CN111454844A - 一种灵芝新菌种、基于该灵芝菌制备的灵芝多糖及抗衰老化妆品 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种灵芝新菌种、基于该灵芝菌制备的灵芝多糖及抗衰老化妆品，所述灵芝新菌种为灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055，保藏编号为CGMCC No.17789。本发明选用保藏编号为CGMCC No.17789灵芝菌种，利用热水浸提法从灵芝菌丝体提取灵芝多糖，制备周期短，提取率高，制备方法易于实现，可量产。另外，采用本发明方法得到的灵芝多糖用于化妆品安全无副作用，能够明显改善皮肤纹理问题，具有良好的美肤效果。

Description

一种灵芝新菌种、基于该灵芝菌制备的灵芝多糖及抗衰老化 妆品

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种灵芝新菌种、从该灵芝菌丝体中提取的灵芝多糖以及以该灵芝多糖为活性成分的具有抗衰老功效的化妆品。

背景技术

灵芝菌是一种重要的药食两用微生物资源，富含多种活性成分，在《本草纲目》中有“补中益气，增智慧，好颜色，久食轻身不老，延年神仙”的描述。灵芝富含多糖、三萜类、蛋白质类、生物碱以及微量元素等多种成分，而灵芝多糖是研究较为广泛的重要活性成分，文献报道具有显著的抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖、保肝护肝等作用。

正因如此，国人对于灵芝的滋养功效就十分推崇，对其衍生的药品、保健品及化妆品也较为拥护。我国有记载的灵芝有103种，其中14种已被人们所利用。目前，在国内应用广泛的品种包括赤芝，紫芝等，灵芝属的许多其它种类也值得进一步研究。

本申请人在野外采集筛选出一种灵芝菌种，从该灵芝菌丝体中提取出灵芝多糖，该灵芝多糖相比于一般的灵芝多糖能够明显改善皮肤纹理问题，具有良好的美肤效果。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供了一种灵芝新菌种、从该灵芝菌丝体中提取的灵芝多糖以及以该灵芝多糖为活性成分的具有抗衰老功效的化妆品。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种灵芝新菌种，所述灵芝新菌种为灵芝(Ganodermalucidum)菌株wG055，保藏编号为CGMCC No.17789。本发明的灵芝新菌种由申请人从安徽省滁州市(32°52'55.6"N 117°33'53.3"E)采集野生真菌子实体，挑取其菌盖和菌柄交接处组织，然后置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d，得到菌丝。挑出菌丝纯化两次，获得真菌的纯化菌株。

第二方面，本发明提供一种从上述灵芝新菌种培养得到的灵芝菌丝体中提取灵芝多糖的方法，具体步骤如下：

1)灵芝菌液的制备：将保藏编号为CGMCC No.17789的灵芝菌种接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，然后将得到的单菌落接种至葡萄糖马铃薯液体培养基培养得到灵芝菌液；

2)热水浸提法提取灵芝多糖：从灵芝菌液中分离出灵芝菌丝体，将所得灵芝菌丝体水洗两遍，冻干得到灵芝菌丝体冻干粉，采用热水浸提法提取灵芝菌丝体冻干粉中的灵芝总多糖；

3)Sevage法除杂蛋白：将步骤2)所得灵芝总多糖加水配成粗多糖溶液，再将粗多糖溶液加入Sevage试剂中，分液提纯得到灵芝多糖。

按上述方案，步骤1)灵芝菌种接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化的温度为23～28℃，活化的时间为3～7d。

按上述方案，步骤2)热水浸提法工艺条件为：以水为提取剂，料液比为1g/35mL，在65℃下浸提1.5h，浸提次数为1次。

按上述方案，步骤3)所述粗多糖溶液浓度为10g·L^-1，所述Sevage试剂为氯仿与正丁醇按体积比氯仿：正丁醇＝5：1的混合液，粗多糖溶液与Sevage试剂体积比为1：3～5。

第三方面，本发明还提供一种根据上述方法得到的灵芝多糖，其中灵芝粗多糖纯度为85～95％(重量百分比)。

第四方面，本发明还提供一种含有上述灵芝多糖的化妆品。

按上述方案，所述化妆品成分中灵芝多糖的质量百分含量为0.5～2％。

本发明的有益效果在于：1、本发明选用保藏编号为CGMCC No.17789灵芝菌种，利用热水浸提法从灵芝菌丝体提取灵芝多糖，制备周期短，提取率高，制备方法易于实现，可量产。2、采用本发明方法得到的灵芝多糖用于化妆品安全无副作用，能够明显改善皮肤纹理问题，具有良好的美肤效果。

附图说明

图1为不同H₂O₂浓度下HSF细胞存活率图；

图2为GLP1～6灵芝多糖浓度对HSF细胞活力影响图；

图3为VC浓度对HSF细胞活力的影响图；

图4为GLPs对HSF损伤模型保护作用的影响图(MTT)；

图5为GLPs对HSF损伤模型修复作用的影响图(MTT)；

图6为GLPs对HSF损伤模型保护作用的影响图(SA-β-Gal)；

图7为GLPs对HSF损伤模型修复作用的影响图(SA-β-Gal)；

图8为料液比对灵芝多糖提取率的影响(不同字母的表示有显著性差异p<0.05；相同字母的表示无显著性差异p>0.05)；

图9浸提时间对灵芝多糖提取率的影响(不同字母的表示有显著性差异p<0.05；相同字母的表示无显著性差异p>0.05)；

图10浸提温度对灵芝多糖提取率的影响(不同字母的表示有显著性差异p<0.05；相同字母的表示无显著性差异p>0.05)；

图11提取次数对灵芝多糖提取率的影响(不同字母的表示有显著性差异p<0.05；相同字母的表示无显著性差异p>0.05)；

图12牛血清蛋白标准曲线；

图13为Sevage法除蛋白质效果；

图14为多糖柱层析洗脱曲线；

图15为GLP(A，B)、GLP I(C，D)、GLPⅡ(E，F)的电镜扫描图；

图16为灵芝多糖红外光谱图(A、B、C分别为GLP、GLP I、GLPⅡ的红外光谱结果)；

图17为低温对样品固形物含量的影响图；

图18为高温对样品固形物含量的影响图；

图19为冷热循环对样品固形物含量的影响图；

图20为样品离心前后的状态图(A为离心前样品状态，B为离心后样品状态)；

图21为不同样品对MMV变化率的影响图；

图22为不同样品对TEWL变化率的影响图；

图23为不同样品对皮肤弹性的影响图(图中A～C依次为R2、R5与R7的结果)；

图24为实施例6中一名志愿者涂抹不同灵芝多糖膏霜的皮肤纹理数据。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的灵芝菌种wG055(Ganoderma lucidum)为保藏菌种CGMCCNo.17789。

下述实施例中，检测灵芝多糖含量的方法参考如下文献：王倩，张佳婵，王昌涛等.碳氮比对真菌发酵桑枝-燕麦麸皮的活性成分和抗氧化能力的影响[J].食品工业科技，2018.

下述实施例中，实验数据利用SPSS 19.0数据处理软件进行统计学处理，组间比较采用单因素ANOVA分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，所得结果以x—±s表示。

实施例1、灵芝菌wG055(Ganoderma lucidum)CGMCC No.17789的分离、鉴定和保藏

1、菌种的分离

本申请人从安徽省滁州市(32°52'55.6"N 117°33'53.3"E)采集野生真菌子实体，挑取其菌盖和菌柄交接处组织，然后置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d，得到菌丝。挑出菌丝纯化两次，获得真菌wG055的纯化菌株。每次纯化的步骤为：将菌丝置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d。

2、形态学鉴定

取液体菌丝接种于PDA培养基上，25℃培养2天后，组织块上萌发白色、绒毛状的气生菌丝，菌丝体呈白色，直径1～3μm，有分枝，弯曲，有锁状联合。前期生长缓慢，进入快速生长期后，菌丝体以接种点为中心，紧贴培养基表面呈辐射状生长，菌落直径开始增大，菌皮变厚。待菌丝体长满培养基表面后，会沿试管壁继续生长。当菌丝老熟时会分泌黄色或黄褐色的色素，易形成菌膜。

3、分子系统发育分析

按照真菌基因组提取试剂盒(品牌为OMEGA，型号为D3390-02)的操作步骤，提取wG055的基因组DNA。

以上述提取的wG055基因组DNA作为扩增模板，以真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC为引物进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环。对得到的PCR产物进行测序，测序结果表明wG055的rDNA-ITS序列与NCBI数据库中已公开的rDNA-ITS序列进行在线同源性比对，结果显示wG055与灵芝菌(Ganoderma lucidum strain)真菌核酸序列同源性最高，相似性为99％。

4、灵芝菌wG055(Ganoderma lucidum)的菌种保藏

wG055已于2019年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.17789。wG055的全称为灵芝(Ganoderma lucidum)wG055 CGMCC No.17789。

菌种筛选实施例：

灵芝菌1～6号(其中1～3号采集自安徽省滁州市、4～5号采集自吉林省长白山，6号为购买的普通灵芝菌种；其中灵芝菌1为灵芝菌种wG055)，用PDA平板对这六种灵芝菌种进行活化，取单菌落转移至马铃薯葡萄糖水液体培养基中进行扩大培养，培养条件是28℃、180rpm培养7d，3500rpm离心15min、过滤取灵芝菌丝体沉淀，于-80℃、0.03mBar条件下冷冻干燥48h。参照文献方法[刘良琴.灵芝多糖的提取纯化、结构表征及灵芝茶的质量控制研究[D].贵州:贵州师范大学,2017:33-47.DOI:CNKI:CDMD:2.1017.827375]，对菌丝体多糖GLPs的提取纯化操作如下：灵芝菌丝干粉→热水浸提→离心取上清液→旋转蒸发浓缩→乙醇醇沉→Sevage法去蛋白→DEAE-52层析→透析→冻干(-80℃，0.03mBar，48h)→GLPs冻干粉。这六种灵芝菌种的菌丝体多糖冻干粉分别命名为GLP1～6。

人皮肤成纤维细胞(HSF细胞)购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。将HSF细胞以每孔1×10⁴个接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养过夜，弃去培养基，分别添加100μL含不同浓度H₂O₂(50～1000μmol·L^-1)的培养基，各组均设5个重复，对照组不添加H₂O₂。刺激1、2、3、4h后，采用MTT法，于490nm波长下测定各孔OD值，得出HSF细胞存活率，50～1000μmol·L^-1的H₂O₂处理1～4h后HSF细胞的存活率结果见图1。可知各处理组HSF细胞存活率随H₂O₂浓度的增大而降低，随时间的增加而降低。低浓度H₂O₂(1～50μmol·L^-1)的对细胞损伤作用不明显，细胞存活率均在80％以上，高浓度H₂O₂(500和1000μmol·L^-1)的杀伤性过强，造成细胞过度损伤。100μmol·L^-1的H₂O₂处理HSF细胞2h，细胞存活率降低为(49.74±2.99)％。建立氧化应损伤型时，细胞存活率通常在50％～70％范围内。若存活率过高，对细胞无法造成明显的氧化损伤；而细胞存活率过低，则容易引发不可逆的损伤，均不利于构建氧化损伤模型。因此选择细胞存活率为50％的H₂O₂浓度(100μmol·L^-1，2h)作为建模条件(结果见图1)。

Vc是公认的抗氧化剂，常被用以抗衰老的保健品、化妆品中，具有较好的效果。选择Vc为阳性对照，对6种灵芝多糖进行细胞毒性检测。图2为不同浓度灵芝多糖处理24h后，HSF细胞的存活率。发现0.31～5.00g·L^-1的灵芝多糖对HSF细胞无毒性，细胞活率均在80％以上，综合成本和添加量考虑，选择了处理的中间浓度1.25g·L^-1作为接下来的实验浓度。Vc(图3)在浓度大于100～500mg·L^-1时，细胞活率低于80％，通过SPSS计算得Vc的IC₈₀浓度为86mg·L^-1，以该浓度为阳性对照进行细胞实验。

实验设置模型组(H₂O₂组)、H₂O₂+GLPs组、阳性对照(维生素C)组+H₂O₂组、空白组，每组设3个重复。保护组为先加入H₂O₂刺激2h后，每孔加入100μL样品培养24h；修复组为先加入样品培养24h后，再以H₂O₂刺激2h。采用MTT法测定细胞存活率。(图4-7中保护作用的control组是只有细胞，无任何样品作用的组；保护作用的model组是细胞加无血清DMEM作用24h后，用H₂O₂刺激的模型组；修复作用的control组是只有细胞，无任何样品作用的组；修复作用的model组是细胞首先用H₂O₂刺激，随后用无血清DMEM作用24h后的组。)

MTT法步骤为将细胞以每孔1×10⁴个的密度接种于96孔培养板中，于37℃、5％CO₂环境中培养过夜。弃培养液，加入不同浓度样品，每个浓度设5个平行，细胞对照组加入无血清的DMEM培养液，培养24h。吸弃培养基，PBS洗两次，加入100μLMTT(1.0g·L^-1)溶液，放入37℃，5％CO₂环境中培养4h后，弃液，加入150μL DMSO，37℃下放置10min后于490nm波长测定各孔吸光度值，按公式1计算细胞存活率。

为了进一步探讨GLPs对氧化应激模型的保护和修复作用，考察GLPs对HSF细胞活力的影响，灵芝多糖浓度对HSF细胞活力影响图见图2。由图2可知，0.31～5.00g·L^-1的灵芝多糖处理HSF细胞，其活率均在80％以上，认为无细胞毒性。为保证实验统一及操作简便，选择浓度1.25g·L^-1进行下一步实验。

维生素C(VC)是公认的抗氧化剂，本发明实施例以VC为阳性对照，分析对比GLPs的防护功效，VC浓度对HSF细胞活力的影响见图3。通过MTT实验可知，维生素C在浓度大于100～500mg·L^-1时，细胞活率低于80％，因此选择IC₈₀浓度(VC浓度86mg·L^-1)作为阳性对照组进行下一步细胞实验。

利用基于衰老的β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal)染色实验来观察细胞衰老情况。SA-β-Gal染色实验的具体步骤为：将HSF细胞以每孔1×10⁶个接种于6孔板中，按照SA-β-半乳糖苷酶试剂盒说明书进行操作，于普通光学显微镜下观察细胞染色数量。

GLPs对H₂O₂诱导的氧化应激的保护(图4，图6)和修复(图5，图7)作用结果(具体做法为：保护组为先加入H₂O₂刺激2h后，每孔加入100μL样品培养24h；修复组为先加入样品培养24h后，再以H₂O₂刺激2h。与control组相比，差异显著p<0.05，差异极显著p<0.01；与model组相比，差异显著^**p<0.05，差异极显著p<0.01。)。由4和5可知，保护和修复实验中model组的细胞的存活率与control组相比均极显著降低(p<0.01)；通过SA-β-Gal染色实验计算衰老细胞比例(图6和7)，model组衰老细胞比例显著高于control组(p<0.01)，说明两种作用方式下的氧化应激模型建立成功(两种处理方式的model组均与control组有显著差别，说明model诱导的氧化损伤成功)。图4和6中，相较model组，用GLPs与VC处理后均能显著提高细胞活力，并且衰老细胞比例显著低于model组，分析其原因可能是GLPs具有一定的抗氧化作用，并且有助于细胞增殖，以此来减少H₂O₂对细胞的损害，对氧化损伤有一定的保护作用。

图5为样品对H₂O₂诱导的氧化应激的修复作用，对比model组，仅GLP1对氧化损伤的HSF的细胞活力有促进增殖的作用(p<0.01)，VC作用下的细胞活力与model组无显著性差异。由图7可知，GLP1可以显著降低损伤细胞的衰老细胞比例，对氧化损伤有一定的修复作用。

实施例2、灵芝菌丝体多糖的制备、初步纯化条件的优化

一、灵芝菌液的制备

(1)将灵芝菌种接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基，28℃培养7d活化。

(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL葡萄糖马铃薯液体培养基，28℃、180rpm培养7d，得到灵芝菌液，分离出灵芝菌丝体。

二、热水浸提法提取灵芝菌丝体多糖

(1)将所得灵芝菌丝体水洗两遍，冻干得到灵芝菌丝体冻干粉。

(2)取1g灵芝菌丝体冻干粉样品粉末，并按表1条件进行单因素实验，每组重复3组，5000r·min^-1离心10min后检测提取液中多糖含量。

表1单因素实验条件

料液比对灵芝多糖提取率的影响：

固定浸提时间为2h，浸提温度为70℃，浸提1次，考察料液比对多糖提取率的影响，实验结果见图8。在此条件下料液比为1:30和1:60(g·mL^-1)时，多糖提取率最高，且与其他条件存在显著性差异。考虑原料与成本问题，在该条件下的最优单因素提取条件为1:30(g·mL^-1)。

浸提时间对灵芝多糖提取率的影响：

固定料液比为1:50(g·mL^-1)，浸提温度为70℃，浸提1次，考察浸提时间(h)对多糖提取率的影响。从图9观察可知，2.5h内多糖提取率差异并不显著，当浸提时间为1h时，提取率最高。从节约角度出发，在该条件下的最优单因素提取条件为1h。浸提温度对灵芝多糖提取率的影响：

固定料液比为1:50(g·mL^-1)，浸提时间为2h，浸提1次，考察浸提温度(℃)对多糖提取率的影响，实验结果见图10。可以看出，70℃时多糖提取率达到最大，且与其他条件存在显著性差异，故确定最佳浸提温度为70℃。

提取次数对灵芝多糖提取率的影响：

固定料液比为1:50(g·mL^-1)，浸提时间为2h，浸提温度为70℃，考察浸提次数对多糖提取率的影响，实验结果见图11。易知随提取次数的增加，多糖提取率大幅下降，第二次提取率仅为(8.05±1.34)％，综合考虑，选择浸提次数为1次。

三、热水浸提法提取灵芝菌丝体多糖正交实验

根据单因素实验结果，以浸提时间(h)、浸提温度(℃)、料液比(g·mL^-1)为考察因素，以灵芝多糖提取率为考察指标，根据正交实验水平表2进行L₉(3⁴)实验，按照表2中的因素设计并进行正交实验，得到实验结果见表3和表4(A为料液比，B为浸提温度，C为浸提时间)。

表2三因素三水平

表3正交试验结果分析

表4正交实验方差分析

多糖提取条件的三因素三水平见表2，正交试验的设计及结果见表3，正交实验方差分析见表4。由极差和方差分析可知F_A＝113.29，F_B＝103.19，F_C＝68.26，所以三因素对多糖提取率的影响由强到弱顺序为A>B>C，正交实验的结果表明，这三个因素的最佳组合为A₃B₁C₃，即总糖提取最优工艺条件为：料液比1:35，浸提温度65℃，浸提时间1.5h。在该条件下验证得到粗多糖的提取率为(47.70±0.50)％，相对标准偏差RSD值为1.04％，再现性良好。远高于灵芝子实体的提取率，这可能源于灵芝菌丝体易于破壁，胞内多糖可快速溶出，且灵芝入土生长成为子实体期间自身代谢会消耗多糖，造成多糖总含量的降低。

四、Sevage法除杂蛋白

(1)Sevage法

配制10g·L^-1的粗多糖溶液以体积比1:5加入Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝5:1，v/v)中，电磁搅拌30min后，转移至分液漏斗中静置10min，除去两相交界处的变性蛋白质。水层取样测蛋白含量和多糖含量，计算得多糖损失率及蛋白去除率。

(2)蛋白含量的测定方法

配制浓度为0.1g·L^-1的牛血清白蛋白标准溶液，在试管中分别加入不同体积的标准溶液，蒸馏水补足至1mL，使其终浓度为0～0.1g·L^-1。每管加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，以空白溶液为参比，并在2～5min后，在595nm波长处测定OD值。标准曲线如图12所示，得到回归方程：y＝5.632x+0.0191，相关系数R²＝0.9954，具有良好的相关性。

取1mL步骤(1)Sevage法分液后的水层液体，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，2～5min后于595nm波长处测定OD值，计算得到蛋白含量。灵芝粗多糖的8次去蛋白处理结果如图13所示。蛋白的脱除率与处理次数呈正相关，首次处理后脱除率仅为(12.31±0.24)％，第8次可达(72.87±1.90)％。当用Sevage处理6次后，蛋白质的脱除率变化不明显。由于多糖与有机试剂长时间接触可能会影响其生物活性，因此共进行6次处理，此时可达(66.68±1.13)％的蛋白的去除率。除蛋白后的灵芝多糖命名为GLP。

五、DEAE-52离子交换柱分离灵芝菌丝体多糖

取脱蛋白后的灵芝多糖配制成10g·L^-1的多糖溶液，上样量20mL。上样前过0.22mm孔径聚醚砜滤膜，除去不溶物。用去离子水、0.1、0.3、0.5mol·L^-1NaCl在1.0mL·min^-1的流速下分步洗脱，每种洗脱液收集30管，每管10mL。用苯酚-硫酸法检测OD值，作洗脱曲线。合并相同峰组分。

由洗脱曲线(图14)可知，共4个洗脱峰，分别出现在90、390、690、990mL处，收集各组分。考虑到最后两个峰多糖含量较低，故仅选用第一组分和第二组分进行后续实验。将收集的组分透析后冻干，得到灵芝多糖组分命名为GLP I(多糖纯度为93.25％)、GLPⅡ(多糖纯度为91.04％)。

六、GLP、GLP I、GLPⅡ的扫描电子显微镜、红外光谱表征

(1)GLP、GLP I、Ⅱ的扫描电子显微镜观察

粘有导电胶的样品台粘取干燥的灵芝多糖粉末，洗耳球吹走多余的样品，喷金后，在扫描电子显微镜下观察。放大倍数设置为200、500、1000、1500、3000倍，拍照记录具有代表性的视野。

GLP、GLP I、GLPⅡ的电镜扫描结果如图15，虽然现阶段还没有多糖表观结构表征的统一标准，但可对不同样品表观结构的差异性进行直观的分析。图15A为GLP放大500倍的电镜扫描结果，GLP呈片状、棒状、球状及叉状结构，其表面多空洞和凹槽，初步判定GLP纯度较低。图15B为GLP放大3000倍的电镜扫描结果，可观察到清晰的网状结构；图15C为GLP I放大500倍的电镜扫描结果，可观察到其均匀分散开来，多呈片层结构和长条片状，表面光滑。GLP I放大3000倍后(图15D)可清晰观察到其表面平滑无空洞，说明GLP I粒径较小；图15E为GLPⅡ放大500倍的电镜扫描结果，多为片状和棍状结构，表面空洞较少但存在较多褶皱。图15F为GLPⅡ放大3000倍的电镜扫描结果，呈现出较为清晰的棒状结构，并附有圆形小球，推测可能为纤维素。

(2)GLP、GLP I、GLPⅡ的红外光谱表征

将灵芝多糖样品与干燥的KBr粉末以1:100的比例进行混和，研磨均匀后压片。将制好的压片置于傅里叶变换红外光谱仪中在4000～400cm^-1范围内进行红外扫描，对采集到的红外吸收图谱进行分析。

图16为GLP、GLP I、GLPⅡ的红外光谱结果，三者在3369～3384cm^-1处出现了宽且高的吸收峰，此峰是糖类物质的特征吸收峰，主要是糖链中非游离O-H的伸缩振动引起的，同时也说明多糖分子间有氢键。在2930cm^-1左右处出现了特征吸收峰。该峰是-CH₂-在糖链中反对称伸缩振动引起的，进一步证实了所测样品为糖类物质。在1640cm^-1左右处出现了由于多糖中结合水或者C＝O的伸缩振动引起吸收峰。在1420cm^-1左右附近的吸收峰为C-H或O-H的拉伸和弯曲振动引起的特征吸收峰。在1200～1000cm^-1范围内出现三个吸收峰是吡喃环的伸缩振动引起的特征峰。在890cm^-1左右处出现了β-糖苷键的特征吸收峰。

七、灵芝多糖膏霜的化妆品功效检测

(1)灵芝多糖膏霜的制备

按表5配方，在50mL烧杯中依次称取A相原料(g)；将不同比例的灵芝多糖加入灭菌后的去离子水中(根据表5计算用量)，溶解过0.22μm聚砜醚滤膜除去不溶物。在250mL烧杯中，将丁二醇、甘油、汉生胶和EDTA-2Na按比例加入，用玻璃棒手搅分散均匀后加入灵芝多糖水溶液；分别用玻璃棒手搅加热A、B相原料，升温至80～85℃后，搅拌10min，将A相倒至B相烧杯中进行均质，均质速度大约在3500r·min^-1左右，均质时间为5～8min；以转速35～40r·min^-1搅拌降温至45℃，加入C相，搅拌降至室温后称量，分装。

通过不同的灵芝多糖总添加量制备四种膏霜，分别为空白对照、灵芝膏霜(0.5wt％)、灵芝膏霜(1.0wt％)和灵芝膏霜(2wt％)。

表5样品配方表

(2)灵芝多糖膏霜稳定性检测

耐寒稳定性：将样品分装到10mL透明样品瓶中，置于-(20±1)℃的冰箱中，并在0、1、2、3、4周取出，回到室温后，观察是否分层、气味和固形物含量的变化，其中固形物含量用PR-101αPALETTE系列数显折射计测定。

结果发现，将样品在-(20±1)℃的冰箱中放置0～4周取出观察，四种样品均无分层现象出现，表层无油脂析出，气味未发生改变，固形物含量无明显波动(见图17)。

耐热稳定性：将样品分装到10mL透明样品瓶中，置于(40±1)℃的冰箱中，并在0、1、2、3、4周取出，回到室温后，观察是否分层、气味和固形物含量的变化。其中固形物含量用PR-101αPALETTE系列数显折射计测定。

结果发现，样品在(40±1)℃的烘箱中放置0～4周取出，分别观察，4种样品均未出现分层现象，表层无油脂析出，气味未发生改变，固形物含量无明显波动(见图18)。

循环稳定性：把样品分装至10mL的透明样品瓶中，置于(40±1)℃的烘箱中24h，再取出，置于-(20±1)℃的冰箱中24h，视为1个循环，共观察五个循环。观察是否分层、气味和固形物含量的变化。其中固形物含量用PR-101αPALETTE系列数显折射计测定。

样品在(40±1)℃与-(20±1)℃环境中循环0～5次，观察冷热交替对样品稳定性的影响。结果表明，4种样品在5次循环中均未出现分层现象，表层无油脂析出，气味未发生改变，固形物含量(见图19)无明显波动。

离心稳定性：把4种样品分装至2mL离心管中，将其置于(40±1)℃的烘箱中，1h后取出，3000r·min^-1离心30min，观察有无分层现象。

结果表明，3000r·min^-1下离心30min后，样品未出现分层现象(图20)，具有较好的稳定性。

(3)灵芝多糖膏霜安全性检测

参照《化妆品安全技术规范(2015年版)》进行皮肤封闭型斑贴试验。按表6标准观察皮肤反应。并记录观察结果。表7为人体封闭斑贴试验结果，通过对30名志愿者的测试发现，四个样品均未出现阳性反应，说明样品较为安全。

表6皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准

表7皮肤封闭型斑贴试验结果

(4)灵芝多糖膏霜的功效性检测

测试样品1为空白对照，测试样品2～4中灵芝粗多糖GLP的添加量分别为0.5wt％、1.0wt％、2.0wt％。

受试者人数：30；年龄：18～35周岁；温度：22℃±1℃；湿度：50％±5％；测试区域：手臂及脸颊；实验环境、志愿者要求以及测试前准备工作具体参照《化妆品安全技术规范(2015年版)》进行。

实验中，在左右手臂内侧标记试验区域，尺寸为3cm×3cm，同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔1cm。使用样品之前，测量每个测试区域的空白值，然后每个区域涂抹量为(2.0±0.l)(mg样品·cm²)^-1。皮肤含水量(MMV)、经皮水分散失(TEWL)以及皮肤弹性测试在涂抹后1、2和4h时分别进行测定，同一时段各测试点各测3个重复，计算平均值。同一个志愿者的测试必须由同一个测量人员完成，以减少误差。

皮肤含水量(MMV)使用Corneometer探头进行测定，测定结果以水合率表示。水合率公式为：水合率＝每测试区域每时段测量值平均值/每测试区域空白值平均值。

结果如下：涂抹4种样品后4h内MMV变化率如图21所示。与空白样品(未添加灵芝多糖)相比，灵芝多糖在0.5wt％到2.0wt％的添加量下MMV变化率明显升高，且变化率随时间延长而增大，表明在该浓度下灵芝多糖具有较好的保湿效果。

经皮水分散失(TEWL)使用Tewamter探头进行测定，测定结果以水散变化率表示。水散变化率公式为：

水散变化率＝每测试区域每时段测量值平均值/每测试区域空白值平均值。

结果如下：涂抹4种样品后4h内TEWL变化率如图22所示。与空白样品相比，含1.0％到2.0％的灵芝多糖的样品可降低TEWL变化率，且随时间的增长而降低，表明灵芝多糖具有一定的锁水效果。

皮肤弹性使用Cutometer探头进行测定，以毫米为单位。每一次测试时间为2s，其中0-1s为恒定负压，1-2s为取消负压，皮肤进行恢复。常用的参数有：回弹部分的弹性量(Ur)、有负压时弹性部分值(Ue)、有负压时最大拉伸量(Uf)、黏弹性部分值(Uv)等。年轻、弹性好的皮肤，Ue较高；年老，弹性差的皮肤，Ue比较低，Uv比较高；越是年轻，弹性好的皮肤，Ur的数值就越高。也有通过这些参数的比值进行皮肤弹性的研究：R2是Ue与Uf之比；R5是皮肤测试时第一次循环过程中Ur与Ue之比；R7是皮肤测试时第一次循环过程中Ur与Uf之比。这些比值代表皮肤形变后恢复到最初位置的能力，其优点是不受皮肤厚度的影响，其值越接近1表明弹性越好。以R2、R5和R7表征皮肤弹性具有代表性意义。

结果如下：4种样品对皮肤弹性的影响如图23所示。其中R2(图23A)、R5(图23B)、R7(图23C)三者比值越接近1，说明皮肤弹性越好。从图中可以看出，样品对R2影响不大，而与空白样品相比，R5及R7均随时间的增加而升高，且与添加量呈依赖性关系，说明灵芝多糖有一定的抗衰作用，可增加皮肤弹性，浓度2wt％条件下效果最佳。

实施例3、灵芝多糖对H₂O₂诱导的成纤维细胞氧化应激的保护及修复作用

一、灵芝多糖的制备

(1)将灵芝菌种接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基，28℃培养7d活化；

(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL葡萄糖马铃薯液体培养基，28℃、180rpm培养7d，得到灵芝菌液；

(3)将步骤(2)所得灵芝菌丝体水洗两遍，冻干得到灵芝菌丝体冻干粉；

(4)取1g样品粉末，以料液比1:35，浸提温度65℃，浸提时间1.5h的条件进行热水浸提，此时多糖的提取率为46.49％；

(5)对步骤(4)所得的多糖进行Sevage法脱蛋白6次；

(6)对步骤(5)所得的脱蛋白多糖进行DEAE-52离子交换树脂分离提纯、冻干成粉末，获得GLP甲及GLP甲I、GLP甲II。

二、灵芝多糖的抗氧化活性

1、检测灵芝多糖对成纤维细胞的抗氧化活性

人皮肤成纤维细胞(HSF细胞)购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

(1)取GLP甲、GLP甲I、GLP甲II，用细胞培养基DMEM稀释成浓度为1.25g·L^-1。

(2)用步骤(1)配制GLP甲、GLP甲I、GLP甲II的溶液刺激细胞24h，去除灵芝多糖样品后，PBS清洗两次，加入0.5ml 0.25％胰酶消化，离心收集细胞沉淀，加入1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA 1ml，37℃细胞培养箱内孵育20分钟，每3-5分钟颠倒一次。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。5000r/min离心5min弃上清得到细胞沉淀，加PBS制成细胞悬液，使细胞数为1x10⁶个/ml。点板，每个样品设置3个复孔，使用荧光酶标仪在488nm激发波长，525nm发射波长处测定。

实验结果见表8，探讨了保护与修复作用下(保护组为先加入H₂O₂刺激2h后，每孔加入100μL样品培养24h；修复组为先加入样品培养24h后，再以H₂O₂刺激2h)，GLP甲、GLP甲I、GLP甲II、VC(维生素C)对细胞活性氧含量(ROS)的作用。结果可知，与空白细胞(无H₂O₂处理，无样品添加，仅用培养基DMEM处理)相比，H₂O₂处理后(模型组，仅用H₂O₂处理细胞2h)能够显著提高细胞内ROS，灵芝多糖样品作用后ROS水平比模型组低，说明了其具有对H₂O₂诱导的成纤维细胞氧化应激的保护及修复作用，总体上来看，GLP甲、GLP甲I、GLP甲II均能显著降低HSF细胞内ROS的含量。

实施例4、灵芝多糖对H₂O₂诱导的成纤维细胞氧化应激的保护及修复作用

一、灵芝多糖的制备

(1)将灵芝菌种接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基，28℃培养7d活化；

(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL葡萄糖马铃薯液体培养基，28℃、200rpm培养6d，得到灵芝菌液；

(3)将步骤(2)所得灵芝菌丝体水洗两遍，冻干得到灵芝菌丝体冻干粉；

(4)取1g样品粉末，以料液比1:30，浸提温度60℃，浸提时间2h的条件进行热水浸提，此时多糖的提取率为43.90％；

(5)对步骤(4)所得的多糖进行Sevage法脱蛋白6次；

(6)对步骤(5)所得的脱蛋白多糖进行DEAE-52离子交换树脂分离提纯、冻干成粉末。获得GLP乙、GLP乙I、GLP乙II；

二、灵芝多糖的抗氧化活性

1、检测灵芝多糖对成纤维细胞的抗氧化活性

按照实施例3的检测方法，将GLP甲、GLP甲I、GLP甲II替换为GLP乙、GLP乙I、GLP乙II，其它步骤均不变。

实验结果见表8，结果表明，GLP乙、GLP乙I、GLP乙II能够显著降低H₂O₂诱导的成纤维细胞内活性氧水平。

实施例5、灵芝多糖对H₂O₂诱导的成纤维细胞氧化应激的保护及修复作用

一、灵芝多糖的制备

(1)将灵芝菌种接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基，28℃培养7d活化；

(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL葡萄糖马铃薯液体培养基，28℃、200rpm培养6d，得到灵芝菌液；

(3)将步骤(2)所得灵芝菌丝体水洗两遍，冻干得到灵芝菌丝体冻干粉；

(4)取1g样品粉末，以料液比1:30，浸提温度66℃，浸提时间2h的条件进行热水浸提，此时多糖的提取率为45.88％；

(5)对步骤(4)所得的多糖进行Sevage法脱蛋白6次；

(6)对步骤(5)所得的脱蛋白多糖进行DEAE-52离子交换树脂分离提纯、冻干成粉末，获得GLP丙、GLP丙I、GLP丙II。

二、灵芝多糖丙的抗氧化活性

1、检测灵芝多糖对成纤维细胞的抗氧化活性

按照实施例3的检测方法，将GLP甲、GLP甲I、GLP甲II替换为GLP丙、GLP丙I、GLP丙II，其它步骤均不变。

实验结果见表8，结果表明，GLP丙、GLP丙I、GLP丙II能够显著降低H₂O₂诱导的成纤维细胞内活性氧水平。

表8 GLP、GLP I、GLPⅡ对细胞内ROS水平的影响

表8结果表明，灵芝多糖甲具有良好的细胞抗氧化活性。

实施例6、灵芝多糖膏霜对人体皮肤纹理的改善

利用灵芝菌1～6号提取灵芝粗多糖制备灵芝多糖膏霜1～6号，各灵芝多糖添加量均固定为2.0wt％，配方见表5。0号为空白对照。选取志愿者10名，在使用膏霜之前采集左侧胳膊内侧本底数据，然后以每天早晚两次的频率涂抹各类膏霜于左侧胳膊内侧不同位置，持续28天。涂抹周期结束后，采集皮肤数据，对其皮肤纹理进行拍照分析。其中一名志愿者的结果见图24，由图中可以看出1号样品明显改善了皮肤纹理，其他志愿者的数据也显示了大致相同的效果。

CCCCTTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGACCGGGTTGTAGCTGGCCTTCTGAGGCATGTGCACGCCCTGTTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTGCGAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTGCGGAGCATATCTGTGCCTGCGTTTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCGATGTAACACATCTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACAAGCTTTTGTGGTTTGTAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCCGTTATCGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTCTCGGTGTGATAATGTCTACGCCGTGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCTTATAAGACAGCTTTATGACCTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCCGGAGGAAA

Claims (8)

1.一种灵芝新菌种，所述灵芝新菌种为灵芝Ganoderma lucidum菌株wG055，保藏编号为CGMCC No.17789。

2.一种从权利要求1所述灵芝新菌种培养得到的灵芝菌丝体中提取灵芝多糖的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)灵芝菌液的制备：将保藏编号为CGMCC No.17789的灵芝菌种接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，然后将得到的单菌落接种至葡萄糖马铃薯液体培养基培养得到灵芝菌液；

2)热水浸提法提取灵芝多糖：从灵芝菌液中分离出灵芝菌丝体，将所得灵芝菌丝体水洗两遍，冻干得到灵芝菌丝体冻干粉，采用热水浸提法提取灵芝菌丝体冻干粉中的灵芝总多糖；

3)Sevage法除杂蛋白：将步骤2)所得灵芝总多糖加水配成粗多糖溶液，再将粗多糖溶液加入Sevage试剂中，分液提纯得到灵芝多糖。

3.根据权利要求2所述的从灵芝新菌种培养得到的灵芝菌丝体中提取灵芝多糖的方法，其特征在于，步骤1)灵芝菌种接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化的温度为23～28℃，活化的时间为3～7d。

4.根据权利要求2所述的从灵芝新菌种培养得到的灵芝菌丝体中提取灵芝多糖的方法，其特征在于，步骤2)热水浸提法工艺条件为：以水为提取剂，料液比为1g/35mL，在65℃下浸提1.5h，浸提次数为1次。

5.根据权利要求2所述的从灵芝新菌种培养得到的灵芝菌丝体中提取灵芝多糖的方法，其特征在于，步骤3)所述粗多糖溶液浓度为10g·L^-1，所述Sevage试剂为氯仿与正丁醇按体积比氯仿：正丁醇＝5：1的混合液，粗多糖溶液与Sevage试剂体积比为1：3～5。

6.一种根据权利要求2-5任一所述方法得到的灵芝多糖，其特征在于，其中灵芝粗多糖纯度为85～95wt％。

7.一种含有权利要求6所述灵芝多糖的化妆品。

8.根据权利要求7所述的含灵芝多糖的化妆品，其特征在于，所述化妆品成分中灵芝多糖的质量百分含量为0.5～2％。

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