KR20160052243A - 효소처리된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물 - Google Patents

효소처리된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출물을 효소 발효시킴으로써 지질개선용 발효 인삼 또는 홍삼 추출물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 지질개선용 발효 인삼 또는 홍삼 추출물은 식품첨가물용 효소를 첨가함으로써 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킨 장점이 있다.

Description

효소처리된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물{Composition comprising enzymatic fermented ginseng or red ginseng extract for serum lipid lowering effects}
본 발명은 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출액을 효소 발효함으로써 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물에 관한 것이다.
인삼은 소련의 과학자 C.A.Meyer가 1843년에 만병을 치료한다는 의미로 학명을 "Panax ginseng C.A. Meyer"로 명명된 식물학적으로는 오가과(Araliaceae) 인삼속(Panax)에 속하는 식물로 뿌리를 약용으로 이용하고 있다. 이러한 인삼은 자연 건강식품으로 널리 이용되고 있으며, 약리 효능의 과학적 입증과 임상을 근거로 인식과 신뢰가 높으며, 의약품 및 기능성 식품으로 그 수요가 증가하고 있다.
인삼은 2,000년 전부터 동양에서 뛰어난 약리효과로 인해 민간에서 이용되어 왔으며, 그 효과는 대부분 사포닌계 성분에 의한 것으로 알려져 있다(Ha, 2005). 인삼은 약용으로 쓰는 뿌리의 처리방법에 따라 홍삼과 백삼으로 나누어지며, 홍삼은 채굴한 수삼을 탈피하지 않고 쪄서 말린 갈홍색을 띤 인삼이며, 백삼은 수삼을 건조한 인삼으로서 미황백색이다. 인삼의 대표적인 약리성분인 사포닌(ginsenoside)은 백삼에 22가지, 홍삼에 30가지 정도가 밝혀져 있으며 (Ryu, 2003), 홍삼 사포닌은 혈압강하작용 (Jeon et al., 1999), 뇌신경세포 보호 및 학습능력 개선작용 (Kim et al.,, 2004; Petkov and Mosharrof, 1987), 항혈전 작용 (Jung et al., 1998), 항산화 작용 (Bae and Kim, 1998) 등이 있다고 보고되고 있어 이에 대한 홍삼만의 탁월한 약리 효능을 기대할 수 있는 것으로 알려져 있다.
인삼의 면역관련연구는 인삼의 각종 추출물, 사포닌류, 진세노사이드 분획물, 중성 또는 산성다당체, 단백질 성분, 에탄올 불용성 분획물, polyacetylene성분, 조직배양체, 홍삼정 등이 체액성 면역, 여러 종류의 T림프구 등에 의한 세포성 면역, 세망내피계 세포와 여러 가지 대식세포의 활성, 활동에 대한 효과 면역에 관련되는 매개물질 분비 조절, interleukin-1유전자, TNF 유전자 등의 발현촉진 등 면역증강 및 조절 효과가 동물실험과 임상에서의 연구에서 입증되고 있다. 인삼의 사포닌 성분과 비사포닌 물질 중에는 여러 종류의 암세포의 증식을 억제하는 활성이 있다고 알려져 있다.
또한, 암세포의 증식을 억제하는 주요 활성성분으로는 홍삼의 특유 사포닌 성분인 G-Rh2와 비사포닌 물질로서 panaxydol, panaxynol, panaxytriol 등의 polyacetylene 성분이 있다. 이들 성분은 암세포 증식 억제 작용이 있다고 알려져 있다. 이 외에도 다당체 성분은 항당뇨 작용, 면역 증강 작용, 항위궤양 작용 등이 알려지고 있다.
인삼의 지용성 성분이 암세포 증식을 현저히 억제하거나 사멸시키는 작용이 있음이 보고된 이후(Hwang, 1987), 이를 근거로 인삼의 지용성 성분으로부터 유효성분으로서 polyacethylene계 화합물을 인정하게 되었다. 현재까지 9종의 polyacethylene계 성분을 분리 동정하였는데 (Nho, 1989), 인삼 중 지용성 성분의 항암 효과는 주로 panaxynol과 panaxydol 에 기인된 것으로 알려졌고(Matsunaga, 1990), 이후 동물실험을 통해 인삼의 지용성 성분이 in vivo에서도 항암 및 면역증강 효과를 나타냄을 확인한 바 있다(Yang, 1983).
홍삼의 제조과정은 수삼을 물로 깨끗하게 씻고, 일정한 용기에 넣어 가열된 수증기를 이용하여, 크기에 따라 일정시간 증삼(蒸蔘)을 한 후 1차 열풍건조 후부터는 태양열을 이용하거나 기타 방법으로 수분이 12.5∼13.5% 정도 될 때까지 건조하여 제조하게 되는 것으로, 상기 홍삼의 제조과정에서 잔뿌리를 떼어낸 것을 홍미삼(紅尾蔘)이라 한다.
상기 홍미삼은 홍삼의 잔뿌리이나 그 성분은 홍삼과 크게 다르지 않는 것으로, 배당체(glycosides), 인삼향성분(panacen), 폴리아세틸렌계 화합물, 함질소성분, 플라보노이드, 비타민(B군), 미량원소, 효소, 항산화물질과 유기산 및 아미노산 등이 함유되어 있으며, 중추신경에 대해서 진정작용과 흥분작용이 있고, 순환계에 작용하여 고혈압이나 동맥경화의 예방효과가 있으며, 조혈작용(造血作用)과 혈당치(血糖値)를 저하시켜 주고, 간을 보호하며, 내분비계에 작용하여 성행동(性行 動)이나 생식효과에 간접적으로 유효하게 작용하며, 항염(抗炎) 및 항종양작용(抗腫瘍作用)이 있고, 방사선에 대한 방어효과, 피부를 보호하며 부드럽게 하는 작용이 있는 것으로 알려져 있다.
그러나 상기 사포닌은 장내 미생물에 의해 분해 및 전환이 이루어져 체내로 흡수된다는 사실이 밝혀졌으며, 이러한 결과 사람에 따라 사포닌의 흡수 정도가 다른 것으로 규명되어 있다. 예를 들어, 2004년도 한국 식품영양학회 국제학술대회Ham et al. 에 따르면 사포닌을 흡수할 수 있는 그룹을 제외하고 프로토파낙사디올(Protopanaxadiol, 이하 'PPD'라 칭한다.)계의 사포닌만을 흡수할 수 있는 그룹이 20.3%, 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol, 이하 'PPT'라 칭한다.)계의 사포닌만을 흡수할 수 있는 그룹이 12.5%, 아예 사포닌 흡수를 못하는 그룹이 4.7%로 사람마다 흡수율의 차이가 두드러지고 있는 것이다.
이에, 사포닌의 체내 흡수율을 증가시키기 위해 유용한 미생물을 이용하여 수삼을 발효하고, 미생물의 당분해효소 등을 이용하여 배당체 구조인 인삼사포닌(ginsenoside)의 성분전환을 유도하여 영양학적, 기능적 가치를 높이고자 하는 인삼 발효 미생물의 선별에 관한 연구가 진행되고(Kim et al., 2007) 있다. 그 일 예로 유산균을 이용한 발효인삼제조에 가장 적합한 유산 균주 및 최적공정을 확립하여 차후 건강기능성 식품소재로서의 유산균 발효 인삼제품화 가능성을 조사한 연구가 수행되고(Park et al., 2006) 있으며, 백삼, 홍삼과 대비하여 발효인삼의 일반성분에 대한 성분 특성에 대한 연구가 보고된 바 있다(Kong et al., 2008).
또한, 인삼을 비롯한 다양한 소재들을 활용하여 발효하거나 또는 첨가하여 식품의 기능성 강화, 관능적 품질을 향상시켜 발효식품으로서 개발하려는 연구가 시도되고 있으며(Kim and Han, 2005), 다양한 미생물이 존재하는 사람의 장내에서 우세균으로 분포하고 체내 유익균의 성장을 촉진하는 생균활성제(probiotics)로서 당류를 발효하여 젖산을 생성하는 세균인 락토바실리(Lactobacilli) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 같은 유산균이 보고된 바 있다(Goldin,1998).
1990년대 이후 국내 경제 발전과 함께 과학기술의 고도성장을 통하여 선진국형 고령화로 접어드는 동시에 성인병과 같은 각종 생활습관병이 급격히 증가하고 있다. 그 원인으로는 현대인들의 스트레스 가중과 운동 부족 및 서구적인 식생활의 증가를 들 수 있으며, 실제 비만을 동반한 합병증인 심장 및 뇌혈관성 질환 사망률이 1,2위를 기록하고 있다. 세계보건기구(WHO)가 ‘위험에 대한 예방, 건강한 생활에 대한 추구’라는 보고서를 통해 비만을 각종 질병, 장애 및 사망의 핵심적인 원인으로 지적하고 있듯이 비만은 고지혈증과 당뇨와 같은 대사성 질환과 암 등 각종 질병을 야기 시킨다. 실제로 세계보건기구의 2002년 보고 자료에 의하면 세계 비만관련 질환인구가 2003년 17억 명에 이르고, 미국의 경우 성인 인구의 약 65%가 과체중에 해당된다고 발표하였다. 따라서 비만 자체를 지구의 심각한 보건문제 중의 하나로써 치료가 필요한 비전염성 만성질병이라고 경고하고 있으며, 세계적으로 소아비만의 증가가 10년을 주기로 3배로 급증하고 있어 추후 더 많은 성인 비만인구의 증가를 초래할 것으로 보고되었다. 한국의 경우, 2001년 국민건강심층분석보고서에 의하면 체질량지수(BMI) 25 kg/㎡ 이상의 비만인구가 20세 미만의 경우 11.2%, 20세 이상인 경우 31%로, 1995년 국민영양조사시 25 kg/㎡ 이상인 비만인구가 20.5%인 수치에 비해 10%가량 증가하였다. 또한 통계청의 자료에 의하면 2009년도 우리나라 사망원인 1위는 암이며 2위 뇌혈관질환, 3위 심장질환, 4위 자살에 이어 5위에 당뇨병으로 조사되었다. 체중 증가에 따르는 당뇨, 동맥경화, 심혈관질환, 고혈압, 고지혈증 등 심각한 성인병을 유발하여, 대장암, 직장암, 전립선암, 유방암, 난소암 등 각종 암의 발생빈도가 높아지기 때문에 비만의 발생원인, 비만의 치료 및 예방법, 처방법 등에 관한 연구 결과가 보고되어지고 있다.
현재, 시판되고 있는 비만치료체 중 최근 췌장지방분해효소저해제(pancreatic lipase inhibitor)로서 tetrahydrolipstatin이 개발되었는데 그 효능으로는 섭취된 지방의 30%까지 저해하는 것으로 제시되어, 의약품(Xenical, Roche Co.)으로 시판되고 있다. 그러나 tetrahydrolipstatin은 위장장애, 과민증, 담즙분비장애, 지용성 비타민 흡수억제 등의 부작용이 보고되어 부작용에 대한 문제가 제기되고 있다. 따라서 최근 들어 이러한 부작용이 없고 안전한 천연물을 이용하여 항비만 기능성 식품의 효능을 검증하는 연구가 이루어지고 있으며 실제로도 이를 이용한 비만예방 및 치료제 개발이 요구되어지고 있다.
대한민국 공개특허 제10-2013-0104714호 "모나스커스 필로서스 발효 홍삼을 유효성분으로 포함하는, 지질대사 이상의 예방 및 개선용 조성물"에서는 모나스커스 필로서스 균주를 이용한 발효홍삼의 추출물을 함유하는 지질대사 이상의 예방 및 개선용 조성물이 제공되어 있다. 그러나 이러한 미생물에 의한 추출액의 발효를 산업화하기 위해서 일정한 품질을 유지하기 위한 공정 표준화가 어렵다는 문제를 안고 있다. 미생물 발효의 원리는 미생물이 자라면서 분비하는 효소가 궁극적으로 식품 또는 한약재에 함유된 성분을 전환하는 것으로 미생물을 한약재에 직접 접종하여 발효했을 때보다 미리 만들어 놓은 효소를 넣어 발효하면 미생물 발효와 같은 효과를 내면서 공정을 단순화하고 품질관리도 용이한 장점이 있다.
KR 10-2013-0104714 B1, 2013년 09월 25일
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 연구를 지속하던 중, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근을 일정 비율로 혼합하여 제조한 추출물을 효소 발효시킴으로써 지질개선 효과를 극대화할 수 있는 다량의 진세노사이드 Rd를 함유하는 새로운 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법을 확립하고 상기 방법에 의한 조성물을 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 진세노사이드 Rd를 포함한 총사포닌 함량이 높은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합 비율로 추출물을 제조하고 이를 효소 발효시킴으로써 유용사포닌인 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물을 이용하여 효소 발효시킨 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물을 이용하여 효소 발효시킨 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물을 이용하여 효소 발효시킨 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질개선용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계(1단계) 및 상기 혼합 추출액에 효소를 첨가하여 효소 발효시키는 단계(2단계)를 포함하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 1단계에서 제조된 인삼 또는 홍삼 혼합 추출액을 농축하는 단계 및 상기 농축된 추출액을 물로 희석하고 2 kDa 내지 6 kDa의 분자량컷(molecular cut-off)으로 한외여과하여 여과물을 수득하는 단계를 더 포함하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 인삼 사포닌은 진세노사이드를 말한다.
본 발명의 진세노사이드 Rd는 PPD계 진세노사이드의 일종으로, 하기 화학식 1과 같은 구조를 가지는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 진세노사이드 Rd는 인삼 또는 홍삼에 1% 미만으로 미량 존재하며 산업적으로 잘 이용되지 않아 왔으나, 관절염 개선, 연골 재생, 콜라겐 형성 등의 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 지질개선효과를 갖는 것을 특징으로 하는 상기 화학식 1로 표현되는 진세노사이드 Rd를 제공한다.
본 발명은 상기 진세노사이드 Rd를 0.01~100 중량%의 양으로 함유함을 특징으로 하는 지질개선용 조성물을 제공한다.
본 발명은 유용사포닌인 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물로 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계 및 상기 혼합 추출액에 효소를 첨가하여 효소 발효시키는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 추출물의 제조방법은 도 1의 공정도를 참조한다.
상기 제조방법은 발효 후 통상적인 방법에 따라 살균하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서 80 내지 100℃에서 5 내지 20분 동안 살균할 수 있다.
상기 제조방법은 발효 후 통상적인 방법에 따라 진공농축, 스프레이 드라이 또는 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서 50 내지 70℃에서 감압농축할 수 있다.
본 발명에서 상기 1단계에서 제조된 인삼 또는 홍삼 혼합 추출액을 농축하는 단계 및 상기 농축된 추출액을 물로 희석하고 2 kDa 내지 6 kDa의 분자량컷(molecular cut-off)으로 한외여과하여 여과물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 희석은 제한되지는 않지만 발효 인삼 또는 홍삼 추출물 총 중량에 대하여 3 내지 20배의 물을 첨가할 수 있다.
본 발명에서 상기 여과단계의 분자량컷은 제한되지는 않지만 3 kDa 또는 5 kDa로 정하여 사용할 수 있으며, 상기 여과단계의 한외여과는 제한되지는 않지만 내액:외액이 75 내지 85: 25 내지 15의 비율을 갖도록 배합하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인삼은 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer), 수삼, 백삼, 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonicum), 삼엽삼(Panax trifolium) 및 히말라야삼(Panax pseudoginseng)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 인삼일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 수삼은 밭에서 캐낸 후 가공하지 아니한 상태의 생삼을 말하며, 백삼은 주로 4~6년근 수삼을 원료로 하여 표피를 제거하거나 제거하지 않고 건조, 가공한 것을 말한다.
본 발명에 있어서 홍삼은 4 내지 6년근 수삼을 엄격히 선별하여 표피를 제거하지 않은 상태에서 증기로 쪄서 건조시킨 담황갈색 또는 담적갈색 인삼을 말한다.
본 발명에 있어서 인삼근 또는 홍삼근은 상기 인삼 또는 홍삼 중 몸통 부분인 인삼의 주근 또는 홍삼의 주근을 말한다.
본 발명에 있어서 홍미삼은 4 내지 6년근 수삼을 증기로 쪄서 말린 홍삼 중에서도 맨 끝부분의 가느다란 잔뿌리, 즉 홍삼의 세근를 말하며, 제조과정에서 주근에서 잔뿌리를 떼어 분리한 것을 '홍미삼(紅尾蔘)'이라 별도로 칭하여 사용하였다.
본 발명에 있어서, 인삼은 수삼, 백삼 또는 홍삼 등을 포함하는 통상적인 인삼 및 이의 가공삼을 포괄하는 명칭으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물은 주근 대비 세근의 비율이 주근 0% 내지 40% 대비 세근 60% 내지 100% 일 수 있으며, 바람직하게는 주근 대비 세근의 비율은 세근이 60% 이상인 것이 적절하다.
본 발명에 있어서, 상기 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물을 추출에 앞서 추출효율을 높이기 위하여 분쇄 또는 분말화할 수 있으며, 당업계에 공지된 통상적인 추출법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면 물 추출법, 알코올 추출법, 유기용매 추출법 및 초임계 추출법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 추출법 또는 알코올 추출법을 이용하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 알코올 추출법에 있어 사용되는 추출용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올,이소프로판올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 등을 사용할 수 있으며. 상기 유기용매 추출법의 추출용매로는 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 염산, 초산, 포름산, 구연산, 시클로헥산 및 석유에테르 등의 유기용매 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
추출시 첨가되는 추출용매의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물(건조 중량)에 대하여 추출용매를 2배 내지 20배(중량기준)로 사용할 수 있다. 추출효율을 증가시키기 위해서는 바람직하게는, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물에 대하여 추출용매 5배 내지 15배(중량기준)를 사용하여 2회 이상 수회 반복할 수 있다.
추출온도는 50 내지 110℃가 적절하며, 바람직하게는 70 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 75℃ 내외이다. 추출시간은 추출온도에 따라 다르지만, 1시간 내지 48시간, 바람직하게는 2시간 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 6시간 동안 추출한다. 또한, 추출시 교반기(shaker)로 교반할 경우에 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출액은 감압농축하여 고형분의 함량이 1 내지 20 브릭스(Brix)인 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 주근 대비 세근의 비율이 60%이상 함유된 인삼 또는 홍삼을 물, 주정 또는 주정함유 용매에 추출하여 농축한 후 약 6 브릭스(Brix)로 조정할 수 있다.
상기 고형분의 함량을 1 내지 20 브릭스(Brix)로 조절하지 않으면 농도가 너무 진해서 발효가 잘되지 않고 겔화되기 때문에, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출액의 고형분 함량을 1 내지 20 브릭스(Brix)로 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 효소 발효 단계는 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출액의 중량에 0.1 내지 15% 정도가 되도록, 바람직하게는 10% 정도가 되도록 효소를 첨가하고 20 내지 60℃의 반응기에서 2 내지 5일 동안 효소 발효시킬 수 있으며, 바람직하게는 50℃에서 5일 정도 배양하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 6 브릭스의 인삼 또는 홍삼 추출물에 10%(w/w)의 펙티나제 효소를 첨가하여 50℃ 조건에서 3일간 교반 배양한 후 95℃에서 30분간 가열하여 효소 반응을 정지시켜 진세노사이드 Rd 강화 발효 인삼 또는 홍삼추출물(GS-E3D)을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소 발효액의 효소 발효 반응을 중지하기 위해서 80 내지 100℃에서 5 내지 30분 동안 살균하며, 바람직하게는 95℃에서 10분 내지 30분 동안 가열하는 것이 바람직하다. 이때 가열에 의하여 상기 첨가된 효소의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소발효액을 살균한 후 30 내지 40℃, 바람직하게는 37℃로 냉각시킨다.
이때 90 내지 95℃에서 5 내지 30분 동안 처리하여 효소를 불활성화시킬 수 있으며, 95℃에서 30분 동안 처리하는 것이 바람직하다.
이때 상기 첨가한 효소에 의하여 발효가 가속화되어 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킬 수 있다.
본 발명의 상기 효소 발효단계에서 효소로서 펙티나아제를 이용하며, 바람직하게 펙티나아제는 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear), α-허브자임(α-herbzym), 노보자임 33095(Novozym 33095)이며, 더욱 바람직하게는 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear) 또는 노보자임 33095(Novozym 33095)인 것을 특징으로 한다.
더욱 상세하게는 본 발명의 효소 발효단계에 의해 진세노사이드 Rb1이나 Rc 등을 진세노사이드 Rd로 전환시킴으로써 다량의 진세노사이드 Rd를 포함시킬 수 있게 한다.
따라서 본 발명에 따라 제조된 지질개선용 발효 인삼 또는 홍삼 추출물은 식품첨가물용 효소를 첨가함으로써 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킬 수 있다. 또한, 진세노사이드 Rd를 포함한 총사포닌 함량이 높은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물을 이용하여 지질개선용 발효 효소 추출물을 제조함으로써 몸에 흡수가 뛰어나고 기능적 활성을 가진 진세노사이드 Rd로 더 많은 구조전환을 시킬 수 있어 기존의 인삼 또는 홍삼과 차별성을 가질 수 있다.
이때 상기 조성물은 통상적인 방법에 따라 약학 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 담체, 부형제 또는 매질(medium)로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
여기서, 본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥, 복강, 근육, 국소도포, 첩포 및 이온토포레시스(iontophoresis)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있고, 이 중에서 국소 적용 및 경구투여가 바람직하다. 본 발명의 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D) 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법은 효소 발효를 이용하여 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근에 미량 존재하는 진세노사이드 Rd를 간편하고, 경제적으로 구조전환시킬 수 있는 장점이 있다. 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법은 식품첨가물용 효소를 첨가함으로써 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킨 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 효소처리된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법의 개략도를 도시한 것이다.
도 2는 효소처리 전 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근 혼합물의 추출액(GS-C46) 및 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 기능성분 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 농도별 one-way ANOVA (Duncan's multiple-range test)에 의한 세포생존율을 나타낸 것이다( a,b,cValues in the row with different superscript letters are significantly different, p<0.05).
도 4는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 Oil Red O 염색을 통한 3T3-L1 지방세포의 분화 억제효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 3T3-L1 전지방세포의 분화 억제효과에 대한 현미경 포토그램(Magnification=10X)을 나타낸 것이다. (A) 대조군, (B)~(F)는 각각 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml 및 5 mg/ml의 실험군을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 3T3-L1 전지방세포의 분화 억제효과에 대한 520 nm에서 흡광도를 분석한 그래프를 나타낸 것이다(a,b,c,d,eValues in the row with different superscript letters are significantly different, p<0.05).
도 7은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 동물실험에서의 중량, 식이 및 음수 섭취량 변화를 나타낸 것이다. (A) 중량변화, (B) 식이변화, (C) 음수 섭취량 변화를 나타낸다(a, b, cValues in the row with different superscripts are significantly different, p<0.05. Data are shown as the mean±SE (n=8)).
도 8은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 동물실험에서의 간 조직 중량 변화를 나타낸 것이다(a,bValues in the row with different superscripts are significantly different, p<0.05. Data are shown as the mean±SE (n=8)).
도 9는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 동물실험에서의 비장, 흉선, 정소, 신장 조직 중량 변화를 나타낸 것이다(Data are shown as the mean±SE (n=8)).
도 10은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 동물실험에서의 신장조직 부근 지방조직의 중량 변화를 나타낸 것이다 (a,b, cValues in the row with different superscripts are significantly different, p<0.05. Data are shown as the mean±SE (n=8)).
도 11은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 동물실험에서의 실험군별 혈 중 leptin 변화를 나타낸 것이다(a, bValues in the row with different superscripts are significantly different, p<0.05. Data are shown as the mean±SE (n=7)).
도 12는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 동물실험에서의 실험군별 혈당을 분석한 결과를 나타낸 것이다(Data are shown as the mean±SE (n=8))
도 13은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 동물실험에서의 실험군별 혈액학적 분석 결과를 나타낸 것이다. (A) triglyceride (TG), (B) total cholesterol (TC), (C) low density lipoprotein (LDL-C), (D) high density lipoprotein (HDL-C)를 나타낸다 (a, b, cValues in the row with different superscripts are significantly different, p<0.05. Data are shown as the mean±SE (n=7).
도 14는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 동물실험에서의 실험군별 간 조직의 지방증을 광학현미경으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(400× magnification). (A) Normal, (B) HFD, (C) HFD+GS-E3D 100 mg/kg, (D) HFD+GS-E3D 300 mg/kg, (E) HFD+GS-E3D 1000 mg/kg, (F) HFD+홍삼추출물 1000 mg/kg, (G) 간 지방증 점수를 나타낸다. 화살표는 간 지방증을 표시한 것이다( a, b, c, dValues in the row with different superscript letters are significantly different, p<0.05. Data are shown as mean±SE (n=8)).
도 15는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 동물실험에서의 실험군별 부고환 지방세포의 크기 변화를 광학현미경으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(400× magnification). (A) Normal, (B) HFD, (C) HFD+GS-E3D 100 mg/kg, (D) HFD+GS-E3D 300 mg/kg, (E) HFD+GS-E3D 1000 mg/kg, (F) HFD+홍삼추출물 1000 mg/kg, (G) 양적인 분석을 나타낸다( a, b, c, dValues in the row with different superscript letters are significantly different, p<0.05. Data are shown as mean±SE (n=8)).
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
이하, 본 발명에 있어서, 인삼은 수삼, 백삼 또는 홍삼 등을 포함하는 통상적인 인삼 및 이의 가공삼을 포괄하는 명칭으로 사용될 수 있다.
1. 실험재료
GAP 인증 4년근 홍삼 주근을 금산인삼농협에서 구입하였고, 홍미삼은 우신산업에서 구입하여 사용하였다. Pectinase 효소는 식품첨가물로 시판되는 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP)(E1), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP)(E2), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3), 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5) 등을 Novozymes(Denmark)에서 구입하여 사용하였다. 또한, α-허브자임(α-herbzym)(E4)은 한국효소원 (한국)에서 구입하였다.
2. 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비 선발을 위한 추출물 제조방법
인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따라 진세노사이드 함량을 알아보고 진세노사이드 Rd 전환을 위한 최적의 배합비율을 찾기 위하여 인삼 또는 홍삼의 주근과 세근의 비율을 주근0:세근10(C-01), 주근2:세근8(C-28), 주근4:세근6(C-46), 주근6:세근4(C-64), 주근8:세근2(C-82), 주근10:세근0(C-10) 비율로 무게를 달아 총 중량 100g으로 맞추고 중량의 5배의 물을 넣고 75℃ 수욕 상에서 6시간씩 3회 반복 추출한 후 여과한 액을 60℃ 수욕 상에서 농축하여 3 Brix, 6 Brix, 12 Brix 로 농도를 조정하였다.
3. 진세노사이드 Rd 강화 효소처리 인삼 또는 홍삼추출물 제조
PPD계열의 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc로부터 진세노사이드 Rd를 제조하기 위하여 상기 인삼 또는 홍삼 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)를 10%(w/w)를 넣고 50℃ 교반배양기(Shaking incubator)에서 3일, 5일 동안 반응한 후 95℃에서 30분간 처리하여 효소 반응을 중지하였다.
4. 진세노사이드 분석
진세노사이드 함량 분석을 위하여 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근 배합비별 추출물시료 및 진세노사이드 Rd 강화 효소처리한 인삼 또는 홍삼추출물을 각각 동결건조기에서 건조하여 분말화하여 시료로 사용하였다. 분말화된 시료를 정확하게 10mg을 달아 메탄올 1ml에 녹여 1시간 동안 초음파 추출 후 원심분리하여 상층액을 회수하여 0.45um 멤프레인필터에 여과하여 여과액을 분석용 시료로 사용하였다. 분석기기 조건은 다음과 같다.
진세노사이드 함량분석은 Waters-PDA(Waters 1525, detector 2998, USA)를 활용하여 물(A액)과 ACN (B액)을 하기 표 1 및 표 2와 같은 용매 조건으로 flow rate 1.0 ml/min으로 하여 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석하였다.
[표 1] 진세노사이드 분석을 위한 용매조건
Figure pat00002
[표 2] 진세노사이드 분석을 위한 HPLC 분석조건
Figure pat00003

[ 실시예 1] 본 발명에 따른 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물 ( GS -E3D) 제조
인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따른 6개의 시료 C-01, C-28, C-46, C-64,C-82, C-10를 활용하여 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물을 제조하기 위한 조건 설정을 위한 실험을 하였다. 인삼 또는 홍삼 추출물에 펙티나제(10%, w/w)를 넣고 50℃ 교반배양기(Shaking incubator)에서 4일, 5일, 6일 동안 반응한 후 95℃에서 30분간 처리하여 효소 반응을 중지한 후 농축한 다음 PPT계열로서 진세노사이드 Rg1, Re, Rf와 PPD 계열로서 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rb3, Rd, F2, CK 함량을 각각 분석하였다. 당쇄가 3개 있는 진세노사이드 Rd는 당쇄가 4개 있는 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rb3로부터 효소에 의해 당이 1개 떨어지면서 만들어지며, 진세노사이드 Rd로부터 당쇄가 2개 있는 F2를 거쳐 당쇄가 1개 있는 CK로 전환된다. 따라서 진세노사이드 Rd 함량을 높이기 위해서는 기질인 추출물에 PPD 계열의 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rb3의 함량이 높을수록 유리하다.
하기 표 3 및 표 4에서 보여지는 바와 같이, 진세노사이드 Rd는 모든 조건에서 세근 100% 추출물인 C01에서 높게 나타나다가 주근의 함량이 늘어날수록 점차적으로 줄어들었고, 추출물의 농도를 브릭스(brix)로 기준하여 3브릭스, 6브릭스, 12브릭스로 하였을 경우 농도가 낮을수록 반응이 빨리 일어나 진세노사이드 Rd 함량이 늘어났다가 줄어들었으며, 농도가 높을 경우 반응이 천천히 지속적으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 12 및 도 13). 그러나 본 제조물의 산업적 적용을 위해서는 반응시간의 단축도 중요하나 반응의 안정성 및 경제성도 중요하므로 반응시간의 단축을 위하여 추출물의 농도를 너무 낮게 할 수 없으므로 적정한 농도 및 반응시간을 결정하는 것이 중요하다. 따라서 발명자는 진세노사이드 Rd 함량을 높이면서 가장 경제성이 있는 조건을 선발하여 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물을 제조하였고 "GS-E3D"로 명명하였다. 요약하면, 주근 대비 세근의 비율이 60%이상 함유된 인삼 또는 홍삼을 물, 주정 또는 주정함유 용매에 추출하여 농축한 후 약 6 브릭스 (1~12 브릭스)로 조정한다. 6 브릭스의 인삼 또는 홍삼 추출물에 10%(w/w)의 펙티나제 효소를 첨가하여 50℃ 조건에서 3일간 교반 배양한 후 95℃에서 30분간 가열하여 효소 반응을 정지시켜 진세노사이드 Rd강화 인삼 또는 홍삼추출물(GS-E3D)을 제조하였다. 제조 공정도는 도 1과 같다.
[표 3] 조건에 따른 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물의 진세노사이드 함량(mg/g)
Figure pat00004

[표 4] 조건에 따른 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물의 진세노사이드 함량(mg/g)
Figure pat00005

[ 실시예 2] 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물 ( GS - E3D )의 규격기준
본 실시예에서 원료는 인삼 Panax ginseng C.A. Meyer(두릅나무과 Araliaceae)의 뿌리를 건조하여 만든 백삼 또는 수삼을 증기로 쪄서 익혀 말린 홍삼을 주정과 정제수 단독 또는 혼합액으로 추출한 다음, 식품첨가물용 효소 펙티나제를 넣고 효소 처리한 발효 인삼 또는 홍삼추출물이다.
본 실시예에서 제조방법은 인삼 또는 홍삼 (주근대비 세근 60%이상 함유) 1 kg에 물 또는 70% 주정 10L를 넣어 75℃에서 18시간 동안 1차 추출 후, 잔사에 30% 에탄올을 9L 넣고 75℃에서 18시간 2차 추출하여 1차 추출액과 2차 추출액을 합하여 농축하여 인삼 또는 홍삼 농축액 (60 Brix, 고형분 함량 60% 이상)을 제조한 후, 인삼 또는 홍삼농축액 100g을 정제수로 1000L가 되게 희석(6 Brix)한 다음 효소 10g을 넣어 50℃에서 3일간 반응시켜 얻었다. 본 시료의 성상은 적갈색으로 특이한 냄새가 있다.
상기 시료 0.2g을 정확하게 달아 메틸알코올 10mL에 녹여 0.45μm 멤브레인 필터로 여과한 시험용액을 사용하여 하기 표 5 및 표 6의 분석조건에 따라 분석기에 주입하여 HPLC 분석하여 피크 (진세노사이드 Rd)의 머무름 시간(RT)을 확인하였다.
[표 5]
Figure pat00006
[표 6]
Figure pat00007

본 시료의 기능성분은 진세노사이드 Rd이며 확인시험법에 따라 시험할 때 진세노사이드 Rd 함량은 15 mg/g이상이어야 한다. 본 시료를 가지고 약전 일반시험법 비중측정법 제1법에 따라 시험할 때 비중은 1.000∼1.040이어야 한다. 본 시료 3.0g에 새로 끓여 식힌 물을 넣어 30mL로 하여 약전 일반시험법 pH 측정법에 따라 시험할 때 pH는 5.0∼7.0이어야 한다. 본 시료를 가지고 약전 일반시험법 굴절률측정법에 따라 시험할 때 굴절률은 1.340∼1.380이어야 한다.
본 시료에 대한 순도시험 방법은 다음과 같다(표 7). 중금속은 본 시료 1.0g을 달아 약전 일반시험법 중금속시험법 제2법에 따라 조작하여 시험한다. 비교액에는 납 표준액 2.0mL를 넣는다(20ppm 이하). 비소는 본 시료 1.0g을 달아 약전 일반시험법 비소시험법 제3법에 따라 시험한다(2ppm 이하). 증발잔류물은 본 시료 1.0g을 달아 장원기 일반시험법 증발잔류물시험법에 따라 시험할 때 1.0∼5.0% 이어야 한다. 잔류농약시험은 본 시료를 가지고 식품의약품안전청고시 생약 등의 잔류오염물질 기준 및 시험방법에 따라 시험할 때 적합하여야 한다. 미생물한도시험은 본 시료를 약전 일반시험법 미생물한도시험법에 따라 시험할 때 호기성생균수는 1g당 100개 이하이어야 한다. 본 규격 및 시험방법에 대하여는 별도의 규정이 없는 한 약전 통칙 및 일반시험법을 준용하는 것으로 한다.
[표 7] 진세노사이드 Rd 강화 발효 인삼 또는 홍삼추출물 (GS-E3D)의 순도시험 분석
Figure pat00008

[ 실시예 3] 진세노사이드 Rd 강화 발효 인삼 또는 홍삼추출물 ( GS - E3D ) 성분 분석
본 발명에 따른 효소 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)을 제조하기 위하여 4년근 인삼 또는 홍삼을 사용하였고, 진세노사이드 Rd 함량을 높이기 위하여 주근 대비 세근의 비율을 60% 이상으로 설정하여 75℃에서 6시간 동안 물로 3회 추출하여 6 Brix까지 농축하여 주근 및 세근 혼합물의 추출액((GS-C46))을 제조하였다. 상기 혼합 추출물((GS-C46))에 펙티나제(Novozyme®33095, Denmark)를 10%되게 첨가한 후 50℃의 교반 배양기에서 3일간 반응시켜 진세노사이드 Rb1 및 Rc를 진세노사이드 Rd로 전환하였다. 더 이상의 반응을 중지하기 위하여 95℃에서 30분간 처리하여 효소를 불활성화시킴으로써 발효 인삼 또는 홍삼 추출물 제조를 완성하였고, 이것을 농축하여 엑기스 또는 분말의 형태로 만들어 분석에 사용하였다. 기능성분 설정은 진세노사이드 Rd(범위 15mg/g 이상)로 하여, 분석결과 기능성분 함량을 하기 표 8에 나타내었다.
진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb1, Rc, Rb2, Rb3,Rd, 20(S)-Rg3,20(R)-Rg3, Rk1, Rg5의 함량은 각각 5.9, 12.6, 4.7, 30.2, 14.0, 17.6, 2.5, 27.7, 1.3, 1.4, 0.8, 1.5 mg/g이었다.
[표 8] 진세노사이드 Rd 강화 발효 인삼 또는 홍삼추출물 (GS-E3D)의 기능성분 함량 분석
Figure pat00009

[ 실험예 1] 최적 효소 선발을 위한 실험
1. 진세노사이드 Rd 강화 최적 효소 선발 실험
조사포닌((주)위디아), 인삼추출물((주)성신BST), 홍삼((주)우신산업)을 구입하여 사용하였다. 홍삼은 80% 에탄올로 환류 추출하여 추출액을 얻었고, 인삼 또는 홍삼 추출물은 동결건조하여 사용하였다.
시료 5mg을 증류수 2 mL에 완전히 녹이고, 효소액은 1% (v/v)로 하여 0.5 mL씩 넣어 2.5 mL로 맞추었다. 50℃ Shaking Incubator에서 120 RPM으로 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응시켰다. 무처리군은 효소 대신 증류수를 가하여 반응시켰다.
진세노사이드 Rd 강화 최적 효소를 선발하기 위해서 식품 첨가물용으로 시판되고 있는 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP)(E1), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP)(E2), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3), α-허브자임(α-herbzym)(E4)을 조사포닌, 인삼농축액 및 홍삼농축액에 1% (v/v)가 되도록 첨가한 후 50℃에서 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응시켜 진세노사이드 함량을 분석하였다.
진세노사이드 함량 분석을 위하여, 추출액에 수포화 n-부탄올 1:1을 넣고 충분히 혼합한 후 원심분리하여 수포화 n-부탄올 층을 회수하는 것을 2회 더 반복하였다. 회수된 수포화 n-부탄올 층에 증류수 3mL로 세척한 후 원심분리하여 부탄올 층만을 회수하여 70℃ 수욕조에서 농축하여 분석을 위한 사포닌 성분을 회수하였다.
상기 4가지 효소에 의한 효소발효 후 조사포닌 발효물의 진세노사이드 함량을 조사하여 하기 표 9 및 표 10에 나타내었다.
[표 9] 조사포닌에 효소 E1 및 E2 처리 후의 진세노사이드 함량 변화
Figure pat00010
[표 10] 조사포닌에 효소 E3 및 E4 처리 후의 진세노사이드 함량 변화
Figure pat00011

상기 4가지 효소에 의한 효소발효 후 인삼 또는 홍삼추출물 발효물의 진세노사이드 함량을 조사하여 하기 표 11 및 표 12에 나타내었다.
[표 11] 인삼 또는 홍삼추출물에 효소 E1 및 E2 처리 후의 진세노사이드 함량 변화
Figure pat00012
[표 12] 인삼 또는 홍삼추출물에 효소 E3 및 E4 처리 후의 진세노사이드 함량 변화
Figure pat00013

상기 표 9 내지 표 12에 나타낸 바와 같이, 상기 4가지 효소 모두 PPT계열 사포닌의 함량에는 크게 영향을 미치지 않았으나 PPD계열 사포닌의 함량변화에는 영향을 미쳐 PPD계열 사포닌에 작용하는 효소로 판단되었다.
상기 표 9 내지 표 12에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rd 함량을 선택적으로 가장 높이는 효소는 4가지 효소 중 E3인 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)로 나타나, 진세노사이드 Rd 생산을 위한 최적 효소는 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear, E3)로 결정하였다. 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP)(E1)과 α-허브자임(α-herbzym)(E4)은 진세노사이드 Rd 함량을 높이나 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)보다 진세노사이드 Rd의 절대함량이 떨어졌고, 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP)(E2)는 반응이 매우 빠르게 진행되어 같은 시간에 진세노사이드 Rd를 거쳐 F2와 Compound K 생성량이 많아 F2와 Compound K를 최종산물로 할 경우 유용한 효소로 판단되었으나, 진세노사이드 Rd 생성을 위한 scale up 공정표준화가 어려울 것으로 판단되어 배제되었다. 진세노사이드 Rd 생성은 정도의 차이는 있었으나 조사포닌과 인삼 또는 홍삼추출물에서 모두 반응 1 내지 6시간에 가장 높은 진세노사이드 Rd 수치를 나타내는 것으로 확인되었다.
2. 경제성을 위한 최적 추출물 농도 및 온도 선발 실험
인삼 또는 홍삼농축액은 증류수로 3, 6, 12 Brix로 희석시켜 사용하였다. 추출액 2 mL에 효소액(E2, E3)은 10% (v/v)로 하여 0.5 mL씩 넣어 2.5 mL로 맞추었다. 온도는 각각 37℃, 50℃로 설정하여 교반 배양기(Shaking Incubator)에서 120 RPM으로 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응시켰다. 무처리군은 조효소 대신 증류수를 가하여 반응시켰다. 효소반응물은 95℃에서 10분간 처리하여 반응을 중지시켰다.
본 기술을 사업화하려면 보다 경제적인 생산 방식을 채택하여야 하는데, 경제적인 Rd 효소전환 최적 온도를 선발하기 위하여 선발된 효소 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)를 37℃와 50℃ 온도 조건에서, 추출물 농도 선발을 위하여 인삼 또는 홍삼추출물의 농도를 3 Brix, 6 Brix, 12 Brix로 조절하여 추출물 농도 및 온도 선발실험을 하였다. 실험결과, 진세노사이드 함량을 조사하여 50℃에서 추출물 농도별 효소 E3에 의한 진세노사이드 함량 변화(표 13), 37℃에서 추출물 농도별 효소 E3에 의한 진세노사이드 함량 변화(표 14) 및 인삼 또는 홍삼 농축액의 온도 및 농도별 효소 전환 후 사포닌 함량을 분석하였다.
[표 13] 50℃에서 추출물 농도별 효소 E3에 의한 진세노사이드 함량 변화
Figure pat00014
[표 14] 37℃에서 추출물 농도별 효소 E3에 의한 진세노사이드 함량 변화
Figure pat00015
상기 표 13 및 표 14에 나타낸 바와 같이, 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)에 의한 진세노사이드 Rd 함량을 높이는 온도 조건은 같은 추출물 조건에서 37℃ 보다 50℃가 훨씬 더 높은 진세노사이드 Rd 전환율을 보였고, 50℃ 온도조건에서는 추출물 농도가 낮을 때 진세노사이드 Rd의 전환이 빠르게 나타났고, 추출물 농도를 높일 경우 반응 시간 연장 및 효소 농도 조정이 필요한 것으로 나타났다. 그러나 추출물의 농도가 낮을 경우 농축 등의 시간적 경제적 비용이 높아지므로 경제적인 생산 방법은 추출물 농도를 높이고 반응시간을 다소 연장하는 것이 좋을 것으로 판단되었다. 따라서 본 실험을 통하여 진세노사이드 Rd 함량을 높이기 위한 최적 효소 온도는 50℃이고, 추출물 농도는 12 Brix로 결정하되 반응 시간 및 효소 농도를 조정하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다.
3. 효소 농도 및 시간 결정을 위한 조건 실험
인삼 또는 홍삼농축액을 증류수로 희석시켜 12 Brix (550 mg에 2.5 mL 증류수)으로 조정한 후 효소액(노보자임 33095(Novozym 33095) (E5))을 10% 또는 15% (w/w)를 넣고 50℃ shaking incubator에서 RPM은 120으로 하여 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일 동안 반응시켰다. 효소반응물은 95℃에서 10분간 처리하여 반응을 중지시켰다.
최소의 효소농도로 Rd강화 발효 인삼 또는 홍삼을 제조하기 위하여 효소 농도와 효소반응 시간 설정 실험을 하였다. 12 Brix로 조정한 인삼 또는 홍삼추출물에 효소 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)를 각각 10%와 15%가 되게 넣고 50℃에서 1일, 2일, 3일, 4일간 반응시킨 후 진세노사이드 함량을 분석하여 하기 표 15에 나타내었다.
[표 15] 효소 Novozym 33095 (E5) 농도에 따른 시간별 진세노사이드 함량 변화
Figure pat00016
상기 표 15에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 함량을 분석한 결과 시간이 증가할수록 진세노사이드 Rd의 함량이 증가하였으나 2일 이후부터는 큰 폭으로 증가하는 경향을 보이지 않았고, 효소 10%와 15%간에 현격한 차이가 나타나지 않음을 관찰하였다. 따라서 12 Brix의 인삼 또는 홍삼 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)를 10% 정도로 넣고 50℃에서 3일간 반응하였을 때 인삼·홍삼 지표성분인 Rg1과 Rb1의 합이 크게 줄지 않으면서도 진세노사이드 Rd 수준이 크게 증가한 효소반응물을 얻을 수 있음을 확인하였다.
[ 실험예 2] 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비 선발을 위한 실험
1. 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따른 추출수율 비교
진세노사이드 Rd는 미생물이나 효소에 의해 PPD 계열인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc등으로부터 당이 1개 떨어져 생성된다. 따라서 본 발명에서는 인삼 또는 홍삼에서 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc등의 PPD계열 진세노사이드 함량이 높을수록 진세노사이드 Rd 함량을 높이는데 유리하다. 따라서 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따라 진세노사이드 함량을 알아보고자 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 비율을 주근0:세근10(C-01), 주근2:세근8(C-28), 주근4:세근6(C-46), 주근6:세근4(C-64), 주근8:세근2(C-82), 주근10:세근0(C-10)의 6개의 비율로 추출 농축 후 동결건조하여 추출수율 및 진세노사이드 분석을 하였다. 추출수율은 인삼 또는 홍삼주근만 사용하였을 경우 29.9%로 가장 낮았고, 주근에 인삼 또는 홍삼세근의 비율을 높일수록 수율은 점차 증가하다가 인삼 또는 홍삼세근만 사용하였을 경우 54.0%로 주근만 사용했을 때보다 세근만 사용했을 경우 추출 수율이 약 2배가량 높은 것을 확인할 수 있었다 (표 16). 이것은 주근의 경우 피부가 두껍고, 물에 용출되지 않는 섬유질, 펙틴 및 전분이 세근보다 많기 때문인 것으로 사료되었다.
[표 16] 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근 배합 비율에 따른 추출 수율
Figure pat00017

2. 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따른 추출수율 비교
진세노사이드는 인삼 또는 홍삼의 주요성분 7가지를 대상으로 분석하였으며(표 17), PPT 계열 진세노사이드로서 진세노사이드 Rg1, Re, Rf와 PPD 계열 진세노사이드로서 Rb1, Rc, Rb2, Rd를 분석하였을 때, 이들 7가지 진세노사이드를 총합으로 본 진세노사이드 총량은 인삼 또는 홍삼세근 추출물(C01)이 75.06 mg/g으로 인삼 또는 홍삼주근 추출물(C10) 30.17 mg/g보다 약 3.2배 월등히 높게 나타났으며, 인삼 또는 홍삼세근에 인삼 또는 홍삼주근을 비율별로 증가할수록 진세노사이드 총합 함량은 줄어들었다. 또한, 진세노사이드 Rd 전환 가능한 PPD 계열 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rb3, Rd의 합은 인삼 또는 홍삼세근 추출물(C01)이 57.64 mg/g으로 인삼 또는 홍삼주근 추출물(C10) 18.08 mg/g보다 약 3.2배 월등히 높게 나타났으며, PPD계열 진세노사이드 함량 역시 인삼 또는 홍삼세근에 인삼 또는 홍삼주근을 비율별로 증가할수록 감소하였다. 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 진세노사이드 Rd 강화를 위한 시료는 인삼 또는 홍삼주근보다는 인삼 또는 홍삼세근을 사용하는 것이 훨씬 유리할 것으로 사료 되었다.
[표 17] 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근 배합 비율에 따른 진세노사이드 분석
Figure pat00018

3. 한외여과 성분분획의 제조
주근:세근을 4:6의 비율로 혼합(R4S6)하여 500 g의 총 중량이 되도록 하고, 5 L의 물을 첨가하여 80 ℃에서 6시간 동안 3회 반복 추출 및 여과한 후 추출액 10 L를 3 kDa 및 5 kDa의 분자량컷(molecular cut-off)을 갖는 한외여과막을 활용하여 각각 0%(내액:외액 9:1), 20%, 40%, 60%, 80% 한외여과한 후, 한외여과 내액을 각각 동결건조하였다.
한외여과 농축액 (내액)의 수율은 3 kDa 및 5 kDa 한외여과막에서 여과율에 따른 수율차이를 나타내지 않았다 (표 18). 3 kDa 포어사이즈를 가진 한외여과막에 의한 수율로 볼 때 20% 한외여과했을 경우 수율은 89.2%으로 약 90%정도 됐고, 50% 한외여과했을 경우 70.9%의 수율을 나타냈으며, 80%까지 농축했을 경우의 수율은 54.9%로 나타났다 (표 18).
[표 18] 한외여과막 3 kDa와 5 kDa의 여과율에 따른 수율
Figure pat00019
내액:외액의 비율은 10%(내액:외액 9:1), 20%(내액:외액 8:2), 30%(내액:외액 7:3), 40%(내액:외액 6:4), 50%(내액:외액 5:5), 60%(내액:외액 4:6), 70%(내액:외액 3:7), 80%(내액:외액 2:8)을 나타낸다.
[ 실험예 3] 세포를 이용한 지질개선 활성 탐색
1. 실험물질의 조제
세포 실험에 사용한 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 조제는 각각 0.1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL의 농도로 cell cultrue media에 희석하여 사용하였으며 시료는 실험당일 조제하여 냉장 보관하였다.
2. 실험 세포주
실험에 사용한 3T3-L1 pre-adipocyte cell (전지방세포)은 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 분양 받아 사용하였으며, 세포 배양에 필요한 시약은 Gibco (USA)에서 구입하였다. 세포 배양 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 10% bovine serum (BS)과 1% antibiotics-antimycotic을 첨가하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 세포 배양기에서 2~3일에 한 번씩 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
3. 세포 생존율 측정( WST -1 assay )
시료 처리에 의한 농도 의존적 세포생존율은 WST-1 assay로 측정되었다. 배양된 3T3-L1 세포를 96 well plate에 5×103 cells/well 가 되도록 분주하였다. 24시간 배양 후 시료를 농도별로 처리하고 48시간을 배양한 후 WST-1 시약을 100 μl당 10 μl씩 첨가하여 반응시킨 뒤 microplate reader (Infinite 200, Tecan Trading AG, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 다음과 같은 공식을 이용하여 산출하였다.
Cell viability (%)=(시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100
본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D) 처리에 따른 3T3-L1 adipocytes 세포 생존율을 조사하기 위하여 농도별 시료를 처리한 후, WST-1 분석 방법으로 세포 생존율을 측정하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 시료를 처리한 실험군에서의 생존율은 고농도인 5 mg/mL에서 96.5%의 생존율을 보여 대조군과 유사한 수준을 나타내었다.
4. Adipogenesis 유도
2×105 cells/ml을 6 well-plate에 세포 밀도가 100%가 될 때까지 배양한 후 배지를 바꿔 37℃, 5% CO2의 환경에서 48시간 더 배양하였다. 1 μM dexamethasone, 0.5 mM methylisobutylmethylxanthine (IBMX), 1 μg/mL insulin등 세포분화유도에 사용된 시약은 Cayman (USA)에서 구입하였다. 지방세포로 분화를 유도하기 위해 adipogenic cocktail이 포함된 분화유도배지(dulbecco's modified Eagle's medium + 10% fetal bovine serum)에서 48시간 배양한 후 insulin 1 μg/mL이 포함된 분화유지배지로 교체하였다. 이 후 48시간 간격으로 배지를 2회 교체한 후 분화유도 상태를 확인하였다. 분화유도과정 중에 시료의 분화 억제 효능을 확인하기 위해 분화유도배지에 시료를 함께 처리하였으며, 시료를 처리하지 않고 분화 유도한 것을 대조군으로 하였다.
5. Oil Red O 염색
세포 배양 배지를 제거하고 PBS (Gibco Inc., Korea) 용액으로 2회 세척한 후 4% formaldehyde (Sigma, USA)를 처리하여 20분 간 상온에서 반응시켰다. 이 후 증류수와 60% isopropanol로 1분간 각각 2회 세척하고 Oil Red O solution (Sigma, USA) 으로 10분간 염색한 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화를 확인하였다. 또한 정량을 위해 isopropanol을 가하여 염색된 시약을 용출시켜 회수한 후 microplate reader (Infinite 200, Tecan Co, Switzerland)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다(Hwang et al., 2003).
도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, Oil Red O 염색을 통해 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)이 3T3-L1 adipocyte의 분화 억제에 미치는 영향을 관찰한 결과 시료의 농도가 증가할수록 염색된 지방구의 수가 점차 감소하는 것으로 확인되었다. 분화유도물질을 처리한 세포와 비교하여 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)을 처리한 실험군은 0.1 mg/mL에서 94.4%, 0.5 mg/mL에서 83.0%, 1 mg/mL에서 77.7%, 2 mg/mL에서 75.9%, 5 mg/mL에서 62.2%의 지방 분화율을 나타내어 시료 처리 농도가 증가함에 따라 지방세포 내 지방함량이 감소되는 것으로 조사되었다.
[ 실험예 4] 비만유도 동물 모델에서의 지질개선 효능 검증
1. 실험동물
실험동물은 샘타코 바이오코리아(오산 한국)에서 C57BL/6 mice male 6주령을 분양받았으며 일주일 순화기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 실험식이 급여는 60% calorie fat diet (중앙실험동물 한국)를 급여하여 비만을 유도하였으며 정상군과 비만유도군의 몸무게 차이가 20%이상 차이가 있는 개체에서 Z열 방식으로 그룹을 배정하였다. 실험군은 정상군(Normal group), 대조군(Control group), 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D) 0.1 g/kg 실험군(GS-E3D 0.1 g group), 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D) 0.3 g/kg 실험군(GS-E3D 0.3 g group), 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D) 1 g/kg 실험군(GS-E3D 1 g group)으로 구분하였으며 양성대조군으로는 홍삼 추출물 1 g/kg실험군(RGE 1 g group)으로 하여 군당 10마리씩 실험에 사용하였다. 본 실험은 원광대학교의 동물실험윤리규정을 준수하여 수행하였다(WKU12-47).
2. 시료 투여
각 실험군(양성 대조군, 실험물질 투여군) 당 한 마리씩 사육 케이지에서 꺼내어 적정 용량의 해당 물질을 마우스용 존데를 이용하여 경구투여 하였으며 체중과 사료 및 음수 섭취량은 급여 후 익일 잔량을 측정하여 주 1회 간격으로 일정한 시간에 측정하였다.
3. 부검
부검은 Ether로 마취 후 복대정맥에서 채혈하여 혈당을 측정하였다. 이 후 간을 비롯한 기타 장기를 적출하여 무게를 측정하고 지방은 부고환, 후복막, 신장조직 부근 지방조직을 적출하여 측정하였다. 또한 간과 지방 조직은 조직 염색하여 간 지방증 및 지방의 크기를 분석하였다.
4. 혈액 분석
동물 부검 시 복대정맥에서 채혈하여 분리한 혈청은 leptin과 triglyceride (TG), total cholestero (TC), low density lipoprotein (LDL-C), high density lipoprotein (HDL-C) 분석에 사용하였으며 녹십자 의료재단(GC Labs, 한국)에 분석을 의뢰하였다.
5. 통계처리
모든 실험결과는 통계 프로그램(SPSS ver.12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균 ± 표준오차(Mean ± S.E.)로 계산하였다. 각 실험군 간의 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA (one-way analysis of variance test)를 실시한 후 유의성이 있는 경우, p<0.05 미만일 때 Ducan's multiple range test로 사후 검정하였다.
6. 중량, 식이 및 음수 섭취량 변화
실험동물은 3주간 비만 유도하여 0주차에 정상군(Normal group)과 비만 유도군간의 체중 차이가 20% 이상으로 확인되어 0주차부터 각 실험군별로 분리하여 시료를 경구투여 하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군(Control group)은 비만유도 1주차부터 정상군과 유의한 체중 차이를 보였으며 실험 종료시 정상군의 체중량은 32.9±0.4 g, 대조군은 44.7±0.6 g으로 나타나 정상군의 체중량에 비해 약 35.7% 높게 조사되었다. 반면 대조군과 비교하여 실험군은 시료 투여 3주차부터 체중이 점차 감소하는 경향이 관찰되어 4주차까지 체중량이 대조군에 비하여 유의한 차이를 보이는 것으로 확인되었다. 실험 종료 후 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)을 섭취한 실험군의 체중은 GS-E3D 0.1 g 실험군이 42.6±0.6 g, GS-E3D 0.3 g 실험군이 42.5±0.7 g, GS-E3D 1 g 실험군이 43.2±0.7 g으로 나타나 대조군보다 체중이 감소하는 경향을 보였다(A). 각 실험군의 식이섭취량은 정상군이 3.4 g, 대조군을 포함한 실험군이 약 2.0~2.8 g으로 나타나 실험군간 유의적인 차이는 없었으나 정상군에 비해 고지방을 섭이한 실험군이 다소 낮게 나타났다.
7. 간 조직 중량 변화
도 8 내지 도 10에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이에 의한 각 실험군별 간 중량 변화를 확인한 결과 정상군은 1.4±0.04 g, 대조군은 1.5±0.06 g으로 나타나 대조군이 정상군에 비해 약 12.2%로 증가하는 경향이 관찰되었다. 실험군간 간 중량은 GS-E3D 0.1 g 실험군이 1.7±0.11 g, GS-E3D 0.3 g 실험군이 1.5±0.11 g, GS-E3D 1 g 실험군이 1.4±0.02 g으로 나타나 GS-E3D 1 g 실험군이 정상군과 가장 유사한 수준을 보였다(도 8). 이와 더불어 시료가 체내 조직에 독성을 미치는지 확인하기 위하여 비장, 흉선, 정소, 신장 조직 중량을 조사한 결과 모든 조직에서 실험군간 유의한 차이가 나타나지 않았다(도 9). 흉선의 경우 정상군과 비교하여 비만유도군 모두에서 중량이 증가하는 경향을 보였는데, 이는 비만 상태에서 지방조직이 초래하는 면역 기능 저하에 따라 흉선의 비대화에 의해 나타난 현상(Matsuzawa et al., 1999; Nieman et al., 1999)으로 생각된다. 더불어 실험군간 흉선 중량을 비교한 결과 무게 차이는 크지 않았으나 RGE 1 g 실험군에서 증가한 것에 대해서는 추가적인 연구가 수행되어야할 것으로 생각된다. 신장조직 부근 지방조직의 무게는 정상군에 비해 대조군이 유의하게 증가하였으나 GS-E3D 0.3 g 실험군과 GS-E3D 1 g 실험군에서 점차 감소하는 경향을 확인하였으며, 후복막 지방과 부고환 지방의 무게는 정상군과 비교하여 대조군에서 증가하였으나 실험군간 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 10).
8. 혈 중 leptin 변화
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)이 혈중 렙틴 농도에 미치는 영향을 확인한 결과 혈중 렙틴의 함량은 정상군에 비하여 대조군이 높게 증가하는 경향을 보였다. 실험군간 렙틴의 농도는 시료의 농도가 높아짐에 따라 점차 감소하여 GS-E3D 1 g 실험군에서 가장 낮은 수준을 보였으나 RGE 1g 실험군은 대조군과 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다.
9. 혈당 분석
도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 투여에 따른 실험군별 혈당 수치는 정상군에 비해 대조군이 다소 증가하는 경향을 보였다. 그러나 비만을 유도한 대조군과 비교한 혈당 수치는 RGE 1 g 실험군을 포함하여 실험군간 유의한 차이를 나타내지 않았다.
10. 혈액학적 분석
고지혈증은 혈액 중의 콜레스테롤, 중성지방, 인지질 및 유리지방산 등의 농도가 비정상적으로 증가한 상태로서 혈중 지질 함량의 증가는 metabolic sensor에 해당하는 단백질의 발현에 영향을 미쳐 관상심혈관계 질환 위험을 증대시킨다고 알려져 있다(Wat et al., 2009). 최근 연구에서 Chen 등(2010)은 고지방식이를 섭취한 쥐에 콩의 oligosaccharide를 처리한 결과 콜레스테롤 및 중성 지질 농도가 감소된 것으로 보아 혈중 지질 수준 개선효과가 높다고 한 바 있다. 또한 Chen 등(2003)은 성장기의 Wistar 쥐에 10%의 대두단백 분획물 급여한 결과 콜레스테롤 및 중성 지질 농도가 감소된 것으로 보아 항비만 효과가 뛰어나다고 시사한 바 있다. 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)도 대조군에 비해 혈중 콜레스테롤과 triglyceride 함량을 유의하게 감소시켜 혈중 지질 함량을 개선하는 것으로 확인되었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 실험군별 혈액학적 분석에서 TC (total cholesterol)와 TG (triglyceride)의 함량은 정상군에 비해 대조군에서 높게 증가하였으나 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 투여 농도가 높아짐에 따라 점차 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 또한 체내 유해한 cholesterol로 알려진 LDL-C (low density lipoprotein cholesterol)의 함량은 대조군에 비해 GS-E3D 1 g 실험군에서 큰 변화를 보이지 않았으나 GS-E3D 0.3 g 실험군과 GS-E3D 1 g 실험군에서는 유의하게 감소되는 것으로 조사되었고, 실험군별 HDL-C (high density lipoprotein cholesterol) 함량은 대조군과 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다.
11. 간 지방증 분석
도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)이 간 조직 내 지방질의 축적에 미치는 영향을 확인하고자 각 실험군별 간 조직을 광학현미경으로 관찰하였다. 대조군의 간지방증 점수는 2.8±0.5점으로 정상군에 비해 유의하게 증가하였으나 GS-E3D 0.1 g 실험군은 2.8±0.5점, GS-E3D 0.3 g 실험군은 2.0±0.0점, GS-E3D 1 g 실험군은 1.3±0.5점으로 조사되어 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 처리 농도가 높아질수록 간 지방증이 유의하게 감소되었다.
12. 지방세포의 크기 및 변화
도 15에 나타낸 바와 같이, 각 실험군별 고지방식이에 의한 부고환지방세포의 크기를 비교하여 보면, 대조군은 4650.1±644.1 μm2으로 정상군의 2677.0±701.6 μm2에 비해 지방세포의 크기가 유의하게 증가한 것으로 확인되었다. 반면 GS-E3D 0.1 g 실험군은 4769.4±551.2 μm2, GS-E3D 0.3 g 실험군은 4189.2±1179.3 μm2, GS-E3D 1 g 실험군은 3271.2±938.8 μm2으로 나타나 시료의 농도가 높아짐에 따라 지방크기가 유의하게 감소하였다.
결론적으로 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)은 처리 농도가 높아짐에 따라 지방세포의 분화를 효과적으로 억제하여 세포 내 지방 함량을 감소시키는 것으로 조사되었다. 또한 동물실험에서 대조군에 비해 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)을 투여한 실험군은 혈액 내 에너지 대사의 주요 marker인 leptin과 콜레스테롤 함량이 감소되었으며, 간과 지방 조직 내 지방 축적과 지방세포의 크기가 유의하게 감소되어 고지방 식이로 인한 간 지방증과 지방 세포 비대화 현상을 효과적으로 개선하였다. 따라서 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)은 비만 개선에 효과가 있었으며, 이를 이용한 기능성 제품 개발에 도움이 될 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직하게 구현한 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 지질개선효과를 갖는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표현되는 진세노사이드 Rd.
    [화학식 1]
    Figure pat00020
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 진세노사이드 Rd를 0.01~100 중량%의 양으로 함유함을 특징으로 하는 지질개선용 조성물.
  3. 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물을 이용하여 효소 발효시킨 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질개선용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물은 주근 대비 세근의 비율이 주근 0% 내지 40% 대비 세근 60% 내지 100%인 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소는 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear), α-허브자임(α-herbzym), 노보자임 33095(Novozym 33095) 중 선택된 어느 하나의 효소인 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 지질개선용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102182238B1 (ko) * 2019-05-15 2020-11-24 재단법인 금산국제인삼약초연구소 진세노사이드 Rd를 강화한 효소처리 홍삼추출물을 포함하는 안구건조증 개선용 조성물 및 이의 제조방법

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