CN115572754A - 一种评价食药用菌液体菌种活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种评价食药用菌液态菌种活力的方法，该方法包括如下步骤：(1)食药用菌液体菌种预处理：将食药用菌液体菌种进行匀浆处理，得到分散均匀的液体菌种；取匀浆后液体菌种，用培养基稀释，得到液体菌种稀释液；(2)向液体菌种稀释液中加入浓度为10mg/mL阿尔玛蓝试剂，混合均匀，于摇床中26℃，150rpm条件下避光孵育30min后，采用荧光分光光度计进行荧光值F590的测定并进行Alamar Blue还原率的计算。本发明提供的评价食药用菌液态菌种活力的方法，可以快速且有效的检测出液态菌种的活力表征问题，在实际生产过程中可以快速检测实时反应菌株活力的变化，为食药用菌的液体菌种化可持续生产提供了保障。
Description
技术领域
本发明涉及食药用菌领域，具体的说涉及一种评价食药用菌液体菌种活力的方法。
背景技术
食药用菌含有丰富的生物活性物质，在人类的健康、疾病治疗中有着重要贡献和意义。液体菌种是食药用菌生长及材料获取主要方式之一，是食药用菌产业化发展的大趋势。液体菌种的活力是保证食药用菌材料质量的基础和前提，食药用菌液体菌种活力与其代谢活性密切相关，但目前缺乏高效、快速的食药用菌液体菌种活力的评价方法，因此制约着食药用菌产业的可持续高质量发展。
目前，据文献报道(①刘海娟等，白灵菇液体发酵菌种培养终点初探[J].食用菌，2022,44(01):13-16+23。②李德天。杏鲍菇液体菌种生产技术参数优化及菌丝活力变化的研究[D].东北农业大学，2021.DOI:10.27010/d.cnki.gdbnu.2021.000818。③朱海峰。黑木耳液体菌种老化评价指标的研究[D].东北农业大学，2021.DOI:10.27010/d.cnki.gdbnu.2021.000564。④花纪。药用真菌裸脚菇和灵芝营养需求及其液体菌种制备工艺研究[D].江西农业大学，2019.DOI:10.27177/d.cnki.gjxnu.2019.000412.)关于食药用菌液体菌种的活力评价主要依据液体菌种对底物的利用率、目标产物产量、酶的活性等指标来间接评价液体菌种在某些方面的活力，无法较为全面地直接反映液体菌种的整体代谢活力。此外，在食药用菌等大型真菌中存在定量困难等问题，使得液体菌种活力更难被表征。
因此，需要开发一种有效全面的评价液体菌种的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种评价食药用菌液态菌种活力的方法，该方法包括如下步骤：
(1)食药用菌液体菌种预处理：将食药用菌液体菌种进行匀浆处理，得到分散均匀的液体菌种；取匀浆后液体菌种，用培养基稀释，得到液体菌种稀释液；
(2)向液体菌种稀释液中加入浓度为10mg/mL阿尔玛蓝试剂(Alamar Blue)，混合均匀，于摇床中26℃，150rpm条件下避光孵育30min后，采用荧光分光光度计进行荧光值F590的测定并进行Alamar Blue还原率的计算；
其中，Alamar Blue还原率(％)＝(实验组F590-阴性对照组F590)/(阳性对照F590-阴性对照组F590)×100
其中，F590为590nm波长荧光；阴性对照为培养基；阳性对照为10mg/mL AlamarBlue。
其中步骤(1)中对液体菌种进行匀浆处理的条件为：Waring-Blender型匀浆机，低速8000r/min匀浆10-30s，间歇5s，重复操作3次；取一定湿重匀浆后的液体菌种，用培养基稀释，得到液体菌种稀释液，液体菌种与培养基的重量体积比为：0.5-50g液体菌种/1000ml培养基；其中培养基的配方如下(单位g/L)：葡萄糖10-50、酵母浸粉2-10、磷酸氢二钾1-8、七水硫酸镁1-8，余量为水；
其中步骤(2)中阿尔玛蓝试剂的配制：采用PBS缓冲液配制浓度为10mg/mL阿尔玛蓝试剂，现用现配放于4℃保存。
本发明提供的评价食药用菌液体菌种活力的方法的创新点：
本发明的食药用菌液态菌种的活力测定方法，可以快速且有效的检测出液态菌种的活力表征问题，在实际生产过程中可以快速检测实时反应菌株活力的变化，为食药用菌的液体菌种化可持续生产提供了保障。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
灵芝菌株：Ganoderma lingzhi GZ36(由上海市农业科学院食用菌研究所提供和保藏，保藏编号GZ36)。
将活化后的灵芝菌株的菌丝体转入摇瓶培养。其中，摇瓶、用于稀释及发酵罐的培养基配方如下：(单位g/L)：葡萄糖14.5、酵母粉8.5、磷酸二氢钾1.5、七水硫酸镁1.5；余量为水，121℃灭菌30min冷却后使用；
将液体菌种进行匀浆处理，得到分散均匀的液体菌种；所述匀浆处理采用低速8000r/min匀浆10s，间歇5s，重复操作3次；
取湿重0.5g匀浆后的液体菌种，用培养基稀释至100mL，得到液体菌种稀释液；
加入1mL浓度为10mg/mL阿尔玛蓝试剂，混合均匀，于摇床中26℃，150rpm条件下避光孵育30min后，采用荧光分光光度计进行荧光值(F590)的测定并进行Alamar Blue还原率的计算，以Alamar Blue还原率来表征液体菌种的活力。其中，Alamar Blue还原率(％)＝(实验组F590-阴性对照组F590)/(100％还原型阳性对照F590-阴性对照组F590)×100
注：F590＝590nm波长荧光，阴性对照：培养基；阳性对照：10mg/mL Alamar Blue
在灵芝菌株培养的过程中，我们定义底物利用率大于等于90％时，Alamar Blue还原率大于等于500％时，菌株活力较好，且还原率越高，菌株活力越好。灵芝GZ36液体菌种活力，如表1结果所示，Alamar Blue还原率均大于500％，说明菌株活力很好。且在不同发酵规模条件下，液体菌种底物利用率为93％-95％时，不同Alamar Blue还原率的液体菌种所需发酵时间不同，活力较高的液体菌种，在相同底物利用率的情况下所用的时间较少。
实施例2
灵芝菌株：Ganoderma lingzhi G0023(由上海市农业科学院食用菌研究所提供和保藏，保藏号G0023)。
将活化后的灵芝菌株的菌丝体转入摇瓶培养。其中，摇瓶、稀释及发酵罐培养基配方如下，单位(g/L)：葡萄糖14.5、酵母粉8.5、磷酸二氢钾1.5、七水硫酸镁1.5，余量为水；121℃灭菌30min冷却后使用；
将液体菌种进行匀浆处理，得到分散均匀的液体菌种；所述匀浆处理采用低速8000r/min匀浆10s，间歇5s，重复操作3次；
取湿重0.5g匀浆后的液体菌种，用培养基稀释至100mL，得到液体菌种稀释液；
加入1mL浓度为10mg/mL阿尔玛蓝试剂，混合均匀，于摇床中26℃，150rpm条件下避光孵育30min后，采用荧光分光光度计进行荧光值(F590)的测定并进行Alamar Blue还原率的计算，以Alamar Blue还原率来表征液体菌种的活力。其中，Alamar Blue还原率(％)＝(实验组F590-阴性对照组F590)/(100％还原型阳性对照F590-阴性对照组F590)×100
注：F590＝590nm波长荧光，阴性对照：液体培养基；阳性对照：10mg/mL AlamarBlue。
在灵芝菌株培养的过程中，我们定义底物利用率大于等于90％时，Alamar Blue还原率大于等于500％时，菌株活力较好，且还原率越高，菌株活力越好。灵芝G0023液体菌种活力，如表1结果所示，250mL发酵规模培养10天，Alamar Blue还原率为550.05％，说明菌株活力较好。
实施例3
棘托竹荪：Dictyophora indusiata ZS03(由上海市农业科学院食用菌研究所提供和保藏，保藏号ZS03)。
将活化后的棘托竹荪菌株的菌丝体转入摇瓶培养。其中，摇瓶、稀释及发酵罐培养基配方如下，单位(g/L)：葡萄糖14.5、酵母粉8.5、磷酸二氢钾1.5、七水硫酸镁1.5，余量为水；121℃灭菌30min冷却后使用；
将液体菌种进行匀浆处理，得到分散均匀的液体菌种；所述匀浆处理采用低速匀浆10s，间歇5s，重复操作3次；
取湿重0.5g匀浆后的液体菌种，用培养基稀释至100mL，得到液体菌种稀释液；
加入1mL浓度为10mg/mL阿尔玛蓝试剂，混合均匀，于摇床中26℃，150rpm条件下避光孵育30min后，采用荧光分光光度计进行荧光值(F590)的测定并进行Alamar Blue还原率的计算，以Alamar Blue还原率来表征液体菌种的活力。其中，Alamar Blue还原率(％)＝(实验组F590-阴性对照组F590)/(100％还原型阳性对照F590-阴性对照组F590)×100
注：F590＝590nm波长荧光，阴性对照：培养基；阳性对照：10mg/mL Alamar Blue。
在棘托竹荪菌株培养的过程中，我们定义底物利用率大于等于80％时，AlamarBlue还原率大于等于300％时，菌株活力较好，且还原率越高，菌株活力越好。棘托竹荪液体菌种活力，如表1结果所示，Alamar Blue还原率为457.07％，250mL发酵规模培养25天，底物利用率为80.05％，说明该菌株活力较好。
表1实施例1-3中Alamar Blue还原率
Claims (2)
1.一种评价食药用菌液态菌种活力的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)食药用菌液体菌种预处理：将食药用菌液体菌种进行匀浆处理，得到分散均匀的液体菌种；取匀浆后液体菌种，用培养基稀释，得到液体菌种稀释液；
(2)向液体菌种稀释液中加入浓度为10mg/mL阿尔玛蓝试剂，混合均匀，于摇床中26℃，150rpm条件下避光孵育30min后，采用荧光分光光度计进行荧光值F590的测定并进行Alamar Blue还原率的计算。
2.根据权利要求1所述的评价食药用菌液态菌种活力的方法，
其中步骤(1)中对液体菌种进行匀浆处理的条件为：Waring-Blender型匀浆机，低速8000r/min匀浆10-30s，间歇5s，重复操作3次；取一定湿重匀浆后的液体菌种，用培养基稀释，得到液体菌种稀释液，液体菌种与培养基的重量体积比为：0.5-50g液体菌种/1000ml培养基；其中培养基的配方如下：葡萄糖10-50、酵母浸粉2-10、磷酸氢二钾1-8、七水硫酸镁1-8，余量为水，单位g/L。
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