CN111019990B - 一种南瓜籽肽粉及其制备方法和用途 - Google Patents
一种南瓜籽肽粉及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种南瓜籽肽粉及其制备方法和用途，所述南瓜籽肽粉的肽含量在90wt％以上，其中90％以上南瓜籽肽的分子量小于1000Dalton。脱脂南瓜籽粕经蛋白提取、酶解、纯化、浓缩和干燥，得到南瓜籽肽。此南瓜籽肽粉具有较好的清除自由基活性，对神经具有较好的保护作用的功效。本发明的方法操作简便，高收率低成本，产品质量稳定，工艺绿色环保，适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种高纯度、低分子量的南瓜籽蛋白肽产品，其肽含量在90wt％以上，分子量小于1000Dalton在90％以上。本发明还涉及到南瓜籽蛋白的制备并酶解，生成南瓜籽小肽的制备方法，该肽粉可用作食品、保健食品或者药品。
背景技术
南瓜籽为葫芦科南瓜属植物南瓜Cucurbita moschata Duch.的种子，药食兼用。中医认为南瓜籽具有下乳、驱虫、利水、健脾、润肺等功效，《滇南草本》中记载：“南瓜性温、味甘无毒，入脾、胃二经，能驱虫解毒、化痰排脓、润肺益气，治便秘、哮喘、咳嗽等症”。现代医学证明南瓜籽具有降血糖、缓解高血压、降胆固醇、抗氧化、抗炎、以及治疗前列腺增生等功效。南瓜籽含有丰富的黄酮、多糖、胡萝卜素、脂肪、蛋白质、游离氨基酸、维生素和矿物质元素。其中脂肪含量高达40wt％，含有油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、瓦克芩酸、芥酸等不饱和脂肪酸，占总脂肪酸的75wt％。此外，研究表明南瓜籽油中含有一种可以成为男性荷尔蒙的活性生物触媒剂成分，能够消除前列腺的初期肿胀，对泌尿系统及前列腺增生具有良好的治疗和预防作用，作为一种保健油，已被确认为首批中国老年保健协会推荐产品，并深受欢迎。随着南瓜籽油产量的不断增大，南瓜籽油加工的副产物-南瓜籽饼粕的综合利用也亟待解决。南瓜籽饼粕大多被用作饲料或者被废弃，不仅资源浪费，而且造成环境污染。南瓜籽粕中含有高达40wt％蛋白质，含有人体必需的8种氨基酸，含量超过FAO(联合国粮农组织)与WHO(世界卫生组织)规定的标准，在必需氨基酸比例与人体所需氨基酸组成模式相似，是一种优质的植物蛋白，其营养价值高，具有很高的开发潜力。目前对南瓜饼粕的开发利用，主要停留在南瓜蛋白的分离提取上，更加深入的研究较少。
植物活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。人体摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是以低肽形式消化吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小，活性肽能自主抑制对脂肪的吸收，并与脂肪发生作用，产生脂肪酶，能促进脂肪的分解。同时活性肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多，表明活性肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。当前对于南瓜籽蛋白肽工业制备工艺的研究较少。专利CN 102197856 A公开了南瓜籽蛋白肽的制备方法，使用超临界二氧化碳萃取技术进行脱脂，碱提酸沉提取蛋白质，加入生物酶酶解后，离心后，直接使用4000Da超滤膜进行过滤，经浓缩冷冻干燥后得到南瓜籽蛋白肽。此专利公开的方法很难适用于大规模生产，原因为：1.超临界二氧化碳萃取技术成本高，工业生产不可行；2.酶解离心后直接使用超滤膜过滤，而不经过粗过滤，容易造成膜阻塞，造成过滤速度慢，大量生产不可行；3.产品干燥方式为冷冻干燥，造价高；4.制备所得的南瓜籽蛋白肽的含量以及分子分布未确定，难以保证产品质量。专利CN 105639047 A将南瓜籽粕粉碎后，加水和生物酶而得，方法虽然简便，但是没有经过除杂和肽的纯化，含有较多的大分子蛋白，严格地说应该是南瓜籽蛋白酶解液，不是南瓜籽蛋白肽。专利CN 105018557 A将南瓜籽粕粉碎后分散于水中，加水酶解后，直接经1000Da超滤膜超滤，浓缩干燥后得到南瓜籽蛋白肽。有如下不足之处：1.南瓜籽粕的蛋白含量要求在50wt％以上，造成工艺的运用有很大的局限性；2.产品经1000Da超滤膜过滤，过滤时间长；3.产品收率低，不超过15wt％；4.产品肽含量和分子量分布的测定方法不明确。因此寻找一种工艺简便、绿色环保、高收率、低成本的工业制备方法成为国内外研究热点。本发明所述的制备工艺，具有操作简便、收率高、成本低、绿色环保等特点，同时产品经国家标准所公布的肽含量和分子量分布的检测方法进行测定，是一种高纯度、水溶性良好、澄清度高、具有多种生理活性的南瓜籽小肽。
发明内容
本发明的目的是提供了一种高纯度、低分子量的南瓜籽肽粉。
本发明的另一目的是提供了一种高纯度、低分子量的南瓜籽肽粉的制备方法。
本发明的另一目的是提供了本发明南瓜籽肽粉用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明南瓜籽肽粉用于制备预防、改善或者治疗神经相关疾病的食品、保健食品或者药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明南瓜籽肽粉用于制备改善或治疗记忆力衰退的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明南瓜籽肽粉用于改善或者治疗睡眠障碍、提高睡眠质量的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明南瓜籽肽粉用于制备预防或治疗缓解大脑或者运动疲劳的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明南瓜籽肽粉用于制备增强免疫力的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明南瓜籽肽粉用于制备提高脂肪代谢的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明南瓜籽肽粉用于制备预防肌肉流失、修复肌肉损伤、增长肌肉组织的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明南瓜籽肽粉用于制备调节肠道有益菌群、提高肠胃动力、促进营养吸收、润肠通便的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了含有本发明南瓜籽肽粉的药物和食品组合物。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种南瓜籽肽粉，其特征在于：肽含量在90wt％以上，其中90％以上南瓜籽肽的分子量小于1000Dalton。
所述南瓜籽肽粉，其制备方法包括下述步骤：将南瓜籽脱脂，依次经过蛋白提取、酶解、纯化、浓缩和干燥后，得到南瓜籽肽。
所述南瓜籽肽粉，其肽含量的检测方法是参照中华人民共和国国家标准GB/T22492-2008附录B和GB/T 22729-2008所述的肽含量的测定方法进行。
所述南瓜籽肽粉，其肽相对分子量分布的测定方法是参照中华人民共和国国家标准GB/T 22492-2008附录A和GB/T 22729-2008附录A所述的高效凝胶过滤色谱法(GPC)进行。
所述南瓜籽肽粉的制备原料为葫芦科南瓜属植物南瓜Cucurbita moschataDuch.的种子。
所述的脱脂方法可以为溶剂法、冷榨、热榨、超临界提取法，优选地使用冷榨脱脂法。
所述的蛋白提取法为普通的碱提酸沉法以及高效逆流提取法，优选地使用高效逆流提取法。
所述的酶解所用的生物酶可以为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、罗汉果蛋白酶中的一种或者它们的混合物。
所述的纯化方法可以为滤膜过滤法和树脂分离法，优选地使用滤膜过滤法。
所述的浓缩方法可以为真空浓缩、常压浓缩、膜浓缩法，优选地使用真空浓缩法。
所述的干燥方法可以为真空干燥、加热干燥、晾干、风干、冷冻干燥和喷雾干燥法。
所述南瓜籽肽粉是通过下述方法制备得到的：
南瓜籽预处理：将南瓜籽去壳，冷榨脱脂，得到脱脂南瓜籽粕；
高效逆流提取法提取蛋白质：将一定量脱脂后的南瓜籽粕，记录为A，与水按重量比为1:5～1:15混合，调节pH至8～12于室温提取0.5～2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为B，调节pH至8～12于室温提取0.5～2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为C，调节pH至8～12于室温提取0.5～2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取0.5～2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为3～5，静置0.5～2h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10～1:30的水，搅拌均匀，得到南瓜籽蛋白液。
蛋白酶解：将上述南瓜籽蛋白液加热至35～60℃，将pH值调节至中性，加入至少南瓜籽粕重量的0.1wt％以上的中性蛋白酶，搅拌酶解至少3h后，调整pH为2～6，煮沸灭活至少2min，得到蛋白酶解液。
分离纯化：将蛋白酶解液使用微滤膜处理后，在40～80℃下浓缩至固含为3～5wt％时，干燥后，得到南瓜籽肽粉，产率40wt％以上。
一种组合物，其含有本发明所述的南瓜籽肽粉和，食品、药物或化妆品食品上可接受的助剂。
根据现有技术，本发明可将所述的组合物制备成任意所述剂型，如素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液，以及液体、乳液、膏霜、粉、块状等化妆品剂型。
本发明所述的南瓜籽肽粉用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品或药品；用于制备预防、改善或者治疗神经相关疾病的食品、保健食品或者药品；用于制备改善或治疗记忆力衰退的食品、保健食品或药品；用于改善或者治疗睡眠障碍、提高睡眠质量的食品、保健食品或药品；用于制备预防或治疗缓解大脑或者运动疲劳的食品、保健食品或药品；用于制备增强免疫力的食品、保健食品或药品；用于制备提高脂肪代谢的食品、保健食品或药品；用于制备预防肌肉流失、修复肌肉损伤、增长肌肉组织的食品、保健食品或药品；用于制备调节肠道有益菌群、提高肠胃动力、促进营养吸收、润肠通便的食品、保健食品或药品。与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明将南瓜籽冷榨脱脂制备南瓜籽粕，发明人做了相关实验，与热榨方法相比，冷榨后蛋白质提取率高出5wt％左右，同时含量高出20wt％左右，与溶剂脱脂法相比，无溶剂残留，对人体无害，工艺安全系数高。
(2)本发明使用高效逆流法提取南瓜籽蛋白，相比普通的碱提酸沉法，蛋白质的提取率提高了10wt％以上，同时减少了用水量，节约生产成本。
(3)本发明仅使用蛋白复溶液进行酶解，没有将蛋白进行干燥，这样不仅减少了蛋白质干燥时的损失，也简化了制备工艺。
(4)本发明使用的蛋白酶均为食用酶，并且来源广泛、成本低、添加量少。
(5)本发明仅用微滤膜进行处理，没有再使用超滤膜或者纳滤膜再次纯化，所得的南瓜籽肽粉，其分子量低，含量高，水溶性好，其水溶液澄清无杂质，此外，微滤膜比超滤膜孔径大很多，生产耗时短，更加适合大规模生产。
(6)本发明参照中华人民共和国国家标准GB/T 22492-2008附录B和GB/T 22729-2008所述的肽含量和相对分子量分布的测定方法进行检测，此方法公认度高。
附图说明
图1：南瓜籽肽处理后斑马鱼肠道中的短乳杆菌生长的影响；
图2：南瓜籽肽对斑马鱼脑部巨噬细胞数量的影响；
图3：南瓜籽肽对斑马鱼脑部吞噬墨汁巨噬细胞数量的影响；
图4：南瓜籽肽处理后斑马鱼肌纤维H&E染色结果。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。如无特别说明，实施例中用到的所有原料和溶剂均为市售产品。
制备实施例1
将南瓜籽冷榨脱油，得到脱脂南瓜籽粕，称取100kg南瓜籽粕，记录为A，加水1000L，调节pH至8.0～8.5于室温提取1h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为B，调节pH至8.0～8.5于室温提取1h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为C，调节pH至8.0～8.5于室温提取1h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为3.0～3.5，静置0.5h，弃去上清液，最后往沉淀物中3000L的水，搅拌均匀，得到南瓜籽蛋白液；将南瓜籽蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入100g中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解3h后，煮沸灭活2min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行处理后，在70℃下浓缩至固含为3wt％时，喷雾干燥后，得到43kg南瓜籽肽粉(N-1)，产率43wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为92.4％，小于1000Dalton分子量占95.0％。
制备实施例2
将南瓜籽冷榨脱油，得到脱脂南瓜籽粕，称取100kg南瓜籽粕，记录为A，加水500L，调节pH至11.0～11.5于室温提取1h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为B，调节pH至11.0～11.5于室温提取1h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为C，调节pH至11.0～11.5于室温提取1h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为4.0～4.5，静置1h，弃去上清液，最后往沉淀物中2000L的水，搅拌均匀，得到南瓜籽蛋白液；将南瓜籽蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入100g木瓜蛋白酶(酶活力为40万u/g)，搅拌酶解3h后，煮沸灭活5min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行处理后，在50℃下浓缩至固含为5wt％时，喷雾干燥后，得到45.4kg南瓜籽肽粉(N-2)，产率45.4wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为90.1％，小于1000Dalton分子量占96.6％。
制备实施例3
将南瓜籽冷榨脱油，得到脱脂南瓜籽粕，称取100kg南瓜籽粕，记录为A，加水500L，调节pH至9.0～9.5于室温提取0.5h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为B，调节pH至9.0～9.5于室温提取0.5h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为C，调节pH至9.0～9.5于室温提取0.5h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取0.5h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为4.5～5.0，静置2h，弃去上清液，最后往沉淀物中1000L的水，搅拌均匀，得到南瓜籽蛋白液；将南瓜籽蛋白液加热至55℃，将pH值调节至中性，加入100g菠萝蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解3h后，煮沸灭活5min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行处理后，在50℃下浓缩至固含为5wt％时，真空干燥后得到41.5kg南瓜籽肽粉(N-3)，产率41.5wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为91.1％，小于1000Dalton分子量占95.4％。
制备实施例4
将南瓜籽冷榨脱油，得到脱脂南瓜籽粕，称取100kg南瓜籽粕，记录为A，加水1000L，调节pH至8.5～9.0于室温提取0.5h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为B，调节pH至8.5～9.0于室温提取0.5h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为C，调节pH至8.5～9.0于室温提取0.5h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取0.5h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为4.0～4.5，静置1h，弃去上清液，最后往沉淀物中3000L的水，搅拌均匀，得到南瓜籽蛋白液；将南瓜籽蛋白液加热至50℃，将pH值调节至8.0～9.0，加入100g碱性蛋白酶(酶活力为20万u/g)，搅拌酶解5h后，煮沸灭活3min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为10μm的微滤膜进行处理后，在50℃下浓缩至固含为3wt％时，冷冻干燥后得到43kg南瓜籽肽粉(N-4)，产率43wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为92.3％，小于1000Dalton分子量占96.2％。
制备实施例5
将南瓜籽冷榨脱油，得到脱脂南瓜籽粕，称取100kg南瓜籽粕，记录为A，加水1000L，调节pH至8.5～9.0于室温提取0.5h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为B，调节pH至8.5～9.0于室温提取0.5h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为C，调节pH至8.5～9.0于室温提取0.5h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取0.5h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为4.0～4.5，静置1h，弃去上清液，最后往沉淀物中2000L的水，搅拌均匀，得到南瓜籽蛋白液；将南瓜籽蛋白液加热至45℃，将pH值调节至8.0～9.0，加入100g胰蛋白酶(酶活力为20万u/g)，搅拌酶解4h后，煮沸灭活2min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为5μm的微滤膜进行处理后，在60℃下浓缩至固含为5wt％时，冷冻干燥后得到43.4kg南瓜籽肽粉(N-5)，产率43.4wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为90.6％，小于1000Dalton分子量占98.4％。
生物活性实施例1(抗氧化作用评价)
1.ABTS+自由基清除实验
PBS缓冲液的配制：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.62g，置于1000mL烧杯中，加入800mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
ABTS+贮存溶液的配制：精密称取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸馏水，超声5min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密称取过硫酸钾76mg左右，置于2mL棕色容量瓶中，加入1mL蒸馏水，超声使其溶解，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确吸取352μL过硫酸钾溶液加入至ABTS溶液中，摇匀，静置过夜。
ABTS+工作溶液的配制：精确吸取贮存溶液1mL，加入65mL左右PBS缓冲液，摇匀。
供试品溶液的配制：取南瓜籽肽粉(N-1)适量，精密称定，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL PBS缓冲液，超声5min，用PBS缓冲液定容至刻度，摇匀，即得。
操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL PBS缓冲液混合均匀；准确吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS缓冲液混合均匀，立即在734nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示ABTS和溶剂混合后溶液的吸光度。
2.SRSA超氧阴离子自由基清除实验
0.1moL/L PBS缓冲液(pH 7.4)的配制：称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，三水合磷酸氢二钾23.1g，置于1000mL烧杯中，加入600mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
150μmoL/L NBT溶液的配制：准确称取NBT 12.5mg置于100mL棕色容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
60μmoL/L PMS溶液的配制：准确称取PMS 18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
468μmoL/L NADH溶液的配制：准确称取NADH 33.9mg，置于100mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的配制：取南瓜籽肽粉(N-1)适量，精密称定，加水超声溶解，混匀，待测。
工作液的配制：取1mL 0.1moL/L PBS缓冲液(pH 7.4)于容量瓶中，加入1mL 150μmoL/L NBT溶液，加入2mL 468μmoL/L NADH溶液，加入1mL 60μmoL/L PMS溶液，搅拌均匀，25℃下反应5min，与560nm波长处测定其吸光度值。
操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL上述工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL蒸馏水混合均匀；准确吸取5mL上述工作溶液和0.5mL蒸馏水混合均匀，立即在560nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示SRSA和溶剂混合后溶液的吸光度。
配制南瓜籽肽粉(N-1)浓度为500μg/mL和1000μg/mL，以维生素C为阳性对照(浓度为100μg/mL)，测试结果如表1所示：
表1南瓜籽肽粉清除自由基测试结果
由表1可知，本发明方法所制备的南瓜籽肽对ABTS和SRSA自由基显示了较好的清除作用，具有较好的抗氧化活性。
生物活性实施例2(神经细胞的保护作用评价)
使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养PC12细胞，细胞传代时用0.125％的胰酶消化约50s，用含10％血清的DMEM培养基终止消化，加入新鲜的培养基将细胞吹打均匀。以105个/mL的细胞密度传代。每瓶细胞加入4mL含细胞的培养液。在37℃，5％CO2条件下培养。PC12细胞在培养瓶中生长至融合状态，采用0.125％胰蛋白酶溶液消化，并反复吹打至细胞悬液，以含10％FBS的高糖DMEM培养基稀释成1.0×105个/mL，每孔100μL接种于96孔培养板中，每组5-6个复孔，在37℃，5％CO2条件下培养24h，成融合状态。
96孔板于各孔中以一定浓度梯度分别给予药物100μL，培养24h后，MTT法检测细胞活力。50mg MTT溶解于10mL PBS，0.22μm微孔滤膜过滤。临用前稀释到0.5mg/mL。各组细胞弃去培养基，PBS洗两次，每加入0.5mg/mL MTT，37℃，5％CO2条件下孵育3h，除去MTT工作液，每孔加入150μL DMSO溶解结晶，振摇10min，测定每孔的OD值(测定波长570nm，参比波长650nm)。以对照组OD值平均值为100％细胞活力，计算模型组和给药组的细胞活力。
实验分组：1)空白组(高糖DMEM)；2)模型组(高糖DMEM培养3h，再加入H2O2使其终浓度为100μM，刺激1h)；3)阳性药(NAC)组：先加入含一定浓度(500μM)阳性药NAC的高糖DMEM培养3h，再加100μM H2O2刺激1h；4)给药组：先加入含各浓度梯度药物的高糖DMEM培养3h，再加100μM H2O2刺激1h。上述各组于相同条件下培养，随后进行实验，并用MTT法检测细胞活力，测定结果如表2和表3所示。
表2南瓜籽肽对正常PC12细胞活力的影响
注：n＝6，*p<0.05，与对照组比较
表3南瓜籽肽对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的影响
注：n＝6，###p<0.001与对照组比较；*p<0.05，***p<0.001，与模型组比较
由表2可知，南瓜籽肽在浓度为1～500μg/mL时对PC12细胞没有明显毒性，而在浓度为300～500μg/mL时，对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤具有显著的保护作用，有以上结果可知，南瓜籽肽对神经细胞具有显著的保护作用。
生物活性实施例3(肠道菌群调节作用评价)
使用CM-DiI标记短乳杆菌，以6×106个/mL浓度短乳杆菌饲喂5dpf无菌野生型AB品系斑马鱼，建立斑马鱼肠道共生性细菌模型；将饲喂短乳杆菌的无菌斑马鱼放置35℃培养至6dpf。6dpf时，移除短乳杆菌并随机分配至6孔板中，每孔30尾，每孔养鱼水容量为3mL。用水溶南瓜籽肽粉(N-1)浓度为2000μg/mL，同时设置模型对照组和正常对照组。将各实验组斑马鱼继续置于35℃培养6h后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下采集图片，计算斑马鱼肠道内短乳杆菌荧光强度(S，该荧光强度表示肠道短乳杆菌数量)，以荧光强度的统计分析结果评价南瓜籽肽粉对肠道菌群的调节作用。公式如下：公式如下：肠道菌群调节作用(％)＝(S供试品-S模型组)/S模型组×100％，统计学分析采用单因素方差分析和T检验，p<0.05表明具有显著性差异，结果如表4所示。
表4南瓜籽肽粉对肠道内短乳杆菌调节作用(n＝10)
与模型对照组比较，**p<0.01；
由表4可知，模型对照组斑马鱼肠道荧光强度为4189048像素，与正常对照组(1517330像素)比较p<0.001，表明肠道内有短乳杆菌生存，模型建立成功。南瓜籽肽粉浓度为2000μg/mL时，斑马鱼肠道荧光强度为5390602像素，与模型对照组418904像素比较p<0.01，肠道菌群调节作用为29％。表明南瓜籽肽粉可以明显促进肠道内短乳杆菌的生长，对肠道菌群具有显著的调节作用。
生物活性实施例4(改善睡眠作用评价)
随机选取受精后5天(5dpf)正常野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(即每实验组)30尾，用水溶给予南瓜籽肽(N-1)42μg/mL，阳性对照药奥沙西泮100μM浓度，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔(实验组)容量为3mL。供试品处理24h后，将斑马鱼转移至96孔板中，每孔(即每浓度组)1尾，除正常对照组外，其余实验组用PTZ(戊四唑)诱导斑马鱼建立失眠模型，每个实验组随机选择10尾斑马鱼，应用行为分析仪测定斑马鱼的失眠时间(T)和运动距离(D)，以运动距离和失眠时间评价供试品对PTZ诱导的斑马鱼失眠症的镇静催眠作用。供试品对失眠症斑马鱼的镇静作用和睡眠改善作用的计算公式如下：镇静作用(％)＝(D模型组-D供试品组)/(D模型组-D正常组)×100％；改善作用(％)＝(T模型组-T供试品组)/(T模型组-T正常组)×100％，用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，实验结果如表5和6所示。
表5南瓜籽肽对斑马鱼镇静作用定量数据(n＝10)
与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001
由表5可知，模型对照组斑马鱼运动距离(1552mm)与正常对照组(133mm)比较p<0.001，表明模型建立成功；阳性对照药奥沙西泮100μM浓度组斑马鱼运动距离为432mm，与模型对照组比较p<0.001，镇静作用为79％，说明奥沙西泮对PTZ诱导的斑马鱼失眠具有明显的镇静作用。
南瓜籽肽在浓度为42μg/mL时，斑马鱼运动距离为988mm，镇静作用为40％，与模型对照组比较p<0.01，提示南瓜籽肽对PTZ诱导的斑马鱼失眠症具有明显的镇静作用。
表6南瓜籽肽对斑马鱼睡眠改善作用定量数据(n＝10)
与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001
由表6可以看出，模型对照组斑马鱼失眠时间(44.4s)与正常对照组(5.8s)比较p<0.001，表明模型建立成功；阳性对照药奥沙西泮100μM浓度组斑马鱼失眠时间为19.6s，与模型对照组比较p<0.001，睡眠改善作用为64％，说明奥沙西泮对PTZ诱导的斑马鱼失眠具有明显的改善作用。
南瓜籽肽在浓度为42μg/mL时，斑马鱼失眠时间为26.1s，睡眠改善作用为47％，与模型对照组比较p<0.01，提示南瓜籽肽在42μg/mL浓度下对PTZ诱导的斑马鱼失眠症具有明显的睡眠改善作用。
生物活性实施例5(增强肌纤维作用评价)
随机选取150尾受精后2天(2dpf)野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼，用无水乙醇诱导斑马鱼建立酒精性肌损伤模型。分别水溶给予南瓜籽肽(N-1)浓度为125μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔药液容量为3mL。除正常对照组外，其余实验组分别与无水乙醇共同处理30h。供试品处理结束后，对斑马鱼进行H&E染色(固定-脱水-包埋-切片-染色)，并进行病理学分析，如图4所示。
如图4所示，正常对照组斑马鱼骨骼肌细胞呈均一长条状，且横纹清晰；模型对照组肌纤维松弛伴炎细胞浸润，但无坏死。南瓜籽肽组肌纤维呈均一长条状，横纹清晰，且无肌炎或坏死，与正常对照组相似，提示在本实验浓度条件下，南瓜籽肽具有肌纤维保护作用。
生物活性实施例6(增强免疫作用评价)
1.对巨噬细胞减少症的改善作用评价
随机选取150尾受精后2天(2dpf)黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼，静脉窦注射酒石酸长春瑞滨建立斑马鱼巨噬细胞减少症模型。用水溶给予南瓜籽肽浓度为31.25μg/mL浓度，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，每孔容量为3mL。各实验组均置于28℃培养箱孵育过夜，加入2.5μg/mL中性红工作液对斑马鱼进行活体染色，染色结束后每组随机选取10尾斑马鱼在显微镜下观察并统计斑马鱼头部巨噬细胞数量(N)，以巨噬细胞数量的统计学分析结果评价供试品对巨噬细胞减少症的改善作用。统计学处理结果用mean±SE表示。巨噬细胞减少症的改善作用计算公式为：巨噬细胞减少症改善作用(％)＝(N供试品组-N模型对照组)/N模型对照组×100％，用T-test检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，结果如表7所示。
表7各实验组对斑马鱼巨噬细胞减少症的改善作用实验结果(n＝10)
与模型对照组比较，***p<0.001
由表7可知，模型对照组斑马鱼头部巨噬细胞数量(25个)与正常对照组(47个)比较p<0.001，提示斑马鱼巨噬细胞减少症模型构建成功。南瓜籽肽组斑马鱼头部巨噬细胞数量为43个，与模型对照组比较均p<0.001，改善作用为72％。提示在本实验浓度条件下，南瓜籽肽对斑马鱼巨噬细胞减少症具有明显的改善作用。
2.对巨噬细胞吞噬功能的促进作用评价
随机选取120尾受精后3天(3dpf)黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼，静脉注射墨汁建立斑马鱼巨噬细胞吞噬功能模型。用水溶给予南瓜籽肽浓度为31.25μg/mL，同时设置模型对照组，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，每孔容量为3mL。各组均置于28℃培养箱孵育过夜，加入2.5μg/mL中性红工作液对斑马鱼进行活体染色，染色后每组随机选取10尾斑马鱼在显微镜下观察并统计斑马鱼头部吞噬墨汁的巨噬细胞数量(N)，以吞噬墨汁的巨噬细胞数量的统计学分析结果评价供试品对巨噬细胞吞噬功能的促进作用。统计学处理结果用mean±SE表示。巨噬细胞吞噬功能的促进作用计算公式为：吞噬功能促进作用(％)＝(N供试品组-N模型对照组)/N模型对照组×100％，用T-test检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，结果如表8所示。
表8南瓜籽肽对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的促进作用实验结果(n＝10)
与模型对照组比较，***p<0.001
由表8可知，南瓜籽肽组斑马鱼头部吞噬了墨汁信号的巨噬细胞数量均为22个，与模型对照组比较均p<0.001，吞噬功能促进作用为38％，提示在本实验浓度条件下，南瓜籽肽对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能均具有明显的促进作用。
生物活性实施例7(抗疲劳作用评价)
随机选取540尾受精后4天(4dpf)野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)30尾，用水溶给予南瓜籽肽(N-1)浓度为125μg/mL，阳性对照药中华跌打丸1000μg/mL浓度，同时设置正常对照组(即养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔(实验组)容量为3mL，每个实验组设置3个平行浓度。预处理24h后，除正常对照组外，其余实验组均同时水溶给予亚硫酸钠以诱发斑马鱼疲劳模型。供试品和亚硫酸钠共同处理斑马鱼一段时间后，每个实验组将3个平行实验组中的斑马鱼汇集在一起(共90尾)，按照乳酸测定试剂盒说明书，利用NanoDrop2000超微量分光光度计间接测定斑马鱼体内乳酸含量，定量评价南瓜籽肽对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼体内的乳酸含量的影响，并计算乳酸含量减少率。南瓜籽肽对斑马鱼体内乳酸影响计算公式为：乳酸含量减少率(％)＝(C模型组-C供试品)/(C模型组-C正常对照组)×100％，用T-test检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，结果如表9所示。
表9南瓜籽肽对斑马鱼体内乳酸含量的评价结果
与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
由表9可知，模型对照组斑马鱼体内乳酸含量(0.750mmol/gprot)与正常对照组(0.259mmol/gprot)比较p<0.001，提示模型建立成功；阳性对照药中华跌打丸斑马鱼体内乳酸含量为0.369mmol/gprot，与模型对照组比较p<0.001，其乳酸含量减少率为77.6％，提示中华跌打丸能显著减少亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼体内的乳酸含量。
南瓜籽肽组斑马鱼体内乳酸含量为0.488mmol/gprot，其乳酸含量减少率为53.4％，与模型对照组比较p<0.001，提示南瓜籽肽能显著减少亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼的乳酸。
Claims (1)
1.南瓜籽肽粉用于制备预防或治疗缓解大脑或者运动疲劳的药品的应用；用于制备预防肌肉流失、修复肌肉损伤、增长肌肉组织的药品的应用；用于制备调节肠道有益菌群的药品的应用；所述南瓜籽肽粉，肽含量在90.1％～92.4％，小于1000Dalton分子量占95.0％～98.4％；肽含量的检测方法是参照GB/T 22492-2008附录B和GB/T 22729-2008所述的肽含量的测定方法进行；肽相对分子量分布的测定方法是参照GB/T 22492-2008附录A和GB/T22729-2008附录A所述的高效凝胶过滤色谱法进行；
所述南瓜籽肽粉的制备方法，包括下述步骤：
南瓜籽脱脂：将南瓜籽去壳，冷榨脱脂，得到脱脂南瓜籽粕；
蛋白质提取：将一定量脱脂后的南瓜籽粕，记录为A，与水按重量比为1:5～1:15混合，调节pH至8～12于室温提取0.5～2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为B，调节pH至8～12于室温提取0.5～2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的南瓜籽粕，记录为C，调节pH至8～12于室温提取0.5～2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取0.5～2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为3～5，静置0.5～2h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10～1:30的水，搅拌均匀，得到南瓜籽蛋白液；
酶解：将上述南瓜籽蛋白液加热至35～60℃，将pH值调节至中性，加入至少南瓜籽粕重量的0.1wt％以上的中性蛋白酶，搅拌酶解至少3h后，调整pH为2～6，煮沸灭活至少2min，得到蛋白酶解液；
分离纯化：将蛋白酶解液使用孔径为0.1～0.5μm的微滤膜处理后；
浓缩和干燥：在40～80℃下浓缩至固含为3～5wt％时，喷雾干燥，
进口温度为140～160℃，出口温度为55～65℃，得到南瓜籽肽粉，产率20wt％以上。
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