CN113288843A - 大米灵芝菌复合发酵物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，包括：将灵芝菌接种至由大米、薰衣草、银耳、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理。本公开的方案通过选取适合的灵芝菌菌种对大米、银耳、薰衣草进行复合液体发酵，制得了一种新型的大米灵芝菌复合发酵原浆，具有良好的保湿、美白效果，可以用作美白保湿化妆品的优良原料或者直接用作化妆品。

Description

大米灵芝菌复合发酵物及其制备方法和应用

技术领域

本公开涉及发酵技术领域，尤其涉及一种大米灵芝菌复合发酵物及其制备方法和应用。

背景技术

大米是稻谷经清理、砻谷、碾米和成品整理等工序后制成的成品，大米含有稻米中近64％的营养物质和90％以上的人体所需的营养元素，同时是中国大部分地区人民的主要食品。大米还具有护肤用途功效，以大米提取液作为主要成分(其富含y-谷维素、稻糠甾醇和原花青素等成分)，有性质温和安全，具有较强的润白功效，并可补充肌肤所缺失水分，使肌肤光滑细腻，充满弹性功效。随着稻米栽培业迅速发展及应用范围拓宽，对大米营养成分及在医疗保健作用方面研究也逐步深入。

薰衣草(Lavandula angustifolia Mill.)，属双子叶植物纲、唇形科、薰衣草属的一种小灌木。主要以干品或精油形式应用于临床和化妆品行业，全草含挥发油1％-3％，薰衣草精油是许多不同类型的芳香族化合物组成的复杂混合物，共三十多种成分，主要成分包括芳樟醇、乙酸芳樟酯、桉树脑、B-罗勤烯(包括顺式和反式)对、乙酸薰衣草酯、薰衣草醇、萜-4-醇和樟脑等等；薰衣草油是一种重要的香原料，广泛应用于化妆品香精的调配，也可用作抗菌剂和驱虫剂；可促进套膜蛋白、紧密连接蛋白等的形成，提高皮肤的屏障功能，结合其抗氧化性，可用作抗衰剂；薰衣草提取物也可用作抗炎剂和保湿剂。

银耳(Tremella fuciformis)是担子菌门、银耳纲、银耳目、银耳科、银耳属真菌的子实体。银耳是传统的食用菌，其中所含有的活性成分银耳多糖具有特殊的保健功能。除了保健功能外，银耳多糖具有卓越的保湿锁水能力，良好的润滑性和成膜性，还具有一定的清除羟基自由基的能力，因而也常用于护肤品。现代的护肤品一般从银耳提取银耳甘露聚糖作为一种多糖类的成分添加，其作用为给予膏霜等丝锻般顺滑的独特质地，起到保湿的护肤功效。

灵芝(Ganoderma Lucidum Karst)是一种多孔菌科真菌，灵芝含有灵芝多糖、三萜类化合物、核苷、甾醇、生物碱、氨基酸、微量元素等多种化学成分，具有抗肿瘤、保肝、调节免疫、抗衰老等生物活性，因此其具有突出保健价值，还是一种能抗皱、消炎、养颜的美容佳品。特别是灵芝的有效成分灵芝多糖能够有效抑制自由基的形成，抗氧化、抗衰老，还能增加皮肤原有胶原蛋白，有效促进透明质酸的形成，让肌肤保持水嫩润华，保持最佳状态。药典中规定灵芝为赤芝或紫芝的干燥子实体，因此子实体是中药和保健品中应用的主要药用部位。上世纪九十年代发现灵芝的孢子粉具有较好药理活性，随着孢子粉产量的大幅度提高，其在保健产品中的应用已超过子实体。同时，灵芝发酵菌丝体具有质量稳定、产量高等优点，在产品开发应用也越来越多。灵芝子实体、孢子粉及菌丝体三种材料均具有抗肿瘤、免疫调节等相似功效，但多糖含量及种类并不相同。

目前食品、化妆品领域较为常用的活性物质提取方法有热水浸提法、酸提取法、碱提取法、酶提取法、微生物发酵法。其中，微生物发酵法不需要添加其它的催化剂，只需先培养出大量的微生物菌种，然后加入底物进行能实现的反应，所以微生物法比化学试剂的反应法更专一、更有效；反应条件温和，微生物发酵一般都是在常温和pH为7左右的条件下进行催化反应，不需要高温、高压等苛刻的条件；设备的运行操作也比较简单、安全，产生的公害较少，一般不会造成环境污染，后处理也相对简单；筛选不同的菌种与优化反应条件可提高转化率，对同一底物进行微生物转化的菌种可能有多种，通过筛选选出最佳菌种，可以保证较高的转化率。当今国内外许多研究者采用生物法生产多糖，即微生物法、酶法、植物细胞组织培养等多种生物转化法结合，已经呈现出明显优势。微生物发酵技术在天然活性物质的研究开发中发挥着越来越重要的作用。发酵技术在护肤品中应用已有大量报道，最著名的例子就是SK II神仙水。

尽管大米、银耳、灵芝和薰衣草各自都在化妆品领域有着应用，但基本都各与多种原料复配使用，活性物提取方式也多种多样，如何选择更有潜力的材料组合，如何改进活性物的提取效果，仍然是研究人员面临的难题。

发明内容

在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。

鉴于现有技术的上述缺陷，本公开的目的是提供一种大米灵芝菌复合发酵物及其制备方法和应用，具有良好的保湿美白功能。

根据本公开的一个方面，提供了一种大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，包括：将灵芝菌接种至由大米、薰衣草、银耳、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述大米灵芝复合发酵物。

本公开中采用的大米是稻谷经清理、砻谷、碾米等工序后制成的成品，优选用量为0.5％-3％，即大米用量占水重量的0.5％-3％(比如0.8％、1％、1.5％、2％、2.5％等)，可以为大米颗粒也可以为大米粉末。如用量比例超过3％，大米和水灭菌后会体系变得过于粘稠，氧气供应不足，不利于微生物发酵；如用量比例不足0.5％，仍然可以顺利发酵，但是体系过稀，生产效率较低。

本公开中采用薰衣草，其提取物不仅可用作香原料，也可用来做抗菌剂和驱虫剂，可促进套膜蛋白、紧密连接蛋白等的形成，提高皮肤的屏障功能，结合其抗氧化性，可用来做抗衰剂，同时还有抗炎和保湿的作用。本公开的实施例中所用薰衣草为花的干品；优选用量为0.01％-0.05％，即发酵底物中所述薰衣草占水重量的0.01％-0.05％(比如0.02％、0.03％、0.04％等)。薰衣草用量比过低不能体现应有的功效，薰衣草用量比过高得到的发酵液整体颜色较深，色素沉着于皮肤且容易产生造成皮肤过敏反应。更优选地，所述薰衣草为干花经过粉碎处理后的粉末。

本公开采用银耳富含银耳多糖，是一种植物源类透明质酸物质，分子量达到100-130万，为植物源性高效保湿剂，并且可以提高化妆品稳定性，降低界面张力。本公开的实施例中所用银耳为干燥的银耳粉，所述银耳粉与水的质量比为0.05％-1％，换言之，银耳粉用量为水用量的0.05％-1％(比如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8wt.％、0.9％等)。本公开所用银耳粉，优选其制备方法包括：对银耳(子实体干物)进行低温粉碎处理，得到银耳粉；也可购于市售。实验证明，银耳用量比过低不能体现应有的功效，银耳用量比过高可能导致发酵体系粘度过高，影响发酵的进行。

本公开中发酵底物将大米、薰衣草、银耳加入水中后经灭菌处理制备而成。

本公开中采用的发酵菌为灵芝菌，灵芝的次级代谢产物高达430多种，主要有灵芝多糖、三萜类化合物、蛋白质等活性成分，具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、降血脂等很高的药用价值和药理作用；灵芝多糖、灵芝中的萜类化合物以及酚类等活性成分具有抗氧化和清除自由基的作用；灵芝还能够抑制幽门螺杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种菌的生长，其中灵芝多糖起着至关重要的作用；灵芝菌的提取物对胶原蛋白和脑酰胺的生成有促进作用，增强皮肤细胞新陈代谢，结合其抗氧化作用，有抗皱抗衰的作用；对荧光素酶具有活化作用，显示有抗炎性；对酪氨酸酶有抑制作用，可以美白皮肤，结合其保湿能力，将使美白效果明显。申请人经筛选实验发现，对于本公开的原料配方进行灵芝菌液体培养，优选采用灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055，保藏编号为CGMCC No.17789。

优选地，用于接种至发酵底物的所述灵芝菌液的菌丝体体积百分比为80％以上(比如85％、95％、100％等)；所述灵芝菌的接种比例，即所述菌液与所述发酵底物的体积比为1％-10％(比如1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、9.5％等)。

进一步地，所述灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055的菌液的制备方法依次包括如下步骤：

活化：将菌种(保藏编号为CGMCC No.17789的灵芝菌种)接种至葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，活化的温度为23-28℃，活化的时间为3-7d；

液体培养：取所述活化步骤得到的单菌落2-3环，接种于100mL葡萄糖马铃薯液体培养基中培养，培养的温度23-28℃，活化的时间为3-7d，转速160-200rpm，得到用于接种的所述灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055的菌液。

上述大米灵芝菌复合发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵培养的温度为25-30℃(比如25.5℃、26℃、27℃、28℃、29℃、29.5℃等)，时间为3-7d(比如3.5天、4天、5天、6天、6.5天等)，所述发酵培养过程中进行搅拌处理；更优选地，所述搅拌处理的转速为100-200rpm(比如110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm等)。

上述大米灵芝菌复合发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理的温度是90-121℃(比如95℃、100℃、105℃、108℃、110℃、115℃、118℃、120℃等)，时间是15-60min(比如20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min等)。

上述大米灵芝菌复合发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理前，还包括分离处理，弃沉淀，取上清液进行所述灭菌处理，最终得到所述大米灵芝菌复合发酵物，即大米灵芝菌复合发酵原浆。

上述大米灵芝菌复合发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理后，还包括分离处理，弃沉淀，取上清液，最终得到所述大米灵芝菌复合发酵物，即大米灵芝菌复合发酵原浆。

上述大米灵芝菌复合发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述分离处理为离心处理；进一步优选地，所述离心处理的速度是3500-8000r/min(比如4000r/min、4500r/min、5000r/min、5500r/min、6500r/min、7000r/min、7500r/min等)，时间是20-60min(比如25min、30min、40min、50min、55min等)。

上述大米灵芝菌复合发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理后，还包括干燥处理，最终得到所述大米灵芝菌复合发酵物，即大米灵芝菌复合发酵干粉。

上述大米灵芝菌复合发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述干燥处理可以是喷雾干燥、真空冷冻干燥等。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种采用上述制备方法制备的大米灵芝菌复合发酵干粉。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种采用上述制备方法制备的大米灵芝菌复合发酵原浆。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种上述大米灵芝菌复合发酵干粉在制备化妆品方面的应用。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种上述大米灵芝菌复合发酵原浆在作为或制备化妆品方面的应用。

上述化妆品可以是面膜、精华液或爽肤水等。

上述根据本公开实施例的技术方案，通过选取适合的灵芝菌菌种对大米、银耳、薰衣草进行复合液体发酵，制得了一种新型的大米灵芝菌复合发酵原浆，具有良好的保湿、美白效果，可以用作美白保湿化妆品的优良原料或者直接用作化妆品。

本公开所使用的灵芝菌菌株保藏日期为2019年6月5日，保藏编号为CGMCCNo.17789，分类命名为：灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。

通过以下结合附图对本公开的最佳实施例的详细说明，本公开的这些以及其他优点将更加明显。

附图说明

本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：

图1示出了使用实施例1制备的大米灵芝菌复合发酵原浆配制成体积百分比为10％的水溶液(10％样品，即1#样品)和体积百分比为0.1％的透明质酸水溶液(0.1％HA)进行皮肤水分含量(简称“水含”)测试所得结果，为使用后不同时间点与各区域使用前水分含量的变化百分比变化趋势图；

图2示出了使用实施例1制备的大米灵芝菌复合发酵原浆配制成体积百分比为10％的水溶液(10％样品，即1#样品)和体积百分比为0.1％的透明质酸水溶液(0.1％HA)进行皮肤水分含量(简称“水含”)测试所得结果，为不同时间点不同区域的水分含量中位数变化趋势图；

图3示出了使用实施例1制备的大米灵芝菌复合发酵原浆配制成体积百分比为10％的水溶液(10％样品，即1#样品)和体积百分比为0.1％的透明质酸水溶液(0.1％HA)进行皮肤水分流失量(即经皮水分散失，简称“水散”)测试所得结果，为使用后不同时间点与各区域使用前TEWL值的变化百分比变化趋势图；

图4示出了使用实施例1制备的大米灵芝菌复合发酵原浆配制成体积百分比为10％的水溶液(10％样品，即1#样品)和体积百分比为0.1％的透明质酸水溶液(0.1％HA)进行皮肤水分流失量(即经皮水分散失，简称“水散”)测试所得结果，为不同时间点不同区域的TEWL值中位数变化趋势。

具体实施方式

在下文中将结合附图对本公开的示范性实施例进行描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的大米来自市面销售，具体为东北五常稻花香大米(品牌：金龙鱼)。

下述实施例中的银耳为段木银耳，品牌为十月稻田，使用前进行粉碎处理。

下述实施例中的薰衣草为安徽省亳州市何欢堂农副产品购销有限公司生产的薰衣草花干品，使用前进行粉碎处理。

下述实施例中的发酵菌为灵芝菌，具体为灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055，保藏编号为CGMCC No.17789，取自北京工商大学化学与材料工程学院生物转化实验室。

实施例1大米灵芝菌复合发酵原浆的制备

1、灵芝菌液的制备：将保藏编号为CGMCC No.17789的灵芝菌种接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基28℃培养7d活化，然后将得到的单菌落接种至100mL葡萄糖马铃薯液体培养基，28℃、180rpm培养7d，得到灵芝菌液，其中，菌丝体体积百分比为80％。

2、发酵底物配制：取银耳0.5g，大米5g，薰衣草0.15g，加入到500g水中，121℃灭菌20min，得到发酵底物；其中，银耳占0.1％，大米占1％，薰衣草占0.03％。

3、大米灵芝菌复合发酵原浆的获得：将15mL由步骤1得到的灵芝菌液接种到500g发酵底物(约500ml)中，得到发酵体系；将发酵体系在30℃培养箱中转速200rpm条件下发酵6天，得到发酵产物；将发酵产物在5000r/min、离心30min，弃沉淀，收集上清液，于115℃灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物即为大米灵芝菌复合发酵原浆。

实施例1所制得的大米灵芝菌复合发酵原浆的外观为清澈透明或半透明液体，颜色为淡黄色至浅褐色，pH值4.1-6.3，无粘度，可溶性固含物含量1.5-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此发酵物符合化妆品质量要求。

对该大米灵芝菌复合发酵原浆进行成分分析，其中，蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010，粗多糖检测方法参照GB/T 5009.8-2008，黄酮检测方法参照GB/T5009.124-2003，总酚检测方法参照GB/T8313-2008；所得结果如下：实施例1制得的复合发酵中原浆含蛋白质1.012g/kg、粗多糖3.915g/kg、总黄酮0.021g/kg(以芦丁计)、总酚0.011g/kg。

实施例2大米灵芝菌复合发酵原浆在作为化妆品的应用

一、大米灵芝菌复合发酵原浆的安全性检测

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本公开根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例1获得的大米复合发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象：

严格按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》要求，选择受试对象，皮肤的待测部位出现瘢痕、鲜红斑痣等影响结果判定的受试者、体质高度敏感者均不能参与试验。本试验选择合适的志愿者30人作为受试对象，年龄范围在18-60岁随机选择。

2、试验方法：

将液体样品(100％大米灵芝菌复合发酵原浆，无稀释)0.02mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照(水)，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后(等待压痕消失)，24h和48h观察皮肤的反应。人体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表1。

表1皮肤不良反应分级标准

3、试验结果：

参见表2。从表中可以看出：使用实施例1得到的大米灵芝菌复合发酵原浆后都是阴性反应，说明本发明提供的大米灵芝菌复合发酵原浆具有安全性，不会给人体带来不良反应。

表2、实施例1获得的大米灵芝菌复合发酵原浆的斑贴试验

二、大米灵芝菌复合发酵原浆的水含、水散测试

对实施例1获得的大米灵芝菌复合发酵原浆的保湿效果进行测试，具体为皮肤水分含量测试、皮肤水分流失量测试，透明质酸(HA)普遍认为是具有较好保湿效果的阳性对照样品，本测试采用10％大米灵芝菌复合发酵原浆(记为1#样品，即用实施例1制备的复合发酵原浆配制的体积浓度为10％的水溶液)和0.1％透明质酸(记为0.1％HA，即用透明质酸配制的体积浓度为0.1％的水溶液)进行对比实验。

1、测试环境：温度:22±1℃；湿度:50％-60％。

2、测试区域：皮肤水分含量测试、皮肤水分流失量测试：左右前臂。

3、测试时间点：皮肤水分含量测试、皮肤水分流失量测试：使用前、使用后5min、20min、60min。

4、实验仪器：Cornemeter，CM825、Tewameter，TM300。

5、测试方法：

1)30名符合条件的志愿者参加测试。测试场所无光线直射、无风，室温22-24℃，湿度40％-60％。检测前用洗面奶清洗双侧前臂，静息30min，取受试者双侧前臂内侧，用记号笔画出面积为3.5×3.5cm正常皮肤。依次测量在使用前的皮肤水分含量及皮肤水分流失量。

2)将浸有待测样品(分别为1#样品，0.1％HA)的面膜分别剪成3×3cm大小，分别贴在前臂相应标记处，15min后取下，轻轻用化妆棉沾干测试部位未干的精华液，并开始计时。

3)分别在5min、20min、60min时测试3个部位角质层含水量及TEWL值。每个部位测量3次取平均值。

6、测试结果：

图1为1#样品和0.1％HA的水含量变化百分比趋势图，图2为1#样品和0.1％HA水含量中位数的变化趋势图。从图中可以看出，1#样品和0.1％HA在使用后5min的水含量中位数均达到最大，随着使用后时间的延长，1#样品和0.1％HA的水含量中位数均呈现降低趋势；20min后，0.1％HA的水含量变化百分比低于0，1#样品的水含量变化百分比高于0，表示使用0.1％HA后该时间点的水含量低于本底数据，而使用1#样品后该时间点的水含量仍然高于本底数据；60min后，1#样品和0.1％HA的水含量中位数均继续呈现降低趋势，水含量变化百分比均低于0，表示使用后该时间点的水含量低于本底数据；可见，1#样品具有优良的补水、保湿性能。

图3为1#样品和0.1％HA的经皮水分散失变化百分比趋势图，图4为1#样品和0.1％HA经皮水分散失量中位数的变化趋势图。由图可知，1#样品和0.1％HA的经皮水分散失变化规律较为相似，两者均在使用后5min达到最大，是因为此时水含量较大造成经皮水分散失也较大；随着使用后时间的延长，经皮水分散失量逐渐下降，并在使用后60min有所回弹，该时间点下的TEWL变化百分比均大于0，表示该时间点下的TEWL高于皮肤本底，这是由于未进一步进行锁水成分(如油脂)的涂抹的原因。

可见实施例1制备的大米灵芝菌复合发酵原浆具有良好的补水性能，其10％体积浓度的复合发酵原浆与0.1％HA补水性能相当。

三、体外抗氧化清除自由基性能测试

1、对DPPH自由基清除作用

溶液配制：DPPH(2×10^-4mol/L)乙醇溶液的配置：称取20mgDPPH，加入无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，DPPH浓度配制为2×10^-4mol/L，0-4℃下避光保存；

实验操作：取3mL待测液与3mL DPPH溶液混匀，测517nm吸光度(A1)；取3mL蒸馏水与3mL DPPH溶液混匀,测517nm吸光度(A2)；取3mL蒸馏水与3mL待测液混匀，测517nm吸光度(A3)。清除率计算公式为：

清除率＝(A₂+A₃-A₁)/A₂×100％。

2、对羟自由基清除作用(水杨酸法)

溶液配制：2mmol/L FeSO₄配制：称取0.304g的无水FeSO₄定容于1L水中；1mmol/LH₂O₂配制：取0.11g(110μl)H₂O₂定容于1L水中；6mmol/L水杨酸配制：称取水杨酸0.828g定容于1L水中。

实验操作：取25mL试管，分别加2mmol/L FeSO₄、6mmol/L水杨酸各3mL，最后加入3mL 1mmol/LH₂O₂启动反应，置于37℃水浴中加热15min，测510nm处吸光度(A₀)。取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL待测液和0.8、0.6、0.4、0.2、0mL的蒸馏水共1mL，加入2mmol/LFeSO₄、6mmol/L水杨酸各3mL，最后加入3mL1mmol/LH₂O₂启动反应，置于37℃水浴中加热15min，测510nm处吸光度(A_x)，每组做3个平行。

考虑到1.0mL待测液和水对体系吸光度的降低，分别加2mmol/L FeSO₄、6mmol/L水杨酸各3mL，然后加入3mL 1mmol/L H₂O₂启动反应，置于37℃恒温15min后测其吸光度(A₀₀)，然后加入1mL蒸馏水后测一次吸光度(A_xx)，则有A_降低＝A₀₀-A_xx。清除率计算公式为：

羟自由基清除率＝(A₀-A_x-A_降低)/A₀×100％。

3、对ABTS自由基清除作用

ABTS工作液的配制：将5mL 7mmol/LABTS水溶液和88μL140mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS·+储备液。使用前用无水乙醇稀释成工作液，使其在734nm下的吸光度在0.70±0.02。

样品测定：取4mL ABTS工作液，加入40μL待测液，准确震荡30s，测定反应6min后734nm波长下的吸光度A_样品。按照下式计算清除率：

ABTS清除率/％＝(1-A_样品/0.700)×100。

4、实验结果

上述抗氧化清除自由基测试的结果请参见表3。其中的样品待测液为事先配置的体积浓度分别为50％、100％的大米灵芝菌复合发酵原浆水溶液，以及同比例底物灭菌后的上清液(作为发酵前的样品)。从表3可以看出，实施例1制备的大米灵芝菌复合发酵原浆具有一定的抗氧化性能。

表3抗氧化清除自由基测试结果

四、酪氨酸酶抑制率测试

1、实验方法

配置：0.1M HCl；PBS溶液(pH＝6.8，0.1mol/L)；L-酪氨酸溶液(0.05g溶于35ml的0.1mol/L的HCl中，用pH＝6.8的PBS(0.1mol/L)缓冲液定容至100ml)；样品溶液(即同比例底物灭菌后未经发酵的上清液，以及实施例1制得的大米灵芝菌复合发酵原浆)。

在玻璃试管中进行生化反应，各管按照下表4数据加入所需PBS缓冲液(pH＝6.8，0.1mol/L)，样品溶液，L-酪氨酸溶液。于37℃水浴中反应10min，加入酪氨酸酶(酶活性为100U/mL)，再于37℃水浴中反应10min，在475nm测吸光度值。

表4

试剂	C<sub>1</sub>(ml)	C<sub>0</sub>(ml)	T<sub>1</sub>(ml)	T<sub>0</sub>(ml)
					PBS	2	2.5	1	1.5
样品	0	0	1	1
					L-酪氨酸	1	1	1	1
酪氨酸酶	0.5	0	0.5	0

计算酪氨酸酶抑制率的公式如下：

IR(％)＝[(C₁-C₀)-(T₁-T₀)]/(C₁-C₀)×100％

式中：IR—样品对OH·清除率；C₁—空白对照组吸光度值；C₀—不加酪氨酸酶的空白对照吸光度值；T₁—样品组吸光度值；T₀—不加酪氨酸酶的样品组吸光度值。

2、实验结果

对于与实施例1同比例底物灭菌后未经发酵的上清液，其酪氨酸酶抑制率为5.51％±0.45％，对于实施例1制得的复合发酵原浆，其酪氨酸酶抑制率为37.14％±3.10％，而采用维生素C作为对照，0.1mg/mL维生素C其酪氨酸酶抑制率为58.82％，0.3mg/mL维生素C其酪氨酸酶抑制率为64.71％，1.2mg/mL维生素C其酪氨酸酶抑制率为70.59％；说明实施例1制备的大米灵芝菌复合发酵原浆的酪氨酸酶抑制能力优良，具有良好的美白效果。

五、细胞MTT增殖实验

人皮肤成纤维细胞是组成皮肤真皮的主要结构成分，其可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，对于保持皮肤强度和弹性、修复损伤及美容美体具有重要作用，是维持皮肤年轻态的决定性因素，也是维持皮肤结构稳定的重要组成部分。本实验采用的人皮肤成纤维细胞(HDF-n，来自ScienCell公司)，对样品对细胞的毒性进行测试。

1、实验步骤：

将细胞种于96孔板，过夜进行同步化处理后用待测液(即将同比例底物灭菌后未经发酵的上清液、实施例1制得的灵芝菌复合发酵原浆分别用细胞培养液DMEM稀释成体积浓度5％的溶液)进行孵育培养24h；培养结束后换新培养基，计入MTT0.5g/L，4h后去培养基，用PBS洗三遍，加入400μL DMSO，使细胞充分裂解；用酶标仪在490nm波长下测定OD值。每次实验重复三次。以对照组细胞存活为1，其他各组细胞存活率＝OD490_实验组/OD490_对照组。

2、实验结果

实验结果见表5，从表中可以看出发酵后5％浓度组的细胞存活率比空白对照高，说明发酵后样品对细胞具有促进增殖作用。

表5

实验分组	空白对照	发酵前5％浓度	发酵后5％浓度
				细胞存活率	1	0.65±0.04	1.68±0.03

六、胶原蛋白含量测定实验

1、实验方法

样品：1)细胞空白：纯DMEM；2)发酵前5％：与实施例1同比例底物灭菌后未经发酵的上清液，用DMEM培养基配制成体积浓度5％的溶液；3)发酵后5％：同比例底物灭菌、接种、培养、离心灭菌后得到的发酵样品，即实施例1制得的发酵原浆，用DMEM培养基配制成体积浓度5％的溶液；4)阳性对照：抗坏血酸葡糖苷用DMEM配制成体积浓度1％的溶液。

收集对数生长期状态良好的人皮肤成纤维细胞(HDF-n，来自ScienCell公司)，经胰蛋白酶消化，完全培养基终止消化，计数；将细胞悬浮液调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，并加入到6孔培养板中，每孔加入1ml新鲜的完全培养基，1ml细胞悬浮液，于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜；吸取培养基，每孔加入不同样品(细胞空白、发酵前5％、发酵后5％、1％阳性对照)2ml，细胞对照孔加入2ml基础培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。使用无菌1.5mL离心管收集细胞上清液，2000-3000转/分，离心20min左右，仔细收集上清液。采用南京建成生物工程研究院提供的人I型胶原(COLI)酶联免疫检测试剂盒进行检测上清液的吸光值(OD值)。

2、胶原蛋白含量测定结果

使用ELISAcalc进行计算胶原蛋白浓度，拟合模型选用logistic曲线(四参数)，用标准品的浓度和相应的OD值，计算标准曲线的回归方程。回归方程:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，其中：A＝1.64442；B＝0.98920；C＝14.91037；D＝0.22063；r²＝0.96004。

再根据样本的OD值，在上述回归方程上使用ELISAcalc计算出对应的样品浓度，如表6所示。从表6可以看出与细胞对照相比，发酵后样品在5％浓度下对细胞胶原蛋白的含量有显著促进作用，与阳性对照相比，无显著差异，表明该发酵液与抗坏血酸葡糖苷有相当的促进胶原蛋白合成的作用，具有良好的抗衰老抗皱效果。

表6

对比例1菌种筛选

1.大米发酵液(样品1～6)制备

以1％大米为底物，分别接种候选的1～6号灵芝菌种，28℃培养5天后，离心分离取上清液。灭菌加防腐剂后测试。候选的1～6号灵芝菌种中，1～3号菌种采集自安徽省滁州市、4～5号菌种采集自吉林省长白山，6号菌种为实验室保藏菌种，1号菌种为灵芝菌种wG055。

具体方法为:

1)种子液的准备：用PDA平板对这六种灵芝菌种进行活化，取单菌落转移至马铃薯葡萄糖水液体培养基中进行扩大培养，培养条件是28℃、180rpm培养5d。

2)样品的准备：500ml三角瓶中，添加3g大米，297g水，121℃15min灭菌，接种3ml种子液，置于28℃180rpm培养5天；分别得到1～6号大米发酵液，即样品1～6。以未接种发酵的大米上清液为0号样品。

2.ABTS自由基清除功效评价

ABTS工作液的配制：将5mL 7mmol/LABTS水溶液和88μL140mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS·+储备液。使用前用无水乙醇稀释成工作液，使其在734nm下的吸光度在0.70±0.02。

样品测定：取4mL ABTS工作液，加入40μL待测液，准确震荡30s，测定反应6min后734nm波长下的吸光度A_样品。按照下式计算清除率：

ABTS清除率/％＝(1-A_样品/0.700)×100。

实验结果见表7，从表中可以看出，相比其他样品，样品1具有最高的ABTS自由基清除能力。

表7不同灵芝菌种得到的大米发酵液的ABTS测试结果

发酵液编号	ABTS清除率％
		0	28.95±5.04
1	65.41±2.34
		2	60.47±4.25
3	56.24±7.45
		4	55.85±0.87
5	57.24±2.47
		6	48.69±5.24

3.肤感测试

依照评价标准(表A)进行评价，具体分数见表B，经过综合分析，样品1的综合分数是相对较高的。

表A肤感测试评价标准

表B样品0～6的肤感测试结果

对比例2

1、发酵底物仅采用大米，而不采用薰衣草和银耳，其他条件与实施例1相同，得到发酵原浆，记为样品A；整体无明显不良气味，但是涂抹开后有隐约的不愉悦的气味。

2、发酵底物仅采用大米和银耳，而不采用薰衣草，其他条件与实施例1相同，得到复合发酵原浆，记为样品B；气味涂抹开后细闻有隐约不愉悦的气味，但是肤感相对样品A更好，吸收更快。

3、实施例1所得复合发酵原浆记为样品C，整体散发薰衣草香气，无不愉快气味，肤感较好，吸收更快。

综上，在根据本公开的实施例中，本公开提供了如下技术方案，但不限于此：

方案1、一种大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，包括：将灵芝菌接种至由大米、薰衣草、银耳、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述大米灵芝复合发酵物。

方案2、根据方案1所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述大米用量占水重量的0.5％-3％；所述薰衣草为干花，占水重量的0.01％-0.05％；所述银耳为干品，占水重量的0.05％-1％。

方案3、根据方案1或2所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，接种前对所述发酵底物进行灭菌处理。

方案4、根据方案1-3中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，用于接种至所述发酵底物的灵芝菌液的菌丝体体积百分比为80％以上；所述菌液与所述发酵底物的体积比为1％-10％。

方案5、根据方案4所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述灵芝菌为灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055，保藏编号为CGMCC No.17789。

方案6、根据方案5所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055的菌液的制备方法依次包括如下步骤：

活化：将菌种接种至葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，活化的温度为23-28℃，活化的时间为3-7d；

液体培养：取所述活化步骤得到的单菌落2-3环，接种于100mL葡萄糖马铃薯液体培养基中培养，培养的温度23-28℃，时间为3-7d，转速160-200rpm，得到用于接种的所述灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055的菌液。

方案7、根据方案1-6中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述薰衣草为干花经过粉碎处理后的粉末。

方案8、根据方案1-7中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述银耳为干燥的银耳粉。

方案9、根据方案1-8中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为25-30℃，时间为3-7d，所述发酵培养过程中进行搅拌处理。

方案10、根据方案9所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述搅拌处理的转速为100-200rpm。

方案11、根据方案1-10中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养后灭菌处理的温度是90-121℃，时间是15-60min。

方案12、根据方案1-11中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理前，还包括分离处理，弃沉淀，取上清液进行所述灭菌处理，最终得到大米灵芝菌复合发酵原浆。

方案13、根据方案1-11中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理后，还包括分离处理，弃沉淀，取上清液，最终得到大米灵芝菌复合发酵原浆。

方案14、根据方案11或12所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述分离处理为离心处理。

方案15、根据方案14所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述离心处理的速度是3500-8000r/min，时间是20-60min。

方案16、根据方案12-15中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理后，还包括干燥处理，最终得到大米灵芝菌复合发酵干粉。

方案17、根据方案16所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述干燥处理为喷雾干燥或真空冷冻干燥。

方案18、一种采用如方案16或17所述制备方法制备的大米灵芝菌复合发酵干粉。

方案19、一种采用如方案12-15中任一项所述的所述制备方法制备的大米灵芝菌复合发酵原浆。

方案20、如方案18所述的大米灵芝菌复合发酵干粉在制备化妆品方面的应用。

方案21、如方案19所述的大米灵芝菌复合发酵原浆在作为或制备化妆品方面的应用。

最后，还需要说明的是，在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 大米灵芝菌复合发酵物及其制备方法和应用

<130> PD200211CN0280

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 646

<212> DNA

<213> 灵芝(Ganoderma lucidum)

<400> 1

ccccttccgt agggtgaacc tgcggaagga tcattatcga gttttgaccg ggttgtagct 60

ggccttctga ggcatgtgca cgccctgttc atccactcta cacctgtgca cttactgtgg 120

gcttcagatt gcgaggcacg ctctttaccg ggcttgcgga gcatatctgt gcctgcgttt 180

atcacaaact ctataaagta acagaatgtg tattgcgatg taacacatct atatacaact 240

ttcagcaacg gatctcttgg ctctcgcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta 300

atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcaccttgc gctccttggt 360

attccgagga gcatgcctgt ttgagtgtca tgaaatcttc aacctacaag cttttgtggt 420

ttgtaggctt ggacttggag gcttgtcggc cgttatcggt cggctcctct taaatgcatt 480

agcttggttc cttgcggatc ggctctcggt gtgataatgt ctacgccgtg accgtgaagc 540

gtttggcgag cttctaaccg tcttataaga cagctttatg acctctgacc tcaaatcagg 600

taggactacc cgctgaactt aagcatatca ataaagccgg aggaaa 646

Claims (10)

1.一种大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，包括：将灵芝菌接种至由大米、薰衣草、银耳、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述大米灵芝复合发酵物。

2.根据权利要求1所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述大米用量占水重量的0.5-3％；所述薰衣草为干花，占水重量的0.01％-0.05％；所述银耳为干品，占水重量的0.05％-1％。

3.根据权利要求1或2所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，接种前对所述发酵底物进行灭菌处理。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，用于接种至所述发酵底物的灵芝菌液的菌丝体体积百分比为80％以上；所述菌液与所述发酵底物的体积比为1％-10％。

5.根据权利要求4所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述灵芝菌为灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055，保藏编号为CGMCC No.17789。

6.根据权利要求5所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055的菌液的制备方法依次包括如下步骤：

活化：将菌种接种至葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，活化的温度为23-28℃，活化的时间为3-7d；

液体培养：取所述活化步骤得到的单菌落2-3环，接种于100mL葡萄糖马铃薯液体培养基中培养，培养的温度23-28℃，时间为3-7d，转速160-200rpm，得到用于接种的所述灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055的菌液。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述薰衣草为干花经过粉碎处理后的粉末。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述银耳为干燥的银耳粉。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为25-30℃，时间为3-7d，所述发酵培养过程中进行搅拌处理。

10.根据权利要求9所述的大米灵芝菌复合发酵物的制备方法，其特征在于，所述搅拌处理的转速为100-200rpm。

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