CN114028279B

CN114028279B - 一种灵芝自乳化油脂发酵液、发酵方法和应用

Info

Publication number: CN114028279B
Application number: CN202111247895.5A
Authority: CN
Inventors: 俞苓; 苏晓薇; 冯杰; 唐庆九; 张劲松; 刘艳芳; 王金燕; 王伊朋; 张丹豫
Original assignee: Hangzhou Huinong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Huinong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-26
Filing date: 2021-10-26
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2041-10-26
Also published as: CN114028279A

Abstract

本发明公开了一种灵芝自乳化油脂发酵液、发酵方法和应用。本发明的发酵方法包括：将灵芝种子液在包括0.3～1.0wt％的油脂和液体培养基的发酵培养基中发酵后，固液分离，获得灵芝发酵液。本发明通过以油脂为诱导物质，影响真菌细胞膜的结构、通透性和酶活性，刺激真菌的生长代谢，进而促进灵芝将外来的油脂吸收利用，从而得到活性成分好、抗氧化和保湿能力强的发酵液。本发明发酵所得的灵芝自乳化油脂发酵液可直接应用于化妆品中，既能作为化妆品配方中的活性成分，又可替代或者减少化妆品中表面活性剂的使用；本发明通过添加油脂增加灵芝活性物质的方法，成本较低，对环境无污染。

Description

一种灵芝自乳化油脂发酵液、发酵方法和应用

技术领域

本发明涉及一种灵芝自乳化油脂发酵液、发酵方法和应用，属于灵芝发酵技术领域。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，是我国名贵的药用真菌之一。始载于汉代《神农本草经》，具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿、维持机体平衡等功效。灵芝化学成分比较丰富，含有多糖、三萜、有机酸、可溶性蛋白质、氨基酸、生物碱、多肽等活性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、抗真菌、抗炎和抗氧化等作用。

灵芝活性物质主要是通过人工栽培子实体或液态深层发酵方式获得。液态深层发酵是指将食药用真菌的菌丝体培养于液态培养基中，在适宜的温度压力条件下通入无菌空气进行振荡培养，从而快速高效获得发酵产物。与传统的人工栽培相比，液态深层发酵方法有发酵周期短，生长速度快，不受季节影响，发酵条件更易控制，可以工业化连续生产，生产效益高等优点。现阶段液态深层发酵方式已经成为获得灵芝发酵产物的有利手段。

然而常规的液态深层发酵方式存在灵芝生长慢以及活性成分含量少的弊端，虽然本领域中也存在通过改变包括培养基各组分含量和发酵参数等培养条件来促进灵芝生长以及活性成分的增加的方式，但是通过改变上述工艺来优化增产具有一定的限制，不仅无法有效提高活性成分的含量和质量，同时会使得成本增加，一定程度上还会有所浪费。因而开发一种兼具成本低及可有效增加灵芝发酵液活性成分，进而提高其抗氧化和保湿性能的低成本的灵芝液态发酵方法仍为本技术领域迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明解决的技术问题是：开发一种兼具成本低及可有效增加灵芝发酵液活性成分，进而提高其抗氧化和保湿性能的低成本的灵芝液态发酵方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种灵芝自乳化油脂发酵液的发酵方法，包括：将灵芝种子液在发酵培养基中发酵后固液分离，获得灵芝发酵液；所述发酵培养基包括0.3wt％～1.0wt％的油脂和液体培养基。

优选地，所述的油脂包括橄榄油、葡萄籽油、甜杏仁油和仙人掌籽油中的至少一种。

优选地，所述发酵的条件为：搅拌转速150～180rpm，发酵温度26～28℃，发酵时间为8～12天。

优选地，所述灵芝种子液的接种量为8～12vol％。

优选地，所述灵芝种子液的制备方法包括将活化后的灵芝菌丝体，经液体培养基活化培养，得到灵芝种子液。

优选地，所述用于活化培养的液体培养基与所述发酵培养基中的液体培养基相同，所述液体培养基包括以下组分：无水葡萄糖20～30g/L、FM801酵母粉2～4g/L、磷酸二氢钾1.5～2g/L和七水合硫酸镁1.5～2g/L。

本发明还提供了上述灵芝自乳化油脂发酵液的发酵方法发酵得到的灵芝自乳化油脂发酵液，所述灵芝自乳化油脂发酵液的灵芝多糖含量为2.73～6.91g/L，还原糖含量为4.42～8.73g/L，DPPH自由基清除率为53.63～88.42％，过氧化氢清除率为90.50～96.40％，超氧阴离子清除率为93.95～97.32％。

本发明还提供了上述的灵芝自乳化油脂发酵液在制备化妆品中的应用。

优选地，所述化妆品包括化妆水、精华、乳液或面膜。

优选地，所述应用中，灵芝自乳化油脂发酵液的安全添加浓度为小于10vol％。

在本发明中，所述灵芝菌种优选包括赤芝(Ganoderma lucidum)；本发明对所述赤芝的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

1.本发明通过以油脂为诱导物质，影响真菌细胞膜的结构、通透性和酶活性，刺激真菌的生长代谢，进而促进灵芝将外来的油脂吸收利用，从而得到活性成分好、抗氧化和保湿能力强的发酵液；

2.本发明所添加的油脂为天然植物油脂，绿色安全；灵芝在包含上述油脂的发酵培养基中发酵，所得的灵芝自乳化油脂发酵液可直接应用于化妆品中，既能作为化妆品配方中的活性成分，又可替代或者减少化妆品中表面活性剂的使用；本发明通过添加油脂增加灵芝活性物质的方法，成本较低，对环境无污染。

附图说明

图1为实施例4(右图)与对比例1(左图)中灵芝自乳化油脂发酵液的颜色对比；

图2为实施例12(右图)与对比例1(左图)中灵芝自乳化油脂发酵液的颜色对比；

图3为实施例10(右图)对比例1(左图)中灵芝自乳化油脂发酵液的颜色对比；

图4为实施例14(右图)与对比例1(左图)中灵芝自乳化油脂发酵液的颜色对比；

图5为实施例4、实施例12、实施例10、实施例14和对比例1中灵芝自乳化油脂发酵液的颜色对比；

图6为实施例4(0.5％橄榄油)、实施例10(0.5％葡萄籽油)、实施例12(0.5％甜杏仁油)、实施例14(0.5％仙人掌籽油)和对比例1(对照)中灵芝自乳化油脂发酵液以及甘露醇的吸湿率；

图7为实施例1(0.3％橄榄油)、实施例4(0.5％橄榄油)、实施例7(0.7％橄榄油)和对比例1(对照)中灵芝自乳化油脂发酵液以及甘露醇的吸湿率；

图8为实施例2(0.3％橄榄油)、实施例5(0.5％橄榄油)、实施例8(0.7％橄榄油)和对比例2(对照)中灵芝自乳化油脂发酵液以及甘露醇的吸湿率；

图9为实施例3(0.3％橄榄油)、实施例6(0.5％橄榄油)、实施例9(0.7％橄榄油)和对比例3(对照)中灵芝自乳化油脂发酵液以及甘露醇的吸湿率；

图10为实施例4(0.5％橄榄油)、实施例10(0.5％葡萄籽油)、实施例12(0.5％甜杏仁油)、实施例14(0.5％仙人掌籽油)和对比例1(对照)中灵芝自乳化油脂发酵液以及甘露醇的保湿率；

图11为实施例1(0.3％橄榄油)、实施例4(0.5％橄榄油)、实施例7(0.7％橄榄油)和对比例1(对照)中灵芝自乳化油脂发酵液以及甘露醇的保湿率；

图12为实施例2(0.3％橄榄油)、实施例5(0.5％橄榄油)、实施例8(0.7％橄榄油)和对比例2(对照)中灵芝自乳化油脂发酵液以及甘露醇的保湿率；

图13为实施例3(0.3％橄榄油)、实施例6(0.5％橄榄油)、实施例9(0.7％橄榄油)和对比例3(对照)中灵芝自乳化油脂发酵液以及甘露醇的保湿率；

图14为实施例4中灵芝自乳化油脂发酵液的在细胞毒性试验中的细胞增殖率；

图15为实施例16中的化妆水的皮肤水分含量增长率。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

在本发明的以下实施例中，所用到的灵芝菌株可具体选用赤芝菌株G0023(南韩灵芝)、G0119(沪农灵芝)或G0160(大仙823)；所述赤芝由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心上海食用菌分中心提供。

实施例1

一种灵芝自乳化油脂发酵液的制备方法，步骤如下：

菌种活化：取灵芝菌株G0023于超净工作台上，使用无菌接种铲将菌斜面切成小块，取1块接种于平板培养皿上中进行活化培养，培养皿中装有25mLPDA固体培养基，培养温度为26℃，培养时间为7d。

灵芝种子液培养：将活化后的灵芝菌株切割成3～5块，然后接种于液体培养基(无水葡萄糖为30g/L、FM801酵母粉为4g/L、磷酸二氢钾为1.5g/L、七水合硫酸镁为1.5g/L)中，在培养温度为26℃、搅拌转速为150rpm的条件下活化培养7d，得到灵芝种子液。

灵芝液态发酵：将灵芝种子液接种到发酵培养基(无水葡萄糖为30g/L、FM801酵母粉为4g/L、磷酸二氢钾为1.5g/L、七水合硫酸镁为1.5g/L，橄榄油为3g/L)中进行发酵，培养温度为26℃，搅拌转速为150rpm，接种量为10vol％，发酵时间为8d，得到灵芝发酵产物。

灵芝自乳化油脂发酵液的获得：将上述灵芝发酵物，在转速为8000rpm的条件下离心，离心转速为8000rpm，得到上清液即为灵芝自乳化油脂发酵液。

实施例2

与实施例1相比，灵芝种子液的发酵天数为10天。

实施例3

与实施例1相比，灵芝种子液的发酵天数为12天。

实施例4

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为5g/L橄榄油。

实施例5

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为5g/L橄榄油，灵芝种子液的发酵天数为10天。

实施例6

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为5g/L橄榄油，灵芝种子液的发酵天数为12天。

实施例7

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为7g/L橄榄油。

实施例8

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为7g/L橄榄油，灵芝种子液的发酵天数为10天。

实施例9

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为7g/L橄榄油，灵芝种子液的发酵天数为12天。

实施例10

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为5g/L葡萄籽油。

实施例11

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为7g/L葡萄籽油

实施例12

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为5g/L甜杏仁油。

实施例13

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为7g/L甜杏仁油。

实施例14

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为5g/L仙人掌籽油。

实施例15

与实施例1相比，发酵培养基中添加的油脂为7g/L仙人掌籽油。

对比例1

与实施例1相比，发酵培养基中不添加油脂。

对比例2

与实施例1相比，发酵培养基中不添加油脂，灵芝种子液的发酵时间为10d。

对比例3

与实施例1相比，发酵培养基中不添加油脂，灵芝种子液的发酵时间为12d。

实施例16

将实施例4中制备得到的灵芝自乳化油脂发酵液制备为化妆水，其配方如表1所述：

表1灵芝化妆水配方

实施例17

将实施例4中制备得到的灵芝自乳化油脂发酵液制备为精华，其配方如表2所示：

表2灵芝精华配方

实施例18

将实施例4中制备得到的灵芝自乳化油脂发酵液制备为面膜，其配方如表3所示：

表3灵芝面膜配方

实施例19

将实施例4中制备得到的灵芝自乳化油脂发酵液制备为乳液，其配方如表4所示：

表4灵芝乳液配方

应用例1

通过对实施例1～15及对比例1～3中获得的灵芝自乳化油脂发酵液进行拍照观察灵芝发酵的自乳化现象，其中结果如图1～5所示。

由图1～5可知，通过在灵芝液态深层发酵过程中添加油脂，可以促进灵芝的自乳化，实施例中得到的发酵液的颜色较对比例更纯净透白。

应用例2

对实施例1～15及对比例1获得的灵芝自乳化油脂发酵液分别进行pH值、还原糖和灵芝多糖的检测，检测结果如表5所示。

其中，pH的检测方法为：通过使用pH计对发酵液进行检测；

还原糖的检测方法为：参考GB 5009.7-2016食品安全国家标准食品中还原糖的测定方法进行检测；

灵芝多糖的检测方法为：参考GB/T 15672-2009食用菌中总糖含量的测定。

表4实施例及对比例获得的灵芝自乳化发酵液的理化检测结果

由表1可得，采用本发明提供的灵芝液态深层发酵方法得到的灵芝自乳化油脂发酵液中的灵芝多糖的含量为2.93～6.91g/L，显著高于对比例中得到的灵芝多糖的含量；同时，在相同的发酵时间下，对比例中未添加油脂的还原糖要比实施例中添加油脂的还原糖低，说明添加油脂的灵芝发酵先利用了油脂，将充分自乳化，产生活性物质。未添加油脂的灵芝发酵的还原糖随着发酵时间越来越长，越来越低，说明灵芝发酵充分利用了葡萄糖，从而产生更多的活性物质；另外，pH呈酸性，说明发酵液呈正常状态，在相同的发酵时间下，实施例中添加油脂的发酵液要比对比例中未添加油脂的发酵液pH值低，说明油脂已经被转化，与发酵液结合在了一起。

应用例3

对实施例1～15和对比例1～3得到的灵芝自乳化油脂发酵液进行抗氧化性能的检测，具体包括对DPPH自由基清除率、过氧化氢(H₂O₂)清除能力和超氧阴离子(O^2-)清除能力的检测，检测结果如表5所示。

(一)DPPH自由基清除率的检测：

分别取实施例1～15和对比例1～3中得到的灵芝自乳化油脂发酵液各2mL于5mL棕色容量瓶中，加入2mL 0.1mmol/LDPPH工作溶液，摇匀后置于避光处，使其反应30min后，立即用酶标仪扫描上述灵芝自乳化油脂发酵液在517nm处的吸光度记作A_i；用无水乙醇代替DPPH溶液在相同条件下测得的样品溶液的吸光度记作A_j；以去离子水代替样品溶液在相同条件下测定的空白吸光度记作A₀。按公式计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率的计算公式如下：

式中的A_i表示样品溶液与DPPH溶液反应后的吸光度；A_j表示用无水乙醇代替DPPH溶液测得样品溶液的吸光度；A₀表示以去离子水代替样品溶液的空白吸光度。

(二)过氧化氢(H₂O₂)清除能力的检测：

参考过氧化氢-鲁米诺体系分别测定实施例1～15和对比例1～3中得到的灵芝自乳化油脂发酵液对过氧化氢(H₂O₂)的清除能力，配置0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(pH＝9.5)与1mmol/L的鲁米诺溶液，并以17:1的体积比例配制成鲁米诺-碳酸盐发光液。测量时向发光池中先注入10μL的样品溶液，后注入10μL 6％的过氧化氢溶液以及150μL的上述鲁米诺-碳酸盐发光液，反应1.5s，设置化学发光仪连续记录实验数据5s，得到发光峰值A₁，将超纯水代替样品得到发光峰值A₀。其中，化学发光体系的测定条件为：高压800V；光谱扫描范围180～800nm；测试温度25℃。

其中，过氧化氢(H₂O₂)清除率的计算公式如下：

式中的A₁表示样品检测数据；A₀表示空白对照检测数据。

(三)超氧阴离子(O^2-)清除能力的检测：

参考邻苯三酚-鲁米诺体系测定实施例1～15和对比例1～3中得到的灵芝自乳化油脂发酵液分别对超氧阴离子(O^2-)清除活性。具体为配制0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(pH＝10)与1mmol/L的鲁米诺溶液，以2:1的比例配制成鲁米诺—碳酸盐发光液。测量时向发光池中注入10μL样品溶液，再注入10μL6.25×10^-4mol/L的邻苯三酚和150μL的鲁米诺～碳酸盐缓冲液，反应2s，设置化学发光仪连续记录实验数据30s，得到发光峰值A₁，将超纯水代替样品得到峰值A₀。

其中，清除率的计算公式如下：

式中的A₁表示样品检测数据，A₀表示空白对照检测数据

表5实施例和对比例得到的灵芝自乳化油脂发酵液的抗氧化性结果

由上表可知，本采用本发明提供的灵芝液态深层发酵方法得到的灵芝自乳化油脂发酵液的DPPH自由基清除率为53.63％～88.42％，过氧化氢清除率为90.50％～96.40％，超氧阴离子清除率为93.95％～97.32％；对比例中的DPPH自由基清除率为30.11％～47.44％，过氧化氢清除率为88.35％～91.87％，超氧阴离子清除率为89.31％～92.09％。由此可见，本发明制备得到的灵芝自乳化油脂发酵液的DPPH自由基清除能力、过氧化氢清除能力和超氧阴离子清除能力均显著高于对比例，其具备较高的抗氧化性能。

应用例4

对实施例1～15和对比例1～3得到的灵芝自乳化油脂发酵液进行吸湿保湿性能的检测。

(一)吸湿能力检测：

以实施例1～15和对比例1～3得到的灵芝自乳化油脂发酵液分别作为样品，将0.5g各样品以及0.5g甘露醇(对照)分别放置于小培养皿中，随后放入温度为25℃，相对湿度为81％的干燥器内，放置一段时间后，精确称取各试样的质量，由样品吸湿前和吸湿后的质量差求吸湿率，检测结果如表7和图6～9所示。

其中，吸湿率计算公式为：

式中的M₀为称量样品吸湿前质量，M_n为样品吸湿一定时间后质量。

表7实施例1～15和对比例1～3得到的灵芝自乳化油脂发酵液的吸湿率

(二)保湿能力检测：

将吸湿能力检测中吸湿达到饱和的样本在温度为25℃，相对湿度为43％的恒温恒湿箱内继续放置，48h后精确称取各试样质量，由试样前后的质量差求保湿率，检测结果如表8和图10～13所示。

其中，保湿率的计算公式如下：

式中H₀为放置前水分质量，H_n为放置一段时间后水分质量。

表8实施例1～15和对比例1～3得到的灵芝自乳化油脂发酵液的保湿率

由表7～8及图6～13可知，添加油脂进行发酵得到的灵芝发酵液与对照相比，要比对照的吸湿保湿能力强，且通过添加橄榄油进行发酵的过程中，添加浓度为0.5％时，吸湿保湿能力效果最好，吸湿能力在第8天达到最优，保湿能力在第12天达到最佳。其中图6为实施例4、10、12、14，对比例1和甘露醇对照组中发酵得到的灵芝发酵液的吸湿率；图7为实施例1、4、7，对比例1和甘露醇对照组中发酵得到的灵芝发酵液的吸湿率；图8为实施例2、5、8，对比例2和甘露醇对照组中发酵得到的灵芝发酵液的吸湿率；图9为实施例3、6、9，对比例3和甘露醇对照组中发酵得到的灵芝发酵液的吸湿率。图10为实施例4、10、12、14，对比例1和甘露醇对照组中发酵得到的灵芝发酵液的保湿率；图11为实施例1、4、7，对比例1和甘露醇对照组中发酵得到的灵芝发酵液的保湿率；图12为实施例2、5、8，对比例2和甘露醇对照组中发酵得到的灵芝发酵液的保湿率；图13为实施例3、6、9，对比例3和甘露醇对照组中发酵得到的灵芝发酵液的保湿率。

应用例5

对实施例4制备得到的灵芝自乳化油脂发酵液进行安全性检测，包括细胞毒性和斑贴试验。

(一)细胞毒性检测：

采用角质细胞为功效评价模型，测试实施例4所得的灵芝自乳化油脂发酵液的细胞毒性。将处于指数生长期的角质细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打均匀，将细胞按2×104cells/孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，于37℃，5％CO₂环境中培养过夜；过夜后，将添加有上述灵芝自乳化油脂发酵液样本胎牛血清(FBS)培养基及未添加上述样本的胎牛血清(FBS)培养基分别作用于角质细胞，每个样本浓度(0.625％、1.25％、2.50％、5％和10％)做3个复孔，每孔100μL，在5％CO2、37℃环境中孵育48h；在测定细胞增殖率时，将孔板中的培养基弃去，并用磷酸盐缓冲液清洗两次后，每孔加入100μL含10％CCK～8试剂的培养基，置37℃中染色2h，置于酶标仪中，以490nm为上述样本的测量波长，630nm为参照波长测定吸光值，检测结果如表9和图14所示。

其中，细胞相对存活率的公式如下：

表9实施例4中的灵芝自乳化油脂发酵液的细胞毒性结果

通过细胞毒性实验可以看出，在本发明制备得到的灵芝自乳化油脂发酵液的体积分数为5％及以下时并不影响细胞的存活率，甚至在0.625％至1.25％时可以帮助细胞增长；而在10％时会出现抑制现象。

(二)斑贴实验：

采用斑贴实验测定实施例4得到的灵芝自乳化油脂发酵液对人皮肤的刺激性。具体方法如下：选择30名志愿者，男女各15名，将灵芝自乳化发酵液约0.020mL涂于斑试器小室中，外用专用胶带贴敷于受试者前臂曲侧，24h后除去斑试器，分别于去除斑试器后0.5h，24h观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015)中皮肤反应分级标准记录其结果，其中空白对照为不添加任何物质的空白斑贴，结果如表10所示。

表10实施例4中的灵芝自乳化油脂发酵液的试验结果

通过人体皮肤斑贴试验可以看出，本发明的灵芝自乳化油脂发酵液的30例受试者中无不良反应。说明本发明提供的灵芝发酵液可以直接接触皮肤，预示其加入在化妆品重具有较好的安全性。

应用例6

对实施例16中得到的化妆水进行刺激性和保湿能力测试。

(一)斑贴实验：

采用斑贴实验测定上述化妆水对人皮肤的刺激性。具体方法如下：选择30名志愿者，男女各15名，将受试物约0.020mL涂于斑试器小室中，外用专用胶带贴敷于受试者前臂曲侧，24h后除去斑试器，分别于去除斑试器后0.5h，24h观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015)中皮肤反应分级标准记录其结果，其中空白对照为不添加任何物质的空白斑贴，如表11所示。

表11实施例16制备得到的化妆水的斑贴试验结果

由表11可知，采用本发明中灵芝自乳化油脂发酵液制备得到的化妆水在斑贴试验中未发现不良反应，说明本发明提供的发酵液可直接应用于化妆水的制备，其具有较高安全性。

(二)保湿能力测试：

选取30名年龄20-45周岁的志愿者，志愿者清洁手臂后，在恒温恒湿环境下(温度20-24℃，湿度40-60％)，平衡30min测试皮肤水分。每处测试区域为5cm×5cm，测量手臂测试区域的空白值，然后按每平方厘米2mg样品的用量将实施例16所得的化妆水涂抹于手臂相应区域，分别于即时涂抹、15min、45min、1h45min、2h45min、3h45min、4h45min和5h45min后测定皮肤水分，比较皮肤水分含量增长率。试用后，测试者均未出现刺激或者过敏现象，结果如图15所示。

皮肤水分含量(MMV)增长率＝(涂抹后t时段皮肤的含水量-涂抹前皮肤的含水量)/涂抹前皮肤的含水量×100％。

从图15可以看出实施例16制备的化妆水的MMV在涂抹后达到最佳保湿效果，并逐渐降低，测试期间皮肤MMV增长率均大于0，由此表明采用本发明提供的灵芝油脂自乳化发酵液制备的化妆水保湿效果好，且具有较强的持久保湿能力。

由上述实施例和应用例可知，本发明提供的灵芝自乳化油脂的液态深层发酵方法可以提高灵芝自乳化油脂发酵液中灵芝多糖的含量，进而可有效提高发酵液的抗氧化能力和保湿能力，且灵芝自乳化油脂发酵液安全无刺激，可进一步应用于化妆水、精华、乳液和面膜的制备。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种灵芝自乳化油脂发酵液的发酵方法，其特征在于，包括：将灵芝种子液在发酵培养基中发酵后固液分离，获得灵芝发酵液；所述发酵培养基包括0.3wt%~1.0wt%的油脂和液体培养基；

所述的油脂为葡萄籽油、甜杏仁油和仙人掌籽油中的至少一种；

所述灵芝自乳化油脂发酵液的灵芝多糖含量为2.73~6.91g/L，还原糖含量为4.42~8.73g/L，DPPH自由基清除率为53.63%~88.42%，过氧化氢清除率为90.50%~96.40%，超氧阴离子清除率为93.95%~97.32%；

所述发酵的条件为：搅拌转速150~180 rpm，发酵温度26~28℃，发酵时间为8~12天；

所述灵芝种子液的接种量为8~12vol%；

所述用于活化培养的液体培养基与所述发酵培养基中的液体培养基相同，所述液体培养基包括以下组分：无水葡萄糖20~30g/L、FM801酵母粉2~4g/L、磷酸二氢钾1.5~2g/L和七水合硫酸镁1.5~2g/L。

2.根据权利要求1所述的灵芝自乳化油脂发酵液的发酵方法，其特征在于，所述灵芝种子液的制备方法包括将活化后的灵芝菌丝体，经液体培养基活化培养，得到灵芝种子液。

3.权利要求1或2所述灵芝自乳化油脂发酵液的发酵方法发酵得到的灵芝自乳化油脂发酵液。

4.权利要求3所述的灵芝自乳化油脂发酵液在制备化妆品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述化妆品包括化妆水、精华、乳液或面膜。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用中，灵芝自乳化油脂发酵液的安全添加浓度为小于10vol%。