CN100999752B - 一种源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物，其为通过将胶原蛋白水解而获得的水解产物。该混合物的制备包括：使用蛋白酶对胶原蛋白进行一次或连续几次的水解，得到含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品；然后进行沉淀或过滤，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和杂质等的水解液；最后对此水解液进行分离纯化和浓缩，得到本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物。该产品所用原料来源广泛，价格低廉，产品的抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分。该产品可以用于食品、保健品、化妆品、甚至动物食品和饲料等，应用范围极其广泛，社会效益和经济效益都很显著。

Description

一种源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物，及其制备方法，和其作为抗氧化剂的用途。

背景技术

丁基羟基茴香醚(BHA)和2.6-二叔丁基对甲酚(BHT)等化学合成的抗氧化剂通常作为食品添加剂用在食品工业上，用于防止食品的氧化变色或者因氧导致的品质劣变。然而这些合成抗氧化剂由于对健康的潜在危害，在食品上的应用越来越受到限制。在最近的二十年里，人们把目光转向来自于动植物的天然的、安全的抗氧化剂。天然抗氧化剂不仅能够防止食品中油脂体系的氧化，而且可以防止人体内自由基的危害，延缓衰老导致的各种退化性疾病，如癌症、冠心病、糖尿病等等。已有一些报道发现蛋白质的水解物具有一定的抗氧化性。例如，在中国专利CN200510009423.0中公开了一系列源自蜂王浆的抗氧化肽，其为通过将蜂王浆用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶进行酶处理，可以获得具有和维生素E同等程度的强抗氧化能力的抗氧化肽。但是这类天然抗氧化剂的原料来源非常有限，不利于它的广泛使用。

在文献1：J. Agric.Food Chem.2001，49，1984～1989中，公开了采用系列酶解法，顺序添加碱性蛋白酶(Alcalase)、链霉蛋白酶E(pronase E，)和胶原酶(collagenase)，在一个三步法循环膜反应器中进行水解，从阿拉斯加鳕鱼鱼皮中水解、分离出两个含有16和13个氨基酸残基的抗氧化肽。但是这种方法存在两个缺点：一是采用三步法循环膜反应器，设备造价高，二是分离出的抗氧化肽的氨基酸残基的分子量比较大，在胃肠道中容易被消化系统的胃蛋白酶、胰蛋白酶及小肠蛋白酶进一步水解，失去抗氧化活性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术制备天然抗氧化剂时，或是原料来源非常有限，不利于广泛使用；或是设备造价高；或是分离出的抗氧化肽的分子量比较大，在胃肠道中容易被进一步水解，失去抗氧化活性等缺陷，从而提供一种简单方便、原料来源丰富廉价，且抗氧化活性高的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物，及其制备方法和用途。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供一种源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物，其为通过将胶原蛋白水解而获得的水解产物，具体包括如下的步骤：

1)使用蛋白酶对胶原蛋白进行一次或连续几次的水解，得到含有多种抗氧化肽的混合物的前制品；

使用蛋白酶对胶原蛋白进行水解的条件视蛋白酶的活力和种类而定，以便生成足够量的抗氧化肽，具体步骤为：在20～45℃(优选25～37℃)，将胶原蛋白与水混合，使得胶原蛋白在混合液中的重量百分比为2～8wt％，用盐酸或氢氧化钠调节胶原蛋白水溶液的pH值至2.0～8.0，然后加入蛋白酶，进行水解反应24～72小时(优选36～48小时)，最后对混合液进行预处理以停止酶解反应；

所述的水优选纯净水、去离子水、或蒸馏水；

所述的胶原蛋白和蛋白酶的重量比为50～2500∶1；

所述的胶原蛋白可以是任何来源的胶原蛋白，优选使用猪、牛、鸡、鱼的胶原蛋白的提取物、粗制品、明胶等各种形式的制品；

所述的蛋白酶可以采用任何能从底物产生抗氧化肽的蛋白酶；所述的蛋白酶为来自动物、植物、微生物等任意的生物的肽键水解酶，例如胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、牛胰腺蛋白酶(protease from bovine pancreas)、碱性蛋白酶(Alcalase)、胶原酶(collagenase)、木瓜蛋白酶(papain)，以及来源于微生物的蛋白酶类，如链霉蛋白酶E(pronase E)、来自链霉菌的蛋白酶(protease from Streptomyces)，以及来自多黏芽胞杆菌的蛋白酶(protease from Bacillus polymyxa)等；其中优选胰蛋白酶或链霉蛋白酶；这些蛋白酶可以单独地或混合使用，以便缩短水解时间，或在终产品中得到较好的口感；

所述的预处理为采用加热或调节pH的方法来钝化蛋白酶，例如，在90℃加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟；

2)将步骤1)得到的含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品进行沉淀或过滤，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和杂质等的水解液；

例如：调节前制品混合液的pH至中性，然后高速离心(例如20,000×g，10分钟)，弃去下部的沉淀，分出上清液；

或是采用醇沉法，加入4～6倍于前制品体积的乙醇，然后采用离心和过滤方法，滤去沉淀的蛋白，分出滤液；

或是采用超滤法，选择截流分子量为5000至1000的超滤膜，将所有分子量大于超滤膜截流分子量的肽留在膜上，分出下层的清液；

3)将步骤2)得到的已除去大分子的水解液进行分离纯化和浓缩；

将水解液进行微过滤，滤去分子量大于150～250的分子，得到干物质含量为20～40wt％的混合液，即本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物；

或是将水解液真空浓缩(浓缩温度低于50℃)后，使用凝胶过滤色谱柱(如Sephadex LH-20，Sephadex G-25)进行分离纯化，采用去离子水或是20～50mM磷酸钠缓冲溶液作为流动相，通常收集抗氧化活性高于50％的组分，然后在60℃以下浓缩洗脱液至干物质含量为20～40wt％，即得到本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物；

或是将浓缩液使用离子交换色谱柱进行分离纯化，采用磷酸钠或醋酸铵或Tris-HCl等缓冲液平衡和洗涤色谱柱，首先分离出来的将是未被吸附的肽；然后用NaCl溶液(0.5～1.0M)从0至0.5～1.0M进行梯度洗脱；按照水解物中肽的酸碱性的强弱，被流动相依次洗脱下来，通常收集抗氧化活性高于50％的组分，然后在50℃以下浓缩洗脱液至干物质含量为20～40wt％，即得到本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物。

步骤3)得到的本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物还可采用冻干机冻干成粉状。

分别采用DPPH法测定本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的自由基清除能力，采用铁离子络合法测定本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的金属络合能力，以及测定本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力，这些方法都是常规的检测方法，具体步骤如下：

1.用DPPH测定抗氧化肽的自由基清除能力(Bersuder et al.，1998)

取待测样品500μL，加入500μL 99.5wt％乙醇，和125μL含0.02wt％DPPH(1，1-二苯基三硝基苯肼)的乙醇溶液。混匀后在室温下避光静置60min，测定517nm下的吸光值。根据以下公式计算自由基清除能力，其中，以去离子水替代试样，所测的吸光度作为对照，以99.5wt％的乙醇替代DPPH溶液，所测吸光度作为空白。

2.金属络合能力的测定

采用铁离子络合法测定抗氧化肽的金属络合能力(Chung et al.，2002)。取待测样品800μL，加入10μL 2mM FeCl₂溶液和20μL 5mM显色剂ferrozine，混匀后在室温下静置10分钟，测定562nm下的吸光度。以去离子水替代试样，所测的吸光度作为对照，按下式计算金属络合能力。

3.测定亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力(Mendis et al.，2005)

在玻璃管中加入1.5mL 0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)和1.5mL 50mM亚麻酸的乙醇溶液，混合均匀后，加入2.0mL待测样品(pH 7.0)。2.0mM BHT(2.6-二叔丁基对甲酚)的甲醇溶液作为参照替代试样测定抗氧化能力。为促进油脂体系的氧化，将整个体系放在60℃的恒温箱中48小时(避光)。对于加热前和加热后的反应液的过氧化脂质通过硫氰化铁法进行测定(Osawa and Namiki，1981)。向100μL混合液中加入75wt％乙醇4.5mL，然后添加30％硫氰酸铵水溶液100μL，1.0N盐酸200μL和20mM氯化亚铁溶液(溶解在3.5％盐酸中)100μL。5分钟后测定500nm下的吸光度。

由上述方法的结果可知，本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物在这三种体系中都具有很高的抗氧化性。

本发明提供的上述源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物具有抗氧化作用，可以作为抗氧化剂，用于保健品、食品添加剂、营养强化剂、动物用添加剂、化妆品、日化用品等。

用于保健品时，该混合物可以添加到由活性氧引起的各种疾病的预防及治疗用的食品中，可以以口服的形式，也可以使用针剂的形式。还可以作为功能性配料添加到饮料、调味品(如酱油)及其他动植物类食品中。

用作营养强化剂时，例如作为配料添加，以口服液、片剂或颗粒状等形式摄取。

用作食品添加剂时可以添加到对氧、光不稳定的食品中，作为抗氧化剂或稳定剂使用。

用作动物用添加剂时，例如添加到饲料中或宠物食品配方中，既可以作为抗氧化剂或稳定剂使用，也可以作为动物的营养强化剂使用。

用作化妆品时，例如适用于洗剂、化妆水、乳状液、口红、霜剂、凝胶、面膜、粉底霜等主要用于皮肤或粘膜等物质。

用作日化用品时，例如用于护齿、护肤、护发、洗涤用剂等。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1)所用原料——胶原蛋白或明胶来源广泛，价格低廉。

本发明所用的胶原蛋白是肉类加工的副产品。我国是世界第一的家畜、家禽饲养大国和消费大国，胶原蛋白的资源极其丰富，我国目前主要将其用于食用明胶和可食肠衣的生产。现在本发明将其作为原料，原料胶原蛋白(或明胶)以15元/公斤计，可生产本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物0.5～0.8公斤，售价以180元/公斤计，销售收入达90～150元。胶原蛋白作为肉类加工厂的副产品进行加工，升值幅度是相当可观的。

2)本发明提供的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分。该产品可以用于食品、保健品、化妆品、甚至动物食品和饲料等，应用范围极其广泛，社会效益和经济效益都很显著。

3)本发明提供的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物中主要是2～6个氨基酸的抗氧化肽，分子量小，更易被消化道直接吸收。

4)本发明利用胶原蛋白水解生产抗氧化肽的水解方法和分离纯化方法操作简便，且不含有害成分，适合大规模生产。

附图说明

图1为实施例4分离后收集得到的组分在254nm下检测肽的浓度、自由基清除能力、金属络合能力和在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力；图中数字1～6分别对应6个组分；

图2为实施例5分离后收集得到的组分在280nm下检测肽的浓度、自由基清除能力、金属络合能力和在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力；图中字母a～f分别对应6个组分。

具体实施方式

实施例1、使用胃蛋白酶和链霉蛋白酶水解胶原蛋白制备本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物

1)在37℃，将猪皮的胶原蛋白粉与纯净水混合，使得胶原蛋白在混合液中的重量百分比为5wt％，用6N的盐酸调节胶原蛋白的pH值至2.0，然后加入胃蛋白酶(pepsin)(胶原蛋白和蛋白酶的重量比为2500∶1)，进行水解反应24小时，水解结束时，将水解产物在90℃加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟，停止酶解反应。

在同样的水解温度下，将此胃蛋白酶水解产物再用链霉蛋白酶E继续水解。首先用氢氧化钠调节胃蛋白酶水解产物的pH值为7.5，然后加入链霉蛋白酶E(pronase E)(胃蛋白酶水解产物和蛋白酶的重量比为125∶1)，进行水解反应24小时，水解结束时，将水解产物煮沸后保持3分钟，停止酶解反应，得到含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品；

2)将步骤1)得到的含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品采用超滤法，选择截流分子量为1000的超滤膜，将所有分子量大于超滤膜截流分子量的肽留在膜上，分出下层的清液；

3)将步骤2)得到的已除去大分子的水解液进行微过滤，滤去分子量大于150的分子，得到干物质含量为20wt％的混合液，即本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物，其主要成分为含2～6个氨基酸的小肽。

将该源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物用蒸馏水稀释到干物质含量为1％后，按照前述的方法测定其抗氧化性。其自由基清除能力高达92％，超过20mM BHT的自由基清除能力(84％)；金属络合能力达61％，(参照1.0mM EDTA为91％)；在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力为78％，高于同样条件下20mM BHT的抗氧化性(61％)。这些结果表明，该源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物具有很高的抗氧化性。适用于各种体系，作为食品添加剂或功能保健成分。

实施例2、使用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和牛胰蛋白酶水解胶原蛋白制备本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物

1)在37℃，将猪皮的胶原蛋白粉与去离子水混合，使得胶原蛋白在混合液中的重量百分比为7wt％，用盐酸调节胶原蛋白的pH值至2.0，然后加入胃蛋白酶(pepsin)(胶原蛋白和蛋白酶的重量比为2500∶1)，进行水解反应24小时，水解结束时，将水解产物在90℃加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟，停止酶解反应。

将此胃蛋白酶水解产物再用木瓜蛋白酶(papain)水解。调节上述胃蛋白酶水解产物pH值为6.2，然后加入木瓜蛋白酶(papain)，木瓜蛋白酶与胃蛋白酶水解产物的重量比为1∶50，在25℃进行水解反应24小时，水解结束时，将水解产物煮沸后保持3分钟，停止酶解反应，然后冷却至37℃。

将此木瓜蛋白酶水解产物再用牛胰腺蛋白酶(protease from bovine pancreas)水解。调节木瓜蛋白酶水解产物的pH值为7.5，然后加入牛胰腺蛋白酶(protease from bovinepancreas)，牛胰蛋白酶与木瓜蛋白酶水解产物的重量比为1∶125，在37℃进行水解24小时，水解结束时将水解产物煮沸后保持3分钟，停止酶解反应，得到含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品；

2)将步骤1)得到的含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品采用超滤法，选择截流分子量为3000的超滤膜，将所有分子量大于超滤膜截流分子量的肽留在膜上，分出下层的清液；

3)将步骤2)得到的已除去大分子的水解液进行微过滤，滤去分子量大于250的分子，得到干物质含量为35wt％的混合液，即本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物。

将该源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物用蒸馏水稀释到干物质含量1％后，按照前述的方法测定其抗氧化性。其自由基清除能力为87％，超过20mM BHT的自由基清除能力(84％)；金属络合能力达82％，(参照1.0mM EDTA为91％)；在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力为56％，仅略低于同样条件下20mM BHT的抗氧化性(61％)。这些结果表明，该源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物除了在油脂体系中抗氧化性稍低外，在其他2种抗氧化体系中都具有很高的抗氧化性，优先用于保健品、化妆品、营养强化剂、动物用添加剂、日化用品以及营养络合剂等。

实施例3、使用胃蛋白酶和牛胰蛋白酶水解胶原蛋白制备本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物

1)在37℃，将鱼皮的胶原蛋白粉与纯净水混合，使得胶原蛋白在混合液中的重量百分比为2wt％，用6N的盐酸调节胶原蛋白的pH值至2.0，然后加入胃蛋白酶(pepsin)(胶原蛋白和蛋白酶的重量比为2500∶1)，进行水解反应24小时，水解结束时，将水解产物在90℃加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟，停止酶解反应.

将此胃蛋白酶水解产物再用牛胰腺蛋白酶(protease from bovine pancreas)水解。调节上述胃蛋白酶水解产物pH值为7.5，然后加入牛胰腺蛋白酶(protease from bovinepancreas)，牛胰腺蛋白酶与胃蛋白酶水解产物的重量比为1∶125，在37℃进行水解反应36小时，水解结束时，将水解产物煮沸后保持3分钟，停止酶解反应，得到含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品；

2)将步骤1)得到的含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品采用超滤法，选择截流分子量为3000的超滤膜，将所有分子量大于超滤膜截流分子量的肽留在膜上，分出下层的清液；

3)将步骤2)得到的已除去大分子的水解液进行微过滤，滤去分子量大于200的分子，得到干物质含量为30wt％的混合液，即本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物，其主要成分为含2～6个氨基酸的小肽。

将该源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物用蒸馏水稀释到浓度1％后，按照前述的方法测定其抗氧化性。其自由基清除能力达60％以上；金属络合能力较低，只有32％(参照1.0mM EDTA为91％)；然而其在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力非常强，高达95％，远高于同样条件下20mM BHT的抗氧化性(61％)。这些结果表明，该源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物在油脂体系中具有很高的抗氧化性，尤其适用于作为食品或动物食品、饲料的天然抗氧化剂。

实施例4、使用牛胰蛋白酶、多黏芽胞杆菌蛋白酶和链霉蛋白酶水解胶原蛋白制备本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物

1)在37℃，将来自于鸡的明胶与纯净水混合，使得胶原蛋白在混合液中的重量百分比为5wt％，用2N的氢氧化钠调节底物胶原蛋白的pH值至7.5，然后加入牛胰腺蛋白酶(protease from bovine pancreas)、多黏芽胞杆菌的蛋白酶(protease from Bacilluspolymyxa)和链霉蛋白酶E(pronase E)，加入的胶原蛋白和每种蛋白酶的质量比为125∶1，进行水解反应40小时，水解结束时，将水解产物在90℃加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟，停止酶解反应，得到含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品；

2)将步骤1)得到的含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品采用醇沉法，加入4倍于前制品体积的乙醇，然后采用离心和过滤方法，滤去沉淀的蛋白，分出的滤液即为除去脂肪和大分子蛋白、多肽和杂质等的水解液；

3)将步骤2)得到的已除去大分子的水解液进行分离纯化和浓缩；

将水解液用真空旋转蒸发仪真空浓缩(浓缩温度低于50℃)后，使用凝胶过滤色谱柱Sephadex LH-20，2.5×80cm进行分离纯化，采用去离子水作为流动相。分离后收集得到6个组分，这6个组分在254nm下检测肽的浓度、自由基清除能力、金属络合能力和在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力如图1(A)、(B)和(C)所示。

根据实际用途和需要，应用前述的3种不同的方法检测各组分的抗氧化性，收集符合需求的抗氧化活性高于50％的组分，然后在60℃以下浓缩洗脱液至干物质含量为20～40wt％，即得到本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物。

当用于天然抗氧化保健品，清除体内自由基时；或者用于化妆品，防止皮肤衰老，可根据自由基清除能力，收集自由基清除活性高于60％的组分，即收集图1(A)中所示的组分1，组分2和组分4-5之间的部分。

当用于金属络合能力的抗氧化性时，例如作为微量金属元素的络合剂用于营养素补充剂时，可按照图1(B)收集金属络合力高于50％的组分，即收集组分1。

当用于食品抗氧化剂时，使用前述的检测在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力的方法测定各组分的抗氧化性，可收集组分1和组分5，其抗氧化活性高于60％以上(图1C)。

实施例5、使用牛胰蛋白酶和链霉蛋白酶水解胶原蛋白制备本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物

1)在37℃，将来自于牛的明胶与纯净水混合，使得胶原蛋白在混合液中的重量百分比为5wt％，用2N的氢氧化钠调节底物胶原蛋白的pH值至7.5，然后加入牛胰腺蛋白酶(protease from bovine pancreas)和链霉蛋白酶E(pronase E)，所加入的胶原蛋白和每种蛋白酶的重量比为125∶1，在水解温度37℃进行水解反应48小时。水解结束时，将水解产物在90℃加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟，停止酶解反应，得到含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品；

2)将步骤1)得到的含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品采用醇沉法，加入6倍于前制品体积的乙醇，然后采用离心和过滤方法，滤去沉淀的蛋白，分出的滤液即为除去脂肪和大分子蛋白、多肽和杂质等的水解液；

3)将步骤2)得到的已除去大分子的水解液进行分离纯化和浓缩；

将水解液用真空旋转蒸发仪真空浓缩(浓缩温度低于50℃)后，使用离子交换色谱柱DEAE-Sephadex A-25，2.5×60cm进行分离纯化，用0.5M Tris-HCl(pH 8.2)缓冲液平衡和洗涤色谱柱，首先分离出来的将是未被吸附的肽；然后用1.0N NaCl溶液从0至1.0N进行梯度洗脱；按照水解物中肽的酸碱性的强弱，被流动相依次洗脱下来，得到6个组分，这6个组分在280nm下检测肽的浓度、自由基清除能力、金属络合能力和在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力如图2(A)、(B)和(C)所示。

根据自由基清除能力，收集抗氧化活性高于60％的组分，可收集组分f部分(其他组分的自由基清除能力均低于40％)(图2B)。

当用于金属络合能力的抗氧化性时，可收集组分d，其金属络合力高达90％以上(其他组分的金属络合能力均低于50％)(图2B)。

根据在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力的方法，可收集组分b和组分f，二者抗氧化活性均高于60％以上(图2C)。

根据需要将组分汇集后，在60℃以下浓缩，至干物质含量为30wt％，即得到本发明的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物。

本发明得到的上述源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物还可进一步采用冻干机冻干成粉状，备用。

Claims (7)

1.一种源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的制备方法，包括如下的步骤：

1)使用蛋白酶对胶原蛋白进行一次或连续几次的水解，得到含有多种抗氧化肽的混合物的前制品；

具体步骤为：在20～45℃，将胶原蛋白与水混合，使得胶原蛋白在混合液中的重量百分比为2～8wt％，用盐酸或氢氧化钠调节胶原蛋白水溶液的pH值至2.0～8.0，然后加入蛋白酶，进行水解反应24～72小时，最后对混合液进行预处理以停止酶解反应，得到含有多种抗氧化肽的混合物的前制品；

2)将步骤1)得到的含有多种抗氧化肽的混合物的前制品进行沉淀或过滤，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和杂质的水解液；

具体步骤为：

调节前制品混合液的pH至中性，然后高速离心，弃去下部的沉淀，分出上清液；

或是采用醇沉法，加入4～6倍于前制品体积的乙醇，然后采用离心和过滤方法，滤去沉淀的蛋白，分出滤液；

或是采用超滤法，选择截流分子量为5000-1000的超滤膜，将所有分子量大于超滤膜截流分子量的肽留在膜上，分出下层的清液；

3)将步骤2)得到的已除去大分子的水解液进行分离纯化和浓缩，得到源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物。

2.如权利要求1所述的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中所述的胶原蛋白为猪、牛、鸡、鸭、鱼、火鸡的胶原蛋白的提取物、粗制品、或明胶制品。

3.如权利要求1所述的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中所述的蛋白酶为来自动物、植物、微生物的肽键水解酶。

4.如权利要求1所述的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胶原酶、木瓜蛋白酶、来自链霉菌的蛋白酶或多黏芽胞杆菌的蛋白酶。

5.如权利要求4所述的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：所述的胰蛋白酶为牛胰腺蛋白酶；所述的来自链霉菌的蛋白酶为链霉蛋白酶E。

6.如权利要求1所述的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中胶原蛋白和蛋白酶的重量比为50～2500∶1。

7.如权利要求1所述的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤3)具体步骤为：

将水解液进行微过滤，滤去分子量大于150～250的分子，得到干物质含量为20～40wt％的混合液；

或是将水解液在低于50℃真空浓缩后，使用凝胶过滤色谱柱进行分离纯化，采用去离子水或是20～50mM磷酸钠缓冲溶液作为流动相，收集抗氧化活性高于50％的组分，然后在60℃以下浓缩洗脱液至干物质含量为20～40wt％；

或是将浓缩液使用离子交换色谱柱进行分离纯化，采用磷酸钠或醋酸铵或Tris-HCl缓冲液平衡和洗涤色谱柱，首先分离出来的将是未被吸附的肽；然后用NaCl溶液从0至0.5～1.0M进行梯度洗脱；按照水解物中肽的酸碱性的强弱，被流动相依次洗脱下来，收集抗氧化活性高于50％的组分，然后在50℃以下浓缩洗脱液至干物质含量为20～40wt％.

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