CN116218694B - 扣囊覆膜孢酵母、具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液 - Google Patents

扣囊覆膜孢酵母、具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种扣囊覆膜孢酵母、具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其应用，本发明通过筛选分离得到一种扣囊覆膜孢酵母，相较于现有已公开的覆膜孢酵母菌，由本发明所述扣囊覆膜孢酵母发酵制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有更优的紧致嫩肤、提亮光泽以及修护等功效；本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，制备工艺简单，可实现工业化生产。

Description

扣囊覆膜孢酵母、具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳 糖酵母样菌发酵产物滤液
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种扣囊覆膜孢酵母、具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其应用。
背景技术
半乳糖酵母样菌发酵产物滤液是国家药监局公布的《已使用化妆品原料目录(2021年版)》中新增的一款使用原料，其INCI名为GALACTOMYCES FERMENT FILTRATE，该原料由酵母菌发酵得到。半乳糖酵母样菌发酵产物滤液是国际一线品牌SK-II的爆款产品“神仙水”独家原料和核心功效成分，其原料名称为Pitera。众多研究者对Pitera研究发现，其通过一种名为覆膜孢酵母属的特殊酵母在发酵过程中产生的半乳糖酵母样菌发酵产物，含有皮肤不可缺少的游离氨基酸、矿物质、有机酸、无机酸等，具有多种功效，如美白、补水、抗衰等。
目前，人们对半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法进行深入研究，希望能制备出如Pitera功效一样好的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，如专利申请文件CN115161207A、CN115125153A；然而，现在技术中的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液制备工艺复杂，得到的产品功效仍较差，无法满足消费者的需求。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种扣囊覆膜孢酵母、具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其应用。由本发明所述扣囊覆膜孢酵母发酵制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有优异的紧致嫩肤、提亮光泽以及屏障修护等功效，在化妆品领域具有极大的应用前景。
第一方面，本发明提供一种扣囊覆膜孢酵母，所述扣囊覆膜孢酵母于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 20221857，保藏日期为2022年12月05日，保藏单位地址为中国武汉。
本发明通过在自主分离的菌种中偶然发现，由本发明分离得到的扣囊覆膜孢酵母制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液安全无刺激、制备工艺简单，可实现工业化生产，且由本发明扣囊覆膜孢酵母发酵制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有更优的紧致嫩肤、提亮光泽以及修护等功效。
第二方面，本发明请求保护一种具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，该半乳糖酵母样菌发酵产物滤液由本发明所述扣囊覆膜孢酵母发酵制得。
经试验发现，由本发明筛选分离得到的扣囊覆膜孢酵母经发酵制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，相较于现有已公开的酵母菌，表现出更优的紧致嫩肤、提亮光泽以及修护等效果。
第三方面，本发明提供一种具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，包括如下步骤：
将上述扣囊覆膜孢酵母接种于发酵培养基中，于25～33℃发酵35～60h制得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
优选地，上述发酵培养基包括带壳高粱粉0.1～1.5wt％、玉米淀粉0.5～2wt％、小麦淀粉0.5～2wt％、乳糖0.1～0.5wt％和余量水。
进一步优选地，所述发酵培养基包括带壳高粱粉0.4～0.8wt％、玉米淀粉0.8～1.2wt％、小麦淀粉0.8～1.2wt％、乳糖0.1～0.5wt％和余量水。
最优选地，所述发酵培养基包括带壳高粱粉0.6wt％、玉米淀粉1wt％、小麦淀粉1wt％、乳糖0.3wt％和余量水。
经试验发现，发酵培养基成分组成会影响扣囊覆膜孢酵母的生长过程，进而影响半乳糖酵母样菌发酵产物滤液中活性物质的含量，影响其紧致嫩肤、提亮及屏障修护功效，当发酵培养基中带壳高粱粉、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖的含量在上述范围时，扣囊覆膜孢酵母生长良好，有利于其产生更多的活性物质，使得发酵产生的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有更优的提亮光泽、紧致嫩肤和修护的功效。
优选地，上述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将上述扣囊覆膜孢酵母接种于所述发酵培养基中，于25～33℃、培养35～60h得到一级种子液；
(2)将上述一级种子液接种于所述发酵培养基中，于25～33℃、培养30～60h得到二级种子液；
(3)取上述二级种子液接种于所述发酵培养基中，于25～33℃、培养30～60h得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
优选地，步骤(1)中扣囊覆膜孢酵母接种于所述发酵培养基中的接种比例关系为：每0.03～3L发酵培养基接种一环扣囊覆膜孢酵母。
优选地，所述一级种子液、所述二级种子液于发酵培养基中的接种量均为0.5％～3％。
优选地，所述步骤(2)和步骤(3)于发酵过程中通入无菌空气；所述步骤(2)中无菌空气的通入流速为30～60dm3/(h·L)；所述步骤(3)中无菌空气的通入流速为8～12dm3/(h·L)。
进一步优选地，所述步骤(2)中无菌空气的通入流速为50dm3/(h·L)；所述步骤(3)中无菌空气的通入流速为10dm3/(h·L)。
本发明扣囊覆膜孢酵母需要在有氧的条件下发酵，发酵过程中无菌空气的接入量影响了发酵培养基的溶氧量，进而影响了菌种的发酵进程。通常地，无菌空气的接入量越大，扣囊覆膜孢酵母的生长越快，但扣囊覆膜孢酵母生长过快时，其不能很好地利用发酵培养基中的物质，分泌的活性物质较少，且扣囊覆膜孢酵母容易过早地进入凋亡期；无菌空气的接入量越小扣囊覆膜孢酵母的生长越慢，发酵的过程延长，不利于工业生产以及成本的控制。
经试验发现，在发酵过程中控制无菌空气的通入流速为上述范围时，使得扣囊覆膜孢酵母生长速度适宜，更为充分地利用发酵培养基中的物质，使得发酵产生的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有更优的提亮光泽、紧致嫩肤和修护的功效，且有利于成本控制。
优选地，上述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法还包括将半乳糖酵母样菌发酵产物滤液精制纯化步骤：
将步骤(3)所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液加热至80～110℃，保温20～40min，趁热过滤收集滤液，将滤液静置5～9天后进行二次过滤，所得二次滤液即为精制的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
优选地，将步骤(3)所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液加热至90℃，保温20min，趁热过滤收集滤液，将滤液静置7天后进行二次过滤，所得二次滤液即为精制的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
优选地，所述过滤为硅藻土过滤机过滤。
精制纯化半乳糖酵母样菌发酵产物滤液实质为对步骤(3)制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液进行灭菌处理和过滤处理；灭菌处理是为了让半乳糖酵母样菌发酵产物滤液符合出厂规格以及保证半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的质量，菌种过度发酵会消耗产品中的活性物；灭菌方法为常规的巴氏灭菌法；过滤处理的目的是为了去除半乳糖酵母样菌发酵产物滤液中的杂质，提高半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的储存稳定性及保证使用效果。
优选地，步骤(1)的发酵温度为28℃，发酵时间为48h；步骤(2)的发酵温度为28℃，发酵时间为24h；步骤(3)的发酵温度为28℃，发酵时间为40h。
优选地，所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)的发酵过程中均于搅拌状态下进行，所述步骤(1)中的搅拌转速为30～70rpm；所述步骤(2)中的搅拌转速为30～70rpm；所述步骤(3)中的搅拌转速为12～40rpm。
进一步优选地，所述步骤(1)中的搅拌转速为50rpm；所述步骤(2)中的搅拌转速为50rpm；所述步骤(3)中的搅拌转速为20rpm。
第四方面，本发明提供上述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在制备化妆品、保健品以及食品中的应用。
第五方面，本发明提供一种化妆品，所述化妆品包括上述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
优选地，在所述化妆品中，所述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液于化妆品中的添加量为0.1wt％～100wt％。
进一步优选地，所述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液于化妆品中的添加量为5wt％～10wt％。
优选地，所述化妆品具有提亮、紧致嫩肤、修护功效。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明通过筛选分离得到一种扣囊覆膜孢酵母，与现有已公开的覆膜孢酵母菌相比，本发明所述扣囊覆膜孢酵母发酵制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有更优的紧致嫩肤、提亮光泽以及修护等功效。
(2)本发明通过筛选适于本发明所述扣囊覆膜孢酵母发酵的发酵培养基，通过调整其组分配比，使得本发明发酵培养基更有利于扣囊覆膜孢酵母获得适宜的生长速度，有利于其发酵产生更多的活性物质，并使得发酵产生的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有更优的提亮光泽、紧致嫩肤和修护的功效。
(3)由本发明提供的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，制备工艺简单，可实现工业化生产，且本发明制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有更优的紧致嫩肤、提亮光泽以及修护等功效。
附图说明
图1为分离得到扣囊覆膜孢酵母的菌落形态图；
图2为显微镜下扣囊覆膜孢酵母的染色图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所提及的百分比，如无特殊说明，均为质量百分比。
本发明中提及的无菌空气的接入量的单位为dm3/(h·L)，其中，dm3是指通入的无菌空气的量，h是指小时，L是指发酵培养基的体积。如本发明提及的无菌空气的接入量为50dm3/(h·L)，即指每一升发酵发酵培养基中，每小时通入的无菌空气的量为50dm3。
实施例1扣囊覆膜孢酵母的分离和鉴定
1、扣囊覆膜孢酵母的分离
本发明利用马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)分离白酒酒糟的微生物。其中，白酒酒糟为贵州省遵义市仁怀市茅台镇的酱香酒糟。具体的分离步骤为：将2μL浓度为1wt％酒糟水溶液涂布于马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)中，在28℃下培养2天，得到具有典型酵母菌菌群特征的菌落。通过接种环划线纯化2-3代，将分离纯化得到的酵母菌接种于马铃薯葡萄糖培养基中，置于4℃保藏。
其中，马铃薯葡萄糖培养基的组成如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、去氧胆酸钠0.5g/L、氯霉素0.1g/L、琼脂15g/L。
2、扣囊覆膜孢酵母的鉴定
(1)菌落形态
菌株分离纯化后，在马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)中形成单菌落，其形态如图1所示。菌落形态几乎一致，呈圆形，白色，且菌落表面具有褶皱。
(2)生理学特性
分离纯化的菌株在25-33℃的环境下均能生长。菌株的染色结果如图2所示。
(3)分子生物学鉴定
通过对菌种样品进行DNA提取，使用ITS通用引物进行扩增测序，利用测序结果在NCBI数据库中进行比对，从而对样品进行初步鉴定。
真菌的ITS序列(内部转录间隔区，internal transcribed spacer of RNA Pol1，ITS)在不同的物种间是高度保守的，不同的物种间序列是不一样的，因而对此序列通过PCR扩增、测序，与GenBank中的已知序列进行比对后，则可判定真菌种类，将其划分到属或种。
3.1DNA提取
将旋转柱置于收集管中，加入250μL缓冲溶液BL，12000rpm离心1min活化硅胶膜；取样本干燥组织(不大于20mg)，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μL缓冲溶液gP1，涡旋振荡1min，65℃水浴10～30min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；加入150μL缓冲溶液gP2，涡旋振荡1min，冰浴5min，随后在12000rpm下离心5min，将上清转移至新的离心管中；加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入旋转柱中，12000rpm离心30s，弃废液；向旋转柱中加入500μL缓冲溶液Pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；向旋转柱中加入500μL冲洗的缓冲溶液(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm下离心30s，弃废液，并将旋转柱放回收集管中，12000rpm下离心2min，开盖晾干1min；取出旋转柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μL TE缓冲溶液(65℃预热TE缓冲溶液)，20～25℃放置2min，12000rpm下离心2min，提取得到DNA。
3.2PCR扩增
表1真菌菌种鉴定通用引物
提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板，以擎科1×TSE101金牌mix进行扩增，扩增体系各组分如表2：。
表2
1×TSE101金牌mix 45μl
ITS1(10P) 2μl
ITS4(10P) 2μl
DNA模板 1μl
表2中的扩增体系按表3中的扩增程序进行扩增：
表3
将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μl样品+6μl溴酚蓝)，300V电压下12分钟。将扩增好PCR产物进行一代测序。
3.3测序结果：将扩增好的PCR进行一代测序，用ContigExpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分，将拼接好的序列在NCBI数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对，对比结果如下表4所示：
表4
根据菌株的菌落形态、生理学特性、基因序列等实验数据综合分析，该菌株鉴定为扣囊覆膜孢酵母，命名为扣囊覆膜孢酵母DGJW-22(Saccharomycopsis fibuligera DGJW-22)；本发明分离得到的扣囊覆膜孢酵母其于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M 20221857，保藏日期为2022年12月05日，保藏单位地址为中国武汉。
实施例2具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
本实施例提供一种具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，包括如下步骤：
1、发酵培养基的制备
将带壳高粱粉、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖均匀分散于水中，配制成含有带壳高粱粉0.6wt％、玉米淀粉1wt％、小麦淀粉1wt％、乳糖0.3wt％的培养基，于115℃下灭菌20min，降温至28℃备用，用于种子液培养及发酵。
2、一级种子液的制备
用接种环取一环保藏编号为CCTCC NO：M 20221857的扣囊覆膜孢酵母接种于50mL的上述发酵培养基中，设置发酵摇瓶的转速为50rpm，于28℃下培养48小时，得到一级种子液。
3、二级种子液的制备
取2L发酵培养基加入至已消毒处理的发酵罐中，加入20mL一级种子液(即一级种子液的接种量为1％)，设置搅拌桨的转速为50rpm，通入0.1m3/h的无菌空气(即无菌空气的接入量为50dm3/(h·L))，于28℃下培养24小时，得到二级种子液。
4、半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
取3L二级种子液接种至300L的发酵培养基中(即二级种子液的接种量为1％)，设置搅拌桨的转速为20rpm，通入3m3/h的无菌空气(即无菌空气的接入量为10dm3/(h·L))，于28℃下培养40小时，得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
5、半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的精制
将半乳糖酵母样菌发酵产物滤液升温至90℃，保温30min，保温结束后趁热将半乳糖酵母样菌发酵产物滤液过硅藻土过滤机过滤，将滤液静置7天后，再将静置后的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液过硅藻土过滤机过滤，得到精制半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
实施例3
本实施例提供一种具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，与实施例2的区别仅在于步骤1中发酵培养基的组成不同，本实施例所用发酵培养基的组分含量如表5所示。
实施例4
本实施例提供一种具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，与实施例2的区别仅在于步骤1中发酵培养基的组成不同，本实施例所用发酵培养基的组分含量如表5所示。
对比例1
本对比例提供一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，与实施例2的区别仅在于步骤1中发酵培养基的组成不同，本对比例所用发酵培养基的组分含量如表5所示。
对比例2
本对比例提供一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，与实施例2的区别仅在于步骤1中发酵培养基的组成不同，本对比例所用发酵培养基的组分含量如表5所示。
对比例3
本对比例提供一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，与实施例2的区别仅在于步骤1中发酵培养基的组成不同，本对比例所用发酵培养基的组分含量如表5所示。
对比例4
本对比例提供一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，与实施例2的区别仅在于步骤1中发酵培养基的组成不同，本对比例所用发酵培养基的组分含量如表5所示。
表5
组份(wt％) 带壳高粱 玉米淀粉 小麦淀粉 乳糖
实施例2 0.6 1 1 0.3
实施例3 0.4 0.8 1.2 0.5
实施例4 0.8 1.2 0.8 0.1
对比例1 0 1 1 0.3
对比例2 0.6 0 1 0.3
对比例3 0.6 1 1 0.05
对比例4 0.6 1 1 0.6
对比例5
本对比例与实施例2的区别仅在于，本对比例将实施例1中保藏编号为CCTCC NO：M20221857的扣囊覆膜孢酵母更换为编号BNCC189428的覆膜孢酵母菌(购于北京北纳创联生物技术研究院)，参照实施例2所述方法制备得到精制半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例6
本对比例为参照专利申请号为CN202211047185.2的专利文件中实施例1记载的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的方法，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
测试例1紧致抗皱-人体功效测试
在使用本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(5wt％的水溶液)后，对皮肤的皮肤弹性进行测试。
测试样品如下：
实施例2～4以及对比例1～6所述方法制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(均配制成5wt％的水溶液)、SK-II护肤精华露(即神仙水，市购，未稀释)、去离子水(作为空白对照组)。
测试所用仪器：皮肤弹性测试仪(MPA 580，Courage and Khazaka，德国)。
受试者选择：年龄18～45岁健康志愿者220人(每20个志愿者使用一个样品)。
测试步骤：清洁志愿者面部区域。受试者取1～2mL样品随机涂抹在半脸区域，另一半脸区域作为空白对照组，涂抹去离子水。每天使用2次，早、晚各一次。在使用样品前、使用样品10天、20天后用皮肤弹性测试仪进行测试面部的紧致度值、弹性值，测试结果取平均值，皮肤紧致度改善率以及皮肤弹性改善率计算公式如下：
皮肤紧致度R0改善率(％)＝(使用后的皮肤紧致度R0平均值-使用前的皮肤紧致度R0平均值)/使用前的皮肤紧致度R0平均值×100％
皮肤弹性R2改善率(％)＝(使用后的皮肤弹性R2平均值-使用前的皮肤弹性R2平均值)/使用前的皮肤弹性R2平均值×100％。
表6
测试结果如表6所示，结果表明，本发明实施例2～4制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有很好的紧致抗皱效果，且含5wt％实施例2的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液水溶液的效果与SK-II精华露效果相当。其中，实施例2～4半乳糖酵母样菌发酵产物滤液优于对比例5的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，表明采用本发明分离的扣囊覆膜孢酵母制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液紧致抗皱的效果更好。实施例2～4半乳糖酵母样菌发酵产物滤液紧致抗皱的效果优于对比例1～4，说明发酵培养基中带壳高粱、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖的加入量影响扣囊覆膜孢酵母的生长，进而影响半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致抗皱效果。另外，本发明发酵培养基中带壳高粱、玉米淀粉、小麦淀粉、乳糖存在协同作用，缺少其中一组份如带壳高粱、玉米淀粉等，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致抗皱效果下降明显。在本发明发酵培养基中，带壳高粱粉、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖的加入量优选为0.1～1.5wt％、0.5～2wt％、0.5～2wt％、0.1～0.5wt％，更优选为0.4～0.8wt％带壳高粱粉、0.8～1.2wt％玉米淀粉、0.8～1.2wt％小麦淀粉和0.1～0.5wt％乳糖，最优选为0.6wt％带壳高粱粉、1wt％玉米淀粉、1wt％小麦淀粉和0.3wt％乳糖。
测试例2屏障修护测试
在使用本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(5wt％的水溶液)后，对皮肤的经皮水分流失值TEWL进行测试。
皮肤的经皮水分流失值越大，表明在单位时间、单位面积内皮肤散失的水分越多，皮肤的屏障越差。在使用样品后，皮肤的经皮水分流失值变小，则表明皮肤散失的水分越少，皮肤的锁水能力越强，皮肤屏障得到修护。
测试样品：实施例2～4、对比例1～6的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液均配制成5wt％的水溶液用于测试、SK-II护肤精华露(即神仙水，市购)、去离子水(作为空白对照组)。
测试所用仪器：皮肤水分流失测试探头Tewameter TM300(Courage&Khazaka，德国)。
受试者选择：年龄18～45岁、皮肤屏障较脆弱(皮肤经皮水分流失值在12g/m2h)的志愿者220人(每20个志愿者使用一个样品)。
测试步骤：清洁志愿者面部区域。受试者取1～2mL样品随机涂抹在半脸区域，另一半脸区域作为空白对照组，涂抹去离子水。每天使用2次，早、晚各一次。在使用样品前、使用样品10天、20天后，采用皮肤水分流失测试探头进行测试皮肤经皮水分流失值，测试结果取平均值，并按照如下公式计算皮肤经皮水分流失值变化率。
皮肤经皮水分流失值变化率(％)＝(使用后的皮肤经皮水分流失值-使用前的皮肤经皮水分流失值)/使用前的皮肤经皮水分流失值×100％。
皮肤经皮水分流失值变化率的数值越大，则说明样品的皮肤屏障修护能力越强。
表7
测试结果如表7所示，表明本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液均具有屏障修护效果。其中，5wt％实施例2的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液水溶液的屏障修护效果优于SK-II精华露。
实施例2～4的屏障修护效果优于对比例5，说明采用本发明分离的扣囊覆膜孢酵母制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的屏障修护效果更好。
实施例2～4的屏障修护效果优于对比例1～4，说明说明发酵培养基中带壳高粱、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖的加入量影响扣囊覆膜孢酵母的生长，进而影响半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的屏障修护效果。本发明发酵培养基中带壳高粱、玉米淀粉、小麦淀粉、乳糖存在协同作用，缺少其中一组份如带壳高粱、玉米淀粉等，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的屏障修护效果下降明显。在本发明中，带壳高粱粉、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖的加入量优选为0.1～1.5wt％、0.5～2wt％、0.5～2wt％、0.1～0.5wt％，最优选为0.6wt％带壳高粱粉、1wt％玉米淀粉、1wt％小麦淀粉和0.3wt％乳糖。
测试例3皮肤光泽度测试
在使用本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(5wt％的水溶液)后，对皮肤的光泽度进行测试。
测试样品：实施例2～4、对比例1～6的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液均配制成5wt％的水溶液用于测试、SK-II护肤精华露(即神仙水，市购)、去离子水(作为空白对照组)。
测试所用仪器：皮肤光泽度测试仪Glossymeter(GL200，Courage and Khazaka，德国)。
受试者选择：年龄18-45岁健康志愿者220人(每20个志愿者使用一个样品)。
测试步骤：清洁志愿者面部区域。受试者取1～2mL样品随机涂抹在半脸区域，另一半脸区域作为空白对照组，涂抹去离子水。每天使用2次，早、晚各一次。在使用样品前、使用样品10天、20天后，通过活性表面分析软件SELS测试受试者标记部位的皮肤光泽度，结果取平均值，并依据如下公式计算皮肤光泽度改善率。
皮肤光泽度改善率(％)＝(使用后的平均值-使用前的平均值)/使用前的平均值×100％。
需要说明的是，皮肤光泽度越大，说明皮肤光泽越好。
各样品使用前、使用10天后和20天后，皮肤光泽度改善率见下表8所示。
表8
皮肤光泽度改善率(％) 使用10天后 使用20天后
空白对照 0.46 -0.27
SK-II精华露 23.5 39.4
实施例2 22.8 39.7
实施例3 22.0 37.2
实施例4 21.6 38.1
对比例1 12.7 18.5
对比例2 14.2 19.8
对比例3 16.4 27.5
对比例4 18.2 29.4
对比例5 14.2 20.3
对比例6 15.8 22.7
测试结果如表8所示，结果表明，本发明实施例2-4制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有很好的提升皮肤光泽度的效果，且5wt％的实施例2的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液水溶液的效果与SK-II精华露效果基本相同。
其中，实施例2-4半乳糖酵母样菌发酵产物滤液优于对比例5的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，说明本发明采用本发明分离的扣囊覆膜孢酵母制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液提亮皮肤的效果更好。
实施例2～4半乳糖酵母样菌发酵产物滤液提亮皮肤的效果优于对比例1～4，说明发酵培养基中带壳高粱、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖的加入量影响扣囊覆膜孢酵母的生长，进而影响半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的提亮皮肤的效果。本发明发酵培养基中带壳高粱、玉米淀粉、小麦淀粉、乳糖存在协同作用，缺少其中一组份如带壳高粱、玉米淀粉等，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的提亮皮肤光泽的效果下降明显。此外，在本发明中，带壳高粱粉、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖的加入量优选为0.1～1.5wt％、0.5～2wt％、0.5～2wt％、0.1～0.5wt％，最优选为0.6wt％带壳高粱粉、1wt％玉米淀粉、1wt％小麦淀粉和0.3wt％乳糖。
测试例4、人体使用评价
测试样品：实施例2～4以及对比例1～6所述方法制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(均配制成5wt％的水溶液)、SK-II护肤精华露(即神仙水，市购，不稀释)、去离子水(作为空白对照组)。
受试者选择：年龄18-45岁健康志愿者220人(每20个志愿者使用一个样品)。
测试步骤：受试者按习惯用量取出产品，均匀涂抹于面部肌肤，连续使用产品20天，每天使用产品2次。在样品使用前、使用20天后受试者对样品的使用感及效果进行程度评价。
表9
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如表9所示，本发明实施例，本发明实施例2～4制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有很好的保湿效果、嫩肤效果、提亮光泽效果、紧致效果和修护效果。说明采用本发明的扣囊覆膜孢酵母制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液可以实现多重护肤功效。其中，在有感觉和有一点感觉的评价中，实施例2～4制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果、嫩肤效果、提亮光泽效果、紧致效果和修护效果对应的人数占比大于对比例5，说明实施例2～4半乳糖酵母样菌发酵产物滤液优于对比例5的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液；实施例2～4半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果、嫩肤效果、提亮光泽效果、紧致效果和修护效果对应的人数占比大于对比例1～4，说明发酵培养基中带壳高粱、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖的加入量影响扣囊覆膜孢酵母的生长，进而影响半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的护肤效果。另外，本发明发酵培养基中带壳高粱、玉米淀粉、小麦淀粉、乳糖存在协同作用，缺少其中一组份如带壳高粱、玉米淀粉等，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的护肤效果下降明显。在本发明发酵培养基中，带壳高粱粉、玉米淀粉、小麦淀粉和乳糖的加入量优选为0.1～1.5wt％、0.5～2wt％、0.5～2wt％、0.1～0.5wt％，更优选为0.4～0.8wt％带壳高粱粉、0.8～1.2wt％玉米淀粉、0.8～1.2wt％小麦淀粉和0.1～0.5wt％乳糖，最优选为0.6wt％带壳高粱粉、1wt％玉米淀粉、1wt％小麦淀粉和0.3wt％乳糖。
测试例5、多次皮肤刺激
本申请中的多次皮肤刺激性测试的具体方法参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)中的标准进行试验，具体方法如下：
准备满足试验条件的白色家兔12只(每一样品使用4只白色家兔)，于试验前将家兔背部脊椎两侧的被毛剪掉(去毛范围各为3cm×3cm)。
取受试物(实施例2～4的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液)0.5mL涂抹在一侧皮肤上(涂抹面积为2.5cm×2.5cm)，另一侧不作处理作为对照。每天涂抹一次，连续涂抹14天。从第二天开始，每次涂抹前剪毛。用纯水清除残留受试物。1h后观察结果。
按《化妆品安全技术规范》(2015年版)的皮肤刺性/腐蚀性试验中的表1进行评分，对照区和试验区同样处理。
结果评价：按下列公式计算每天家兔每只家兔平均积分，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)的皮肤刺激性/腐蚀性试验中的表2判定家兔皮肤刺激强度。试验中观察皮肤是否有皮肤刺激性以外的其他症状。
每天每只动物平均积分＝(∑红斑和水肿积分/受试动物数)/14
表10
样品 每天每只动物积分均值 结果
对照组 0 无皮肤刺激性
实施例2 0 无皮肤刺激性
实施例3 0 无皮肤刺激性
实施例4 0 无皮肤刺激性
测试结果如表10所示，测试结果表明，本发明实施例的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液对皮肤不具有刺激性，使用安全。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种扣囊覆膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)DGJW-22，其特征在于，所述扣囊覆膜孢酵母其于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 20221857。
2.一种具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，其特征在于，所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液由权利要求1所述的扣囊覆膜孢酵母置于发酵培养基发酵制得；
所述发酵培养基包括带壳高粱粉0.1～1.5wt％、玉米淀粉0.5～2wt％、小麦淀粉0.5～2wt％、乳糖0.1～0.5wt％和余量水。
3.一种如权利要求2所述的具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将所述扣囊覆膜孢酵母接种于所述发酵培养基中，于25～33℃、培养35～60h得到一级种子液；
(2)将所述一级种子液接种于所述发酵培养基中，于25～33℃、培养30～60h得到二级种子液；
(3)取所述二级种子液接种于所述发酵培养基中，于25～33℃、培养30～60h得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液；
所述发酵培养基包括带壳高粱粉0.1～1.5wt％、玉米淀粉0.5～2wt％、小麦淀粉0.5～2wt％、乳糖0.1～0.5wt％和余量水。
4.如权利要求3所述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述一级种子液、所述二级种子液于所述发酵培养基中的接种量均为0.5％～3％；
所述步骤(2)和步骤(3)于发酵过程中通入无菌空气；所述步骤(2)中无菌空气的通入流速为30～60dm3/(h·L)；所述步骤(3)中无菌空气的通入流速为8～12dm3/(h·L)。
5.如权利要求3所述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述方法还包括将半乳糖酵母样菌发酵产物滤液精制纯化步骤：
将步骤(3)所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液加热至80～110℃，保温20～40min，趁热过滤收集滤液，将所述滤液静置5～9天后进行二次过滤，所得二次滤液即为精制的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
6.权利要求2所述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在制备化妆品中的应用。
7.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品包括权利要求2所述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
8.如权利要求7所述化妆品，其特征在于，所述具有紧致嫩肤、提亮光泽和修护功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液于所述化妆品中的添加量为0.1wt％～100wt％。
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