CN111751345A - 一种苜蓿黄萎病菌活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种苜蓿黄萎病菌活性检测方法。本申请的活性检测方法包括，采用苜蓿黄萎病菌分生孢子制备孢子悬浮液；0.05mg/mL碘化丙啶染料:孢子悬浮液按1:200体积比混匀，室温避光染色10‑15分钟；染色后立即离心，去上清液，用灭菌去离子水洗涤，最后加灭菌去离子水混匀避光放置；采用激光扫描共聚焦显微镜检测，激发波长534nm，发射波长617nm；随机扫描至少30个孢子，如有孢子无荧光，则判定孢子有活性，如所有孢子均呈红色荧光，则判定孢子无活性。本申请方法，能直接观察孢子死活，仅需约30分钟即可完成检测，具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，为口岸检疫、植物保护等部门提供了一种新的检测方法。
Description
技术领域
本申请涉及苜蓿黄萎病菌检测技术领域，特别是涉及一种苜蓿黄萎病菌活性检测方法。
背景技术
苜蓿黄萎病菌(Verticillium albo-atrum)属丝孢纲丝孢目丛梗孢科轮枝孢属，主要危害苜蓿、马铃薯等经济作物。苜蓿有“牧草之王”的美称，在畜牧业发展中有至关重要的作用；苜蓿被感染后会导致黄萎病，对苜蓿生产造成巨大的经济损失，因此称为苜蓿黄萎病菌。
目前，苜蓿黄萎病菌广泛分布于除南极洲以外的各大洲，遍及欧洲、美国、加拿大、墨西哥、新西兰、日本等。研究显示，苜蓿黄萎病菌可以通过多种途径传播，例如，种子带菌传播、牧草传播、饲料传播、土壤传播等；另外也可以通过风、灌溉水、昆虫等媒介进行传播；其中，种子带菌传播是苜蓿黄萎病菌远距离传播的关键。
为了保障畜牧业生产的安全，苜蓿黄萎病菌已经被列为进境植物检疫一类危险性病原真菌。因此，苜蓿黄萎病菌检测，尤其是活性检测，对检验检疫部门具有重要意义。
目前，苜蓿黄萎病菌的活性检测主要采用传统的形态学鉴定和致病性检测，该方法主要包括：先对疑似带菌的苜蓿种子进行培养；然后显微镜观察，根据轮枝状分生孢子梗和分生孢子的着生情况检出带菌种子；进一步的，对挑取的孢子进行培养，并采用培养物对苜蓿幼苗进行感染；最后，还需要提取被感染的苜蓿幼苗的组织块进行培养，观察菌落性状和病原菌特征。以上方法虽然能够比较完善的判断苜蓿黄萎病菌的活性和致病性；但是，所需时间较长，而且对操作人员的技术要求较高，主观依耐性较强，不能很好的满足快速检验检疫的使用需求。在苜蓿黄萎病菌的相关研究报道中，也有采用PCR扩增技术对苜蓿黄萎病菌进行检测鉴定；但是，分子检测只能鉴定样品中是否含有苜蓿黄萎病菌成份，不能检测苜蓿黄萎病菌的活性。
另外，有研究报道显示，可以采用荧光染料对病原菌的孢子进行活性检测，可以快速判断孢子的活性，例如大豆的一些病原菌活性检测、美澳型核果褐腐病菌活性检测等；但是，目前尚未有荧光染料检测苜蓿黄萎病菌活性的相关研究和报道。
因此，针对现有的苜蓿黄萎病菌主要采用传统形态学鉴定和致病性检测进行活性检测的问题，为了能够更好的保护苜蓿和畜牧业的生产安全，亟需研发一种更快速、简单、有效的苜蓿黄萎病菌活性检测方法。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的苜蓿黄萎病菌活性检测方法。
本申请采用了以下技术方案：
本申请公开了一种苜蓿黄萎病菌活性检测方法，包括以下步骤：
制备孢子悬浮液步骤，包括将苜蓿黄萎病菌的分生孢子挑取到灭菌水中，配制成浓度大于10个孢子/μL的孢子悬浮液；
孢子染色步骤，包括将浓度为0.05mg/mL的碘化丙啶染料溶液与制备的孢子悬浮液，按照碘化丙啶染料溶液:孢子悬浮液为1:200的体积比混合均匀，室温避光染色10-15min；
终止染色步骤，包括对孢子染色步骤的产物立即进行离心，去上清液终止染色；加入灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液；最后，加入灭菌去离子水，混匀，避光放置备用；
激光扫描共聚焦显微镜检测步骤，包括将终止染色步骤的产物制成玻璃片，倒置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上；选择氩离子激光器激发荧光信号，设置荧光通道的激发波长为534nm，收集荧光信号的发射波长为617nm，并设置一个明场通道作为对照，进行激光扫描共聚焦显微镜检测；
孢子活性判断步骤，通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，所扫描的孢子中，检测到没有荧光的孢子，判定苜蓿黄萎病菌孢子具有活性；所扫描的孢子中，所有孢子均呈红色荧光，则判定苜蓿黄萎病菌孢子不具活性。
需要说明的是，本申请借鉴现有的荧光染料染色孢子进行活性检测的方案，尝试采用各种荧光染料对苜蓿黄萎病菌的分生孢子进行活性检测，并对染色条件、检测方案和活性判断等进行优化和试验；最终研发并获得了适用于苜蓿黄萎病菌活性检测的荧光染料，以及相应的染色检测方案和活性判断方案，最终有效的实现了借助荧光染料和激光扫描共聚焦显微镜的苜蓿黄萎病菌活性检测。采用本申请的活性检测方法，能够有效的区分检测苜蓿黄萎病菌孢子的死活，并且，从制样、染色到获得活性检测结果，整个检测过程仅仅约30min，极大的减少了苜蓿黄萎病菌活性检测的时间，提高了检测效率。
优选的，本申请的苜蓿黄萎病菌活性检测方法中，激光扫描共聚焦显微镜的扫描方式包括，在低倍镜下找到孢子，然后转到高倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰；在扫描时，先选择低像素的平面扫描方式进行粗略扫描xy:512×512，依据扫描成像效果中荧光信号强弱调整探测针孔Pinhole:1AU，即1Airy Units＝0.8μm、调整光电倍增管增益Gain:560、激光扫描强度Scan Str:5％，根据图像信噪比调整扫描模式为line、重复扫描次数Average:2，扫描速度Scan speed:6；调整至成像质量较好时，再用精确扫描方式xy:2048×2048，获取最终图像。
需要说明的是，以上扫描方式只是本申请的一种实现方式中，具体采用的扫描方法和条件，参考以上条件，本领域技术人员可以根据实际情况或仪器设备进行适当的调整，在此不作具体限定。
优选的，本申请的苜蓿黄萎病菌活性检测方法中，激光扫描共聚焦显微镜检测步骤，还包括在明场通道下观察孢子，选择形态良好的孢子用于后续的孢子活性判断步骤。
需要说明的是，明场通道主要是用于确定被观察的孢子，在明场通道下，所有染色或未染色的孢子都能够被观察到；选择形态良好的孢子用于后续的孢子活性判断步骤，主要是为了确保活性判断的质量。
优选的，本申请的苜蓿黄萎病菌活性检测方法还包括孢子萌发试验步骤，该孢子萌发试验步骤，包括取制备的孢子悬浮液，均匀涂布于培养基上，用封口膜封口，25℃培养，培养条件为12h光照12h黑暗培养，根据孢子萌发情况判断孢子活性。
需要说明的是，孢子萌发试验步骤主要是在直接通过荧光染料难以判断其活性的情况下使用，如果按照本申请的方法直接采用碘化丙啶染色即可判断出苜蓿黄萎病菌活性，则不需要孢子萌发试验步骤。
优选的，孢子萌发试验步骤中，采用的培养基为PDA培养基。
优选的，本申请中，根据孢子萌发情况判断孢子活性，具体包括，在显微镜下观察孢子萌发，具有活性的孢子在培养5h后能看到孢子萌发，芽管伸长，培养24h芽管逐渐伸长，培养7d出现分支且形成交错的团。
本申请的有益效果在于：
本申请的苜蓿黄萎病菌活性检测方法，能够直接有效的观察区分苜蓿黄萎病菌分生孢子的死活，并且操作简单；从制样到获得结果，整个检测过程仅仅约30分钟，极大的提高了苜蓿黄萎病菌活性检测的效率。本申请的苜蓿黄萎病菌活性检测方法具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，能替代传统的形态学检测活性的方法，为口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门的苜蓿黄萎病菌活性检测提供了一种新的快速、有效的检测方法和途径，对苜蓿黄萎病菌的快速检测和防治、保障生产安全具有重要意义。
附图说明
图1是本申请实施例中PI对苜蓿黄萎病菌死孢子的染色结果图；
图2是本申请实施例中PI对苜蓿黄萎病菌活孢子的染色结果图；
图3是本申请实施例中苜蓿黄萎病菌活孢子的萌发试验观察结果图。
具体实施方式
传统的苜蓿黄萎病菌活性检测主要是通过培养后观察其孢子形态结构，看孢子是否有萌发，并采用培养的孢子对苜蓿幼苗进行感染，以此判断其活性；这种传统的培养检测方法虽然可以准确的判断活性，但是耗时长，不利于快速检测和防治。
采用荧光染料对植物病原菌孢子进行染色，并观察其染色结果，以此判断活性，在大豆的一些病原菌活性检测和美澳型核果褐腐病菌活性检测中都有相关的应用和研究。但是，并非所有的病原菌都适用于荧光染料染色检测孢子活性。并且，适用于大豆病原菌或美澳型核果褐腐病菌的活性检测方法，也不能直接沿用于苜蓿黄萎病菌，例如，本申请的一种实现方式中，常规使用的钙黄绿素、Alamar Blue、Hoechst 33342、DAPI、AO等荧光染料都无法明显区分苜蓿黄萎病菌孢子的死活。
为此，本申请采用多种荧光染料，特别针对苜蓿黄萎病菌的活性检测条件进行了深入研究，最终得出适合于苜蓿黄萎病菌活性检测的荧光染料和相应的检测条件。具体的，适用于本申请的荧光染料为PI；将浓度为0.05mg/mL的碘化丙啶染料溶液与制备的孢子悬浮液，按照碘化丙啶染料溶液:孢子悬浮液为1:200的体积比混合均匀，室温避光染色10-15min；染色完成后立即进行离心，去上清液终止染色，加入灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液，再加入灭菌去离子水，混匀，避光放置备用；然后将终止染色步骤的产物制成玻璃片，倒置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上；选择氩离子激光器激发荧光信号，设置荧光通道的激发波长为534nm，收集荧光信号的发射波长为617nm，并设置一个明场通道作为对照，进行激光扫描共聚焦显微镜检测；通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，所扫描的孢子中，检测到没有荧光的孢子，判定苜蓿黄萎病菌孢子具有活性；所扫描的孢子中，所有孢子均呈红色荧光，则判定苜蓿黄萎病菌孢子不具活性。
需要说明的是，在本申请的PI浓度和染色时间条件下对苜蓿黄萎病菌进行活性检测，不仅能够得到较好的死孢子和活孢子的区分效果，成像效果良好，而且对孢子萌发的影响较小；在本申请的一种实现方式中，采用本申请的PI浓度和染色时间条件进行染色后，仍然能够保持苜蓿黄萎病菌孢子较高的萌发率，对孢子本身的活性几乎没有影响。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、荧光染料的筛选
1.材料和设备
本例采用苜蓿黄萎病菌菌株ATCC121306进行试验。
本例总共采用10种荧光染色剂对苜蓿黄萎病菌的分生孢子进行活性检测实验，荧光染料的详细信息见表1。
表1供试荧光染料
| 染料名称 | 激发波长(nm) | 发射波长(nm) | 荧光颜色 | 来源 |
| PI | 534 | 617 | 红色 | Sigma公司 |
| FDA | 488 | 530 | 绿色 | Sigma公司 |
| AO | 488 | 530 | 绿色 | Sigma公司 |
| JC-1 | 488 | 530 | 绿色 | Sigma公司 |
| 钙黄绿素 | 488 | 530 | 绿色 | Sigma公司 |
| DAPI | 340 | 488 | 蓝色 | Sigma公司 |
| Hoechst33258 | 340 | 460 | 蓝色 | 北京诺博莱德 |
| Hoechst33342 | 340 | 460 | 蓝色 | 北京诺博莱德 |
| AlamarBlue | 340 | 488 | 蓝色 | 上海翊圣 |
| 台盼蓝 | 340 | 488 | 蓝色 | 北京诺博莱德 |
本例的主要仪器设备包括：购自ZEISS的LSM 5 EXCITER激光共聚焦扫描显微镜和ZEISS STANDARD20显微镜，购自HIAYAMA的HICLAVE HV-85高压灭菌锅，购自THERMO的FRESCO 21离心机，以及购自EPPENDORF的THERMOMIXER恒温混匀仪。
2.方法
(1)菌株培养
挑取苜蓿黄萎病菌菌株的培养物，分别接种于PDA培养基平板上，用Parafilm封口膜密封培养皿，于25℃条件下光暗交替培养7天，其中光暗交替具体为光照12h、暗培养12h，交替进行。
(2)孢子悬浮液配制
用灭菌去离子水冲洗苜蓿黄萎病菌培养物表面孢子堆，收集于干净的10mL离心管中，充分振荡3min左右，使得绝大多数孢子从菌丝中分离出来，用无菌枪头将菌丝吸取干净，得到纯净的孢子，显微镜下计算孢子的浓度，最后加入灭菌去离子水，分别将孢子配制成1×105个孢子/mL的孢子悬浮液4～5mL。
(3)荧光染料初筛
将新鲜配置孢子悬浮液，每个处理取200μL孢子悬浮液到1.5mL离心管中用于试验；每个荧光染料设置两个组，一组为经过金属浴100℃处理15min的死孢子，另一组为不经过处理的活孢子；对于每个荧光染料的死孢子组和活孢子组分别进行3个不同浓度和3个不同染色时间，共计9个处理的正交筛选实验。各荧光染料的工作液浓度和染色时间详见表2。
表2荧光染料染色条件
| 染料名称 | 工作液浓度 | 染色时间 |
| PI | 0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL | 10min，15min，30min |
| FDA | 10mg/mL、1mg/mL、0.2mg/mL | 10min，15min，30min |
| Alamar Blue | 0.1mL/mL、1mL/mL、3mL/mL | 30min，60min，90min |
| Hoechst33258 | 10μg/mL、100μg/mL、500μg/mL | 10min，30min，45min |
| Hoechst33342 | 10μg/mL、100μg/mL、500μg/mL | 10min，30min，45min |
| DAPI | 0.2mg/mL、1mg/mL、0.05mg/mL | 5min，10min，15min |
| JC-1 | 1.67mg/mL、0.16mg/mL、0.5mg/mL | 10min，20min，30min |
| AO | 2mg/mL、0.2mg/mL、10mg/mL | 10min，20min，30min |
| 台盼蓝 | 0.4％染色液、4％染色液、20％染色液 | 5min，15min，25min |
| 钙黄绿素 | 1mg/mL、10mg/mL、20mg/mL | 15min，30min，45min |
表2中，工作液浓度是指直接使用的荧光染料溶液的浓度，PI、Hoechst33258、Hoechst 33342、DAPI、AO和钙黄绿素染料的溶剂均为ddH2O，即用ddH2O将荧光染料稀释为相应浓度，FDA用丙酮稀释为相应浓度，Alamar Blue用马铃薯葡萄糖培养基溶液(缩写PD)稀释为相应浓度，JC-1用DMSO稀释为相应浓度；台盼蓝溶液直接用水将原始溶液稀释为0.4％染色液、4％染色液或20％染色液，例如取20份台盼蓝溶液加80份的水，即稀释获得20％染色液。
染色方法：取1μL的某一种荧光染料溶液，加入200μL孢子悬浮液，振荡混匀，室温下避光染色，到时间之后，立即14000rpm离心1min，去除上清液，加入200μL无菌去离子水，振荡混匀，14000rpm离心1min，去除上清液，加入20μL灭菌去离子水，混匀，避光放置，以备后续检测使用。
(4)激光共聚焦显微镜扫描
吸取1μL活性染料处理之后的样品制备玻片，封片，倒置于激光共聚焦扫描显微镜载物台上，调到可视档(即OcμLar)，在荧光显微镜下低倍镜下找到孢子，转到20倍镜下观察，调制视野清晰度，然后调到LCM档，根据所用的荧光染料选择激发合适波长的激光器，例如氩离子激光器等，设置荧光通道的激发波长，例如340nm、488nm或534nm，收集荧光信号的发射波长，例如488nm、530nm或617nm，并且设置一个明场作为对照。
选择粗略扫描模式，进行粗略扫描xy:512×512，依据扫描成像效果中荧光信号强弱调整探测针孔Pinhole:1AU，即1Airy Units＝0.8μm、调整光电倍增管增益Gain:560、激光扫描强度Scan Str:5％，根据图像信噪比调整扫描模式为line、重复扫描次数Average:2，扫描速度Scan speed:6；调整至成像质量较好时，再用精确扫描方式xy:2048×2048，获取最终图像。本实验中，最终获得的图像要最大程度反映出孢子的染色情况，得到的明场孢子图像要最大程度的清晰。
3.荧光染料初筛结果
(1)荧光染料FDA对苜蓿黄萎病菌孢子的染色结果
在荧光染料初筛时，分别采用了10mg/mL、1mg/mL、0.2mg/mL三个工作液浓度，对苜蓿黄萎病菌孢子进行染色，每个浓度分别设置了10min、15min、30min三个染色时间。激光共聚焦显微镜扫描结果显示，死孢子和活孢子都能够被染色，只是程度不同，通过荧光强弱来判断孢子死活的区分效果较差；因此，FDA不能很好的区分苜蓿黄萎病菌的活孢子和死孢子。
(2)AO对苜蓿黄萎病菌孢子染色结果
在荧光染料初筛时，分别采用了2mg/mL、0.2mg/mL、10mg/mL三个工作液浓度，对苜蓿黄萎病菌孢子进行染色，每个浓度分别设置了10min、20min、30min三个染色时间。激光共聚焦显微镜扫描结果显示，AO能够染色获得明亮的绿色荧光，但是，活孢子和死孢子都能够被染色获得绿色荧光，不能区分苜蓿黄萎病菌孢子的死活。
(3)DAPI对苜蓿黄萎病菌孢子染色结果
在荧光染料初筛时，分别采用了0.2mg/mL、1mg/mL、0.05mg/mL三个工作液浓度，对苜蓿黄萎病菌孢子进行染色，每个浓度分别设置了5min、10min、15min三个染色时间。激光共聚焦显微镜扫描结果显示，DAPI能够染色获得明显的蓝色荧光，但是，同样的，活孢子和死孢子都能够被染色获得蓝色荧光。因此，DAPI也不能区分苜蓿黄萎病菌孢子的死活。
(4)PI对苜蓿黄萎病菌孢子染色结果
在荧光染料初筛时，分别采用了0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL三个工作液浓度，对苜蓿黄萎病菌孢子进行染色，每个浓度分别设置了10min、15min、30min三个染色时间。激光共聚焦显微镜扫描结果显示，其中，0.05mg/mL染色10min时，PI能够明显区分苜蓿黄萎病菌活孢子和死孢子，其结果如图1和图2所示。图1为死孢子染色情况，其中，左图为荧光通道，右图为明场。图2为活孢子染色情况，其中，左图为荧光通道，右图为明场。结果显示，死孢子染色后有明显的红色荧光，而活孢子没有荧光；说明PI能够将死孢子染为红色，而活孢子不被染色，能够明显区分苜蓿黄萎病菌孢子的死活。
(5)JC-1对苜蓿黄萎病菌孢子染色结果
在荧光染料初筛时，分别采用了1.67mg/mL、0.16mg/mL、0.5mg/mL三个工作液浓度，对苜蓿黄萎病菌孢子进行染色，每个浓度分别设置了10min、20min、30min三个染色时间。激光共聚焦显微镜扫描结果显示，JC-1能够将死孢子染色为明亮的绿色荧光，而活孢子仅有微弱的绿色荧光。这种区分需要通过荧光强弱来判断，区分效果较差。
(6)台盼蓝对苜蓿黄萎病菌孢子染色结果
在荧光染料初筛时，分别采用了0.4％染色液、4％染色液、20％染色液三个工作液浓度，对苜蓿黄萎病菌孢子进行染色，每个浓度分别设置了5min、15min、25min三个染色时间。激光共聚焦显微镜扫描结果显示，台盼蓝能够将死孢子染色为微弱的红色荧光，而活孢子没有荧光。并且，虽然台盼蓝在0.4％染色液染色15min时，能够区分苜蓿黄萎病菌孢子的死活，但是区分效果不明显，特别是死孢子的红色荧光太微弱，容易误判。而其它浓度和染色时间的处理效果更差，难以清晰区分死孢子和活孢子。
(7)Hoechst 33258对苜蓿黄萎病菌孢子染色结果
在荧光染料初筛时，分别采用了10μg/mL、100μg/mL、500μg/mL三个工作液浓度，对苜蓿黄萎病菌孢子进行染色，每个浓度分别设置了10min、30min、45min三个染色时间。激光共聚焦显微镜扫描结果显示，无论死孢子还是活孢子染色后都没有荧光，因此，Hoechst33258不能区分苜蓿黄萎病菌孢子的死活。
(8)Hoechst 33342对苜蓿黄萎病菌孢子染色结果
Hoechst 33342同样设置了三个浓度和三个染色时间，但是，其结果与Hoechst33258类似，无论死孢子还是活孢子染色后都没有荧光，因此，Hoechst33342也不能区分苜蓿黄萎病菌孢子的死活。
(9)Alamar Blue对苜蓿黄萎病菌孢子染色结果
Alamar Blue同样设置了三个浓度和三个染色时间，其结果与Hoechst 33258类似，无论死孢子还是活孢子染色后都没有荧光，因此，Alamar Blue也不能区分苜蓿黄萎病菌孢子的死活。
(10)钙黄绿素对苜蓿黄萎病菌孢子染色结果
钙黄绿素同样设置了三个浓度和三个染色时间，其结果与Hoechst 33258类似，无论死孢子还是活孢子染色后都没有荧光，因此，钙黄绿素也不能区分苜蓿黄萎病菌孢子的死活。
综上所诉，Hoechst 33258、Hoechst 33342、Alamar Blue与钙黄绿素4种荧光染料均不能使苜蓿黄萎病菌孢子染色，不能用于苜蓿黄萎病菌孢子活性检测。FDA、AO、DAPI、PI、JC-1和台盼蓝6种荧光染料能够使苜蓿黄萎病菌孢子染色；但是，仅仅PI能够将死孢子染色为明亮的红色荧光，而活孢子没有荧光，具有很好的苜蓿黄萎病菌孢子死活区分效果；因此，本例初筛PI作为苜蓿黄萎病菌活性检测的荧光染料。
二、染色条件优化
本例进一步的对筛选获得的PI的染色条件进行深入的优化，并对不同条件处理后的孢子活性检测检测，以建立适合于苜蓿黄萎病菌的活性检测方法。具体如下：
1.染色条件优化和活性检测
(1)染色条件优化
本例对PI的不同浓度和不同染色时间进行了优化试验，每个处理取200μL孢子悬浮液到1.5mL离心管中用于试验；每个初筛获得的荧光染料设置三个组，其中两组进行染色，一组为经过金属浴100℃处理15min的死孢子，另一组为不经过处理的活孢子；再一组为不经过染色实验的孢子悬浮液，作为对照组；对于每个荧光染料的死孢子组和活孢子组分别进行五个不同浓度和五个不同染色时间，共计二十五组的正交实验。
具体的，PI的五个不同浓度分别为原液的5倍浓缩液(即浓度为5mg/mL)、1mg/mL的原液、原液的2倍稀释液、原液的10倍稀释液、原液的20倍稀释液，五个不同染色时间分别为4min、8min、10min、15min、20min。
染色方法参照“(3)荧光染料初筛”步骤进行。染色完成后，死孢子组直接进行LSCM扫描分析，获取图片；活孢子组分成两部分，一部分做扫描分析获取图片，一部分用琼脂载玻片法进行孢子萌发试验，计算萌发率。
(2)病原菌活性检测
本例对不同温度处理的孢子进行了试验，分别在五种温度下进行处理，每种温度分别处理五种不同时间，共计25个处理组，将所有处理组的孢子分成两组进行实验：一组进行荧光染料染色，另一组通过琼脂载玻片法测定孢子萌发率，进行统计学分析。五种温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，五种不同处理时间分别为1min、5min、10min、20min、30min。
其中，荧光染料染色的条件，包括染料浓度、染色时间等采用“(1)染色条件优化”步骤获得的优化条件进行，染色方法与“(1)染色条件优化”相同。
(3)孢子萌发实验
前面两个步骤中提到的萌发试验具体包括，将PDA培养基放入微波炉中熔化，用移液枪吸取100μL的PDA，分成三份滴加在灭菌过的载波片上，然后等其凝固，吸取1μL的孢子悬浮液滴加在载玻片的PDA上，放置在一次性培养皿中，用Parafilm封口膜封好，25℃光照培养5h，进行观察，每份PDA观察100个孢子，共计300个，重复三次。以能看到孢子较为明显的萌发、芽管伸长为萌发标准。统计孢子萌发率，进行统计学分析。
2.染色条件优化和活性检测结果
本例对PI进行了5倍浓缩液(即浓度为5mg/mL)、1mg/mL的原液、原液的2倍稀释液、原液的10倍稀释液、原液的20倍稀释液五个浓度，和4min、8min、10min、15min、20min五个染色时间的正交优化。并具体对染色时间为4min、10min、20min，PI浓度为5倍浓缩液、原液的2倍稀释液、原液的20倍稀释液正交的9组进行了萌发试验。
结果显示，对照组的孢子萌发率为99.8％，几乎为100％；由PI的5倍浓缩液染色4min、10min、20min后，孢子萌发率分别为15.4％、11.2％、4.3％；由PI的原液2倍稀释液染色后的萌发率分别为99.4％，99.4％，99.6％；可见，5倍浓缩液对孢子的活性造成很大的影响，处理20min的孢子萌发率不足5％，而2倍稀释液和更低浓度的稀释液对孢子萌发几乎没有影响。
本例对不同浓度的碘化丙啶对苜蓿黄萎病菌孢子染色率统计，结果如表3所示。
表3不同浓度的碘化丙啶对苜蓿黄萎病菌孢子染色率统计(单位％)
表3的结果显示，在碘化丙啶浓度确定的情况下，染色率随染色时间增加；其中，染色10min的染色率和稳定性更好。至于碘化丙啶的浓度，结合激光共聚焦显微镜观察结果，以0.05mg/mL为佳，在该浓度下死孢子染色后有明显的红色荧光。
综上，通过对孢子萌发结果和表3的孢子染色率结果分析，PI的5倍浓缩液染色活孢子之后导致孢子萌发率大幅下降，而2倍稀释液和更低浓度的对活孢子萌发没有影响，可能是因为5倍浓缩液的浓度过高影响了孢子活性。通过LSCM分析，PI的5倍稀释液染色4min之后，活孢子也会被染色，并且个别死孢子荧光过于饱和影响观察，导致成像结果不佳；10倍稀释液染色结果和20倍稀释液没有太大差异，同样浓度下的不同时间处理，荧光强度没有发生明显变化；综合染色剂对孢子活性的影响和成像结果，本例最终确定PI染色剂最佳染色条件为20倍稀释液，即工作液浓度为0.05mg/mL，染色10-15min。
(3)病原菌活性检测结果
本例进行40℃、45℃、50℃、55℃、60℃处理1min、5min、10min、20min、30min的正交试验，处理完成后，采用PI原液的20倍稀释液(即0.05mg/mL)染色10min，然后将每个处理的染色孢子分为两部分，一部分用于显微镜观察，一部分用于孢子萌发试验。分别统计各个处理后的染色率和萌发率。
结果显示，孢子萌发结果和PI染色结果基本一致，萌发率高对应的孢子活性强，相应的染色率较低，即被染色的死孢子较少。在确定温度下，随着处理时间的增加，萌发率逐渐降低，相应的染色率逐渐升高；特别是60℃处理30min时，萌发率为0，对应的染色率为100％，说明所有孢子均无活性。
三、病原菌活性检测方法的建立
根据前面的分析试验，本例最终确定苜蓿黄萎病菌的活性检测方法如下：
制备孢子悬浮液步骤，包括将苜蓿黄萎病菌的分生孢子挑取到灭菌水中，配制成浓度大于10个孢子/μL的孢子悬浮液；
孢子染色步骤，包括将浓度为0.05mg/mL的碘化丙啶染料溶液与制备的孢子悬浮液，按照碘化丙啶染料溶液:孢子悬浮液为1:200的体积比混合均匀，室温避光染色10-15min；
终止染色步骤，包括对孢子染色步骤的产物立即进行离心，去上清液终止染色；加入灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液；最后，加入灭菌去离子水，混匀，避光放置备用；
激光扫描共聚焦显微镜检测步骤，包括将终止染色步骤的产物制成玻璃片，倒置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上；选择氩离子激光器激发荧光信号，设置荧光通道的激发波长为534nm，收集荧光信号的发射波长为617nm，并设置一个明场通道作为对照，进行激光扫描共聚焦显微镜检测；
孢子活性判断步骤，通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，所扫描的孢子中，检测到没有荧光的孢子，判定苜蓿黄萎病菌孢子具有活性；所扫描的孢子中，所有孢子均呈红色荧光，则判定苜蓿黄萎病菌孢子不具活性。
其中，激光扫描共聚焦显微镜的扫描方式包括，在低倍镜下找到孢子，然后转到高倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰；在扫描时，先选择低像素的平面扫描方式进行粗略扫描xy:512×512，依据扫描成像效果中荧光信号强弱调整探测针孔Pinhole:1AU，即1AiryUnits＝0.8μm、调整光电倍增管增益Gain:560、激光扫描强度Scan Str:5％，根据图像信噪比调整扫描模式为line、重复扫描次数Average:2，扫描速度Scan speed:6；调整至成像质量较好时，再用精确扫描方式xy:2048×2048，获取最终图像。激光扫描共聚焦显微镜检测步骤，优选在明场通道下观察孢子，选择形态良好的孢子用于后续的孢子活性判断步骤。
四、萌发试验
本例判断孢子死活的方法是，激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，所扫描的孢子中，检测到没有荧光的孢子，判定苜蓿黄萎病菌孢子具有活性；所扫描的孢子中，所有孢子均呈红色荧光，则判定苜蓿黄萎病菌孢子不具活性。
如果按照以上方法无法判断孢子活性，本例进一步的可以通过孢子萌发试验步骤判断活性。具体的，取孢子悬浮液，均匀涂布于PDA培养基上，用封口膜封口，25℃培养，12h光照12h黑暗培养，观察孢子萌发情况。
在显微镜下观察孢子的萌发，结果如图3所示，图3中A图为苜蓿黄萎病菌孢子培养24h后萌发情况，B图为苜蓿黄萎病菌孢子培养7d后萌发情况。也就是说，对于具有活性的孢子，在培养5h后能看到孢子较为明显的萌发，芽管伸长；培养24h芽管逐渐伸长，如图3的A图所示；培养7d出现分支且形成交错的团，如图3的B图所示。如果经过5h培养并未见明显萌发，基本可以初步判断为死孢子；进一步的，24h培养和7d培养都没有出现芽管伸长或分支且形成交错的团，则判断样本为死孢子。
五、讨论与结论
1.活性染色剂的筛选
本例从10种荧光染料中筛选出适合苜蓿黄萎病菌孢子活性检测研究的染料1种，即碘化丙啶。综合分析10种染色剂，文献的研究对象更多是用在动物或者植物细胞的原生质体，而非真菌孢子，研究对象的不一样，很多时候，结果只具有参考性，并不准确，适合动植物细胞的活性检测不代表能够准确判断出真菌孢子的活性状态，最终通过筛选得到PI能够准确反映出苜蓿黄萎病菌的孢子活性状态，发现台盼蓝能够使死孢子发出红色荧光，活孢子无法发出荧光；同时也发现JC-1，AO，DAPI也能够使孢子发出明亮的荧光，但不能从是否发出荧光来判断孢子活性，另外4种染色剂，即Alamar Blue、Hoechst 33342、Hoechst33258和钙黄绿素，无法使苜蓿黄萎病菌孢子发出荧光，无法进行判断。
2.苜蓿黄萎病菌孢子最佳染色条件优化
对于PI染色剂，对孢子进行5倍浓缩液、原液、2倍稀释液、10倍稀释液、20倍稀释液五个染料浓度梯度和4min、8min、10min、15min、20min五个染色时间梯度的试验筛选，同时做染色之后对孢子活性影响的孢子萌发实验。由PI原液5倍浓缩液染色4min、10min、20min后，孢子萌发率分别为15.4％、11.2％、4.3％，发现过高的染色剂浓度和过长的染色时间会影响孢子活性。PI原液10倍稀释液染色结果，从LSCM中扫描成像所得的图片过饱和，导致图片效果不够好。最终通过筛选，染色剂对孢子活性的影响需要尽量低，即染色时间尽可能短，染色浓度尽可能低；成像结果需要保证图片不能过饱和；且死孢子和活孢子务必对比明显，即死孢子和活孢子中一个能够发出明亮的荧光，另外一个无法发出荧光；因此，PI最佳染色条件为原液20倍稀释液(即工作液浓度为0.05mg/mL)染色10-15min。
3.苜蓿黄萎病菌活性检测分析
通过对苜蓿黄萎病菌孢子分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃五种不同温度下进行1min、5min、10min、20min、30min五种时间处理的正交试验，分别对各组进行PI最佳染色条件的染色，并同时平行做孢子萌发实验。从活性检测实验来看，孢子萌发实验和染色实验结果基本一致，从40℃处理5min开始，孢子萌发就明显受到影响，萌发率明显降低，相应的染色率升高。PI染色剂的作用机理为不能穿透完整的细胞膜，死孢子细胞膜失去活性，PI进入细胞核内，和核酸进行结果，发出红色荧光，所以PI能够让死孢子发出红色荧光，活孢子无法荧光，以此来区分死孢子和活孢子。
本例所建立的苜蓿黄萎病菌活性检测方法直观、快速，相较于传统的孢子萌发实验，具有更高的可信度和准确度。本例通过观察孢子染色后所发出的荧光就可以判定孢子活性状态，检测时间仅仅约30min，相较于传统的孢子萌发实验，检测时间大大减少，且该方法能够精确到每个孢子的状态，灵敏度高。本例的活性检测方法在实际检疫过程中具有应用价值，在实际情况下，往往只能获取到少量孢子，有可能仅仅只有几个或者一个孢子，过去对于这些孢子的检测只能通过孢子萌发实验，往往会忽略掉休眠状态的孢子，得到不准确的结果，而本例的方法可以直接应用于活性检测，不仅仅降低了检测时间，也能够更准确的对孢子活性状态进行描述，增加结果的可信度。
4.结论
本例从10种活性染料中成功筛选到1种活性染料，即PI，能够用于苜蓿黄萎病菌活性检测。
本例确定了针对苜蓿黄萎病菌孢子的PI最佳染色条件为，200μL的孢子悬浮液中，添加1μL的工作液浓度为0.05mg/mL的PI荧光染料，室温避光染色10-15min。
本例建立的苜蓿黄萎病菌活性检测新方法，能够更加准确的形容孢子状态，该方法为搭建我国高频跨境入侵有害生物检测技术新平台提供理论基础和技术支持。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (6)
1.一种苜蓿黄萎病菌活性检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
制备孢子悬浮液步骤，包括将苜蓿黄萎病菌的分生孢子挑取到灭菌水中，配制成浓度大于10个孢子/μL的孢子悬浮液；
孢子染色步骤，包括将浓度为0.05mg/mL的碘化丙啶染料溶液与制备的孢子悬浮液，按照碘化丙啶染料溶液:孢子悬浮液为1:200的体积比混合均匀，室温避光染色10-15min；
终止染色步骤，包括对所述孢子染色步骤的产物立即进行离心，去上清液终止染色；加入灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液；最后，加入灭菌去离子水，混匀，避光放置备用；
激光扫描共聚焦显微镜检测步骤，包括将所述终止染色步骤的产物制成玻璃片，倒置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上；选择氩离子激光器激发荧光信号，设置荧光通道的激发波长为534nm，收集荧光信号的发射波长为617nm，并设置一个明场通道作为对照，进行激光扫描共聚焦显微镜检测；
孢子活性判断步骤，通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，所扫描的孢子中，检测到没有荧光的孢子，判定苜蓿黄萎病菌孢子具有活性；所扫描的孢子中，所有孢子均呈红色荧光，则判定苜蓿黄萎病菌孢子不具活性。
2.根据权利要求1所述的苜蓿黄萎病菌活性检测方法，其特征在于：所述激光扫描共聚焦显微镜的扫描方式包括，在低倍镜下找到孢子，然后转到高倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰；在扫描时，先选择低像素的平面扫描方式进行粗略扫描xy:512×512，依据扫描成像效果中荧光信号强弱调整探测针孔Pinhole:1AU，即1AiryUnits＝0.8μm、调整光电倍增管增益Gain:560、激光扫描强度Scan Str:5％，根据图像信噪比调整扫描模式为line、重复扫描次数Average:2，扫描速度Scan speed:6；调整至成像质量较好时，再用精确扫描方式xy:2048×2048，获取最终图像。
3.根据权利要求1所述的苜蓿黄萎病菌活性检测方法，其特征在于：所述激光扫描共聚焦显微镜检测步骤，还包括在明场通道下观察孢子，选择形态良好的孢子用于后续的所述孢子活性判断步骤。
4.根据权利要求1-3任一项所述的苜蓿黄萎病菌活性检测方法，其特征在于：还包括孢子萌发试验步骤；
所述孢子萌发试验步骤，包括取制备的孢子悬浮液，均匀涂布于培养基上，用封口膜封口，25℃培养，培养条件为12h光照12h黑暗培养，根据孢子萌发情况判断孢子活性。
5.根据权利要求4所述的苜蓿黄萎病菌活性检测方法，其特征在于：所述孢子萌发试验步骤中，采用的培养基为PDA培养基。
6.根据权利要求4所述的苜蓿黄萎病菌活性检测方法，其特征在于：所述根据孢子萌发情况判断孢子活性，具体包括，在显微镜下观察孢子萌发，具有活性的孢子在培养5h后能看到孢子萌发，芽管伸长，培养24h芽管逐渐伸长，培养7d出现分支且形成交错的团。
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