CN105936927A - 一种核桃低聚肽及其制备工艺和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核桃低聚肽及其制备工艺和用途，所述低聚肽粉肽含量在70wt％以上，其中85％以上核桃肽的分子量小于1500Dalton。所述工艺主要包括两次酶解获得核桃低聚肽粉，产率提高4％～9％。所述核桃低聚肽粉具有较好的抗氧化活性，对神经元细胞具有较好的保护作用，可以用于预防或者治疗帕金森症等相关疾病，并缓解大脑疲劳。
Description
技术领域
本发明涉及到核桃低聚肽的生产工艺，特别是涉及到一种提高核桃低聚肽产率的制备工艺，属于生物技术领域。
背景技术
核桃又名胡桃，学名Juglans regia L，核桃属，与腰果、榛子、扁桃并称世界四大干果。《太平御览》中有“胡桃本生西羌，外刚内柔，质似古贤，欲以奉贡。”古称藏族为羌人，故又有羌桃之称。核桃植株全身都是宝，除其果仁可食用外，核桃枝、核桃花、核桃外皮、核桃壳、核桃叶等还可入药。现代医学表明，核桃对泌尿系统结石、慢性气管炎、皮炎、湿疹及痢疾等疾病疗效很好。唐代名医孟诜说，核桃“通经脉、润血脉、常服骨肉细腻光润”；明代大医学家李时珍对核桃仁的医药价值的概括是“补气养血，润燥化痰，益命门，利三焦，温肺润肠等”。据记载，核桃仁含油量约为60％，核桃油中70％以上为不饱和脂肪酸。核桃除含有营养价值极高的油脂外，还含有约24％的优质蛋白质，可消化率达87.2％。核桃蛋白质中18种氨基酸齐全，且人体所需的8种必需氨基酸含量合理，对人体生理有重要功能的谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸的含量均较高，故核桃蛋白是一种良好的蛋白源。
与核桃蛋白相比，其水解产物核桃低聚肽除氨基酸组成与核桃蛋白一样具有优质蛋白的特点以外，还具有核桃蛋白所不具备的良好的溶解性、稳定性等理化性质，而且具有易吸收和低过敏原性、降低血脂和胆固醇、降低血压、促进矿物质吸收和脂肪代谢、增强运动员体能等多种生理功能，因此开发核桃低聚肽已经成为食品药品领域的研究热点。前
专利CN 105567774A所述的低聚肽粉的制备方法为单次酶解法，是将核桃仁冷榨去油，使用碱提酸沉法获得核桃蛋白质，依次经过酶解、膜纯化、浓缩、干燥等步骤获得纯度为80％以上核桃低聚肽粉。工艺稳定、绿色环保，并适合大规模生产。核桃低聚肽理论产率在35％左右，因此在现有基础上，将桃低聚肽产率提高一个百分点也比较困难。产率使用中性或者中性木瓜复合蛋白酶酶解，核桃低聚肽产率在20％左右，而使用其它蛋白酶解所得低聚肽产率在10～17％，造成核桃蛋白利用率低。核桃粕中蛋白含量在35～40％，单次酶解达到一定的酶解平衡后，大分子蛋白仍残留较多，这样可以考虑通过增加酶解次数的方法，提高低聚肽的产率。
本发明提供了一种提高核桃低聚肽产率的制备工艺，核桃低聚肽产率得到明显提高，进一步降低了生产成本。同时，生物活力实验表明，本工艺生产的核桃低聚肽粉同样具有较好的抗氧化活性；对神经元细胞具有较好的保护作用；对肿瘤细胞具有较强的抑制作用。因而可以开发用于预防或者治疗帕金森症等疾病，缓解大脑疲劳的药品、食品或者保健食品，同时也具有开发用于预防或者治疗肿瘤疾病的药品、食品或者保健食品。
发明内容
本发明公开了一种提高核桃低聚肽产率的制备工艺，旨在提供一种提高核桃低聚肽产率的制备工艺，以降低生产成本，减少废弃物的产生，提高蛋白利用率，工艺简便，适合大规模生产。本工艺生产的核桃低聚肽粉具有较好的抗氧化活性，可以用于治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健食品；对神经元细胞具有较好的保护作用，可以用于预防或者治疗帕金森症等相关疾病，和缓解大脑疲劳的药品、食品或者保健食品；对肿瘤细胞的增殖具有较好的抑制作用，可以开发用于制备抗肿瘤疾病相关药物、食品或保健食品。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种核桃低聚肽，采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在70wt％以上，其中85％以上核桃低聚肽的分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下：
数均分子量范围：25～5000
重均分子量范围：26～5000。
优选地，肽含量为82.3wt％以上，小于1500Dalton分子量占94.1％以上；肽含量为82.9wt％以上，小于1500Dalton分子量占87.8％以上；肽含量为75.4wt％以上，小于1500Dalton分子量占88.4％以上。
更优选地，肽含量为82.3wt％，小于1500Dalton分子量占94.1％；肽含量为82.9wt％，小于1500Dalton分子量占87.8％；肽含量为75.4wt％，小于1500Dalton分子量占88.4％。
本发明还提供了所述核桃低聚肽粉的制备方法，包括二次酶解步骤；优选地，还包括碱提酸沉法提取蛋白；(2)蛋白酶解；(3)分离纯化。
优选地，所述方法包括下述步骤：
(1)碱提酸沉法提取蛋白：将脱脂后的核桃粕，与水按重量比为1∶5～1∶15混合，调节pH至9～11于室温提取2次，每次1～2h，合并两次碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为3～5，静置5～6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10～1∶20的水，搅拌均匀；
(2)蛋白酶解：将步骤(1)中的蛋白液加入核桃粕重量的0.1～2％生物酶，调节温度为40～55℃搅拌酶解3～7h后，煮沸灭活10～30min，离心，沉淀物和上清液待用；
(3)分离纯化：将步骤(2)中的上清液使用孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经2000～20000Dalton超滤膜处理后，超滤膜透过液待用，合并步骤(2)中的沉淀物和两种膜的截留液，加入第一次酶解加酶量的10％～30％生物酶调节温度为40～55℃搅拌酶解3～7h后，煮沸灭活10～30min，离心，上清液经孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液经2000～20000Dalton超滤膜处理后，合并两次酶解的超滤膜透过液，浓缩干燥后，得到核桃低聚肽粉。
优选地，核桃的脱脂选自冷榨、热榨或者有机溶剂脱脂法，优选地使用冷榨脱脂法。
优选地，所述的碱提酸沉法选自连续逆流提取法和普通提取法。
优选地，所述生物酶选自食品级的中性蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40万u/g)、菠萝蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、碱性蛋白酶(酶活力≥20万u/g)、胃蛋白酶(酶活力≥50万u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一种或者它们的混合物，优选地使用中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或者它们的混合物。
优选地，所述浓缩可以为膜浓缩、减压浓缩或常压浓缩；所述干燥可以为喷雾干燥、真空干燥、加热干燥或冷冻干燥。
所述制备工艺为两次酶解，低聚肽产率比单次酶解法提高了4～9％，所制备的低聚肽的肽含量与其分子量分布和单次酶解法相当。
本发明还提供了一种组合物，其含有上述核桃低聚肽粉，和药物或食品上可接受的助剂。
所述组合物的剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
本发明所述的核桃低聚肽粉用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品的应用。所述的核桃低聚肽粉是由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶制备的。
本发明所述的核桃低聚肽粉、组合物，都可用于制备治疗或预防帕金森症，或缓解大脑疲劳的的药物、食品或保健品方面的应用。所述的核桃低聚肽粉是由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶制备的。
本发明所述的核桃低聚肽粉可以开发用于制备抗肿瘤疾病相关药物、食品或保健品方面的应用。所述的核桃低聚肽粉是由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶制备的。
本发明所述的核桃低聚肽粉可以开发用于制备对PC12细胞的增殖具有抑制作用的相关药物、食品或保健品方面的应用。所述的核桃低聚肽粉是由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶制备的。
另外，本发明还提供了一种提高核桃低聚肽产率的制备工艺，其包括下述步骤：核桃仁脱脂、粉碎、过筛，碱提酸沉法获得蛋白沉淀物，加水复溶进行第一次酶解，煮沸灭活、过滤，酶解液经微滤膜与超滤膜纯化，收集滤渣和两种膜的截留液进行第二次酶解，二次酶解液再经煮沸灭活、过滤，经微滤膜与超滤膜纯化后，最后合并两次酶解液的超滤膜透过液，浓缩、干燥后，得到较高产率的核桃低聚肽粉，产率提高了4％～9％，并采用GB/T22492-2008附录A与附录B的检测方法，得到本发明的核桃低聚肽。
所述的核桃低聚粉具有较好的抗氧化活性，可以用于治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健食品。
所述的核桃低聚粉对神经元细胞具有较好的保护作用，可以用于预防或者治疗帕金森症等相关疾病，也可以用作缓解大脑疲劳的药品、食品或者保健食品。
所述的核桃低聚粉对肿瘤细胞的增殖具有较好的抑制作用，可以开发用于制备抗肿瘤疾病相关药物、食品或保健食品。
附图说明
图1：中性蛋白酶制得肽粉液相色谱图；
图2：木瓜蛋白酶制得肽粉液相色谱图；
图3：菠萝蛋白酶制得肽粉液相色谱图。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例中用到的所有原料和溶剂均购自Sigma Biochemical and Organic Compounds for Research and Diagnostic ClinicalReagents公司。
实施例1：
单次酶解法获得肽粉：将300kg冷榨脱脂后的核桃粕均分成三等份，第一等份核桃粕(记录为A)，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至10于室温提取2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入第二等份的核桃粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入第三等份的核桃粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀。将上述核桃蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入1kg中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，截留液在80℃下浓缩至固含为3.8％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的淡黄色核桃肽粉(批号为：H-1)，产率为20.8％，肽含量为82.4wt％，小于1500Dalton分子量占96％。
本发明方法的两次酶解法获得肽粉：将300kg冷榨脱脂后的核桃粕均分成三等份，第一等份核桃粕(记录为A)，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至10于室温提取2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入第二等份的核桃粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入第三等份的核桃粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀并将pH值调节至中性，再加入1kg中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，调节温度为45℃搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，沉淀物待用；上清液经孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，超滤膜透过液待用，合并沉淀物和两种膜的截留液并调节pH值为中性，加入100g中性蛋白酶调节温度为45℃搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液经孔径为0.1μm的微滤膜过滤，透过液经5000Dalton超滤膜处理后，合并两次酶解的超滤膜透过液，减压浓缩至固含4.2％，经喷雾干燥后，得到淡黄色核桃低聚肽粉(批号为：H-1-1)，产率为25.7％，肽含量为82.3wt％，小于1500Dalton分子量占94.1％，可见在不影响肽含量和分子量分布的前提下，使用本发明方法比单次酶解方法(产率20.8％)产率提高了4.9％，
实施例2：
单次酶解法获得肽粉：将冷榨脱脂后的核桃粕100kg，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至9.5于室温提取2次，每次2h，合并两次碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，并加热至50℃，将pH值调节至中性，加入1kg木瓜蛋白酶(酶活力为50万u/g)，搅拌酶解5h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，截留液在80℃下浓缩至固含为4.1％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的淡黄色核桃肽粉(批号为：H-2)，产率为15.4％，肽含量为81.5wt％，小于1500Dalton分子量占88.1％。
本发明方法的两次酶解法获得肽粉：将冷榨脱脂后的核桃粕100kg，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至9.5于室温提取2次，每次2h，合并两次碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀并将pH值调节至中性，加入1kg木瓜蛋白酶(酶活力为50万u/g)，调节温度为50℃搅拌酶解5h后，煮沸灭活30min，离心，沉淀物待用；上清液经孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，超滤膜透过液待用，合并沉淀物和两种膜的截留液并调节pH值为中性，加入300g木瓜蛋白酶调节温度为50℃搅拌酶解4h后，煮沸灭活30min，离心，上清液经孔径为0.1μm的微滤膜过滤，透过液经10000Dalton超滤膜处理后，合并两次酶解的超滤膜透过液，减压浓缩至固含4.0％，经喷雾干燥后，得到淡黄色核桃低聚肽粉(批号为：H-2-1)，产率为23.6％，肽含量为82.9wt％，小于1500Dalton分子量占87.8％。可见在不影响肽含量和分子量分布的前提下，使用本发明方法比单次酶解方法(产率15.4％)产率提高了8.2％。
实施例3：
单次酶解法获得肽粉：将冷榨脱脂后的核桃粕100kg，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至9.5于室温提取2次，每次2h，合并两次碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，并加热至55℃，将pH值调节至中性，加入1kg菠萝蛋白酶(酶活力为100万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，截留液在80℃下浓缩至固含为3.7％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的淡黄色核桃肽粉(批号为：H-3)，产率为14.5％，肽含量为74.1wt％，小于1500Dalton分子量占87.2％。
本发明方法的两次酶解法获得肽粉：将冷榨脱脂后的核桃粕100kg，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至9.5于室温提取2次，每次2h，合并两次碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀并将pH值调节至中性，再加入1kg木瓜蛋白酶(酶活力为100万u/g)，调节温度为55℃搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，沉淀物待用；上清液经孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，超滤膜透过液待用，合并沉淀物和两种膜的截留液并调节pH值为中性，加入300g菠萝蛋白酶调节温度为55℃搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液经孔径为0.1μm的微滤膜过滤，透过液经5000Dalton超滤膜处理后，合并两次酶解的超滤膜透过液，减压浓缩至固含3.8％，经喷雾干燥后，得到淡黄色核桃低聚肽粉(批号为：H-3-1)，产率为22.8％，测得肽含量为75.4wt％，小于1500Dalton分子量占88.4％。可见在不影响肽含量和分子量分布的前提下，使用本发明方法比单次酶解方法(产率14.5％)产率提高了8.3％。
生物活性实施例1：
1.DPPH自由基清除实验：
1.1DPPH乙醇溶液的配制：精密称取DPPH 4mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入50mL乙醇，超声30s，用乙醇定容至刻度，摇匀，待用。本品须现配现用。
1.2供试品溶液的配制：精密称取核桃低聚肽粉10mg，置于50mL棕色容量瓶中，加入30mL乙醇，超声5min，用乙醇定容至刻度，摇匀，即得。
1.3操作步骤：准确吸取2mL供试品溶液和2mL DPPH溶液混合均匀；准确吸取2mL供试品溶液和2mL乙醇混合均匀；准确吸取2mLDPPH溶液和2mL乙醇混合均匀，室温放置30min，在515nm波长处测定吸光度，并根据以下计算公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和DPPH混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示DPPH和溶剂混合后溶液的吸光度。
2.ABTS+自由基清除实验：
2.1PBS缓冲液的配制：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.62g，置于1000mL烧杯中，加入800mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
2.2ABTS+贮存溶液的配制：精密称取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸馏水，超声5min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密称取过硫酸钾76mg左右，置于2mL棕色容量瓶中，加入1mL蒸馏水，超声使其溶解，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确吸取352μL过硫酸钾溶液加入至ABTS溶液中，摇匀，静置过夜。
2.3ABTS+工作溶液的配制：精确吸取贮存溶液1mL，加入65mL左右PBS缓冲液，摇匀。
2.4供试品溶液的配制：精密称取核桃低聚肽粉20mg，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL PBS缓冲液，超声5min，用PBS缓冲液定容至刻度，摇匀，即得。
2.5操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL PBS缓冲液混合均匀；准确吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS缓冲液混合均匀，立即在734nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示ABTS和溶剂混合后溶液的吸光度。
3.SRSA超氧阴离子自由基清除实验：
3.1 0.1moL/L PBS缓冲液(pH7.4)的配制：称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，三水合磷酸氢二钾23.1g，置于1000mL烧杯中，加入600mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
3.2 150μmoL/L NBT溶液的配制：准确称取NBT 12.5mg置于100mL棕色容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
3.3 60μmoL/L PMS溶液的配制：准确称取PMS 18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
3.4 468μmoL/L NADH溶液的配制：准确称取NADH 33.9mg，置于100mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
3.5供试品溶液的配制：配制1mg/mL的核桃低聚肽粉，待测。
3.6工作液的配制：取1mL 0.1moL/L PBS缓冲液(pH7.4)于容量瓶中，加入1mL 150μmoL/L NBT溶液，加入2mL 468μmoL/L NADH溶液，加入1mL 60μmoL/L PMS溶液，搅拌均匀，25℃下反应5min，与560nm波长处测定其吸光度值。
3.7操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL上述工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL蒸馏水混合均匀；准确吸取5mL上述工作溶液和0.5mL蒸馏水混合均匀，立即在560nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示SRSA和溶剂混合后溶液的吸光度。
分别配制制备实施例1-3的多肽产品浓度为100μg/mL，以维生素C为阳性对照(浓度为100μg/mL)，测试结果如表1所示：
表1 核桃低聚肽粉抗氧化活性
由表1可知，使用本专利的两次酶解法所制备的低聚肽粉和单次酶解法所制备的低聚肽粉的抗氧化活性基本一致，可见使用本专利的发明方法所制备的核桃低聚肽粉同样可用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健食品。
生物活性实施例2：
PC12氧化应激细胞模型：它是一种很好的研究神经细胞生理、病理及药理的模型，是研究帕金森症和神经疲劳的最常用的体外药物筛选模型。
(1)PC12细胞的培养
使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养PC12细胞，细胞传代时用0.25％的胰酶消化约50s，用含10％血清的DMEM培养基终止消化，加入新鲜的培养基将细胞吹打均匀。以105个/mL的细胞密度传代。每瓶细胞加入4mL含细胞的培养液。在37℃，5％CO2条件下培养。
(2)细胞接种
PC12细胞在培养瓶中生长至融合状态，采用0.25％胰蛋白酶溶液消化，并反复吹打至细胞悬液，以含10％FBS的高糖DMEM培养基稀释成1.0×105个/mL，每孔100μL接种于96孔培养板中每组10个复孔，在37℃，5％CO2条件下培养24h，成融合状态。
(3)药物对正常的PC12细胞生长活力的影响
96孔板于各孔中以一定浓度梯度分别给予核桃低聚肽100μL，培养24h后，MTT法检测细胞活力。50mg MTT溶解于10mL PBS，0.22μm微孔滤膜过滤。临用前稀释到0.5mg/mL。各组细胞弃去培养基，PBS洗两次，每加入0.5mg/mL MTT，37℃，5％CO2条件下孵育3h，除去MTT工作液，每孔加入150μL DMSO溶解结晶，振摇10min，测定每孔的OD值(测定波长570nm，参比波长650nm)。以对照组OD值平均值为100％细胞活力，计算模型组和给药组的细胞活力。测定结果如表1所示。
表2 核桃低聚肽粉对正常PC12细胞活力的影响
(4)药物对过氧化氢损伤的PC12细胞保护作用考察：
A空白组(1％血清的DMEM)；
B模型组(1％血清DMEM培养6h，再加入H2O2使其终浓度为100μM，刺激12h)；
C阳性药(NAC)组：先加入含一定浓度阳性药NAC的1％血清DMEM培养6h，再加100μMH2O2刺激12h。
D给药组：先加入各浓度梯度的核桃低聚肽的1％血清的DMEM培养6h，再加100μMH2O2刺激12h。
上述各组于相同条件下培养，随后进行后续实验。于96孔板中MTT法检测细胞活力。测定结果如表3-5所示。
表3 核桃低聚肽粉H-1-1对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的影响
表4 核桃低聚肽粉H-2-1对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的影响
表5 核桃低聚肽粉H-3-1对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的影响
由表2可知，中性蛋白酶所制备的核桃低聚肽粉(H-1-1)没有降低PC12细胞的增殖活力，并且随着浓度的提高，PC12细胞数量显著增加。由表3可以看出，模型组经H2O2刺激后，细胞活力为45.7％；当加入80μg/mL阳性对照药NAC培养后，细胞活力提高到75.9％，显示有明显的保护作用；而加入核桃低聚肽培养后，细胞活力随着肽粉浓度的增加而提高，呈现浓度依赖性，保护作用明显；在浓度为500μg/mL，细胞活力达到69.2％，与模型组相比，细胞活力提高了50％。由此可见此肽粉对神经元细胞具有较强的保护作用，因而可以用于预防或者治疗帕金森症等相关疾病，也可用作缓解大脑疲劳的药品或者保健食品。
同时表2也显示木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶所制备的核桃低聚肽粉(H-2-1和H-3-1)对PC12细胞的增殖具有较强的抑制作用，随着浓度的提高，PC12细胞数量显著降低。核桃木瓜酶解肽H-2-1在浓度为500μg/mL时，细胞增殖活力降低到59.2％，而核桃菠萝酶解肽H-3-1在浓度为200μg/mL时，细胞增殖活力降低到65.8％。由此可看出不同蛋白酶制备的低聚肽活性基团不同，造成不同的生物活性。据报道，多肽对肿瘤细胞的增殖具有较好的抑制作用，因而具有较好的抗肿瘤活性。PC12细胞本身是一种肿瘤神经元细胞，核桃低聚肽粉(H-2-1和H-3-1)对其的抑制作用，可以推测核桃低聚肽粉有可能具有抗肿瘤活性。
同时表4和表5表明木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶所制备的核桃低聚肽粉(H-2-1和H-3-1)在浓度为500μg/mL时显示了可以降低由于自由基过多造成对细胞的损伤。抗肿瘤活性也影响体现其对细胞的保护作用，造成保护作用不明显。
总之，中性蛋白酶所制备的核桃低聚肽粉对神经元细胞具有较好的保护作用，因而可以用于预防或者治疗帕金森症等相关疾病，也可用作缓解大脑疲劳的药品或者保健食品。而木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶所制备的核桃低聚肽粉对神经元细胞也显示了较弱的保护作用，但显示了较强的抗肿瘤活性，推测其可以用于制备抗肿瘤药物或者预防肿瘤的药品或者保健食品，更深层的药理研究正在进行之中。
Claims (10)
1.一种核桃低聚肽，其特征在于：采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在70wt％以上，其中85％以上核桃低聚肽的分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下：
数均分子量范围：25～5000
重均分子量范围：26～5000；
优选地，肽含量为82.3wt％以上，小于1500Dalton分子量占94.1％以上；
优选地，肽含量为82.9wt％以上，小于1500Dalton分子量占87.8％以上；
优选地，肽含量为75.4wt％以上，小于1500Dalton分子量占88.4％以上。
2.权利要求1所述核桃低聚肽粉的制备方法，其特征在于包括下述步骤：两次酶解。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)碱提酸沉法提取蛋白：将脱脂后的核桃粕，与水按重量比为1∶5～1∶15混合，调节pH至9～11于室温提取2次，每次1～2h，合并两次碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为3～5，静置5～6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10～1∶20的水，搅拌均匀；
(2)蛋白酶解：将步骤(1)中的蛋白液加入核桃粕重量的0.1～2％生物酶，调节温度为40～55℃搅拌酶解3～7h后，煮沸灭活10～30min，离心，沉淀物和上清液待用；
(3)分离纯化：将步骤(2)中的上清液使用孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经2000～20000Dalton超滤膜处理后，超滤膜透过液待用，合并步骤(2)中的沉淀物和两种膜的截留液，加入第一次酶解加酶量的10％～30％生物酶，调节温度为40～55℃搅拌酶解3～7h后，煮沸灭活10～30min，离心，上清液经孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液经2000～20000Dalton超滤膜处理后，合并两次酶解的超滤膜透过液，浓缩干燥后，得到核桃低聚肽粉。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：核桃的脱脂选自冷榨、热榨或者有机溶剂脱脂法，优选地使用冷榨脱脂法；所述的碱提酸沉法可以为连续逆流提取法或者普通提取法。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述生物酶选自食品级的中性蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40万u/g)、菠萝蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、碱性蛋白酶(酶活力≥20万u/g)、胃蛋白酶(酶活力≥50万u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一种或者它们的混合物，优选地使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或者它们的混合物。
6.权利要求3所述核桃低聚肽粉的制备方法，其特征在于所述制备工艺为两次酶解，低聚肽产率比单次酶解法提高了4～9％，所制备的低聚肽的肽含量与其分子量分布和单次酶解法相当。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述浓缩可以为膜浓缩、减压浓缩或常压浓缩；所述干燥可以为喷雾干燥、真空干燥、加热干燥或冷冻干燥。
8.一种组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的核桃低聚肽粉，和药物或食品上可接受的助剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于：其剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
10.权利要求1所述的核桃低聚肽粉用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品的应用；用于制备治疗或预防帕金森症、缓解大脑疲劳的药物、食品或保健品的应用；用于制备抗肿瘤疾病的药物、食品或保健品的应用；用于制备对PC12细胞的增殖具有抑制作用的药物、食品或保健品的应用。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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