CN112961893A - 罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及制备方法和在制备化妆品或细胞氧化损伤保护的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及制备方法和在制备化妆品或细胞氧化损伤保护的药物中的应用。该制备方法包括如下步骤：S1：罗非鱼皮经冷冻干燥脱水后进行脱脂、脱色处理，得脱脂罗非鱼皮；S2：对脱脂罗非鱼皮进行酶解处理，得罗非鱼皮蛋白酶解液；所述酶解的条件为：利用胰蛋白酶或碱性蛋白酶酶解得到。本发明提供的制备方法以罗非鱼皮为原料，经脱脂脱色处理后进行酶解，得到的罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽具有较佳的抗氧化活性及较强的细胞氧化损伤保护作用，在制备化妆品及细胞氧化损伤保护的药物中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，更具体地，涉及罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及制备方法和在制备化妆品或细胞氧化损伤保护的药物中的应用。
背景技术
罗非鱼生长速度快，食性杂，易饲养，是动物性蛋白的重要来源。我国是罗非鱼养殖大国，其产量稳居世界首位。当前，罗非鱼加工产品仍以冷鲜鱼片和条冻鱼为主，副产品开发利用较少。鱼皮、鱼骨和内脏等副产物被用作饲料或肥料，这不仅造成资源的浪费，而且废弃物处理不当也对环境造成污染，大大限制了罗非鱼资源的精深加工与高值化利用水平。
生物活性肽具有胃肠道消化吸收效率高、增强机体免疫力等多种营养和生理功能，其中生物活性肽的抗氧化特性近年来受到广泛关注。目前使用的抗氧化剂大多数是化学合成物，虽然其抗氧化效果好，但对人体可能具有蓄积性致癌作用。因此，寻找健康的天然抗氧化剂，特别是具有清除机体内自由基功能的抗氧化活性肽成为研究的热点。
王成成等(罗非鱼皮明胶肽抗氧化活性及对细胞氧化应激的保护作用，2017年)以罗非鱼皮为原料，先得到罗非鱼皮明胶，然后进行酶解得到明胶肽，该明胶肽具有抗氧化活性和对细胞氧化应激的保护作用，但其抗氧化活性和对细胞氧化应激的保护作用仍不够强，还有一定的提升空间。
因此，开发一种罗非鱼皮的新型利用技术，同时提升其抗氧化活性和对细胞氧化应激的保护作用具有重要的研究意义和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中罗非鱼皮的利用有限，得到的产物抗氧化活性和对细胞氧化应激的保护作用不够强的缺陷或不足，提供一种罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法。本发明提供的制备方法以罗非鱼皮为原料，经脱脂脱色处理后进行酶解，得到的罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽具有较佳的抗氧化活性及较强的细胞氧化损伤保护作用，在制备化妆品及细胞氧化损伤保护的药物中具有广泛的应用前景。
本发明的另一目的在于提供一种罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。
本发明的另一目的在于提供上述罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽在制备化妆品或细胞氧化损伤保护的药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：罗非鱼皮经冷冻干燥脱水后进行脱脂、脱色处理，得脱脂罗非鱼皮；
S2：对脱脂罗非鱼皮进行酶解处理，得罗非鱼皮蛋白酶解液；所述酶解的条件为：利用胰蛋白酶或碱性蛋白酶酶解2.5～3.5h。
本发明提供的制备方法以罗非鱼皮为原料，经脱脂脱色处理后进行酶解，得到的罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽具有较佳的抗氧化活性及较强的细胞氧化损伤保护作用，在制备化妆品及细胞氧化损伤保护的药物中具有广泛的应用前景。
本领域常规的冷冻干燥条件均可用于本发明中。
优选地，S1中冷冻干燥的温度为-35～-40℃，时间为24～48h。
优选地，S1中利用连续相变萃取法进行脱脂、脱色处理。
更为优选地，所述连续相变萃取法利用低温连续相变萃取设备进行。
更为优选地，所述连续相变萃取法选用的萃取流动相为正丁烷，萃取时间为50min，萃取温度为50℃，萃取压力为0.5MPa，解析温度70℃。
优选地，S2中利用胰蛋白酶进行酶解。
优选地，S2中酶解的pH为7.5～8.5，进一步优选为8.5。
优选地，S2中酶解的温度为45～60℃，进一步优选为58℃。
优选地，S2中酶解的时间为2.5～3h，进一步优选为2.5h。
优选地，S2中酶解的固液比为3.0～4.0％。进一步优选为4.0％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的制备方法以罗非鱼皮为原料，经脱脂脱色处理后进行酶解，得到的罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽具有较佳的抗氧化活性及较强的细胞氧化损伤保护作用，在制备化妆品及细胞氧化损伤保护的药物中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为脱脂罗非鱼皮实物图；
图2为不同蛋白酶酶解物DPPH自由基清除率活性图
图3为温度对DPPH自由基清除率的影响；
图4为pH对DPPH自由基清除率的影响；
图5为固液比对DPPH自由基的清除率的影响
图6为不同质量浓度酶解产物对DPPH自由基的清除能力；
图7为Trolox标准曲线；
图8为不同质量浓度酶解产物对ABTS自由基的清除能力；
图9为Trolox标准曲线；
图10为不同质量浓度酶解产物的ORAC值；
图11为罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的细胞抗氧化活性；
图12为罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽对H2O2诱导的HepG2细胞的保护作用。
具体实施方式
下面结合实施例和对照例对本发明做进一步的描述。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明不限于此。下述实施例和对比例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市购等商业途径得到的原料和试剂。
按照如下操作及条件对各实施例中的物质进行如下测定。
(1)DPPH自由基清除活性测定
在酶解单因素实验和正交试验中，将离心后酶解液稀释4倍后测定DPPH自由基清除率。在综合评价最优酶解条件下罗非鱼皮酶解物的抗氧化活性时，首先将酶解物经冷冻干燥冻成干粉，随后将酶解物配成质量浓度分别为5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL，再分别测定不同浓度下的DPPH自由基清除活性，并计算其IC50值。
DPPH自由基清除活性测定过程如下：准确称取DPPH 5.9mg，用无水乙醇定容至100mL，配成0.15mmol/L的DPPH反应液后避光保存。分别取1.5mL样品溶液，加入1.5mL DPPH溶液，混合均匀，室温避光放置30min，随后在517nm处测定吸光值，以去离子水和乙醇调零，每组实验做3次平行。酶解液DPPH自由基清除率计算公式如下：
式中：At:1.5mL样品溶液和1.5mL DPPH溶液的吸光度；
Ar:1.5mL样品溶液和1.5mL无水乙醇的吸光度；
A0:1.5mL DPPH溶液和1.5mL去离子水的吸光度。
(2)ABTS自由基清除能力测定
将冻干酶解物用DD水配成不同浓度的样液(5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL)备用。测定时在96孔微量滴定板的每孔中加入100μL的ABTS·+工作液，再加入100μL样液，振荡混匀，于10min后读取734nm下吸光度At，以100μL ABTS·+工作液+100μL溶剂(DD水)作空白吸光度A0。以100μL样品+100μL溶剂(DD水)混合均匀吸光度为Ar，同一测定设计3个平行。在25和50μM Trolox浓度范围建立标准曲线。结果以每100克冻干酶解物相当于Trolox的量(Trolox equivalent，TE)表示，即μmol TE/g。
ABTS自由基清除能力计算见公式(2)：
(3)ORAC值(氧自由基吸收能力)
ORAC值的测定方法如下：用75mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)分别配制不同浓度的样品浓度、1000μmol/L Trolox母液、8×10-5mmol/L FL工作液和153mmol/L AAPH溶液。依次精确吸取Trolox溶液或样品溶液50μL，FL工作液100μL加入到96孔黑色板中，将96孔板震荡3min，37℃恒温培养箱里放10min后迅速加入AAPH溶液50μL启动反应，以激发波长490nm，发射波长514nm进行测定，每隔1min测定一次荧光值(记为Fn)，直到荧光衰减至基线(本实验设置60个循环)。在20至200μM Trolox浓度范围建立标准曲线。ORAC值以具有相同氧自由基吸收能力的Trolox浓度表示。
实施例1
本实施例提供一种罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，具体操作如下：
(1)脱脂罗非鱼皮的制备
新鲜罗非鱼皮经冷冻干燥脱水，采用本实验室低温连续相变萃取设备(萃取流动相为正丁烷，萃取时间50min，萃取温度50℃，萃取压力0.5MPa，解析温度70℃)对罗非鱼皮脱脂、脱色处理，所得脱脂罗非鱼皮见图1。
(2)罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备
胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味酶理论最优酶解条件见表1，按照表1中的条件进行酶解制备罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽(酶解液)，具体操作如下：酶解在250mL锥形瓶中进行，分别震荡酶解1h、2h、3h、4h、5h，随后沸水灭酶15min，冷却后于4000r/min离心15min，所得上清液即罗非鱼皮蛋白酶解液。
表1不同酶理论最优酶解条件
选取以上4种蛋白酶酶解液，稀释4倍，通过测定DPPH自由基清除活性确定最优工具酶。
结果如图2。在四种酶中，胰蛋白酶最佳酶解时间为3h，此时DPPH自由基清除率为34.46％。在4h时碱性蛋白酶DPPH自由基清除率达到最大为29.82％。在2h时中性蛋白酶和风味酶的水解产物清除率最大值分别达到23.25％，19.40％。综合酶解时间和酶解产物对DPPH自由基的清除率，胰蛋白酶在酶解3h时效果最佳，故采用胰蛋白酶为最佳实验用酶。
(3)酶解工艺条件优化
1.单因素试验
选用胰蛋白酶进行酶解，以DPPH自由基清除活性为指标，分别对酶解时间、温度、pH和固液比进行考察。
1.1酶解温度对酶解效果的影响
胰蛋白酶属于一种具有生物活性的蛋白质，过高或过低的温度都会影响蛋白酶的活性甚至使其失活，从而影响酶解速度。按固液比3％、酶底比0.5％、pH8.0条件，在不同温度下酶解3h，研究酶解温度对罗非鱼皮蛋白酶解效果的影响。图3结果表明，在55℃前，随着反应温度的升高，酶解物DPPH自由基清除率先快速增加，随后趋缓。但温度超过55℃后，由于温度过高蛋白酶结构发生改变，使酶活性降低，从而降低反应速度，使酶解物DPPH自由基清除率随着温度的升高而呈快速下降趋势。此外，温度过低也会影响酶促反应从而影响酶解效果。即温度达到55℃时，DPPH自由基的清除率达到了最高值，为37.20％，因此选取55℃作为脱脂罗非鱼皮进一步酶解的温度。
1.2 pH对酶解效果的影响
pH值直接影响到酶和底物蛋白分子的某些解离基团的解离状态，从而影响蛋白酶的水解效果。按固液比3％、酶底比0.5％、55℃条件下，在不同pH酶解3h，研究酶解pH值对罗非鱼皮蛋白酶解效果的影响。只有在特定pH条件下，酶及底物蛋白质的解离基团才能处于易于结合并转化成产物的解离状态。从图4可以看出，DPPH自由基清除率随着pH升高呈现先上升后下降的趋势，pH影响酶的生物活性，pH也会影响蛋白质分子的某些解离基团的解离状态。并且在pH8.0时达到最大值37.16％。因此，pH8.0可作为罗非鱼皮进一步酶解的pH值。
1.3固液比对酶解效果的影响
液固比的大小会影响到酶与底物的结合效果，从而影响蛋白酶的水解效果。按酶底比0.5％、55℃、pH8.0条件，在不同固液比条件下酶解3h，研究固液比对罗非鱼皮蛋白酶解效果的影响。从图5可以看出，DPPH自由基清除率随着固液比的升高而上升，在固液比为3.5％时自由基清除率为38.44％。可以看出，随着固液比增大，酶解物抗氧化效果呈增强趋势，并且固液比太大会增加浓缩成本的投入，综合考虑各方面因素，因此，选取固液比3.5％为罗非鱼皮进行下一步酶解的条件。
2.正交试验
在单因素基础上，选取酶解时间、温度、pH、固液比四因素进行正交试验，以DPPH自由基清除率为指标，采用四因素三水平的正交试验设计。酶解时间、温度、pH、固液比四个因素的水平编码如表2，试验结果如表3。
表2正交试验因素水平表
表3酶解正交试验结果
根据正交试验的极差分析结果可知，影响DPPH清除率的主要因素顺序是：D＞B＞C＞A，最佳组合为A1B3C3D3。即脱脂罗非鱼皮蛋白的最优酶解条件为：酶解时间2.5小时，酶解温度58℃，pH8.5，固液比为4％。
实施例2综合评价罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的抗氧化活性
评价最佳组合条件下得到的罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的抗氧化活性。
(1)对DPPH自由基的清除能力
最优酶解条件下所得的冻干酶解物对DPPH自由基的清除能力见图6，当酶解物质量浓度分别为5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL时，其DPPH自由基清除率分别为28.88％、43.06％、45.61％、62.65％、62.76％、64.80％，呈现浓度依赖性。当酶解物浓度达到30mg/mL时，随浓度增大，DPPH自由基的清除率增长趋缓。同时可以看出，虽然本实施例所用罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽仅为多肽混合物，当酶解物浓度为50mg/mL时，其DPPH自由基清除率效果达64.80％，其IC50值为24.15mg/mL，显示出良好的抗氧化潜力。
(2)对ABTS自由基的清除能力
最优酶解条件下的冻干酶解物对ABTS自由基的清除率见图8，随着样品浓度的增加罗非鱼皮蛋白酶解物对ABTS自由基的清除能力液增强，在样品浓度为50mg/mL时ABTS自由基清除率可达97.95％。根据标准曲线如图7，冻干酶解物的ABTS自由基的清除率达到92.23μmol TE/100g，表明罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽具有较强的的体外抗氧化活性，其IC50值为0.337mg/mL。
(3)ORAC值测定
ORAC值，又称抗氧化能力指数，ORAC同样可以通过对自由基生成的抑制对自由基链式反应的阻断，完成抗氧化反应，是通过荧光衰退曲线的保护面积与标准抗氧化物质的保护面积相比得出。
本实施例通过ORAC荧光法进行抗氧化实验，以具有相同氧自由基吸收能力的Trolox浓度表示不同样品的ORAC值作为抗氧化能力的评价指标，以罗非鱼皮冻干酶解物为样品，研究ORAC荧光法检测抗氧化能力。标准物Trolox浓度与NetAUC之间线性关系见图9，根据标准曲线算出不同质量浓度样品的Trolox当量值。通过ORAC值的检测对罗非鱼皮冻干酶解物抗氧化能力进行了量化，见图10。不同浓度的罗非鱼皮冻干酶解物ORAC值分别相当于16.77、21.56、24.95μmol/L Trolox。结果显示随着罗非鱼皮冻干酶解物质量浓度增大，ORAC活性随之增加，在120μg/mL浓度下，罗非鱼皮冻干酶解物的ORAC值达到24.95μmolTrolox/L，说明罗非鱼皮冻干酶解物(罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽)具有较强抗氧化能力。
实施例3综合评价罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽对HepG2细胞的抗氧化及细胞保护作用
(1)细胞抗氧化活性(CAA)和不同浓度H2O2的细胞毒性
为了进一步确认罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽在细胞内的抗氧化活性，按如下方法进行细胞抗氧化活性(CAA)试验，具体操作如下：
细胞(6.0×104个细胞/孔)在一个黑色的96孔板培养24小时，然后在含有不同抗氧化肽的最终浓度(0.01，0.025，0.05，0.1，0.2，0.5，1mg/mL)细胞培养1h。然后去除培养基，用PBS洗涤细胞。随后，在孔中加入100μL的自由基生产剂ABAP(600μM)。将平板置于酶标仪中，在485nm激发后，在528nm发射下每5min记录1h的荧光。根据荧光强度随时间变化的曲线下面积(AUC)计算出罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的CAA值后，将其表示为μmol槲皮素当量(QE)/100g肽。
与常用的化学抗氧化活性测定法相比，CAA法被认为是一种优越的抗氧化活性指标。因为它考虑了生物系统的复杂性，包括HepG2细胞内抗氧化化合物的生物利用度、摄取和代谢。采用CAA法测定其细胞抗氧化活性。
在评价其CAA前，建立了H2O2对HepG2细胞的氧化应激模型，并用MTT法测定抗氧化肽的细胞毒性。具体为，细胞(1×104个细胞/孔)在100μL的培养基中孵育48h，然后在CO2培养箱中加入100μL含不同浓度H2O2(0.1-9mM)的DMEM培养基。对照组用100μLDMEM培养基培养。孵育1、2、3h后，用MTT法测定细胞活力。细胞毒性水平计算方法为：细胞存活率(％)＝(处理吸光度)/(对照吸光度)×100。
MTT法的结果证实，在检测CAA值的浓度(0.025-5mg/mL)下，罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽对HepG2细胞没有细胞毒性作用(图11A)，甚至发现罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽对细胞生长有很大的促进作用。从图11B的CAA检测结果可以看出，即使在极低的浓度(0.01mg/mL)下，这些罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽也有作用，且CAA值随着浓度的增加而不断增加。这些肽的CAA值为14.48mmol QE/100g，显著高于桑叶抗氧化肽(2204μM QE/100g)和松仁肽(916μM QE/100g)。结果表明，该罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽具有良好的抗氧化活性，具有清除人体细胞内自由基的能力，与DPPH、ABTS和ORAC的研究结果一致。由此可见，罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽不仅在体外具有良好的抗氧化活性，而且在细胞内也表现出潜在的抗氧化作用，通过清除自由基抑制活性氧的形成和/或促进内源性抗氧化防御系统。
(2)对H2O2诱导的氧化应激的细胞保护作用
在不同浓度H2O2诱导细胞氧化应激的基础上，选择合适浓度(3mM,3h)的H2O2，进一步研究罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的细胞保护作用。HepG2细胞(1×104个细胞/孔)在96孔板培养24h，然后使用100μL罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽(1、3、5、8、10、20、50、100μg/mL)或抗坏血酸(60μg/mL)24h，接着用过氧化氢处理3h。孵育后用MTT法测定细胞活力，细胞活力(％)＝(处理吸光度)/(对照吸光度)×100。
结果如图12所示。如图12A所示，H2O2在低浓度(0-0.3mM)下对细胞活力无显著影响。但H2O2处理(0.3-9mM)后，细胞活力显著降低，且与暴露时间(1-3h)成反比，这与之前的报告结果相似。H2O2(3mM,3h)显示约50％的细胞毒性。因此，我们选择这个浓度和时间进行后续实验。
此外，评估罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽对HepG2细胞氧化应激条件下的细胞保护作用，将细胞使用不同浓度的罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽(1-100μg/mL)或抗坏血酸(60μg/mL)24h后用3mMH2O2处理3h。如图12B所示，随着罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽浓度的增加(1-20μg/mL)，对细胞氧化损伤的保护作用明显增强，说明罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽对细胞活力的保护作用呈浓度依赖性。然而，罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽浓度为20μg/mL时，罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的保护作用显著降低。与之前报道的结果类似，高浓度的罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽显示出抑制反应，表明过量的抗氧化剂也可能作为促氧化剂，导致氧化应激。有趣的是，与抗坏血酸(57.16％，60μg/mL)相比，这些肽在极低浓度(58.99％，1μg/mL)的细胞保护作用更强。上述结果提示，罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽在一定水平的治疗下是安全的，并具有显著的抗氧化应激能力。它们可以保护细胞免受H2O2诱导的细胞抗氧化系统的氧化应激。
最后应当指出的是，以上实施例仅是本发明的具有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明内容直接导出或联想到所有变形，均应认为是本发明的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：罗非鱼皮经冷冻干燥脱水后进行脱脂、脱色处理，得脱脂罗非鱼皮；
S2：对脱脂罗非鱼皮进行酶解处理，得罗非鱼皮蛋白酶解液；所述酶解的条件为：利用胰蛋白酶或碱性蛋白酶酶解2.5～3.5h。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1中冷冻干燥的温度为-35～-40℃，时间为24～48h。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1中利用连续相变萃取进行脱脂、脱色处理。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，利用连续相变萃取进行脱脂、脱色处理的条件为：萃取流动相为正丁烷，萃取时间为50min，萃取温度50℃，萃取压力0.5MPa，解析温度70℃。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2中利用胰蛋白酶进行酶解。
6.根据权利要求1或3所述制备方法，其特征在于，S2中酶解的pH为7.5～8.5；S2中酶解的温度为45～60℃。
7.根据权利要求1或3所述制备方法，其特征在于，S2中酶解的时间为2.5～3h；S2中酶解的固液比为3.0～4.0％。
8.一种罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽，其特征在于，通过权利要求1～7任一所述制备方法得到。
9.权利要求8所述罗非鱼皮胶原蛋白抗氧化肽在制备化妆品或细胞氧化损伤保护的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述化妆品为具有抗氧化或修复功能的化妆品。
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