CN112107512B - 一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华。通过对灵芝及孢子粉进行混合发酵，发酵菌水解灵芝孢子双层细胞壁和灵芝子实体细胞壁，使胞内物质流出，从而促进有效成分的提取。同时发酵可以降解大分子得到分子量更小即更易被皮肤吸收的小分子，促进功效物质的吸收利用。通过使用灵芝子实体孢子粉发酵液大大增加了多肽的含量，具有抗氧化、保湿、抗炎等功效，同时也发现灵芝发酵液具有调节头皮微生态，增强头皮保湿，使头皮屏障强韧的作用。

Description

一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华及其制备方法
技术领域
本发明涉及轻化工业技术领域，具体涉及一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，以及该头皮精华的制备方法。
背景技术
随着工业化发展，工厂、汽车废气的排放，空气污染成为一个重要问题。人的头发、头皮上会粘连上很多污染物，这些污染物对头皮具有一定刺激性，会导致头皮敏感。而且不正当的清洁方式，以及生活压力等影响，脱发也成为人们日益关注的一个问题。
然而，头皮敏感和脱发等头皮问题仅靠洗发水很难解决，功效成分很难沉积在头皮上。但头皮精华涂抹后可以在头皮上停留，并且能够持续地发挥作用。
灵芝又称林中灵，外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。灵芝久负盛名，具有滋补强体、固本扶正、养颜安神的功效。现代研究表明灵芝子实体水提物中还含有水溶性多糖、蛋白质、氨基酸、多肽等物质，具有抗辐射、抗衰老、美白、保湿等功效。
灵芝孢子粉是灵芝成熟时所释放的孢子，是灵芝有性生殖细胞，又称担孢子。灵芝孢子粉在保健品中应用很广泛，其水提物也和灵芝子实体一样含有多糖、蛋白质、多肽，但其成分结构和含量有所区别。同样的，这些成分也具有抗衰老、美白、保湿等功效。有文献对灵芝子实体和孢子粉成分进行分析对比，结果表明，孢子粉的蛋白含量约是子实体的两倍，脂肪含量孢子粉是子实体的五倍，但多糖含量子实体更高。灵芝孢子壁具有双层细胞壁，结实坚硬，不破壁的孢子粉只有10％～20％有效成分被人体吸收。
目前对灵芝的发酵都是对灵芝子实体或灵芝孢子粉单一发酵，还没有将灵芝子实体与孢子粉混合加工形成的产品。实际上灵芝子实体和孢子粉含有的活性成分是有区别的，混合两个成分能够增加产品的保健功效。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，其具有调节头皮微生态，增强头皮保湿，使头皮屏障强韧的作用。
本发明的第二目的在于提供上述头皮精华的制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，以所述头皮精华的质量为100％计，包括以下质量百分含量的原料：灵芝子实体孢子粉发酵液5-15％，甘油1-5％，咖啡因0.1-0.5％，羟丙基淀粉磷酸酯0.5-4％，薄荷醇0.05-0.3％，泛醇0.05-0.5％，PEG-40氢化蓖麻油0.5-2％，香精0.1-0.5％，苯氧乙醇0.4-0.8％，乙基己基甘油0.1-0.5％，尿囊素0.05-0.3％，甘草酸二钾0.1-0.5％，余量为纯水。
其中，灵芝子实体孢子粉发酵液富含多肽，具有调节头皮微生态，增强头皮保湿，舒缓头皮，减少敏感，使头皮屏障强韧的作用。甘油用于护肤品中具有保湿和修复作用。咖啡因具有一定的防脱发效果，将其与灵芝子实体孢子粉发酵液复配，能够进一步活化毛囊和减少脱发。羟丙基淀粉磷酸酯在化妆品、护肤品里主要作为乳化稳定剂和柔润剂使用。薄荷醇为薄荷叶和茎中的提取物，能够起到清凉止痒的作用，护肤品里主要作为清凉剂和收敛剂。泛醇又称泛酞醇，通常被称为前维生素B5。为无色至微黄色透明粘稠的液体，略带特殊气味。对皮肤和头发具有保湿、抗炎、刺激细胞分裂等作用。PEG-40氢化蓖麻油在化妆品、护肤品里作为乳化剂和表面活性剂，化妆水类产品加入后会较为滑顺，甚至有相当的起泡性。
苯氧乙醇作为防腐剂，在头皮精华中的质量含量小于1％。乙基己基甘油具有保湿作用和抗菌性，可作为防腐剂使用，且稳定性强，能提高产品滋润效果，兼具柔滑肤感。该成分还能增强传统防腐剂如苯氧乙醇、甲基异噻唑啉酮、羟苯甲酯等，减少产品中这些成分的用量，增加了产品的安全性。
尿囊素是一种两性化合物，能结合多种物质形成复盐，具有避光、杀菌防腐、止痛、抗氧化作用，能使皮肤保持水份，滋润和柔软，对头发有保护作用，可使头发不分叉、不断发。
甘草酸二钾是甘草中的主要提取成份之一，存在抗氧化活性，它在细胞色素P450/NADPH氧化系统中显示出很强的抗自由基氧化作用，将其应用于洗发产品中能够抗炎舒缓。
本发明还涉及该头皮精华的制备方法，包括以下步骤：
(1)将纯水和羟丙基淀粉磷酸酯混合均匀得到A相备用；
将灵芝子实体孢子粉发酵液、甘油、咖啡因、泛醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油、尿囊素和甘草酸二钾混合均匀得到B相备用；
将薄荷醇、PEG-40氢化蓖麻油和香精混合均匀得到C相备用；
(2)开启搅拌锅的搅拌功能，将A相加入搅拌锅中，加热至70～75℃后搅拌至混合均匀，然后冷却至室温；
(3)将B相加入搅拌锅中，搅拌至混合均匀；
(4)将C相加入到搅拌锅中并搅拌均匀，得到头皮精华。
对制备过程的机理解释如下：先加入纯水和羟丙基淀粉磷酸酯，有利于后续的活性物质在体系中的溶解和分散。然后加入灵芝子实体孢子粉发酵液、咖啡因、尿囊素和甘草酸二钾等B相水溶性活性物质和防腐剂，最后加入C相挥发性物质。
本发明还涉及灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)灵芝发酵基质制备：将灵芝子实体干燥，粉碎过80-120目筛处理，加入孢子粉，再加入蒸馏水制备成质量分数为7-13％的溶液，灭菌处理，得到灭菌后的灵芝发酵基质；
(2)菌种活化：采用平板划线法将菌种分别接种到培养基中，在30-37℃下培养44-52h，得到活化菌株；
(3)混合发酵：将活化菌株进行扩大培养后进行混合，得到混合种子液，将混合种子液加入到灭菌后的灵芝发酵基质中，进行发酵，得到初始灵芝子实体孢子粉发酵液；
(4)发酵后处理：将初始灵芝子实体孢子粉发酵液灭菌处理，菌体破碎，过滤，得到灵芝子实体孢子粉发酵液。
进一步的，步骤(1)中灵芝子实体与孢子粉的质量比为(10-1)：(1-10)。
进一步的，步骤(1)中灵芝子实体与孢子粉的质量比为1:1。
本发明人经过大量的试验发现，灵芝子实体和孢子粉采用上述的质量比发酵得到的发酵液中各活性成分的含量，特别是多肽的含量较高。
进一步的，步骤(2)中菌种选自青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌CICC10262、保加利亚乳杆菌CICC 20271、酿酒酵母菌CICC 1252中的一种或多种。
本发明中所述的青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌CICC 10262、保加利亚乳杆菌CICC 20271、酿酒酵母菌CICC 1252均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
进一步的，菌种选自青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌CICC 10262、保加利亚乳杆菌CICC 20271和酿酒酵母菌CICC 1252的混合菌种。
进一步的，步骤(3)中混合种子液中青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌CICC10262、保加利亚乳杆菌CICC 20271和酿酒酵母菌CICC 1252的质量比为(1.5-2.5):1:(1.5:-2.5)：(0.8-1.2)。
进一步的，步骤(3)中混合种子液中青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌CICC10262、保加利亚乳杆菌CICC 20271和酿酒酵母菌CICC 1252的质量比为2:1:2:1。
本发明人经过大量的试验发现，当菌种采用上述四种菌种混合发酵时，可以使孢子粉坚韧的双层细胞壁、子实体细胞壁打开，细胞膜破裂，胞内成分流出，活性物质利用率提高，可以提高头皮精华的保湿舒敏功效。同时采用上述比例范围下的四种菌种发酵，灵芝子实体和孢子粉中的有益成分提取率高。
本发明中各菌种的活化方法均采用现有方法进行，具体如下所示：
青春双歧杆菌活化培养基：MRS培养基，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温-80 1g/L，琼脂20g/L，蒸馏水，pH值6.2±0.2；
青春双歧杆菌活化方法：在MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养48h，无氧条件下传3代。
纳豆芽孢杆菌活化培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂15～20g/L，蒸馏水，pH值7.5±0.2；
纳豆芽孢杆菌活化方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上划线，35℃正常培养48h。
保加利亚乳杆菌活化培养基：MRS固体培养基，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温-80 1g/L，琼脂20g/L，蒸馏水，pH值6.2±0.2；
保加利亚乳杆菌活化方法：在MRS培养基中划线，37℃恒温无氧培养48h。
酿酒酵母菌活化培养基：营养酵母葡萄糖液体培养基(NYDA固体培养基)，牛肉浸膏g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，正常PH。
酿酒酵母菌活化方法：在NYDA培养基上划线，30℃正常培养48h。
进一步的，步骤(3)中混合种子液以1.5-2.5％的质量分数加入到灭菌后的灵芝发酵基质中。
进一步的，步骤(3)中发酵温度为35-45℃，在转速为100-150rpm的摇床上进行发酵44-52h。
本发明中活化菌株进行扩大培养具体如下：
各培养基都是液体培养基：
酿酒酵母菌CICC 1252扩大培养培养基：NYDB液体培养基，牛肉浸膏g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，正常pH。
活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，30℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/mL时结束，得到酿酒酵母种子液。
纳豆芽孢杆菌CICC 10262扩大培养培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，PH 7。
固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，35℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/mL时结束，得到纳豆芽孢杆菌种子液。
青春双歧杆菌CICC 6175培养基：MRS液体培养基，包括牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温-80 1g/L，pH值6.2±0.2。
固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/mL时结束，得到青春双歧杆菌种子液；
保加利亚乳杆菌CICC 20271(耐氧训练)：
固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/mL时结束，得到保加利亚乳杆菌种子液；
或液体培养基活化后，接种5％到装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^9cfu/mL时结束，得到保加利亚乳杆菌种子液。
进一步的，步骤(1)和(4)中灭菌处理为在121℃下灭菌15min或在600MPa，25℃下进行超高压灭菌。
进一步的，步骤(4)中菌体破碎采用高压匀浆机或超声破碎，过滤采用离心、超滤膜、微滤膜或反渗透过滤。
本发明人经过大量的试验发现，菌体破碎后部分灵芝细胞内物质溶出，让有益成分流出。使用High Pressure Homogenizer高压匀浆机，压力设定为100mpa，匀浆3次，出口温度为25℃。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华。通过对灵芝及孢子粉进行混合发酵，发酵菌水解灵芝孢子双层细胞壁和灵芝子实体细胞壁，使胞内物质流出，从而促进有效成分的提取。同时发酵可以降解大分子得到分子量更小即更易被皮肤吸收的小分子，促进功效物质的吸收利用。通过使用灵芝子实体孢子粉发酵液大大增加了多肽的含量，具有抗氧化、保湿、抗炎等功效，同时也发现灵芝发酵液具有调节头皮微生态，增强头皮保湿，使头皮屏障强韧的作用。
另外针对头皮敏感问题和脱发问题，本发明采用咖啡因复配灵芝子实体孢子粉发酵液，能够舒缓头皮，减少瘙痒，进一步活化毛囊和减少脱发。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例中具体的菌种活化方法如下：
青春双歧杆菌活化培养基：MRS培养基，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温-80 1g/L，琼脂20g/L，蒸馏水，pH值6.2±0.2；
青春双歧杆菌活化方法：在MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养48h，无氧条件下传3代。
纳豆芽孢杆菌活化培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂15～20g/L，蒸馏水，pH值7.5±0.2；
纳豆芽孢杆菌活化方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上划线，35℃正常培养48h。
保加利亚乳杆菌活化培养基：MRS固体培养基，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温-80 1g/L，琼脂20g/L，蒸馏水，pH值6.2±0.2；
保加利亚乳杆菌活化方法：在MRS培养基中划线，37℃恒温无氧培养48h。
酿酒酵母菌活化培养基：营养酵母葡萄糖液体培养基(NYDA固体培养基)，牛肉浸膏g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，正常pH。
酿酒酵母菌活化方法：在NYDA培养基上划线，30℃正常培养48h。
活化菌株扩大培养具体如下(各培养基都是液体培养基)：
酿酒酵母菌CICC 1252扩大培养培养基：NYDB液体培养基，牛肉浸膏g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，正常pH。
活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，30℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/mL时结束，得到酿酒酵母种子液。
纳豆芽孢杆菌CICC 10262扩大培养培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7。
固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，35℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/mL时结束，得到纳豆芽孢杆菌种子液。
青春双歧杆菌CICC 6175培养基：MRS液体培养基，包括牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温-80 1g/L，pH值6.2±0.2。
固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/mL时结束，得到青春双歧杆菌种子液；
保加利亚乳杆菌CICC 20271(耐氧训练)：
固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/mL时结束，得到保加利亚乳杆菌种子液。
制备例为灵芝子实体孢子粉发酵液的制备
制备例1
本制备例的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法，包括如下步骤：
(1)灵芝发酵基质制备：将灵芝子实体干燥，粉碎过100目筛处理，加入孢子粉，灵芝子实体与孢子粉的质量比为1:1，再加入蒸馏水制备成质量分数为10％的溶液，在121℃下灭菌15min处理，得到灭菌后的灵芝发酵基质；
(2)菌种活化：采用平板划线法将菌种分别接种到培养基中进行培养，所述的菌种为青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌CICC 10262、保加利亚乳杆菌CICC 20271和酿酒酵母菌CICC 1252的混合菌种，得到活化菌株；
(3)混合发酵：将得到的活化菌株进行扩大培养后进行混合，得到混合种子液，混合种子液中青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌CICC 10262、保加利亚乳杆菌CICC20271和酿酒酵母菌CICC 1252的质量比2:1:2:1，将混合种子液以2％的质量分数加入到灭菌后的灵芝发酵基质中，进行发酵，发酵温度为40℃，在转速为125rpm的摇床上进行发酵48h，得到初始灵芝子实体孢子粉发酵液；
(4)发酵后处理：将初始灵芝子实体孢子粉发酵液在121℃下灭菌15min处理，采用高压匀浆机进行菌体破碎，压力设定为100mpa，匀浆3次，出口温度为25℃，离心过滤，得到灵芝子实体孢子粉发酵液。
以下制备例中改变某一项或几项实验参数，其他操作均与制备例1相同，具体的参数设定参见表1，制备例中的青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌CICC 10262、保加利亚乳杆菌CICC 20271、酿酒酵母菌CICC 1252均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
对比例1
本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法为：将灵芝子实体粉碎过100目筛处理，加入孢子粉，灵芝子实体与孢子粉的质量比为1：1，加水配制成质量分数为10％的溶液，在121℃下灭菌15min处理，然后在40℃下保温48h，再在121℃下灭菌15min，离心分离取上清液，即得到清水提取液。
对比例2
本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法与制备例1相同，不同之处在于，将孢子粉和灵芝子实体替换为相同重量的灵芝子实体进行发酵。
对比例3
本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法与制备例1相同，不同之处在于，将孢子粉和灵芝子实体替换为相同重量的孢子粉进行发酵。
对比例4
本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法与制备例1相同，不同之处在于，步骤(4)中菌体不进行破碎处理。
表1
Figure BDA0002709968110000111
灵芝子实体孢子粉发酵液成分的测定
分别测定制备例1-14以及对比例1-4制备的灵芝子实体孢子粉发酵液，多糖测试方法参照SNT4260；采用BCA法测定蛋白多肽的含量；采用Folin-Ciocalteu法测定多酚含量；采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH法测定总黄酮含量，结果见表2。
表2
组别 多糖(mg/mL) 多肽(mg/mL) 多酚(mg/mL) 总黄酮(mg/mL)
制备例1 3.17 4.24 0.057 0.033
制备例2 3.12 4.18 0.053 0.031
制备例3 3.08 4.15 0.051 0.029
制备例4 2.84 3.86 0.037 0.018
制备例5 2.76 3.79 0.032 0.015
制备例6 3.01 4.02 0.045 0.026
制备例7 2.98 4.06 0.047 0.025
制备例8 2.91 3.97 0.041 0.023
制备例9 3.11 4.19 0.052 0.030
制备例10 3.08 4.11 0.051 0.028
制备例11 2.85 3.79 0.032 0.017
制备例12 2.89 3.82 0.034 0.020
制备例13 3.15 4.19 0.055 0.032
制备例14 3.14 4.21 0.053 0.030
对比例1 1.04 2.03 0.033 0.019
对比例2 3.25 3.88 0.052 0.021
对比例3 1.93 3.29 0.041 0.014
对比例4 2.81 3.75 0.038 0.021
从表1和表2制备例1-5中可以看出，采用本发明的混合种子液青春双歧杆菌CICC6175、纳豆芽孢杆菌CICC 10262、保加利亚乳杆菌CICC 20271和酿酒酵母菌CICC 1252的质量比为(1.5-2.5):1:(1.5:-2.5)：(0.8-1.2)下制备的灵芝子实体孢子粉发酵液的多糖、多肽、多酚及总黄酮成分含量相对较高，当比例为2:1:2:1时即制备例1的方案时各成分的含量最高，说明采用本发明的四种菌种在上述比例范围内进行发酵，灵芝子实体和孢子粉中的有益成分提取率最高。
从制备例1-3和制备例6-8中的数据可以看出，采用四种菌种发酵比采用少于四种菌种发酵灵芝子实体和孢子粉中发酵液中的有益成分高。
从制备例1和制备例9-12的数据可以看出，采用本发明的孢子粉和子实体的质量比1：1下发酵得到的灵芝子实体和孢子粉中发酵液中的有益成分高。
从对比例1-4的数据中可以看出，采用水提制备灵芝子实体和孢子粉水提液、单独采用孢子粉或灵芝子实体发酵得到的发酵液中的有益成分较低，对于步骤(4)得到的菌体进行破碎处理，可以明显提高发酵液中的有益成分含量。
灵芝发酵液抑菌实验
(1)将表皮葡萄球菌ATCC12228接种于营养肉汤培养基，金黄色葡萄球菌ATCC6538接种于营养肉汤培养基，痤疮丙酸杆菌ATCC6919接种于GAM培养液，糠秕马拉色菌ATCC44344培养于橄榄油培养基。
(2)每种培养液各取10mL，各2份，分别加入0.1mL制备例1的灵芝发酵液和0.1mL去离子水作为空白对照。
(3)将表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌置于37℃下进行24h需氧培养，将痤疮丙酸杆菌、糠秕马拉色菌置于37℃下进行48h厌氧培养。
(4)用稀释平板法测定培养前后培养液中各种菌的数目，测试结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002709968110000131
表3数据可以看出，加入灵芝发酵液培养24h后，金黄色葡萄球菌的数量下降1个数量级，糠秕马拉色菌的数量也被抑制了，而痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的数量没有显著变化。说明本发明的灵芝发酵液可以作用于头皮微生物，特别是能够选择性抑制金黄葡萄球菌和糠秕马拉色菌，从而使头皮菌群达到平衡。将其用于头皮精华中，能够调节头皮微生态，达到去头屑、滋养头皮的效果。
本发明人也对制备例2-3、制备例6-10、制备例13-14进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。
抗炎数据
1、实验方法
将RAW264.7细胞接种至96孔板，用1μg/ml LPS进行诱导刺激，同时加入待测化合物(终浓度50μM)处理，设置不含药物组和L-NMMA阳性药物组做对照。细胞过夜培养后取培养基检测NO生成，在570nm处测定吸光值。在剩余培养基中加入MTS进行细胞存活率检测，排除化合物对细胞的毒性影响。
NO生成抑制率(％)＝(非药物处理组OD570nm-样品组OD570nm)/非药物处理组OD570nm×100％
IC50(50％concentration of inhibition)按Reed&Muench法计算。
2、试剂
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中科院上海细胞库，DMEM培养基和胎牛血清购自BI公司。Griess Reagent、LPS及对照药物L-NMMA购自Sigma公司。
3、实验结果
表4
Figure BDA0002709968110000141
Figure BDA0002709968110000151
4、结果分析
一氧化氮(nitric oxide,NO)具有广泛而重要的生物学调控功能，在炎症、肿瘤及心血管系统等均有重要作用。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(induced NO synthase，iNOS)，产生NO进行免疫应答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用LPS脂多糖诱导一氧化氮合成酶的生成，同时加入待测化合物处理，吸取培养基通过Griess法在570nm波长测吸光值来检测亚硝酸盐(NO2 -)。
从上表可以看出，采用本发明的方法制备的灵芝子实体孢子粉发酵液能够抑制一氧化氮的生成并且不产生细胞毒性，实施例1-12的数据可以看出，当采用灵芝子实体与孢子粉的质量比不在(10-1)：(1-10)范围内时，一氧化氮抑制率明显降低，实施例1与对比例1-4的数据可以看出，采用水提制备灵芝子实体和孢子粉水提液、单独采用孢子粉或灵芝子实体发酵得到的发酵液对一氧化氮的抑制率明显降低，进而证明本发明制备的灵芝发酵液具有较好的抗炎作用，且所述抗炎作用与本发明包括菌种选择、菌种之间的比例，灵芝子实体与孢子粉的质量比在内的多种参数在内的特定的发酵方法有明显关联。
实施例为头皮精华的制备
实施例1
(1)将纯水92.05份和羟丙基淀粉磷酸酯0.5份混合均匀得到A相备用；
将灵芝子实体孢子粉发酵液5份、甘油1份、咖啡因0.1份、泛醇0.05份、苯氧乙醇0.4份、乙基己基甘油0.1份、尿囊素0.05份和甘草酸二钾0.1份混合均匀得到B相备用；
将薄荷醇0.05份、PEG-40氢化蓖麻油0.5份和香精0.1份混合均匀得到C相备用；
(2)搅拌条件下，将A相加入搅拌锅中，加热至70℃后搅拌至混合均匀，然后冷却至室温；
(3)将B相加入搅拌锅中，搅拌至混合均匀；
(4)将C相加入到搅拌锅中并搅拌均匀，得到头皮精华。
实施例2～5和对比例5改变某一项实验参数，其它操作步骤和测试过程同实施例1，具体设置方式见表5。
表5
Figure BDA0002709968110000161
头皮使用测试
选取年龄范围18～60岁的35名女性志愿者，随机分为7组，每组5人。前6组为实验组，分别在使用普通市售洗发水洗头后使用上述实施例1～3和对比例5～7制备的头皮精华；最后一组为空白组，使用同种洗发水洗头后未使用头皮精华。根据使用者习惯，每天或隔天洗头，实验时间为28天。
头皮精华使用方法为：洗发后取2～5mL头皮精华涂抹于头皮表面。指腹按揉3～5分钟后直接吹干头发或自然晾干。
选取头顶正中作为测试部位，在实验第0，14，28天采用皮肤水分测试仪水分测试探头Corneometer CM825测试其头皮角质层含水量，测试三次取平均值，结果如表6所示；在实验第0，14，28天采用超小皮肤水分流失TEWL测试探头Tewameter TM Nano测试其头皮经皮失水，测试三次取平均值，结果如表7所示。
采用ASFS分值(adhere scalp flaking score，黏着性头皮鳞屑分值)对实施例1～5的人群进行临床评估，无可见脱屑为0分；发根偶见细小脱屑为1分；少量的大型脱屑或大量细小脱屑为3分；大量大型脱屑为4分。在实验开始第0天，14天，28天于洗头前进行评分，结果如表8所示。
表6
Figure BDA0002709968110000171
表7
Figure BDA0002709968110000172
Figure BDA0002709968110000181
从表6和7可知，实施例1～3均在第28天头皮角质层含水量上升，头皮经皮失水量下降，和空白组数据对比，说明含有灵芝发酵液的去屑头皮精华具有滋润头皮的作用，可以使头皮角质层水含量增加。头皮经皮失水减少意味着头皮屏障功能增强，以上对于减少头屑产生有一定帮助。
将实施例2与对比例5和6对比可知，添加发酵比例在(10-1):(1-10)之间的灵芝发酵液在保湿和头皮经皮失水上的功效比在该范围外的更好。
将实施例2与对比例7对比可知，使用添加了灵芝发酵液的头皮精华，使用者头皮角质层含水量上升及经皮失水量下降程度都比添加了灵芝水提液的头皮精华高，说明灵芝发酵液比灵芝水提液对头皮的保湿滋润滋润、屏障修复效果更好。
表8
ASFS分值 0天 14天 28天
实施例1 2.48 2.25 1.82
实施例2 2.22 1.81 1.39
实施例3 2.62 2.53 1.44
对比例5 2.18 2.01 1.56
对比例6 2.39 2.24 1.82
对比例7 2.21 2.11 1.76
空白组 2.49 2.47 2.44
从表8可知，从第0天至第28天，实施例1～3受试者的平均ASEF分值都在降低，对比未使用添加灵芝发酵液头皮精华的空白组，可见使用添加灵芝发酵液的头皮精华能够改善头屑。
将实施例2与对比例5和6对比可知，添加发酵比例在(10-1):(1-10)之间的灵芝发酵液在改善头屑上的效果比在该范围外的更好。
将实施例2与对比例7对比可知，使用添加了灵芝发酵液的头皮精华，使用者改善头屑的效果比添加了灵芝水提液的头皮精华好。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，其特征在于，以所述头皮精华的质量为100%计，包括以下质量百分含量的原料：灵芝子实体孢子粉发酵液5-15%，甘油1-5%，咖啡因0.1-0.5%，羟丙基淀粉磷酸酯0.5-4%，薄荷醇0.05-0.3%，泛醇0.05-0.5%，PEG-40氢化蓖麻油0.5-2%，香精0.1-0.5%，苯氧乙醇0.4-0.8%，乙基己基甘油0.1-0.5%，尿囊素0.05-0.3%，甘草酸二钾0.1-0.5%，余量为纯水；
所述灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法包括以下步骤：
（1）灵芝发酵基质制备：将灵芝子实体干燥，粉碎过80-120目筛处理，加入孢子粉，再加入蒸馏水制备成质量分数为7-13%的溶液，灭菌处理，得到灭菌后的灵芝发酵基质；
（2）菌种活化：采用平板划线法将菌种分别接种到培养基中，在30-37℃下培养44-52h，得到活化菌株；
（3）混合发酵：将所述的活化菌株进行扩大培养后进行混合，得到混合种子液，将所述的混合种子液加入到所述的灭菌后的灵芝发酵基质中，进行发酵，得到初始灵芝子实体孢子粉发酵液；
（4）发酵后处理：将所述的初始灵芝子实体孢子粉发酵液灭菌处理，菌体破碎，过滤，得到所述的灵芝子实体孢子粉发酵液；
步骤（3）中，混合种子液中青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌 CICC 10262、保加利亚乳杆菌 CICC 20271和酿酒酵母菌 CICC 1252的质量比为（1.5-2.5）:1:（1.5:-2.5）：（0.8-1.2）。
2.根据权利要求1所述头皮精华的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将所述纯水和羟丙基淀粉磷酸酯混合均匀得到A相备用；
将所述灵芝子实体孢子粉发酵液、甘油、咖啡因、泛醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油、尿囊素和甘草酸二钾混合均匀得到B相备用；
将薄荷醇、PEG-40氢化蓖麻油和香精混合均匀得到C相备用；
（2）搅拌条件下，将所述A相加入搅拌锅中，加热至70~75℃后搅拌至混合均匀，然后冷却至室温；
（3）将所述B相加入搅拌锅中，搅拌至混合均匀；
（4）将C相加入到搅拌锅中并搅拌均匀，得到所述头皮精华。
3.根据权利要求1所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，其特征在于，步骤（1）中，所述灵芝子实体与孢子粉的质量比为（10-1）：（1-10）。
4.根据权利要求3所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，其特征在于，步骤（1）中，所述灵芝子实体与孢子粉的质量比为1：1。
5.根据权利要求1所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，其特征在于，步骤（3）中，混合种子液中青春双歧杆菌CICC 6175、纳豆芽孢杆菌 CICC 10262、保加利亚乳杆菌 CICC 20271和酿酒酵母菌 CICC 1252的质量比为2:1:2:1。
6.根据权利要求1所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，其特征在于，步骤（3）中，混合种子液以1.5-2.5%的质量分数加入到所述灭菌后的灵芝发酵基质中。
7.根据权利要求1所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，其特征在于，步骤（3）中，发酵温度为35-45℃，在转速为100-150rpm的摇床上进行发酵44-52h。
8.根据权利要求1所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，其特征在于，步骤（1）和（4）中，灭菌处理为在121℃下灭菌15min或在600MPa，25℃下进行超高压灭菌。
9.根据权利要求1所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的头皮精华，其特征在于，步骤（4）中，菌体破碎采用高压匀浆机或超声破碎，过滤采用离心、超滤膜、微滤膜或反渗透过滤。
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