代皮肤角质细胞以每孔5×10³个的密度，接种于每孔含100μL培养基的96孔培养盘中，并于实验组A的培养液额外加入蒲公英水提取液，使其浓度为0.5mg/mL；于实验组B的培养液额外加入蒲公英水提取液，使其浓度为1mg/mL。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。

2.培养完毕后，移除培养基，并加入10％甲醛，于室温下固定15分钟。

3.移除各孔培养基，并以1X DPBS冲洗细胞3次后，加入0.5％Triton X-100，并于室温下固定10分钟。

4.移除各孔培养基，并加入固定溶液(Blocking solution，100mg BSA溶于 10ml1X DPBS)，于室温下作用1小时。

5.加入抗AQP3抗体，于37℃作用2小时。

6.移除各孔培养基，并以1X DPBS冲洗细胞3次后，加入抗老鼠alexa 488抗体，于37℃作用1小时。

7.移除各孔培养基，并以1X DPBS冲洗细胞3次后，加入Hoechst 33342染剂，于室温下作用3-5分钟。

8.移除各孔培养基，并以1X DPBS冲洗细胞3次。.

9.以荧光显微镜观察并拍照纪录。

实验结果：

如图8所示，侦测到的水通道蛋白于荧光显微照片下会呈现绿色荧光，由此可知，与对照组相较之下，经本发明蒲公英水提取液处理后的实验组A及实验组B的水通道蛋白皆有生成的趋势，其中，实验组B侦测到的水通道蛋白与实验组A相比又有更多的生成量，由此可知，本发明的蒲公英水提取液具有促进水通道蛋白生成的功效，藉此有益于增加细胞含水量，并可达到抗水肿的功效。

实施例6.人体试验-以内服方式施用蒲公英水提取液

使用样品：含本发明的蒲公英水提取液的饮品50g/瓶(以水以及本发明的蒲公英水提取液所配制成每50g的饮品中含有4g的蒲公英水提取液，即占8％)。其中，此蒲公英水提取液系由实施例一的方法所制备而成。

受试者人数：7位(BMI>24或体脂≧25％的受试者)。

实验方式：受试者每日饮用一瓶含本发明的蒲公英水提取液的饮品(每瓶含有4g的蒲公英水提取液)，共饮用28日(即4周)。并于开始饮用前(第 0周)以及饮用28日后，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，进行血液采集及体组成量测。(于饮用前、后进行检测时，受试者的饮食与运动习惯均保持不变，以避免影响检测的结果)。

体脂、臀围及腰围检测：

使用体脂测量仪器TANITA四肢与躯干体组成计，型号BC-545F进行皮下体脂、内脏体脂、全身体脂、躯干体脂及肌肉量测量，并通过量尺测量受试者臀围及腰围数值。

实验结果：

请参阅图9及图10。其分别为受试者在饮用含本案蒲公英水提取液的饮品 0周及4周后的总胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇的平均变化量。其中，受试者平均总胆固醇于饮用前为201mg/dl，而饮用4周后，平均总胆固醇降为187 mg/dl，约降低7％；另外，受试者平均低密度脂蛋白胆固醇于饮用前为 123.1mg/dl，而饮用4周后，平均低密度脂蛋白胆固醇降为113.4mg/dl，约降低7.9％。

请参阅图11。所述图系受试者饮用含本发明的蒲公英水提取液的饮品0周及4周后的平均全身体脂量。其中，受试者于饮用前的平均全身体脂量为17.6 公斤，而于饮用4周后的平均全身体脂量为17.2公斤，平均减少约0.4公斤，达统计上的显著。

请参阅图12。所述图系受试者饮用含本发明的蒲公英水提取液的饮品0周及4周后的平均躯干体脂量。其中，受试者于饮用前的平均躯干体脂量为9公斤，而于饮用4周后的平均躯干体脂量为8.8公斤，平均减少约0.2公斤，达统计上的显著。

请参阅图13。所述图系受试者饮用含本发明的蒲公英水提取液的饮品0周及4周后的平均皮下体脂量。其中，受试者于饮用前的平均皮下体脂量为15.7 公斤，而于饮用4周后的平均皮下体脂量为15.3公斤，平均减少约0.4公斤，达统计上的显著。

请参阅图14。所述图系受试者饮用含本发明的蒲公英水提取液的饮品0周及4周后的平均内脏体脂量(以百分比计算)。其中，受试者于饮用前的平均内脏体脂量定为100％，而于饮用4周后的平均内脏体脂量为93.9％，平均降低约6.1％，达统计上的显著。

请参阅图15及图16。其分别为受试者在饮用含本案蒲公英水提取液的饮品0周及4周后的臀围及腰围的平均变化量。其中，受试者的平均臀围及腰围于饮用前分别为97.4公分及80.6公分；于饮用4周后，受试者的平均臀围及腰围分别为95.2公分及78.3公分，受试者平均臀围减少约2.2公分，平均腰围减少约2.3公分。

请参阅图17。所述图系受试者饮用含本发明的蒲公英水提取液的饮品0周及4周后的平均肌肉量。其中，受试者于饮用前的平均肌肉量为38.1公斤，而于饮用4周后的平均肌肉量为38.7公斤，平均增加约0.6公斤。

参照图9至图17，相比饮用前(第0周)，持续4周饮用蒲公英水提取液饮可使平均总胆固醇减少约7％、平均低密度脂蛋白胆固醇降低约7.9％、平均全身体脂量降低约0.4公斤、平均躯干体脂降低约0.2公斤、平均皮下体脂0.4公斤、平均内脏体脂降低约6.1％、平均臀围减少约2.2公分、平均腰围减少约2.3 公分、及平均肌肉量增加约0.6公斤。由此可知，长期使用蒲公英水提取液饮可减少全身体脂肪、减少躯干体脂肪、减少皮下脂肪、减少内脏脂肪、减少腰围、减少臀围、提升肌肉量、降低血液总胆固醇及降低低密度脂蛋白胆固醇，即蒲公英水提取液具有降低脂肪堆积、提升肌肉量、及促进胆固醇代谢的功效。

实施例7.人体试验-排尿量测试

受试者人数：5位

实验方式：受试者饮用一瓶含本发明的蒲公英水提取液的饮品(每瓶含有 4g的蒲公英水提取液)，并于饮用前及饮用后，测量其排尿量的改变。(于饮用前、后进行检测时，受试者的饮食与运动均保持不变，以避免影响检测的结果)。

实验结果：

请参阅图18。所述图系受试者饮用含本发明的蒲公英水提取液的饮品前及印饮用后的平均尿液量(以百分比计算)。其中，受试者于饮用前的平均尿液量定为100％，而于饮用后的平均尿液量为189.8％，平均提升约89.8％。由此可知，使用蒲公英水提取液饮能有效增加排尿量，加速排出体内多余水分。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

【序列表】

<110> 大江生医股份有限公司

<120> 蒲公英水提取液用于制备促进脂肪代谢及水份代谢的组合物的用途

<130> N/A

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PPARG2-F

<400> 1

tcgctgatgc actgcctatg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PPARG2-R

<400> 2

gagaggtcca cagagctgat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C/EBP-α-F

<400> 3

caagaacagc aacgagtacc g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C/EBP-α-R

<400> 4

gtcactggtc aactccagca c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GLUT4-F

<400> 5

gtgactggaa cactggtcct a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GLUT4-R

<400> 6

ccagccacgt tgcattgtag 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UCP1-F

<400> 7

aggcttccag taccattagg t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UCP1-R

<400> 8

ctgagtgagg caaagctgat tt 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CETP-F

<400> 9

gcccagacca gcaacattct 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CETP-R

<400> 10

caggccctct gtctcctttt c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACTB-F

<400> 11

ggctgtattc ccctccatcg 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACTB-R

<400> 12

ccagttggta acaatgccat gt 22

Claims

1.一种蒲公英水提取液用于制备促进生理代谢活性的组合物的用途，其特征在于，其中所述生理代谢包含脂肪代谢及水份代谢，其中所述蒲公英水提取液是由蒲公英以一溶剂提取而得，其中所述溶剂为水。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脂肪代谢包含降低脂肪堆积、促进胆固醇代谢及提升肌肉量的功效。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述降低脂肪堆积包含减少全身体脂肪、减少躯干体脂肪、减少皮下脂肪、减少内脏脂肪、减少腰围及减少臀围。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述促进胆固醇代谢包含降低血液总胆固醇及降低低密度脂蛋白胆固醇。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述水份代谢包含保护肾小管细胞存活于高盐溶液、促进水通道蛋白表现及提升排尿量。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蒲公英水提取液是通过降低过氧化物酶体增殖物活化受体γ基因、降低CCAAT增强子结合蛋白α基因、降低葡萄糖转运蛋白基因、提升体解偶联蛋白1基因及/或提升胆固醇酯转移蛋白基因的表现量，以达到所述促进生理代谢活性的用途。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述溶剂与所述蒲公英的重量比范围为50：1至1：1。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述提取是于75℃至100℃进行0.5至2小时。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蒲公英水提取液的浓度至少为0.0125mg/mL。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为医药组合物、食品组合物、或保健食品组合物。