CN112618406A - 一种具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及苦瓜籽肽技术领域，具体公开了一种具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉及制备方法和应用，涉及高纯度、低分子量的苦瓜籽肽粉及其制备方法和用途，所述苦瓜籽肽粉的肽含量在90wt%以上，其中80%以上苦瓜籽肽的分子量小于500 Dalton。脱脂苦瓜籽粕经蛋白提取、酶解、纯化、浓缩和干燥，得到苦瓜籽肽。本发明的方法操作简便，高收率低成本，产品质量稳定，工艺绿色环保，适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及苦瓜籽肽技术领域，具体涉及一种具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉及其制备方法和应用。
背景技术
苦瓜是一种有益的药用植物和蔬菜，果实味苦，通常用于烹饪。我国古代就已将苦瓜列入中药范畴，苦瓜气味苦、无毒、性寒，具有清热祛暑、明目解毒、利尿凉血、解劳清心、益气壮阳之功效。苦瓜拥有良好的营养及药用价值，在糖尿病、炎症反应和癌症的临床治疗上有显著功效，在中国、日本等国家已长期被用作药食同源的功能性食品。苦瓜籽在营养及药用价值方面与苦瓜有极大的相似之处。苦瓜籽含灰分21.8％，纤维19.5％，碳水化合物16.4％，油脂31.0％，蛋白质36.5％。此外，苦瓜籽中还含有2.71％的黄酮以及多种人体必需的微量元素，其中K、Mg和P的含量最高，Cr和Zn的含量分别高达5.165μg/g和45.45μg/g。具报道，苦瓜肽具有抗肿瘤、降血糖、抑菌等功效，目前获得苦瓜肽的方式主要是从苦瓜果实或者苦瓜籽进行提取获得的，收率低，成本高，不易大规模生产。因此寻找一种工艺简便、绿色环保、高收率、低成本的工业制备方法成为国内外研究热点。
发明内容
为获得具有营养和药用价值的苦瓜肽，本发明的目的在于提供一种具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉。
为提供具有高收率、低成本的苦瓜肽的制备方法，本发明的另一目的在于提供具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉的制备方法。
进一步的，本发明的目的还在于提供上述具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉的应用。
本发明提供如下的技术方案：
一种具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉，所述苦瓜籽肽粉中，肽的质量含量≥90％；总肽中，分子量<500Da的肽的质量比为80％以上，肽的分子量的质量占比分布如下：
肽的分子量的数均分子量范围：15～464，重均分子量范围：40～485。
上述苦瓜籽肽粉，其肽含量的检测方法是参照中华人民共和国国家标准GB/T22492-2008附录B和GB/T 22729-2008所述的肽含量的测定方法进行。苦瓜籽肽粉，肽相对分子量分布的测定方法是参照中华人民共和国国家标准GB/T 22492-2008附录A和GB/T22729-2008附录A所述的高效凝胶过滤色谱法(GPC)进行，此方法公认度高。
作为本发明的优选，苦瓜籽肽粉依次经由苦瓜籽脱脂、提取蛋白质、酶解蛋白质、分离纯化、浓缩和干燥后得到。
上述制备方法中，所述的脱脂方法可以为溶剂法、冷榨、热榨、超临界提取法，优选地使用冷榨脱脂法。发明人的研究发现，冷榨脱脂后的蛋白质提取率较其他脱脂方法高出5wt％左右，同时蛋白质含量高出20wt％左右，而且与溶剂脱脂法相比，无溶剂残留，对人体无害，工艺安全系数高。
所述的纯化方法可以为滤膜过滤法和树脂分离法，优选地使用滤膜过滤法。
本发明仅用孔径为0.1～0.5μm微滤膜进行处理，没有再使用超滤膜再次纯化，所得的苦瓜籽肽粉，其分子量低，含量高，水溶性好，其水溶液澄清无杂质，此外，微滤膜比超滤膜孔径大很多，生产耗时短，更加适合大规模生产。
所述的浓缩方法可以为真空浓缩、常压浓缩、膜浓缩法，优选地使用真空浓缩法。
所述的干燥方法可以为真空干燥、加热干燥、晾干、风干、冷冻干燥和喷雾干燥法，优选地使用喷雾干燥法。
作为本发明的优选，所述提取蛋白质过程如下：
将一定量脱脂后的苦瓜籽粕记录为A，与水按重量比为1:5～1:15混合，调节pH值至8～12于室温提取0.5～2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为B，调节pH值至8～12于室温提取0.5～2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成滤渣二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为C，调节pH值至8～12于室温提取0.5～2h；B完成滤渣二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取0.5～2h，而C第一次提取的滤液待用；C完成滤渣第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH值为3～5，静置0.5～2h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10～1:30的水，搅拌均匀，得到苦瓜籽蛋白液。
本发明的蛋白质提取过程还可以选用普通的碱提酸沉法，但是发明人研究发现，采用本申请的蛋白质提取过程与碱提酸沉法相比，蛋白质的提取率提高了10wt％以上，同时减少了用水量，节约生产成本。更重要的是，采用上述蛋白质提取过程获得的苦瓜籽肽粉的自由基清除作用明显的优于普通的碱提酸沉法。
作为本发明的优选，蛋白质酶解过程如下：将得到的苦瓜籽蛋白液加热至35～60℃，调节pH值至2～10，加入至少苦瓜籽蛋白液质量的0.1wt％以上的生物酶，搅拌酶解至少3h后，煮沸灭活至少2min，得到蛋白酶解液。
本发明仅使用蛋白复溶液进行酶解，没有将蛋白进行干燥，这样不仅减少了蛋白质干燥时的损失，也简化了制备工艺。
作为本发明的优选，酶解所用的生物酶为酶活力≥30万u/g的中性蛋白酶、酶活力≥40万u/g的木瓜蛋白酶、酶活力≥30万u/g的菠萝蛋白酶、酶活力≥20万u/g的碱性蛋白酶、酶活力≥20万u/g的酸性蛋白酶、酶活力≥50万u/g的胃蛋白酶、酶活力≥3000u/g的胰酶、酶活力≥5万u/g的无花果蛋白酶、酶活力≥5万u/g的罗汉果蛋白酶中的一种或者它们的混合物。本发明使用的蛋白酶均为食用酶，并且来源广泛、成本低、添加量少。
作为本发明的优选，所述浓缩和干燥过程为40～80℃下将蛋白酶解液分离纯化后浓缩至固含量为3～5wt％。本发明优选喷雾干燥法，没有使用冷冻干燥或者真空干燥法制备产品，使用喷雾干燥法不仅节约了干燥时间，而且产品质粒均匀。
一种包含上述苦瓜籽肽粉的组合物，所述组合物为药物或食品上可接受的助剂。
作为本发明的优选，所述助剂的剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
一种上述苦瓜籽肽粉应用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品或药品。
一种上述组合物应用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品或药品。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明将苦瓜籽冷榨脱脂制备苦瓜籽粕，发明人做了相关实验，与热榨方法相比，冷榨后蛋白质提取率高出5wt％左右，同时含量高出20wt％左右，与溶剂脱脂法相比，无溶剂残留，对人体无害，工艺安全系数高；
(2)发明的蛋白质提取过程提取苦瓜籽蛋白，相比普通的碱提酸沉法，蛋白质的提取率提高了10wt％以上，同时减少了用水量，节约生产成本；而且所得苦瓜籽肽粉的自由基清除作用也明显提升；
(3)本发明仅使用蛋白复溶液进行酶解，没有将蛋白进行干燥，这样不仅减少了蛋白质干燥时的损失，也简化了制备工艺；
(4)本发明使用的蛋白酶均为食用酶，并且来源广泛、成本低、添加量少；
(5)本发明仅用孔径为0.1～0.5μm微滤膜进行处理，没有再使用超滤膜再次纯化，所得的苦瓜籽肽粉，其分子量低，含量高，水溶性好，其水溶液澄清无杂质，此外，微滤膜比超滤膜孔径大很多，生产耗时短，更加适合大规模生产；
(6)本发明没有使用冷冻干燥或者真空干燥法制备产品，使用喷雾干燥法不仅节约了干燥时间，而且产品质粒均匀；
(7)本发明参照中华人民共和国国家标准GB/T 22492-2008附录B和GB/T 22729-2008所述的肽含量和相对分子量分布的测定方法进行检测，此方法公认度高。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
实施例1
将苦瓜籽冷榨脱脂，得到脱脂苦瓜籽粕；将100kg苦瓜籽粕，记录为A，与1000L的水混合，调节pH值至8.0～8.5于室温提取0.5h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为B，调节pH值至8.0～8.5于室温提取0.5h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为C，调节pH值至8.0～8.5于室温提取0.5h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取0.5h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为4.0～4.5，静置0.5h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为3000L的水，搅拌均匀，得到苦瓜籽蛋白液；将苦瓜籽蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入100g食品级中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解3h后，煮沸灭活2min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜处理后，在80℃下浓缩至固含为4wt％时，喷雾干燥，进口温度为150℃，出口温度为55℃，得到22.5kg苦瓜籽肽粉，产率22.5wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为92.4％，小于500Dalton分子量占81.1％。
实施例2
将苦瓜籽冷榨脱脂，得到脱脂苦瓜籽粕；将100kg苦瓜籽粕，记录为A，与1500L的水混合，调节pH值至9.5～10.0于室温提取1h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为B，调节pH至9.5～10.0于室温提取1h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为C，调节pH值至9.5～10.0于室温提取1h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH值为3.0～3.5，静置1h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积为3000L的水，搅拌均匀，得到苦瓜籽蛋白液；将苦瓜籽蛋白液加热至50℃，将pH值调节至中性，加入100g食品级木瓜蛋白酶(酶活力为40万u/g)，搅拌酶解3h后，煮沸灭活2min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为10μm的微滤膜处理后，在50℃下浓缩至固含为3wt％时，冷冻干燥得到23.6kg苦瓜籽肽粉，产率23.6wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为91.0％，小于500Dalton分子量占80.8％。
实施例3
将苦瓜籽冷榨脱脂，得到脱脂苦瓜籽粕；将100kg苦瓜籽粕，记录为A，与500L的水混合，调节pH值至8.0～8.5于室温提取1h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为B，调节pH值至8.0～8.5于室温提取1h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为C，调节pH值至8.0～8.5于室温提取1h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH值为3.5～4.0，静置1h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积为2000L的水，搅拌均匀，得到苦瓜籽蛋白液；将苦瓜籽蛋白液加热至55℃，将pH值调节至中性，加入100g食品级菠萝蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解4h后，煮沸灭活5min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为5μm的微滤膜处理后，在60℃下浓缩至固含为5wt％时，冷冻干燥得到21.4kg苦瓜籽肽粉，产率21.4wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为93.2％，小于500Dalton分子量占84.7％。
生物活性测试
1.ABTS+自由基清除实验
1.1 PBS缓冲液的配制：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.62g，置于1000mL烧杯中，加入800mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用；
1.2 ABTS+贮存溶液的配制：精密称取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸馏水，超声5min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密称取过硫酸钾76mg左右，置于2mL棕色容量瓶中，加入1mL蒸馏水，超声使其溶解，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确吸取352μL过硫酸钾溶液加入至ABTS溶液中，摇匀，静置过夜；
1.3 ABTS+工作溶液的配制：精确吸取贮存溶液1mL，加入65mL左右PBS缓冲液，摇匀；1.4供试品溶液的配制：配制合适浓度的苦瓜多肽溶液；
1.5操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL PBS缓冲液混合均匀；准确吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS缓冲液混合均匀，立即在734nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示ABTS和溶剂混合后溶液的吸光度。
2.SRSA超氧阴离子自由基清除实验
2.1 0.1moL/L PBS缓冲液(pH 7.4)的配制：称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，三水合磷酸氢二钾23.1g，置于1000mL烧杯中，加入600mL蒸馏水，搅拌使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用；
2.2 150μmoL/L NBT溶液的配制：准确称取NBT 12.5mg置于100mL棕色容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得；
2.3 60μmoL/L PMS溶液的配制：准确称取PMS 18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得；
2.4 468μmoL/L NADH溶液的配制：准确称取NADH 33.9mg，置于100mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得；
2.5供试品溶液的配制：配制合适浓度的苦瓜多肽溶液；
2.6工作液的配制：取1mL 0.1moL/L PBS缓冲液(pH7.4)于容量瓶中，加入1mL 150μmoL/L NBT溶液，加入2mL 468μmoL/L NADH溶液，加入1mL 60μmoL/L PMS溶液，搅拌均匀，25℃下反应5min，与560nm波长处测定其吸光度值；
2.7操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL上述工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL蒸馏水混合均匀；准确吸取5mL 上述工作溶液和0.5mL蒸馏水混合均匀，立即在560nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示SRSA和溶剂混合后溶液的吸光度。
分别配制制备实施例1-3产品浓度为0.5和1mg/mL，以没食子酸为阳性对照，测试结果如下表所示。
表1苦瓜多肽粉抗氧化活性测试结果
由表1可知，不同生物酶酶解所得的苦瓜籽多肽均有较好的抗氧化活性，可见所需生物酶的种类不同对产品的活性影响不大。由此可知，苦瓜多肽是具有开发潜力的新资源食品和药品，因此苦瓜多肽有可能防止人体中细胞老化、改善记忆力、延缓衰老、保护心血管、防止老年痴呆等作用，更深层的生物活性正在研究之中。
Claims (10)
1.一种具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉，其特征在于，所述苦瓜籽肽粉中，肽的质量含量≥90%；总肽中，分子量<500Da的肽的质量比为80%以上，肽的分子量的质量占比分布如下：
分子量 质量占比
>1000 Da <5%；
500～1000Da 5%～10%；
200～500Da 45%～55%；
<200Da <30%；
肽的分子量的数均分子量范围：15～464，重均分子量范围：40～485。
2.一种如权利要求1所述的具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉的制备方法，其特征在于，苦瓜籽肽粉依次经由苦瓜籽脱脂、提取蛋白质、酶解蛋白质、分离纯化、浓缩和干燥后得到。
3.根据权利要求2所述的具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉的制备方法，其特征在于，所述提取蛋白质过程如下：
将一定量脱脂后的苦瓜籽粕记录为A，与水按重量比为1:5～1:15混合，调节pH值至8～12于室温提取0.5～2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为B，调节pH值至8~12于室温提取0.5～2 h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成滤渣二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的苦瓜籽粕，记录为C，调节pH值至8～12于室温提取0.5~2 h；B完成滤渣二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取0.5~2 h，而C第一次提取的滤液待用；C完成滤渣第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH值为3～5，静置0.5～2 h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10~1:30的水，搅拌均匀，得到苦瓜籽蛋白液。
4.根据权利要求2所述的具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉的制备方法，其特征在于，蛋白质酶解过程如下：将得到的苦瓜籽蛋白液加热至35～60℃，调节pH值至2～10，加入至少苦瓜籽蛋白液质量的0.1wt%以上的生物酶，搅拌酶解至少3 h后，煮沸灭活至少2 min，得到蛋白酶解液。
5.根据权利要求2或4所述的具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉的制备方法，其特征在于，酶解所用的生物酶为酶活力≥30万u/g的中性蛋白酶、酶活力≥40万u/g的木瓜蛋白酶、酶活力≥30万u/g的菠萝蛋白酶、酶活力≥20万u/g的碱性蛋白酶、酶活力≥20万u/g的酸性蛋白酶、酶活力≥50万u/g的胃蛋白酶、酶活力≥3000u/g的胰酶、酶活力≥5万u/g的无花果蛋白酶、酶活力≥5万u/g的罗汉果蛋白酶中的一种或者它们的混合物。
6.根据权利要求2所述的具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉的制备方法，其特征在于，所述浓缩和干燥过程为40~80℃下将蛋白酶解液分离纯化后浓缩至固含量为3~5wt%。
7.一种包含如权利要求1所述的具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉的组合物，其特征在于：所述组合物为药物或食品上可接受的助剂。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述助剂的剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液、以及化妆品剂型中的液体、乳液、膏霜、粉、块。
9.一种如权利要求1所述的具有自由基清除作用的苦瓜籽肽粉应用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品、药品或化妆品。
10.一种如权利要求7或8所述的组合物应用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品、药品或化妆品。
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