CN103037888A - 增生性疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预防或治疗增生性疾病的方法。具体地，本发明涉及源自或可源自植物的组合物的应用，如植物防御素，尤其涉及其在预防或治疗增生性疾病如癌症的方法中的应用。本发明还涉及相关的应用、系统和试剂盒。

Description

增生性疾病的治疗

技术领域

本发明涉及预防或治疗增生性疾病（增殖性疾病，proliferative disease）的方法。具体地，本发明涉及源自或可源自植物的组合物的应用（用途），如植物防御素，尤其涉及其在预防或治疗增生性疾病如癌症的方法中的应用。本发明还涉及相关的应用、系统和试剂盒。

相关申请的引用

本申请要求2010年6月24日提交的美国临时专利申请号61/358,126的优先权，其全部内容在此引用作为参考。

有关联邦政府资助研究的声明

不适用

背景技术

众所周知，无论是组成型还是诱导型，植物可产生多种化合物，以保护自身免受环境应力、损伤或微生物侵袭的伤害。

迄今已表征的大多数植物抗菌蛋白（抗微生物蛋白）具有相同的特征。它们一般为小的（<10kDa）、高碱性蛋白且通常包含偶数个半胱氨酸残基（通常为4、6或8）。这些半胱氨酸全部参与分子内的二硫键，并使蛋白质赋有结构和热力学稳定性（Broekaert et al.(1997)）。根据氨基酸序列的同源性，主要参考半胱氨酸残基的数目和间距，对一些不同家族进行定义。它们包括植物防御素（Broekaert等，1995，1997；Lay等，2003a）、硫素（thionins）（Bohlmann，1994）、脂质转移蛋白（Kader，1996，1997）、橡胶蛋白（hevein）（Broekaert等，1992）和knottin类蛋白（Cammue等，1992），以及源自光壳澳大利亚坚果（Macadamia integrifolia）（Marcus等，1997；McManus等，1999）和凤仙花（Impatiens balsamina）（Tailor等，1997；Patel等，1998）的抗菌蛋白（表1）。虽然不同的蛋白家族可能利用不同机制发挥作用，但所有的这些抗菌蛋白均在靶微生物质膜水平发挥活性（Broekaert等，1997）。环蛋白为一种小的、常见于茜草科（Rubiaceae）和堇菜科（Violaceae）家族（参考Craik等，1999，2004；Craik，2001）成员中的富含半胱氨酸的植物肽的新型家族。这些不寻常的环状肽（表1）具有多种生物活性，包括抗菌性（Tarn等，1999）、抗HIV性（Gustafson等，1994）和杀虫（Jennings等，2001）特性。

表1植物中小的、富含半胱氨酸的抗菌蛋白

植物抗菌蛋白中代表性成员的成熟蛋白大小和半胱氨酸残基间距如表1所示。共有序列中的数字表示代表性成员中的高度保守的半胱氨酸残基间的氨基酸数，但该家族中其他成员的半胱氨酸间的长度稍许不同。连接线表示二硫键。虚线表示环蛋白的环状主链（源自Lay和Anderson，2005）。

防御素

之前术语“防御素”在本领域内被用于描述由许多不同物种产生且在特有的防御病原体，包括细菌、真菌、酵母菌和病毒中发挥功能的一个多样的分子家族。

植物防御素

植物防御素（也称为γ-硫素）为具有八个半胱氨酸残基的小的（~5kDa，45至54个氨基酸）碱性蛋白。在构型上，该八个半胱氨酸残基可形成四个严格保守的二硫键:Cys_I-Cys_VIII，Cys_II-Cys_IV，Cys_III-Cys_VI和Cys_V-Cys_VII。除了这四个严格保守的二硫键外，一些植物防御素还具有另外的二硫键（Lay等，2003a，2003b；Janssen等，2003）。

名称“植物防御素”起源于1995年，由Terras和他的同事创造，其在萝卜种子中分离出两种抗真菌蛋白（Rs-AFP1和Rs-AFP2）并注意到这些蛋白质的一级和三维结构水平明显与植物α/β-硫素不同，但却与昆虫和哺乳动物防御素具有一些结构相似性（Terras等，1995；Broekaert等，1995）。

虽然相对有限，但植物防御素还是表现出明显的序列保守性。严格保守的是八个半胱氨酸残基和位置34（相对于Rs-AFP2编号）上的甘氨酸。在大多数序列中，位置8上的丝氨酸、位置11上的芳香族残基、位置13上的甘氨酸和位置29上的谷氨酸也是保守的（Lay等，2003a；Lay和Anderson，2005）。

第一种植物防御素的三维解析结构（solution structure）于1993年被Bruix等人阐述为γ1-P和γ1-H。从那以后，确定了其他的源自种子的防御素和两种源自花（NaD1和PhD1）的防御素的结构（Lay等，2003b；Janssen等，2003）。所有的这些防御素均阐述了已知的半胱氨酸稳定的αβ（CSαβ）基序并共有包含明确的α-螺旋和三股反向平行的β-折叠（β-sheet）的高度重叠的三维结构。采用βαββ排列组织这些元件（elements）并借助四个二硫桥对其进行加固。

昆虫防御素和蝎毒素（scorpion toxin）也显示出CSαβ基序。比较结构表征的植物防御素、昆虫防御素和蝎毒素的氨基酸序列，很明显在大小和组成差异上，CSαβ支架具有高度自由性（highly permissive）。

植物防御素/γ-硫素的结构与α-硫素和β-硫素采取的结构相反。α-和β-硫素形成紧凑的、两性的、L形分子，其中L的长垂直臂由两个α螺旋构成，且短臂由两个反向平行的β链和最后的（~10）C末端残基形成。还借助三个或四个二硫键对这些蛋白质进行稳固（Bohlmann和Apel，1991）。

植物防御素在植物王国具有广泛分布且可能存在于大多数（即使不是全部）的植物中。大多数植物防御素分离自种子，其中富含大量的植物防御素并且在分子、生化和结构水平上进行表征（Broekaert等，1995；Thomma等，2003；Lay和Anderson，2005）。在其他组织中也鉴定出防御素，包括叶片、荚（pod）、块茎、果实、根、树皮和花组织（Lay和Anderson，2005）。

Lay和Anderson（2005）公布了多个已确定的防御素的氨基酸序列比对，这些防御素要么作为纯化蛋白，要么作为由cDNA推导的（蛋白）。其他的植物防御素公开于美国专利No.6,911,577、国际专利公布No.WO00/11196和国际专利公布No.WO 00/68405中，其全部内容在此引用作为参考。

哺乳动物防御素

哺乳动物防御素形成了三个不同结构的亚家族，称为α-防御素、β-防御素和θ-防御素。相比植物防御素，全部的三个亚家族仅包含六个半胱氨酸残基，其相对于它们的大小、其半胱氨酸位置（placement）和连接（connectivity）、前体性质以及表达位点而不同（Selsted等，1993；Hancock和Lehrer，1998；Tang等，1999a，b；Lehrer和Ganz，2002）。所有的亚家族与先天性宿主免疫密切相且最近发现其作为免疫刺激剂与适应性免疫相关（Tang等，1999b；Lehrer和Ganz，2002）。根据它们的防御作用，最初创造了名称“防御素”（Ganz等，1985；Selsted等，1985）。

α-防御素（也称为经典防御素）在长度上具有29-35个氨基酸且它们的六个半胱氨酸残基形成了含Cys_I-Cys_VI，Cys_II-Cys_IV和Cys_III-Cys_IV构型的三个二硫键（表2）。

相比α-防御素，β-防御素更大（在大小上具有36至42个氨基酸）且具有不同的半胱氨酸配对（Cys_I-Cys_V，Cys_II-Cys_IV和Cys_III-Cys_VI）和间距（Tang和Selsted，1993）。它们还可产生为前原防御素（preprodefensins）。然而，它们的前结构域（prodomain）短得多。类似于α-防御素，β-防御素的合成可为组成型或可为诱导型，发生于损伤或暴露于细菌、寄生原虫、细菌脂多糖后，并且其还可响应于体液介质（humoral mediator）（即细胞因子）（Diamond等，1996；Russell等，1996；Tarver等，1998）。

源自昆虫和哺乳动物的防御素和防御素类蛋白（防御素样蛋白，defensin-like protein）的代表性成员的成熟蛋白大小和半胱氨酸残基间距如表2所示。共有序列中的数字表示代表性成员中的高度保守的半胱氨酸残基间的氨基酸数，但该家族中其他成员的半胱氨酸间的长度稍许不同。连接线表示二硫键。虚线表示哺乳动物θ-防御素的环状主链。

表2昆虫和哺乳动物的防御素和防御素类蛋白的代表性成员

昆虫防御素

在昆虫中，已鉴定出大量防御素和防御素类蛋白质。这些蛋白质产自脂肪体（相当于哺乳动物的肝脏），随后从脂肪体释放至血淋巴（Lamberty等人，1999）。大多数昆虫防御素具有三个二硫键。然而，许多的相关蛋白质即源自黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的果蝇霉素具有四个二硫键（Fehlbaum等，1994；Landon等，1997）（表2）。

已解析多个昆虫防御素的三维结构（例如，Hanzawa等，1990；Bdnmatin等，1992；Cornet等，1995；Lamberty等，2001；Da Silva等，2003）。它们的球状折叠，如昆虫防御素A典型具备的，特征为α-螺旋、双链反向平行β-折叠和长的N末端环。借助存在于Cys_I-Cys_IV，Cys_II-Cys_V和Cys_III-Cys_VI构型中的三个二硫键稳固二级结构的这些元件（Bonmatin等，1992；Cornet等，1995）。

两类植物防御素

根据从cDNA克隆预测的前体蛋白结构，植物防御素可分为两大类（Lay等，2003a）（图8）。在第一个且也是最大类中，前体蛋白由内质网（ER）信号序列和成熟的防御素结构域组成。这些蛋白进入分泌途径且对于翻译后修饰或亚细胞靶向没有明显信号（图8A）。

产生的第二类防御素为更大的前体，包括约33个氨基酸的C末端前结构域或前肽（CTPP）（图8B）。已在茄科物种中鉴定出II类防御素，其中它们组成性表达于花组织（Lay等，2003a；Gu等，1992；Milligan等，1995；Brandstadter等，1996）和果实（Aluru等，1999）以及盐胁迫叶片中（Komori等，1997；Yamada等，1997）。源自花烟草（NaD1）和矮牵牛（PhD1和PhD2）的茄科防御素的CTPP在成熟期间通过蛋白水解去除（Lay等，2003a）。

茄科防御素上的CTPP具有显著高含量的酸性和疏水性氨基酸。有趣地，在中性pH时，CTPP负电荷抵消了防御素结构域中的正电荷（Lay和Anderson，2005）。

植物防御素的生物活性

一些生物活性归因于植物防御素，包括对真菌（Broekaert等，1997；Lay等，2003a；Osborn等，1995；Terras等，1993）以及革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌（Segura等，1998;Moreno等，1994；Zhang和Lewis，1997）的生长抑制作用。一些防御素还是消化酶的有效抑制剂，如α-淀粉酶（Zhang等，1997；Bloch等，1991）和丝氨酸蛋白酶（Wijaya等，2000；Melo等，2002），两种功能都与保护免遭虫食的功能一致。这也得到以下观察结果的支持，当人工饲料中混入0.2%（w/w）时，细菌表达的绿豆防御素（mung bean defensin）VrCRP对绿豆象（bruchid Callosobruchuschinensis）而言是致命的（Chen等，2002）。一些防御素还抑制蛋白翻译（Mendez等，1990；Colilla等，1990；Mendez等，1996）或结合至离子通道（Kushmerick等，1998）。源自拟南芥（Arabidopsis halleri）的防御素还赋有锌耐性，表明其在应激适应中发挥功能（Mirouze等，2006）。最近，向日葵防御素被证明可在列当属（Orobanche）寄生植物中诱导细胞死亡（de Zelicourt等，2007）。

抗真菌活性

一些但不是全部植物防御素的最好表征的活性是其不同效力地抑制大量真菌物种的能力（例如，见Broekaert等，1997；Lay等，2003a；Osborn等，1995）。例如，Rs-AFP2在1μg/mL时，抑制甜菜茎点霉（Phoma betae）的生长，但在100μg/mL时不能有效对抗油菜菌核病菌（Sclerotiniasclerotiorum）（Terras等，1992）。根据其对真菌，山顶镰孢菌（Fusariumculmorum），生长和形态的影响，可将其区分为两类防御素。“形态（morphogenic）”植物防御素可减少菌丝伸长，并同时增加菌丝分支，而“非形态（non-morphogenic）”植物防御素降低菌丝伸长率但不会引起明显的形态扭曲（Osborn等，1995）。

最近，证明了豌豆防御素Psd1被吸收至细胞内并进入粗糙链孢菌（Neurospora crassa）的细胞核，其中其与参与细胞周期调控的细胞核细胞周期蛋白样蛋白具有相互作用（Lobo等，2007）。对于源自苜蓿的防御素MsDef1而言，禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）上的两个有丝分裂活化蛋白（MAP）激酶信号级联对调节MsDef1活性具有很重要作用（Ramamoorthy等，2007）。

真菌膜的透化作用（permeabilization）也被报道与一些植物防御素有关（Lay和Anderson，2005）。例如，NaD1是分离自花烟草的花组织的植物防御素。NaD1的氨基酸和编码序列公开于国际专利公布No.WO02/063011，其全部内容在此引用作为参考。在生物体外，测试NaD1的抗真菌活性，其抵抗丝状真菌棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）（Fov）、棉花黄萎病菌（Verticillium dehliae）、根串珠霉（Thielaviopsis basicola）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans）。在1μM，NaD1使Fov和茎基溃疡病菌的生长降低了50%，而棉花黄萎病菌、根串珠霉和构巢曲霉均被抑制了约65%。当NaD1为5μM时，全部的五个物种的生长均被抑制了高于80%。这五个真菌物种为子囊菌门（ascomycete phylum）的全部成员并在盘菌亚门（subphylum pezizomycotiria）中分布于三类。这些真菌是农业上重要的真菌病原体。迄今，所有测试的丝状真菌对NaD1的抑制敏感（van derWeerden等，2008）。

通过还原和烷基化半胱氨酸残基研究NaD1中四个二硫键的重要性。在含Fov的生长抑制实验中，对NaD1而言，甚至在十倍高于IC₅₀的浓度下，还原和烷基化的NaD1（NaD1_R&A）完全失活。

关于抗菌肽和肿瘤细胞的现有工作

利用小的富含半胱氨酸/阳离子抗菌肽治疗人类疾病

在癌症、肿瘤发生、血管生成和侵染的多个方面，越来越多的文献涉及人类α-防御素和β防御素。哺乳动物的防御素也被提议用于治疗病毒和真菌感染并可替代或辅助通过抗生素治疗细菌感染。然而，它们对哺乳动物细胞的细胞毒性仍是一大障碍。Moss等人（美国专利No.7,511,015）已表明利用精氨酸残基的核糖基化或ADP-核糖基化对防御素肽进行修饰可改变肽毒性并提高其抗菌性能。

Mader和Hoskin（2006）的回顾指出可将作为新型细胞毒性药物的阳离子抗菌肽用于癌症治疗。但是应该注意Pelegrini和Franco（2005）的回顾错误地指出源自槲寄生的α-硫素/β-硫素和γ-硫素（也称植物防御素）一样为抗癌分子。本领域内的技术人员应该理解这些现有技术并不涉及植物防御素（γ-硫素），而是涉及在结构和功能上有明显区别的α-硫素/β-硫素。

对人类肿瘤细胞具有抗增殖活性的植物防御素的报道

自2004年以来，一些独立报道表明植物防御素（类）蛋白在体外也显示出对多种人类肿瘤细胞系（具有不同效力）具有抗增殖活性（例如见Wong和Ng（2005）；Ngai和Ng（2005），Ma等，（2009）和Lin等，（2009））。这些蛋白主要分离自豆科植物（如豆类）。根据其估计的分子质量（~5kDa），以及在有些情况下，根据有限的N末端氨基酸与已知防御素序列的相似性，将这些蛋白质进行植物防御素归类。但是，这些参考文献中公开的蛋白缺乏定义防御素的严格保守的半胱氨酸残基和半胱氨酸间距。此外，这些参考文献中公开的蛋白不是II类防御素，也不是源自茄科家族。

文献回顾表明中国辣椒防御素（Capsicum Chinese defensin，CcD1）是唯一的其他茄科家族II类防御素，其之前已经被提及具有抑制哺乳动物的细胞活性的潜能（Anaya-Lopez等，2006）。据报道，编码CcD1全长序列的表达构建体转染至牛内皮细胞系BE-E6E7导致条件培养基，其对对人类转化细胞系HeLa具有抗增殖作用。在实验设计和数据解释中存在许多缺陷，对于本领域内的技术人员而言，从这些所述研究得出有关CcD1是否具有抗增殖活性的有效结论是不太可能的。这些包括:（i）虽然CcD1的mRNA提示在转染细胞中，但是没有证据可证明CcD1蛋白实际表达于条件培养基，（ii）利用CcD1全长开放阅读框而不是成熟的编码结构域需要通过去除CTPP结构域，处理所表达的前体，从而产生“活性”防御素-这点没有证明，（iii）转染过程可改变细胞并且对转染实验的控制不足，因为利用了非转染细胞，而没有正确控制载体单独转染细胞，（iv）使用条件培养基而不是纯化的CcD1蛋白会影响实验读出（结果，readout），因为培养基组分或来自转染细胞的其他分泌的分子本身或与CcD1结合，具有抗增殖活性，（v）在多种转染的内皮细胞群（Anaya-Lopez等，2006，图2）中的CcD1mRNA表达水平不与提出的CcD1转染细胞条件培养基的抗增殖活性相关（Anaya-Lopez等，2006，图4），因为不同条件培养基样品介导的所观察到的抗增殖反应之间没有统计学显著差异。还应该注意同一作者在2008年通过单独公布的论文（Loenza-Angeles等，2008），明确承认了这些实验设计和解释中的不足。根据这些结果，本领域内的技术人员不能从Anaya-Lopez等（2006）中得出CcD1对哺乳动物细胞具有任何的抗增殖活性。

之前本发明人在国际专利公开No.WO 02/063011中公布了某些新型防御素以及其在植物或植物部分中诱导病原体感染抗性的应用。WO02/063011中的全部内容在此引用作为参考。

经对植物防御素的进一步研究，意外地发现源自茄科（Solanaceae）植物家族的II类防御素（Class II defensins）具有有效的细胞毒性性质。因此，这些重大发现表明存在可预防和治疗增生性疾病的新型重要方法。因此，这些发现提供了预防和治疗增生性疾病如癌症的方法，以及其相关的系统和试剂盒。

发明内容

根据本发明的第一个方面，其提供了用于预防或治疗增生性疾病的植物防御素。

根据本发明的第二个方面，其提供了编码第一个方面中的植物防御素的核酸。

根据本发明的第三个方面，其提供了包含第二个方面中的核酸的载体。

根据本发明的第四个方面，其提供了包含第三个方面中的载体的宿主细胞。

根据本发明的第五个方面，其提供了由第四个方面中的宿主细胞产生的表达产物。

根据本发明的第六个方面，其提供了用于预防或治疗增生性疾病的药物组合物，其中该药物组合物包含第一个方面中的植物防御素、第二个方面中的核酸、第三个方面中的载体、第四个方面中的宿主细胞或第五个方面中的表达产物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

根据本发明的第七个方面，其提供了用于预防或治疗增生性疾病的方法，其中该方法包括为受试者给予治疗有效量的第一个方面中的植物防御素、第二个方面中的核酸、第三个方面中的载体、第四个方面中的宿主细胞或第五个方面中的表达产物或第六个方面中的药物组合物，由此预防或治疗增生性疾病。

根据本发明的第八个方面，其提供了第一个方面中的植物防御素、第二个方面中的核酸、第三个方面中的载体、第四个方面中的宿主细胞或第五个方面中的表达产物或第六个方面中的药物组合物在制备用于预防或治疗增生性疾病的药物中的应用。

根据本发明的第九个方面，其提供了用于预防或治疗增生性疾病的试剂盒，其中该试剂盒包括治疗有效量的第一个方面中的植物防御素、第二个方面中的核酸、第三个方面中的载体、第四个方面中的宿主细胞或第五个方面中的表达产物或第六个方面中的药物组合物。

根据本发明的第十个方面，其提供了第九个方面中的试剂盒在预防或治疗增生性疾病中的应用，其中为受试者给予治疗有效量的第一个方面中的植物防御素、第二个方面中的核酸、第三个方面中的载体、第四个方面中的宿主细胞或第五个方面中的表达产物或第六个方面中的药物组合物，由此预防或治疗增生性疾病。

根据本发明的第十一个方面，其提供了用于筛选针对哺乳动物肿瘤细胞的植物防御素的细胞毒性的方法，其中该方法包括将第一个方面中的植物防御素、第二个方面中的核酸、第三个方面中的载体、第四个方面中的宿主细胞或第五个方面中的表达产物或第六个方面中的药物组合物与哺乳动物细胞系接触，并测定由于与植物防御素接触而对哺乳细胞系（造成）的细胞毒性。

根据本发明的第十二个方面，其提供了利用第十一方面中的方法筛选出的植物防御素。

根据本发明的第十三个方面，其提供了用于产生具有降低的溶血活性（haemolytic activity）的植物防御素的方法，其中该方法包括在防御素的N末端处或附近，向植物防御素引入至少一个丙氨酸残基。

根据本发明的第十四个方面，其提供了利用第十三个方面中的方法产生的具有降低的溶血活性的植物防御素。

定义

术语“可源（自）”包括术语“可获（自）”和“可分离（自）”，且可与其交换使用。“可源自”、“可获自”或“可分离自”特定来源或方法的本发明组合物或其他事项不仅包括源自、获自、分离自该来源或方法的组合物或其他事项，还包括无论如何获得或产生的相同的组合物或事项。

这里使用的术语“多肽”指的是由肽键连接在一起的氨基酸组成的多聚物且包括片段或其类似物。虽然本发明旨在表示“多肽”构成了完整长度蛋白质的一部分，但是此处术语“多肽”、“蛋白质”和“氨基酸”可以交换使用。

这里使用的术语“核酸”指的是脱氧核糖核苷酸的单链或双链聚合物、核糖核苷酸碱基或已知的天然核苷酸类似物，或其混合物。除另有说明外，该术语包括参照指定序列，以及参照与其互补的序列。在这里术语“核酸”、“多聚核苷酸”和“核苷酸序列”可交换使用。应该理解这里使用的与核酸相关的“5'末端”对应于所编码多肽的N末端，且“3'末端”对应于所编码多肽的C末端。

术语“纯化的”指的是所指材料已从其天然环境或寄主中分离，且相关杂质减少或消除，使得所指分子作为主要物质存在。因此，术语“纯化的”指的是目标物质为主要的存在物质（即以摩尔计，其比组合物中任何其他单个物种更为丰富）且优选地，基本纯化部分为这样的组合物，其中目标物质包括全部存在大分子物质的至少约30%（以摩尔计）。通常地，基本纯的组合物包括存在于组合物中的全部大分子物质的多于约80%至90%。最优选地，目标物质被纯化至基本均一（利用传统检测方法不能检测出组合物中的污染物质），其中该组合物基本由单个的大分子物质组成。术语“纯化的”和“分离的”可交换使用。一般利用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定纯度和均一性。基本上纯化制剂中以主要物质存在的蛋白或核酸。在一些实施例中，术语“纯化的”表示蛋白或核酸在电泳凝胶中基本上产生一个带。

术语“片段”指的是编码组分的多肽或核酸或指本发明的多肽或核酸的部分。通常地，在性质上，片段具有与该片段作为其组分的多肽或核酸相同的生物活性。肽片段的长度可在约5至约150个氨基酸之间、约5至约100个氨基酸之间、约5至约50个氨基酸之间或约5至约25个氨基酸之间。可替换地，肽片段长度在约5至约15个氨基酸之间。因此，术语“片段”包括的多肽为全长植物防御素多肽的组分部分，且在性质上，具有与全长植物防御素多肽相同的生物活性。该片段可源自全长植物防御素多肽或可替换地，借助其他方法进行合成，如化学合成。

术语“片段”还可指编码组分的核酸或指本发明多聚核苷酸的组成部分。核酸片段并不一定需要编码保持生物活性的多肽。例如，相反地，该片段可用作杂交探针或PCR引物。该片段可源自本发明的多聚核苷酸或可替换地，借助一些其他方法进行合成，如化学合成。还可借助本领域内的那些技术人员所熟知技术，利用本发明的核酸和其片段，生产反义分子。

有关例如细胞、核酸、蛋白或载体使用的术语“重组”表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源核酸或蛋白或通过改变天然核酸或蛋白进行修饰，或表示该细胞源自经过该修饰的细胞。因此，“重组”细胞表达在该细胞天然（非重组的）形式中未发现的基因或表达以其他方式被异常表达、表达不足（under express）或根本未被表达的天然基因。所用的术语“重组核酸”指的是最初在体外形成的核酸，通常地，借助核酸操控，例如利用聚合酶或核酸内切酶，且该形式通常不会在自然界发现。通过这种方式，可实现不同序列间的可操作连接。因此，针对本发明的目的，分离的线性形式核酸或在体外通过连接通常不相连接的DNA分子形成的表达载体都视为“重组体”。应该理解一旦制备重组核酸并将其重新引入宿主细胞或有机体，其就进行非重组地复制，即利用宿主细胞的体内细胞器（cellularmachinery），而不是在体外操控。然而，一旦利用重组产生这些核酸，即使其随后进行非重组复制，用于本发明的目的，这些核酸仍视为重组体。类似地，“重组蛋白”指利用重组技术获得的蛋白，即通过上述重组核酸表达。

在两个或多个多肽（或核酸）序列背景中使用的术语“同一性”或百分比“同一性”意味两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定的氨基酸残基（或核苷酸）百分数，当在比较窗口或指定区域上进行最大对应的比较和比对时，指定区域上的这些氨基酸残基（或核苷酸）是相同的，如利用序列比对算法或借助手工序列对比或视觉检测进行测量，这些技术都是本领域内的技术人员所熟知的。

这里使用的术语“治疗”指的是任何和全部的用途，该用途可治愈疾病状态或症状，预防疾病发生，或以任何其他方式预防、阻止、延迟、改善或逆转疾病或其他不良症状的发展。

除非另有定义，否则这里使用的所有技术和科学术语均与本领域内每个普通技术人员通常理解的含义相同（例如，细胞生物学、化学、分子生物学和细胞培养）。用于分子和生物化学方法的标准技术可见于Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd ed.（2001）；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.和Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology（1999）4th Ed，John Wiley & Sons，Inc.和the full version entitled Current Protocols in Molecular Biology。

在整个说明书中，词语“包括”，或其变型如“包含”或“具有”意指包含所述元素（元件）、整体（整数）或步骤，或元素、整体或步骤的组，但也不排除任何其他的元素、整体或步骤，或元素、整体或步骤的组。

在整个说明书中，除非另有说明，否则参考数值意指“大约”该数值。术语“大约”用于表示包括测定数值所采用的设备和方法的固有误差变化或研究对象之间存在的差异。

本说明书中对任何现有技术的参考不是、且不应该被视为承认或以任何形式表明现有技术构成了本领域内技术人员所知的公知常识的一部分。

将本说明书中提到的所有公开、专利、专利申请和其他材料的全部内容并入本文中作为参考。

序列表的简要说明

SEQ ID NO:1为II类植物防御素的成熟结构域的氨基酸共有序列。

SEQ ID NO:2为植物防御素NaD1的示例性的全长氨基酸序列，且SEQ ID NO:3为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:4为植物防御素NaD1的成熟结构域的示例性的氨基酸序列，且SEQ ID NO:5为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:6为经过重组改变的植物防御素NaD1成熟结构域的示例性的氨基酸序列，在N末端具有额外的丙氨酸残基，且SEQ ID NO:7为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:8为植物防御素TPP3的示例性的全长氨基酸序列，且SEQ ID NO:9为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:10为植物防御素TPP3的成熟结构域的示例性的氨基酸序列，且SEQ ID NO:11为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:12为经过重组改变的植物防御素TPP3成熟结构域的示例性的氨基酸序列，在N末端具有额外的丙氨酸残基，且SEQ ID NO:13为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:14为植物防御素PhD1A的示例性的全长氨基酸序列，对应于Sol基因组网络数据库登录号SGN-U207537，且SEQ ID NO:15为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:16为经本发明人克隆和测序的植物防御素PhD1A的进一步示例性的全长氨基酸，且SEQ ID NO:17为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:18为植物防御素PhD1A成熟结构域的示例性的氨基酸序列，且SEQ ID NO:19为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:20为植物防御素NsD1的示例性的全长氨基酸序列，且SEQ ID NO:21为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:22为植物防御素NsD1成熟结构域的示例性的氨基酸序列，且SEQ ID NO:23为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:24为植物防御素NsD2的示例性的全长氨基酸序列，且SEQ ID NO:25为对应的核酸序列。

SEQ ID NO:26为植物防御素NsD2成熟结构域的示例性的氨基酸序列，且SEQ ID NO:27为对应的核酸序列。

附图说明

现参照以下附图，仅以示例性方式描述本发明。

图1A:图1A是免疫印迹，示出了重组NaD1（rNaD1）的表达和纯化。且利用SDS-PAGE分离在48h（30μL）收集的毕赤酵母（P.pastoris）表达培养基以及源自SP琼脂糖凝胶纯化不同阶段的、包括未结合组分（30μL）、洗涤组分（30μL）和第一批五个1.5mL的洗脱组分（每个30μL）的样品，借助α-NaD1抗体，利用免疫印迹进行检测。将花的NaD1（200ng）用作阳性对照。在48小时的表达培养基以及SP琼脂糖凝胶洗脱组分中可检测到重组的NaD1。图1B:为反向HPLC图谱（trace），示出了利用SP琼脂糖凝胶从毕赤酵母纯化的rNaD1的纯度。包含rNaD1的SP琼脂糖凝胶洗脱组分加载至分析型C8RP-HPLC柱并利用40min的线性梯度进行洗脱（0-100%的缓冲液B）。在215nm检测蛋白质的吸光度。检测出单个主要蛋白，表明该蛋白具有高纯度。图1C:图1C比较了rNaD1和从花中纯化的天然NaD1的结构。将rNaD1（开放的正方形）和天然NaD1（封闭的菱形）的远UV圆二色光谱进行比较，发现两者未显示出显著差异，表明rNaD1被正确折叠。图1D:图1D比较了rNaD1和从花中纯化的天然NaD1的抗真菌活性。相对于同一时期无蛋白对照的生长，绘制出当存在rNaD1（开放的正方形）或NaD1（封闭的菱形）时的棉花枯萎病菌的菌丝生长。图中示出了由分别实施四次的三个独立实验获得的数据。误差棒表示均值的标准误差。

图2A至图2E是示出了NaD1对肿瘤细胞存活率的影响的图示。（2A）人乳腺癌MCF-7，（2B）人结肠癌HCT-116，（2C）人黑色素瘤MM170，（2D）人前列腺癌PC3，（2E）小鼠黑色素瘤B16-F1。在已在存在增加的NaD1、rNaD1浓度（0至100μM）或重组StPin1A（rStPin1A）下培养的肿瘤细胞上实施MTT细胞存活率实验。示出了存活率百分比，其中包含具有100%活性的指定未经处理的细胞。图2F比较了相对肿瘤细胞和正常细胞的NaD1的活性。从一系列人类和小鼠肿瘤细胞系以及人类正常原代细胞系上的MTT细胞存活率实验中，测出NaD1或rNaD1的抑制浓度（IC50）（μM）。图2G图形示出了NaD1或NaD2对人黑色素瘤MM170的影响。在已在存在增加的NaD1、rNaD1或NaD2浓度（0至100μM）下培养的细胞上实施MTT细胞存活率实验。示出了存活率百分比，其中包含具有100%活性的指定未经处理细胞。图2H和2I示出了NaD1对正常原代人类细胞的影响，（2H）脐静脉内皮细胞（HUVEC），（2I）冠状动脉平滑肌细胞（CASMC）。在已在存在增加的NaD1、rNaD1或rStPin1A浓度（0至100μM）下培养的细胞上实施MTT细胞存活率实验。示出了存活率百分比，其中包含具有100%活性的指定未经处理细胞。图2J示出了还原和烷基化的NaD1（NaD1_R&A）对小鼠黑色素瘤B16-F1细胞存活率的影响。分别在已在存在增加的NaD1、NaD1_R&A或rNaD1浓度（0至30μM或0至50μM）下培养的细胞上实施MTT细胞存活率实验。示出了存活率百分比，其中包含具有100%活性的指定未经处理细胞。

图3A和3B示出了NaD1对（3A）人U937骨髓单核细胞（myelomonocytic cells）或（3B）人黑色素瘤MM170细胞透化作用的影响。将细胞在37℃、增加的NaD1浓度（0至100μM）下，培育30min，其中还加入了碘化丙啶（PI）。利用流式细胞术测定显示PI染色阳性（PI⁺）的细胞数。图3C和3D示出了（3C）NaD1和（3D）NaD1_R&A对U937人骨髓单核细胞中ATP释放的影响。将NaD1、NaD1_R&A加入处于磷酸盐缓冲盐（PBS）和ATP荧光素酶检测试剂（Roche^TM）中的细胞，并且利用分光光度测定法，在波长562nm处，检测不同时间的ATP释放。图3E示出了用于显像经NaD1处理的PC3细胞中形态变化的场发射扫描电子显微图像。左边和右边分别为未处理的PC3细胞或经NaD1处理的PC3细胞的FE-SEM图像。顶部为1200放大倍数下观察到的细胞且在加速电压为2.00kV时，显微镜的低二次电子图像（LEI）为10μm。底部为3000放大倍数下观察到的细胞且在加速电压为2.00kV时，显微镜的低二次电子图像（LEI）为1μm。

图4示出了NaD1和rNaD1对红血细胞（RBC）溶解的影响。在增加的NaD1、rNaD1浓度下，且仅存在PBS或水，于37℃下对人的RBC培育16h。然后，在波长412nm处，利用分光光度法测量所释放出的指示RBC溶解的血红蛋白。结果针对水处理的RBC（指定为100%溶解）而标准化。

图5示出了在存在血清的情况下，NaD1对肿瘤细胞透化作用的影响。当NaD1为10μM，在增加的胎牛血清（FCS）浓度下，于37℃对U937细胞培育30min，其中还加入碘化丙啶（PI）。利用流式细胞术测量显示染色阳性（PI⁺）或阴性（PI^-）的细胞数量。

图6示出了NaD1对B16-F1肿瘤生长的影响。固体B16-F1黑色素瘤（~直径10mm）位于C57BL/6小鼠皮下。然后，每两天向肿瘤内注射50μL包含1mg/mL NaD1、NaD1_R&A的PBS或仅PBS载体，通过测量肿瘤大小测定对肿瘤生长的影响。在0天，每个小鼠的肿瘤大小标准化为1。结果表示每次治疗五只小鼠的均值的标准误差。

图7A至7C示出了NaD1与细胞脂质间的结合作用。利用NaD1探测Echelon^TM脂质带并利用兔抗NaD1抗体检测结合作用，然后是辣根过氧化物酶（HRP）结合的驴抗兔IgG抗体。（7A）膜脂质带^TM，（7B）PIP脂质带^TM，（7C）SphingoStrip脂质带^TM。在每条带上，NaD1与单个带的结合作用利用密度计量学进行定量。图7D至7F示出了NaD2与细胞脂质间的结合作用。利用NaD2探测Echelon^TM脂质带并利用兔抗NaD2抗体检测结合作用，然后是辣根过氧化物酶（HRP）结合的驴抗兔IgG抗体。（7D）膜脂质带^TM，（7E）PIP脂质带^TM，（7F）SphingoStrip脂质带^TM。在每条带上，NaD2与单个带的结合作用利用密度计量学进行定量测定。图7G总结了相关的脂质结合特异性以及天然、重组及还原和烷基化NaD1和NaD2、天然NsD3、NsD1、NsD2、PhD1A和TPP3的强度。条（bar）表示结合磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰丙氨酸PA、磷脂酰甘油PG的强度。

图8示出了两大类植物防御素的前体蛋白结构，如从cDNA克隆预测的结构。在第一且最大类中，前体蛋白由内质网（ER）信号序列和成熟的防御素结构域组成（8A）。产生的第二类防御素为更大的前体，具有C末端前肽（CTPP）（8B）。

图9A示出了PhD1A对人U937骨髓单核细胞透化作用的影响。在增加的天然PhD1A浓度（0至50μM）下，于37℃对细胞培育30min，其中还加入碘化丙啶（PI）。利用流式细胞术测量显示PI染色阳性（PI⁺）的细胞数量。图9B示出了PhD1A对U937人骨髓单核细胞的ATP释放的影响。将PhD1A加入处于磷酸盐缓冲液（PBS）和ATP荧光素酶检测试剂（Roche^TM）中的细胞，并且利用分光光度测定法，在波长562nm处，检测不同时间的ATP释放。图9C示出了重组体（rTPP3）对人U937骨髓单核细胞透化作用的影响。在增加的rTPP3浓度（0至40μM）下，于37℃对细胞培育30min，其中还加入碘化丙啶（PI）。利用流式细胞术测量显示染色阳性（PI⁺）的细胞数量。图9D示出了示出了rTPP3对U937人骨髓单核细胞的ATP释放的影响。将重组的TPP3加入处于磷酸盐缓冲液（PBS）和ATP荧光素酶检测试剂（Roche^TM）中的细胞，并且利用分光光度测定法，在波长562nm处，检测不同时间的ATP释放。

图10示出了茄科II类防御素（NaD1、PhD1A、TPP3）和非茄科的I类防御素大丽花（Dahlia merckii）防御素Dm-AMP1、大麦（Hordeumvulgare）γ-硫素γ1-H、玉米（Zea mays）γ-硫素γ2-Z对人U937骨髓单核细胞透化作用的影响。在每分子为10μM时，于37℃下对细胞培育30min，其中还加入碘化丙啶（PI）。利用流式细胞术测量显示PI染色阳性（PI⁺）的细胞数量。数据为三次重复的平均值±SEM。

图11A和图11B示出了当存在血清时，PhD1A（11A）或rTPP3（11B）对肿瘤细胞透化作用的影响。在存在或不存在10μM的PhD1A或rTPP3时，在增加的胎牛血清（FCS）浓度下，于37℃对U937细胞培育30min，其中还加入碘化丙啶（PI）。利用流式细胞术测量显示染色阳性（PI⁺）或阴性（PI^-）的细胞数量。由于不含血清，当0%FSC，不含防御素时，产生了高数量的透化细胞。

图12A示出了相比天然的NaD1，天然NsD3、NsD1、NsD2对U937人骨髓单核细胞的ATP释放的影响。将每个10μM防御素加入处于磷酸盐缓冲液（PBS）和ATP荧光素酶检测试剂（Roche^TM）中的细胞，并且利用分光光度测定法，在波长562nm处，检测不同时间的ATP释放。图12B示出了相比NaD1，NsD3、NsD1、NsD2对人U937骨髓单核细胞透化作用的影响。在10μM，将细胞在37℃下培育30min，其中还加入碘化丙啶（PI）。利用流式细胞术测量显示PI染色阳性（PI⁺）的细胞数量。

图13示出了II类防御素NsD1、NsD2、PhD1A和NaD1对红血细胞（RBC）溶解的影响。在每个10μM或30μM防御素下，于37℃下对人的RBC培育16h。然后，在波长412nm处，利用分光光度法测量所释放出的指示RBC溶解的血红蛋白。将结果针对利用水处理的RBC（指定为100%溶解）标准化。PBS=阴性（或背景溶解）对照。

图14A至图14E示出了NsD1（a）、NsD2（b）、NsD3（c）、TPP3（d）和PhD1a（e）与PIP细胞脂质间的结合作用。利用防御素探测PIP Echelon^TM脂质带并利用兔抗NaD1抗体（针对NsD1、NsD2、PhD1A、TPP3）或兔抗NaD2抗体（针对NsD3）然后是辣根过氧化物酶（HRP）结合的驴抗兔IgG抗体检测结合作用。在每条带上，防御素与单个带的结合作用利用密度计量学进行定量。

图15示出了I类和II类植物防御素NaD1和NaD2（花烟草）、NsD1、NsD2、NsD3（野生烟草）、PhD1A（矮牵牛）、TPP3（番茄）、Dm-AMP1（大丽花）的成熟结构域的氨基酸序列比对。黑色框或灰色框残基分别具有同一性和同源性。实线表示保守的二硫键。

具体实施方式

本发明人意外发现防御素（也称γ-硫素）具有有效的细胞毒性特性。该重大发现描述了一种可预防和治疗增生性疾病的新的重要方法。因此，该发现提供了用于预防或治疗增生性疾病如癌症的方法，以及相关应用、系统和试剂盒。

例如，NaD1为分离自花烟草花组织的植物防御素。NaD1的氨基酸和编码序列公开于国际专利公布No.WO 02/063011，其全部内容在此引用作为参考。

产生大量活性防御素如NaD1的能力在考虑作为临床背景中治疗剂的潜在用途上具有显著的重要性。从天然资源（观赏型花烟草的花）纯化出所需的大量NaD1是不可行的，需要获得有效的重组蛋白。将毕赤酵母表达系统与规定的蛋白纯化方法成功结合，获得高水平的纯的活性重组NaD1（图1A、1B）。重组NaD1具有与天然NaD1（图1C）相似的结构折叠并保留了其抑制尖孢镰孢菌（F.oxysporum）（图1D）菌丝生长的能力。这些数据表明可建立有效的用于获得大量纯的活性重组防御素如NaD1的系统。

天然和重组NaD1可在体外在低μM浓度下选择性杀死肿瘤细胞（图2A-2F）。在IC₅₀值在2和4.5μM之间，天然或重组NaD1都可以相似效力杀死来自不同组织（前列腺癌PC3、结肠癌HCT-116、乳腺癌MCF-7和黑色素瘤MM170）的一系列人类肿瘤细胞系和小鼠黑色素瘤细胞系B16-F1。正常的原代细胞（人类冠状动脉平滑肌细胞或脐静脉内皮细胞）也可被天然或重组NaD1杀死，但相比肿瘤细胞系，需要显著较高的浓度（IC₅₀值为7.5-12μM）。这些数据表明植物防御素如NaD1具有如抗肿瘤试剂一样的潜能，在特定的低μM浓度，可适用于选择性地杀死肿瘤细胞，而不会杀死正常细胞。相比NaD1（茄科II类防御素），茄科I类防御素NaD2或蛋白酶抑制剂StPin1A不能杀死肿瘤细胞（图2A-2I），表明II类防御素具有杀死肿瘤细胞的独特能力（下面将进一步讨论）。还原和烷基化形式的NaD1不影响肿瘤细胞存活率，表明完整的三级结构是NaD1对肿瘤细胞产生毒性作用的关键。

调查发现NaD1对肿瘤细胞的作用机制涉及质膜的透化作用。如NaD1能介导荧光染料PI吸收（图3A、3B）和ATP释放（图3C、3D）所论证，NaD1以剂量依赖方式透化人肿瘤细胞系U937和MM170。肿瘤细胞的透化作用是快速的，当添加至细胞时立刻释放ATP，ATP的释放峰在~5min处。还原和烷基化形式的NaD1不能透化肿瘤细胞（图3D）。人前列腺癌PC3细胞测验进一步支持了NaD1的肿瘤细胞透化活性，其中利用扫描电子显微镜，将细胞进行NaD1处理（图3E）。这些数据表明NaD1通过迅速破坏质膜稳定而导致细胞透化，从而杀死肿瘤细胞。了解NaD1作用机制，可为单独的或与其他抗癌药物结合的防御素的治疗应用提供有用信息。

防御素应用潜力如NaD1用作抗癌药物还需要满足其在血清/血浆中保持活性且在红细胞中不显示溶解活性；NaD1在体外杀死肿瘤细胞的所需浓度下，没有表现出对人红血细胞（RBC）的溶血活性。当浓度为12.5μM或更高时，天然NaD1表现出溶血活性，在100μM时，峰值在~50%RBC溶解处。值得注意地，即使在高达100μM的高浓度下，重组NaD1也没有表现出溶血活性（图4）。通过在重组NaD1的N末端添加单个的丙氨酸残基，使得天然和重组NaD1的一级氨基酸序列不同。由于天然和重组NaD1间没有大的结构差异（图1C）且在透化肿瘤细胞中两种形式都显示出非常相似的活性，所以重组NaD1的N末端上的额外丙氨酸导致了NaD1的溶血活性丧失。因此，相比天然防御素序列，产生的重组防御素如在N末端具有丙氨酸的NaD1预测具有显著的应用优势，如用于具有最小溶血活性的治疗。还应该注意在存在高达40%的血清下，天然和重组NaD1都保留有杀死肿瘤细胞的能力（图5）。所发现的NaD1在存在血清时保留肿瘤细胞透化活性是非常重要的，因为在存在血清时许多阳离子肽的活性显著降低且不能有效用作治疗药物。

防御素应用潜力如NaD1用作抗癌药物可在小鼠黑色素瘤生长的体内模型中得到进一步论证。相比利用还原和烷基化NaD1（失活的）或仅载体治疗肿瘤，通过直接地瘤内注射1mg NaD1/kg体重治疗实体（solid）晚期B16F1肿瘤，可显著降低肿瘤生长（图6）。此外，当进行高达300mgNaD1/kg体重的口服用药时，NaD1对小鼠无不良影响。

此处所示数据论证了（i）在低μM浓度，可在体外选择性地广泛杀死肿瘤细胞，（ii）存在血清时，保留活性，以及（iii）缺乏溶血活性，因此使得防御素如NaD1可有望用作抗癌药物模型。

研究候选的NaD1相互作用分子来识别作为NaD1配体的磷脂。发现NaD1可特异性地结合至一些磷脂肌醇，以及磷脂酰丝氨酸（PS），磷脂酰丙氨酸（PA），磷脂酰甘油（PG）和硫脂（sulfatide）（图7A-7C）。天然和重组NaD1都显示出非常相似的脂质结合特异性（图7G）。有趣地，还发现I类防御素NaD2也可与磷脂结合，但具有与NaD1非常不同的特异性，还观察到可与PA发生牢固结合，但不与许多可与NaD1结合的磷脂肌醇发生结合（图7D-7F）。NaD1与该磷脂特定系列的相互作用有助于NaD1对肿瘤细胞的细胞毒性。还应该注意NaD1的还原和烷基化不能导致与磷脂结合的丧失（图7G）。这些数据表明NaD1的三级结构对磷脂结合和抗肿瘤活性而言，都是必不可少的。

茄科II类防御素NaD1可杀死肿瘤细胞但I类防御素NaD2不能杀死肿瘤细胞表明了茄科II类防御素具有对肿瘤细胞的特殊细胞毒性。事实上，茄科II类防御素TPP3和PhD1A均被发现具有与NaD1相似的肿瘤细胞透化活性（图9A-9D）。如对NaD1所述，TPP3和PhD1A均也被发现在存在血清时，保留了肿瘤细胞透化活性（图11A和11B）。相反地，非茄科I类防御素Dm-AMP1、γ1-H和γ2-Z未显示出肿瘤细胞透化活性（图10）。相对I类防御素，茄科II类防御素所特有的杀死肿瘤细胞能力的进一步支持证据表明II类茄科防御素NsD1和NsD2可透化肿瘤细胞但I类防御素NsD3不能透化肿瘤细胞（图12）。还应该注意其他的II类防御素也保留有NaD1在红血细胞中所观察到的缺乏溶血活性。在高达30μM的浓度下，NsD1、NsD2和PhD1A都显示出不能溶解RBC或非常低的溶解RBC（图13）能力。另外，II类防御素NaD1和I类防御素NaD2中确认的不同形式的磷脂结合特异性（图7）在其他的茄科I类和II类防御素中也可观察到。II类防御素NsD1、NsD2、Tpp3和PhD1A均普遍优选结合至磷脂肌醇（图14A-14B，14D-14E），但I类防御素NsD3最牢固地结合至PA（图14C）。

用于预防或治疗增生性疾病的植物防御素

本发明提供了用于预防或治疗增生性疾病的植物防御素。

在一些实施例中，该植物防御素为任何的植物γ-硫素。

在其他的实施例中，该植物防御素具有至少八个典型的（canonical）半胱氨酸残基，构型上可形成二硫键:Cys_I-Cys_VIII，Cys_II-Cys_IV，Cys_III-Cys_VI和Cys_V-Cys_VII。

仍在其他的实施例中，该植物防御素为具有或先前具有C末端前结构域（prodomain）或前肽（CTPP）的II类植物防御素。

在具体实施例中，该植物防御素源自或可源自茄科、禾本科（Poaceae）或菊科（Asteraceae）。

在一些实施例中，该植物防御素不为CcD1（NCBI数据库编号AF128239）。

在优选实施例中，该植物防御素具有至少八个典型的半胱氨酸残基，在构型上形成二硫键:Cys_I-Cys_VIII，Cys_II-Cys_IV，Cys_III-Cys_VI和Cys_V-Cys_VII，且为具有或先前具有C末端前结构域或前肽（CTPP）的II类茄科植物防御素。

在一些实施例中，该植物防御素包括如SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26所述氨基酸序列或其片段。

仍在其他的实施例中，该植物防御素包括的氨基酸序列95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%或60%相同于SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26所述氨基酸序列或其片段。

仍在其他的实施例中，该植物防御素包括的氨基酸序列99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%、50%、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%相同于SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26所述氨基酸序列或其片段。

仍在进一步实施例中，该植物防御素为茄科II类防御素。

在具体实施例中，植物防御素源自或可源自花烟草、野生烟草、矮牵牛、番茄、烟草、烟草植物（Nicotiana attenuata）、高烟草（Nicotianaexcelsior）、圆锥烟草（Nicotiana paniculata）、马铃薯、中国辣椒或甜椒。

在更多的具体实施例中，该植物防御素源自或可源自花烟草、野生烟草、矮牵牛或番茄。

在一些实施例中，防御素选自包含以下的组：NaD1（NCBI数据库编号A509566），NsD1（SEQ ID NO:20或22），NsD2（SEQ ID NO:24或26），PhD1A（Sol基因组网络数据库编号为SGN-U207537或SEQ ID NO:16），TPP3（NCBI数据库编号SLU20591），FST（NCBI数据库编号Z11748），NatD1（NCBI数据库编号AY456268），NeThio1（NCBI数据库编号AB005265），NeThio2（NCBI数据库编号AB005266），NpThiol（NCBI数据库编号AB005250），CcD1（NCBI数据库编号AF128239），PhD1（NCBI数据库编号A507975），PhD2（NCBI数据库编号AF507976），具有对应于NCBI数据库编号EU367112、EU560901、AF112869或AF112443中所述序列的氨基酸或核酸序列的任何防御素，或具有对应于Sol基因组网络数据库编号SGN-U448338、SGN-U449253、SGN-U448480、SGN-U447308、SGN-U578020、SGN-U577258、SGN-U286650、SGN-U268098、SGN-U198967、SGN-U196048、SGN-U 198968或SGN-U198966中所述序列的氨基酸或核酸序列的任何防御素。

在具体的优选实施例中，该植物防御素为NaD1、NsD1、NsD2、PhD1A或TPP3。

在一些实施例中，该植物防御素可为此处所公开的任何氨基酸序列片段或任何核酸序列片段或补体（complement）。

在具体实施例中，片段包含成熟结构域。

在优选实施例中，该成熟结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、6、10、12、18、22或26所述。

在一些实施例中，该植物防御素可为分离的、纯化的或重组的植物防御素。

在具体实施例中，该重组的植物防御素在N末端或邻近N末端处具有额外的丙氨酸残基。

在优选实施例中，该重组的植物防御素具有降低的溶血活性。

在具体的优选实施例中，该重组的植物防御素包含如SEQ ID NO:6、22或26所述氨基酸序列或其片段。

多聚核苷酸

在本发明组合物包含多肽的实施例中，本发明还提供了编码该多肽的核酸，或其片段或补体。该核酸可为天然存在的或可为合成的或重组的。

在一些实施例中，该核酸可操作地连接至一个或多个启动子。在具体实施例中，该核酸可编码预防或治疗增生性疾病的多肽。

因此，在一些实施例中，该植物防御素可以核酸形式提供。在一些实施例中，该植物防御素核酸编码如SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26所述氨基酸序列或其片段。仍在其他实施例中，该植物防御素核酸包括如SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27所述核苷酸序列或其片段或补体。

仍在其他实施例中，该植物防御素核酸包含的核苷酸序列95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%或60%相同于SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27所述核苷酸序列或其片段或补体。

依在其他实施例中，该植物防御素核酸包含的核苷酸序列99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%、50%、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%相同于SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27所述核苷酸序列或其片段或补体。

载体、宿主细胞和表达产物

本发明还提供了含有这里所述核酸的载体。该载体可为质粒载体、病毒载体或适用于外源序列插入、其导入细胞和所导入序列表达的任何其他合适载体。该载体可为真核表达载体且可包括表达控制和加工（processing）序列如启动子、增强子、核糖体结合位点、多聚腺苷酸化信号和转录终止序列。在优选实施例中，该载体包括一个或多个可操作编码这里所述任何一个或多个植物防御素的核酸。

本发明进一步提供了包含这里所述载体的宿主细胞。通常地，宿主细胞借助载体进行转化、转染或转导，例如，利用电穿孔随后在选择性培养基上选择转化、转染或转导细胞。载体形式中的最终异源核酸序列和其中插入的核酸可被保存在染色体外或可通过同源重组导入宿主细胞的基因组。这些细胞转化、转染或转导方法都是本领域内的那些技术人员所熟知的。例如可参考标准文本如Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual，Gold Spring Harbor，New York，1989和Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences,1992。

此外，本发明还提供了这里所述宿主细胞的表达产物。在一些实施例中，表达产物可为预防或治疗增生性疾病的多肽。在优选实施例中，表达产物为任何一个或多个这里所公开的植物防御素。

组合物

本发明还提供了用于预防或治疗增生性疾病的药物组合物，其中该药物组合物包括这里所述植物防御素、核酸、载体、宿主细胞或表达产物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

因此，本发明组合物可用于治疗用药。在这些应用中，为已患疾病的受试者给予可足够治愈或至少部分遏制疾病以及任何并发症的量的组合物。该组合物的量应足以有效治疗患者。根据本领域内那些技术人员所熟知的方法制备组合物且因此可包括美容上或药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。用于制备给药组合物的方法是本领域内的那些技术人员所众所周知的，且进一步细节例如见Remington’s Pharmaceutical Science，15th ed.，Mack Publishing Company，Easton,Pa.，其内容在此引用作为参考。

该组合物可包含任何合适的表面活性剂如阴离子、阳离子或非离子型的表面活性剂如山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可包括悬浮剂如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料如硅酸盐以及其他组分如羊毛脂。

该组合物还可以脂质体形式给药。脂质体可源自磷脂或其他脂质物质，且可通过分散于水性介质中的单层或多层状水合液体晶体形成。可使用任何非毒性的、生理上可接受的和能形成脂质体的可代谢脂质。脂质体形式的组合物可包含稳定剂、防腐剂和赋形剂。优选脂质包括磷脂和磷脂酰胆碱（卵磷脂），包括天然的和合成的。获得脂质体的方法是本领域内所熟知的，且在这方面具体参考Prescott Ed.，Methods in Cell Biology，Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.（1976）,p.33et seq.，其内容在此引用作为参考。

在一些实施例中，该组合物可采用片剂、液体、洗剂、乳脂剂、凝胶剂、糊剂或乳剂。

剂量

任何特定患者的“治疗有效”剂量水平取决于多种因素，包括所治疗的病症和病情严重程度、所用化合物或药剂的活性、所用组合物、年龄、体重、健康状况、患者性别和饮食、给药时间、给药途径、植物防御素或组合物的螯合（sequestration）速率、治疗持续时间和任何与治疗结合或同时使用的药物，以及本领域内所熟知的其他相关因素。因此本领域内的技术人员可通过常规实验确定治疗适用病症所需的植物防御素或组合物的有效的、非毒性剂量。

通常地，在治疗应用中，疗法是针对疾病状态的持续时间。

进一步地，本领域内的每个普通技术人员可显见组合物的最佳剂量以及单个剂量的间隔取决于所治疗病症的性质和程度，给药形式、途径和位置以及正接受治疗的具体个体的特性。并且，这些最佳条件可通过常规技术确定。

本领域内的每个技术人员还显见最佳的治疗方案，如规定天数中每天给定的组合物的剂量数，可由本领域内的那些技术人员利用常规的治疗测定实验方案确定。

以重量计，为患者施加的组合物的治疗有效剂量预计为每24小时每千克体重在约0.01mg至约150mg范围内；通常地，每24小时每千克体重在约0.1mg至约150mg范围内；每24小时每千克体重在约0.1mg至约100mg范围内；每24小时每千克体重在约0.5mg至约100mg范围内；或每24小时每千克体重在约1.0mg至约100mg范围内。更一般地，有效剂量范围预计为每24小时每千克体重在约5mg至约50mg范围内。

可替换地，有效剂量可高达约5000mg/m²。一般地，有效剂量预计在约10至约5000mg/m²范围内，通常地在约10至约2500mg/m²范围内，在约25至约2000mg/m²范围内，在约50至约1500mg/m²范围内，在约50至约1000mg/m²范围内，或在约75至约600mg/m²范围内。

给药途径

本发明组合物可通过标准途径给药。一般地，通过肠胃外（例如，静脉内、脊柱内、皮下或肌肉内）、口服或局部途径进行该组合物给药。

在其他实施例中，可通过其他的肠/肠内途径进行该组合物给药，如直肠、舌下或唇下，或通过中枢神经系统如通过硬脑膜外、大脑内或侧脑室途径。其他的给药位置可包括上皮、透皮、皮内、鼻、动脉内、心内、骨内、鞘内、腹腔内、膀胱内、玻璃体内、海绵体内、阴道内或子宫内。

载体、赋形剂和稀释剂

载体、赋形剂和稀释剂必须为“可接受的”，能与组合物的其他组分相容，且不能对其接受者造成伤害。这些载体、赋形剂和稀释剂可提高本发明组合物的完整性和半衰期。还可提高或保护本发明组合物的生物活性。

示例性的药学上可接受的载体或稀释剂为去矿质或蒸馏水；盐溶液；植物基油，如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇（lower alkanol），例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇（lower aralkanol）；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯如棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；黄蓍胶或阿拉伯胶，和凡士林。通常地，（一种或多种）载体占组合物的10%至99.9%（重量）。

本发明组合物采用适用于注射给药的形式，采用适用于口服摄取的制剂（如胶囊剂、片剂、囊片、酏剂），采用适用于局部给药的软膏、乳膏或洗液形式，采用适用于吸入给药的气溶胶形式如通过鼻内吸入或口服吸入，采用适用于肠胃外给药的形式，即皮下、肌肉或静脉注射。

对于可注射的溶液或悬浮液给药，无毒性的可接受稀释剂或载体可包括林格氏液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2-丙二醇。

用于预防或治疗增生性疾病的方法

本发明提供了用于预防或治疗增生性疾病的方法，其中该方法包括为受试者给予治疗有效量的此处所公开的植物防御素、核酸、载体、宿主细胞、表达产物或药物组合物，因此预防或治疗增生性疾病。

本发明还提供了这里所公开的植物防御素、核酸、载体、宿主细胞和表达产物在制备用于预防或治疗增生性疾病的药物中的应用。

在一些实施例中，增生性疾病可为选自包含血管新生疾病（angiogenicdisease）、转移性疾病、致肿瘤性疾病（tumourigenic disease）、肿瘤性疾病（neoplastic disease）和癌症的组的细胞增生性疾病。

在一些实施例中，增生性疾病指癌症。在具体实施例中，该癌症选自包含基底细胞癌、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌的组。

在其他实施例中，该癌症选自包含急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、B细胞淋巴瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、肠肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、脑星形胶质细胞瘤/恶性胶质瘤、子宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病/结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆形细胞肿瘤、室管膜瘤、子宫内膜癌、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管、导管癌、眼癌、眼黑色素瘤/视网膜母细胞瘤、胆癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤（GIST）、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、胃类癌、头和/或颈部癌症、心脏癌、肝细胞（肝脏）癌、下咽癌、下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤、卡波济氏肉瘤、肾细胞癌、咽喉癌、白血病（急性淋巴细胞性/急性骨髓/慢性淋巴细胞性/慢性粒细胞/多毛细胞）、嘴唇和/或口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤（AIDS相关/Burkitt/皮肤T细胞/Hodgkin/非Hodgkin/原发性中枢神经系统）、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤，骨/成骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、颈部转移性鳞状癌、口腔癌/多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、骨髓增生性疾病、鼻腔和/或鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢恶性生殖细胞瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、鼻窦及鼻腔癌甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、成松果体细胞瘤和/或幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤文氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、Sezary综合征、皮肤癌（非黑色素瘤）、皮肤癌（恶性黑色素瘤）、皮肤癌（Merkel细胞）、小细胞肺癌、小肠肿瘤、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈部转移性癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和/或胸腺肿瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管和隐匿性原发性/或肾盂癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、原发性巨球蛋白血症或肾母细胞瘤的组。

试剂盒

本发明提供了用于预防或治疗增生性疾病的试剂盒，其中该试剂盒包含治疗有效量的此处所公开的植物防御素、核酸、载体、宿主细胞、表达产物或药物组合物。

本发明还提供了此处所公开试剂盒用于预防或治疗增生性疾病的的应用，其中为受试者给予治疗有效量的此处所公开的植物防御素、核酸、载体、宿主细胞、表达产物或药物组合物，因此预防或治疗增生性疾病。

本发明试剂盒使本发明方法运用起来更方便。通常地，用于实施本发明方法的试剂盒包含实施该方法的全部必要试剂。例如，在一个实施例中，该试剂盒包括此处所公开的植物防御素、多肽、多核苷酸、载体、宿主细胞、表达产物或药物组合物。

通常地，这里描述的试剂盒还包括一个或多个容器。根据本发明，区室化的（compartmentalised）试剂盒包括其化合物或组合物包含在单独容器的任何试剂盒，且还包括小的玻璃容器、塑料容器或塑料或纸条。这些容器可有效地将化合物或组合物从一个隔间转移至另一个隔间，同时避免样品的交叉污染，且每个容器均可定量地将试剂或溶液从一个隔间添加至另一个隔间。

通常地，本发明试剂盒还包括使用该试剂盒组分的使用说明，以便执行合适方法。

本发明方法和试剂盒也同样适用于任何动物，包括人类或其他动物，例如非人类的灵长类动物、马、牛、绵羊、山羊、野兔、鸟、猫科动物和犬科动物物种。因此，应用于不同物种，本发明的单一试剂盒是适用的，或可替换地可能要求不同试剂盒，例如包含针对每个单个物种的特定化合物或组合物。

本发明方法和试剂盒适用于期望预防或治疗增生性疾病的任何情况。

组合物的前体和调制剂（modulator）的筛选

本发明提供了用于筛选针对哺乳动物肿瘤细胞的细胞毒性的植物防御素的方法，其中该方法包括将这里所公开的植物防御素、核酸、载体、宿主细胞、表达产物或药物组合物与哺乳动物细胞系接触，并测定由于与植物防御素的接触，对哺乳动物细胞系的细胞毒性。

本发明还设想利用这里公开的核酸和其片段或补体，借助本领域内那些技术人员所熟知的重组DNA方法，从其他物种识别和获得对应的部分和完整序列，这些方法包括但不局限于DNA印迹杂交（southernhybridization）、RNA印迹杂交（northern hybridization）、聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）和基因图谱技术（gene mapping technique）。还可借助本领域内的那些技术人员所熟知技术，利用本发明核酸和其片段生产反义分子。

因此，本发明设想将基于这里所公开的核酸序列的寡核苷酸和片段用作识别同源序列的引物和探针。寡核苷酸为适用于核酸扩增反应如PCR的核苷酸残基的短链段（short stretch），一般地，长度上至少约10个核苷酸至约50个核苷酸，更一般地，长度上约15个核苷酸至约30个核苷酸。探针为可变长度的核苷酸序列，例如在约10个核苷酸和数千个核苷酸之间，其用于检测同源序列，通常地通过杂交检测。序列之间的同源（序列同一性）水平主要取决于杂交条件的严格性。具体地，在低严格性、中等严格性或高严格性的条件下，将用作探针的核苷酸序列杂交至同源物或此处所公开的多核苷酸的其他功能等同变体。低严格性杂交条件对应于50℃下2×SSC中实施的杂交。可利用本领域内的那些技术人员所熟知的许多条件和因素改变杂交严格性。例如，杂交至指定核酸的核酸的长度和性质（DNA、RNA、碱基组成）；盐和其他组分的浓度，如存在或不存在甲酰胺，硫酸葡聚糖，聚乙二醇等；以及改变杂交温度和/或洗涤步骤。例如，可在2×SSC，0.5%SDS和至少55℃（低严格性），至少60℃（中等严格性），至少65℃（中等/高严格性），至少70℃（高严格性）或至少75℃（非常高的严格性）对杂交滤膜（hybridization filter）冲洗两次，时间30min。

在优选实施例中，利用MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）方法筛选防御素。本领域内的技术人员可利用MTT方法评估细胞的存活和增殖。因此，在这些试剂要么促进要么抑制细胞存活和生长的基础上，其可用于测定潜在治疗试剂的细胞毒性。在该方法中，MTT在活细胞中还原成蓝紫色的甲瓒。在稀盐酸中加入增溶溶液（通常为二甲基亚砜、酸化的乙醇溶液，或十二烷基硫酸钠洗涤溶液），将不溶的蓝紫色的甲瓒产物溶解至有色溶液中。通过分光光度计，在特定波长（通常在500和600nm之间）定量测量该有色溶液的吸光率。吸收最大值取决于所使用的溶剂。

本发明还提供了通过此处公开方法筛选的用于预防或治疗增生性疾病的植物防御素。

用于获得具有降低的溶血活性的植物防御素的方法

本发明提供了用于获得具有降低的溶血活性的植物防御素的方法，其中该方法包括在植物防御素的N末端处或邻近N末端处引入至少一个丙氨酸残基。本领域内的技术人员应该理解可利用多种方法，完成该N末端丙氨酸的添加，例如位点定向诱变（定点诱变，site-directed mutagenesis）、同源重组、转座子和非同源末端连接。

相对于发生的或合理预期发生的溶血现象，通过利用未经过降低溶血活性修饰的相应植物防御素，如果植物防御素的活性可导致相对少的溶血现象，溶血活性可视为“降低的”。

本发明还提供了借助此处公开方法所获得的具有降低的溶血活性的植物防御素。

联合治疗

本领域内的技术人员应该意识到可将多肽、核酸、载体、宿主细胞、表达产物和此处所公开的药物组合物给药作为联合治疗途径的一部分，将此处公开方法中的其他治疗途径与多肽、核酸、载体、宿主细胞、表达产物和此处所公开的药物组合物中的一个或多个结合一起使用。针对该联合疗法，组合中的组分可同时给予或以任何顺序相继给予或在不同时间给予，以实现所需的治疗效果。当单独给药时，即使没有必要，优选地利用相同的给药途径进行组分给药。可替换地，该组分可在单一剂量单位作为组合产物配制在一起。可与本发明组合物结合使用的合适试剂均是本领域内的那些技术人员所熟知的，且可包括如化疗药物、放射性同位素和靶向治疗药物（targeted therapies）如抗体。

可与多肽、核酸、载体、宿主细胞、表达产物和此处所公开的组合物结合使用的化疗药物可包括烷基化剂如顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺，抗代谢物如嘌呤或嘧啶、植物生物碱和萜类化合物，如长春花生物碱（长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛），紫杉烷类化合物（包括紫杉醇和多西紫杉醇），鬼臼毒素，拓扑异构酶抑制剂，如伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷，抗肿瘤药物如多柔比星、表柔比星、博来霉素和酪氨酸激酶抑制剂。

可与多肽、核酸、载体、宿主细胞、表达产物和此处所公开的组合物结合使用的靶向治疗药物可包括如甲磺酸伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼、曲妥珠单抗、拉帕替尼、吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、西罗莫司、依维莫司、伏立诺他、罗米地辛、贝沙罗汀、阿利维A酸、维生素A酸（tretinoin）、硼替佐米、抗叶酸制剂（pralatrexate）、贝伐单抗、索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、利妥昔单抗、阿仑单抗、靶向CD20的单克隆抗体、托西莫、1311-托西莫单抗、替伊莫单抗、地尼白介素、他莫昔芬、托瑞米芬、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑。

可与多肽、核酸、载体、宿主细胞、表达产物和此处所公开的组合物结合使用的其他疗法可包括如手术干预、饮食方案和补充剂（supplement）、催眠疗法（hypnotherapy）、可替换的药物和物理治疗。

治疗的时间安排（timing）

本领域内的那些技术人员应该理解无论在诊断还是其随后地例如作为补充该治疗目前可用疗法的后续治疗或巩固治疗，多肽、多核苷酸、载体、宿主细胞、表达产物和此处所公开的组合物可进行单一药剂给药或作为这里所公开方法的组合治疗途径的一部分。对于基因或环境方面倾向于患这种疾病的受试者，多肽、多核苷酸、载体、宿主细胞、表达产物和此处所公开的组合物还可用作预防疗法。

本领域内的技术人员应该理解并意识到此处所公开的不同特征可结合形成涵盖于本发明范围内的特征组合。

参照下述仅为说明性但非限制性的实施例，进一步描述本发明。

实施例

材料和方法

从花烟草提纯NaD1

为了从自然来源分离出NaD1，将花发育处于花瓣着色阶段的整个花烟草花研磨成细粉末且如先前所述在稀硫酸中提取（(Lay等，2003a）。简言之，花（湿重760克）冷冻于液态氮中，在臼和杵中将其研磨成细粉末，并利用Ultra-Turrax均化器（Janke和Kunkel）于50mM硫酸（每克湿重3mL）中均化5min。在4℃搅拌1小时后，利用Miracloth（Calbiochem，San Diego，CA）过滤和离心（25,000×g，15min，4℃）除去细胞碎片。然后通过加入10M的NaOH将pH调至7.0，在离心去除沉淀蛋白质（25,000×g，15min，4℃）前将提取物于4℃搅拌1小时。将上清液（1.8L）施加至利用10mM磷酸钠缓冲液预平衡的SP Sepharose^TMFast Flow（GEHealthcare Bio-Sciences）柱（2.5×2.5cm）。利用20柱容积的10mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）洗涤除去未结合蛋白并在3×10mL流分中，利用包含500mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）洗脱结合蛋白。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析每个纯化步骤中的样品并利用抗NaD1抗体进行免疫印迹分析。将源自SP Sepharose（琼脂糖凝胶）柱包含NaD1的流分进行反相高效液相色谱分析（RP-HPLC）。

反相高效液相色谱分析

利用连接有保护柱（guard column）的制备型C8柱（22×250mm，Vydac），在与检测器（型号166，Beckman）连接的System Gold HPLC（Beckman）上进行反相高效液相色谱分析（RP-HPLC）。将蛋白样品装载在缓冲液A中（0.1%（v/v）三氟乙酸）并利用0-100%（v/v）缓冲液B（0.089%（v/v）三氟乙酸中60%（v/v）乙腈）进行线性梯度洗脱，其中流速10mL/min，时间40min。在215nm处监测吸光度，检测蛋白（图1B）。收集蛋白峰并利用SDS-PAGE对其进行分析。

将NaD1纯化的每个阶段样品（30μL）添加至（RegisteredTrademark）LDS样品上样缓冲液（10μL，Invitrogen），并加热至70℃，时间10min。然后将样品加载至

预制的（precast）4-12%的Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）并利用在200V运行的XCell-Surelock电泳装置（Invitrogen）分离出蛋白质。利用考马斯亮蓝染色对蛋白质进行可视化或将其转移至硝化纤维素上，进行抗NaD1抗体的免疫印迹分析。

植物中其他防御素的分离（NsD1，NsD2，PhD1A）

利用这里所述从花烟草花中纯化出NaD1的方法，从种子或花中分离出防御素。简言之，将种子（500克）置于Ultra-Turrax均化器中（Janke和Kunkel）并在加入50mM硫酸（每克湿重4mL）前，将其研磨成细粉末。在加入50mM硫酸（每克湿重3mL）前，在液态氮中将花研磨成细粉末。均化5min，然后将均匀混合物（匀浆）转移至烧杯，在4℃下搅拌1小时。利用Miracloth（Calbiochem，圣地亚哥，CA）过滤和离心（25,000×g，15min，4℃）除去细胞碎片。然后通过加入10M的NaOH将pH调至7.0，在离心去除沉淀蛋白质（25,000×g，15min，4℃）前将提取物于4℃搅拌1小时。将上清液加至利用10mM磷酸钠缓冲液预平衡的SPSepharose^TM Fast Flow（GE Healthcare Bio-Sciences）柱（2.5×2.5cm）。利用20柱容积的10mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）洗涤除去未结合蛋白并在3×10mL流分中，利用包含500mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）洗脱结合蛋白。

利用分析型Zorbax 300SB-C8RP-HPLC柱和Agilent Technologies1200系列系统或Beekman Coulter System Gold HPLC上的制备型Vydac C8RP-15HPLC柱，对源自SP Sepharose柱的流分进行反相高效液相色谱分析（RP-HPLC）。将蛋白样品装载在缓冲液A中（0.1%（v/v）三氟乙酸）并利用0-100%（v/v）缓冲液B（0.089%（v/v）三氟乙酸中60%（v/v）乙腈）进行线性梯度洗脱。在215nm处监测吸光度，检测洗脱蛋白（图1B）。收集蛋白峰并利用SDS-PAGE和质谱分析鉴定防御素。

毕赤酵母中重组防御素的表达和纯化

毕赤酵母表达系统是熟知的且可售自Invitrogen（Carlsbad，CA；见公开pPIC9表达载体序列的供应商的毕赤酵母表达手册）。将感兴趣的防御素，包括NaD1，TPP3，γ2-z，γ1-H，Dm-AMP1，克隆至pPIC9表达载体（这些克隆所编码的蛋白质分别指定为rNaD1，rTPP3，rγ2-z，rγ1-H,rDm-AMP1）。然后利用这些构建体转化毕赤酵母GS115细胞。在100mL烧瓶中，将每个克隆的菌落接种至10mL的BMG培养基（如Invitrogen毕赤酵母表达手册中所述）并在30℃摇床（140rpm）上孵育过夜。在放置于30℃摇床（140rpm）上的2L三角瓶中，将培养物接种至500mL的BMG。一旦OD₆₀₀达到2.0（18h），通过离心（2,500×g，10min）收获细胞并将其再悬浮于5L三角瓶中的1L BMM培养基中（OD600=1.0），在28℃的摇床上孵育3天。通过离心（4750rpm，20min）从细胞中分离出表达培养基，然后利用等体积的20mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）进行稀释。利用NaOH将培养基的pH调至6.0，然后将其加至利用10mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）预平衡的SP Sepharose柱（1cm×1cm，AmershamBiosciences）。然后利用100mL的10mM、pH 6.0磷酸钾缓冲液对柱进行冲洗，利用10mL包含500mM NaCl的10mM磷酸钾缓冲液洗脱结合的蛋白（图1A）。利用如下所述40min线性梯度，将已洗脱的蛋白质进行RP-HPLC分析。收集蛋白峰并利用SDS-PAGE进行分析且利用抗NaD1抗体进行免疫印迹分析。冻干包含防御素的流分并将其再悬浮于无菌的milli Q超纯水中。将牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白标准，利用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白质测定法（Pierce Chemical Co.），测定毕赤酵母表达的防御素的蛋白浓度。

rNaD1的圆二色谱分析

为了检测毕赤酵母提纯出的NaD1（rNaD1）是否被正确折叠，对其进行远紫外圆二色（CD）谱分析并将其与天然NaD1进行比较（图1C）。发现两种色谱具有相似性，表明相对于天然NaD1结构，rNaD1结构没有发生显著变化。

rNaD1的抗真菌活性

将rNaD1对棉花枯萎病菌生长的影响与天然NaD1对棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）生长的影响进行比较。在低浓度下，重组NaD1显示出抗真菌活性，IC₅₀为~1.6μM。NaD1要稍微更有效，IC₅₀为~1.0μM（图1D）。

还原和烷基化NaD1的制备

将冻干的NaD1（500μg）溶解于400μL的储备缓冲液（stock buffer）中（200mM Tris-HCI pH 8.0，2mM EDTA，6M盐酸胍，0.02%（v/v）

加入还原缓冲液（含15mM二硫苏糖醇的储备缓冲液[DTT]）（44μL），然后在40℃孵育4.5小时。将反应混合物冷却至室温，之后加入碘乙酸（1M NaOH中0.5M，55μL），然后于室温下，在黑暗中继续孵育30min。利用

（Registered Trademark）旋转柱（3K分子量截留，PALL Life Sciences）除去盐，利用BCA蛋白质测定法（Pierce）测定DTT、碘乙酸和蛋白浓度。如这里所述，测出还原和烷基化NaD1（NaD1_R&A）对Fov生长的影响。

免疫印迹分析

为了进行免疫印迹分析，将蛋白质移至硝化纤维素并用蛋白质A纯化的抗NaD1抗体（1:3000稀释，7.5mg/mL）探测，接着是与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG（1:3500稀释；Amersham Pharmacia Biotech）。借助

生物成像系统（Syngene），利用增强的化学发光（ECL）检测试剂（Amersham Pharmacia Biotech）显现结合抗体。

为了获得抗NaD1或抗NaD2的抗血清，如Harlow和Lane（1988）所述，借助戊二醛，分别将纯化的NaD1或NaD2（1.5mg）与钥孔虫戚血兰素（Keyhole Limpet Hemocyanin）（0.5mg，Sigma）结合。为兔注入1.5mL蛋白质（150μL NaD1）和等体积的弗氏完全佐剂（Freund’s completeadjuvant）（Sigma）。四和八周后，进行结合蛋白（100ng NaD1或NaD2）和弗氏不完全佐剂（Sigma-Aldrich）的加强免疫。在注射前收集免疫前血清，在第三和第四次免疫后，收集14天的免疫血清。利用蛋白质A琼脂糖CL-4B（Amersham Pharmacia Biotech）纯化免疫前血清和免疫血清中的IgG组分，并将其保存于-80℃下，浓度分别为3.4mg/mL和7.5mg/mL。

rStPin1A的细菌表达和纯化

之前，美国专利No.7,462,695“昆虫胰凝乳蛋白酶及其抑制剂”和11/753,072“多基因表达载体”描述了分离自马铃薯（Solarium tuberosum）的I型丝氨酸蛋白酶抑制剂rStPin1A，其内容在此引用作为参考。

对编码StPin1A成熟结构域的DNA片段进行PCR扩增，以便将其亚克隆至大肠杆菌（E.coli）中用于重组蛋白质表达的载体pHUE（Baker等，2005，Cantanzariti等，2004）。使用以下引物:Sac2StPin1A5':5'CTC CGCGGT GGT AAG GAA TCG GAA TCT GAA TCT TG 3'；PotlSall3':5'GGTCGA CTT AAG CCA CCC TAG GAA TTT GTA CAA CAT C 3'，分别在5'和3'末端引入Sac II和Sal I酶切位点。PCR反应物包含2×GoTaqMastermix（25μL，Promega），Sac2Potl5'引物（10μM，2μL），PotlSali3'引物（10μM，2μL），无菌蒸馏水（16μL）和作为模板的pGEM-T Easy-StPinTA质粒DNA（20ng，5μL）。在94℃发生2min的初始变性，然后在94℃保持1min，在60℃保持1min和在72℃中保持1min，持续30个循环，最后在72℃下进行最终的延伸步骤，时间10min。

根据制造商说明，将PCR产物克隆至之后用于化学转化感受态大肠杆菌TOP10细胞（Invitrogen）的CR2.1-TOPO载体（Invitrogen）。利用Wizard Plus SV Miniprep试剂盒（Promega），分离出质粒DNA，利用TOPO特异的M13正向和反向引物，对载体插入物进行测序（Macrogen）。

利用Sac II和Sal I切除插入物，然后利用Perfectprep试剂盒（Eppendorf）将其从琼脂糖凝胶提取出插入物，并将其结合至之后用于转化大肠杆菌TOP10细胞（Invitrogen）的pHUE。分离出包含StPin1A的pHUE的质粒DNA，然后利用其转化大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus-RIL细胞（Stratagene）。

将转化的大肠杆菌的单一菌落接种至20mL包含氨苄青霉素（0.1mg/mL）、氯霉素（0.034mg/mL）和四环素（0.01mg/mL）的2YT培养基（10mL，16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/LNaCI）并将其于37℃、震荡条件下过夜生长。然后将该培养物接种至包含抗生素的新鲜2YT培养基（1L），在37℃下进行震荡孵育，直至其光密度（595nm）达到~0.8。然后加入IPTG（最终浓度1mM），再进行3h的培养生长。

利用离心收集细胞并在镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）树脂（Qiagen）上，利用QiaExpressionist Manual（Qiagen）中描述的天然蛋白质纯化协议，通过亲和层析纯化可溶性的重组蛋白。利用包含250mM咪唑的缓冲液，从树脂洗脱结合的蛋白，然后在4℃，包含50mM Tris-HCI(pH 8.0)和300mM NaCl的溶液中分离（渗析，dialysis）8-16h。通过去泛素蛋白酶，6H.Usp2-cc的孵育（37℃，1h）（Catanzariti等，2004；Baker等，2005），裂解分离出的融合蛋白。之后利用与检测器（型号166，Beckman）和制备型C8柱（22×250mm，Vydac）连接的System Gold HPLC（Beckman）纯化裂解的蛋白质。将蛋白样品装载在缓冲液A中（0.1%（v/v）三氟乙酸）并利用0-60%（v/v）缓冲液B（0.089%（v/v）三氟乙酸中60%（v/v）乙腈）梯度洗脱5min和利用60-100%缓冲液B洗脱20min，其中流速10mL/min。在215nm处监测吸光度，检测蛋白质。手动收集蛋白峰并利用SDS-PAGE对其进行分析。

细胞系和培养

以下为用于本研究的哺乳动物细胞系:人黑色素瘤MM170细胞，永生化T淋巴Jurkat细胞，人白血病单核细胞淋巴瘤U937细胞，人前列腺癌PC3细胞，小鼠黑色素瘤B16细胞，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，GAG-缺陷型CHO突变体pgsA-745细胞和非洲绿猴肾成纤维COS-7细胞。细胞生长于处于5%CO2/95%空气的潮湿气氛中的37℃的组织培养瓶中，并根据增殖速率，进行两至三个星期的常规次培养（sub-culture）。所有的哺乳动物细胞均培养于补充有10%热灭活胎牛血清（FBS，Invitrogen）、100U/mL青霉素（Invitrogen）和100μg/mL链霉素（Invitrogen）的RPMI-1640培养基（Invitrogen），但CHO和PGS细胞培养于补充有10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM-F12培养基（DMEM，Invitrogen）。通过加入3-5mL包含0.25%胰蛋白酶和0.5μM EDTA（Invitrogen）的混合物，从烧瓶分离出粘连的细胞系。

外周血单核细胞（PBMC）的Ficoll-paque分离

Ficoll-paque分离后，重悬浮PBMC至细胞浓度为1×10⁶PBMC/mL。简言之，将血液收集至肝素化管，利用无菌的1×PBS/0.5%BSA(D-PBS,游离的Ca²⁺和Mg²⁺,Invitrogen)稀释1/2。利用无菌的50mL管，将稀释的血液（35mL）覆盖在15mL的ficoll-paque上，然后在1800rpm下离心30min（破碎）。将上层血浆移至新管并进行再次旋转（离心），然后除去PBMC层，将细胞分开至顶部有1×PBS/0.5%BSA的四个管中。在1000rpm RT下，将细胞离心10min，利用50mL 1×PBS/0.5%BSA（×3）冲洗每个管得到的颗粒（沉淀物，pellet）。然后在800rpm下将细胞离心15min，除去更多的血小板。

红血细胞（RBC）的溶解

Ficoll-paque分离后，收集RBC细胞并利用1×PBS对其冲洗，以1000×g沉淀10min。将RBC稀释1/10，以便利用增加的防御素浓度（0-100μM）对其进行处理，将其在5%CO₂/95%空气的潮湿气氛中孵育过夜。经过24h孵育后，在2000rpm下，将细胞离心10min，利用1×PBS将上清液稀释1/100。在412nm处测定吸光度，得出红血细胞的溶解程度。

MTT细胞存活分析

在不同密度（起始密度2×10⁶细胞/mL）下将肿瘤细胞接种于平底96孔微量滴定板的小孔中（50μL），重复四次。将每次分析中仅包含完全培养基的四个小孔用作背景对照。将微量滴定板于37℃、5%CO₂/95%空气的潮湿气氛中孵育过夜，然后向每个小孔加入完全培养基（100μL），于37℃进一步孵育48h。通过光学显微镜测定每个细胞系中用于细胞活力分析的最适细胞密度（30-50%汇合（融合，confluency））。

在上述细胞优化分析测得的最适密度下，将肿瘤细胞接种在96孔的微量滴定板中（50μL/小孔）。该分析还包括相同体积的完全培养基的背景对照孔（n=8）。将微量滴定板于37℃孵育过夜，然后加入不同浓度的蛋白质，再将该微量滴定板进一步孵育48h。细胞存活3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT，Sigma-Aldrich）分析如下所示:向每个小孔（100μL）加入MTT溶液（1mg/mL），将该板于37℃、5%CO₂/95%空气的潮湿气氛中孵育2-3h。然后，对于粘连细胞系，除去培养基，替换成二甲基亚砜（100μL,DMSO,Sigma-Aldrich），并将其置于振荡器上震荡5min，以溶解四唑盐。对于悬浮细胞，在添加DMSO前，将细胞在1500rpm下离心5min。在570nm处，测量每个小孔的吸光度并利用Origin软件程序测量IC₅₀值（抑制50%细胞生长的蛋白质浓度）。

ATP生物荧光法

借助透化的肿瘤细胞，利用ATP生物荧光法（Roche Diagnostics，NSWAustralia）量化ATP释放。根据制造商说明，溶解荧光素酶试剂，并将其于4℃下孵育5min。简言之，再悬浮细胞，浓度为1×PBS/0.1%BSA中1×10⁶细胞/mL，将细胞加至（40μL/孔）包含10μL蛋白样品的空白微量滴定板（Nunc^TM）中的荧光素酶试剂（50μL/孔）。同时，利用多通道移液管，加入混合物（90μL/孔）并于562nm处，在微量滴定板读出器（读板器）上立即读出样品，每间隔30s读出一次，时间30min。然后利用SoftMaxPro4.0软件（Molecular Devices公司）分析数据。

荧光激活细胞分选（FACS）细胞透性分析

除另有说明外，重悬浮细胞，在补充有10%FBS,100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的完全培养RPMI-1640培养基中细胞浓度为4×10⁵细胞/mL，并将其加入V形底的96孔板或微型离心管中。除非另有说明，否则在添加不同浓度（5μL）或设定10μM浓度的蛋白期间，将细胞保存于37℃下。通常地，将细胞与所感兴趣蛋白混合，并在37℃孵育30min。在某些实验中，还可将细胞于4℃或37℃孵育2-60min，然后进行流式细胞仪分析。将细胞加入等体积的包含2μg/mL碘化丙啶（PI,Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,Invitrogen）的完全培养基中，并利用FACSCanto细胞分选机（Becton Dickson,Fanklin Lakes,NJ）和Cell Quest Pro软件（BectonDickson），立即进行流式细胞仪分析。通常地，每个样品收集5000-10000份事件（event），利用FlowJo软件（Tree Star,Ashland,OR）分析最终数据。根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），借助由其排除PI能力确定的活性细胞，适当地门控（gate）细胞。为了便于分析，相对对照，将所有数据进行标准化（正常细胞的范围%约为0-7%）处理。

透化细胞的扫描电子显微镜分析

在本研究中，当相对于未处理的对照组利用NaD1(10μM)进行处理时，利用扫描电子显微镜观察PC3细胞。从培养箱取出细胞后，立即将其置于冰上保存，直至需要。利用在蒸馏水中浸泡的滤纸，对小的玻璃培养皿进行分层并随后盖上盖玻片。利用洗涤缓冲液（0.2M磷酸钠（pH 7.2）和5.4%(w/v)葡萄糖）洗涤样品，然后进行初始固定，在4℃，将样品在等份的1.25%戊二醛和0.5%的四氧化锇固定剂中浸泡30min。利用洗涤缓冲液对样品洗涤两次，时间15min，然后将其于冰上的2%锇和光密性/气密性的玻璃培养皿中浸泡1h。然后利用洗涤缓冲液对样品洗涤三次，时间5min，再进行脱水程序。根据协议实施脱水步骤并在浓度增加的乙醇（EtOH）中进行所需的连续浸泡:50%EtOH中浸泡1×10min，70%EtOH中浸泡1×10min，90%EtOH中浸泡1×10min，95%EtOH中浸泡1×10min，最后在100%EtOH中浸泡2×10min。对固定和脱水的样品进行冷冻干燥，其中将样品于熔化氮（melting nitrogen）中浸泡数秒，然后置于真空蒸发器（Dynavac）的铜块上。冷冻干燥48h后，将样品置于金属架（metalstub）上并放在干燥器中。最后利用自动溅射仪（automated sputter coater）（SC7640Polaron），将样品涂上一层薄薄的金属（金和钯）。利用高分辨率数字场发射扫描电子显微镜，FE-SEM（JSM-6340F，JEOL Ltd，日本）分析样品。

脂质涂层的膜条基分析（lipid-coated membrane strip-based assay）

在室温下，将膜脂质条^TM、PIP条^TM和Sphingo条^TM（EchelonBiosciences,Salt Lake City,UT）于PBS/3%BSA孵育1-2小时，以阻止非特异性结合。然后在4℃下，将膜条于PBS/1%BSA稀释的防御素（0.12μM）中孵育过夜，然后于室温下，利用PBS/0.1%Tween-20彻底洗涤60min。在4℃，通过利用兔抗NaD1多克隆抗体（用于检测NaD1,NsD1,NsD2,rTPP3或PhD1A）或兔抗NaD2抗体（用于检测NaD2或NsD3）（均利用PBS/1%BSA进行1:2000稀释）探测膜的条，检测膜结合蛋白，时间1h，然后在4℃，利用HRP结合的驴抗兔IgG抗体（利用PBS/1%BSA进行1:2000稀释），时间1h。每个抗体孵育后，在室温，利用PBS/0.1%Tween-20充分冲洗膜条，时间60min。利用增强的化学发光（ECL）免疫印迹试剂（GE Healthcare BioSciences,NSW澳大利亚）检测化学发光并暴露于Hyperfilm(GE Healthcare Bio Sciences,NSW，澳大利亚)，利用Xomat(All-Pro-Imaging)显影。

对利用ImageJ（National Institute of Health,Bethesda,Maryland）从脂质条获得的图像进行密度计量分析。简言之，在感兴趣区域周围追踪同等大小圆圈。还将同等大小的背景圆圈置于没有脂质的膜上区域并将其作为背景。将感兴趣区域定量为从背景扣除的平均像素强度。

实施例1:NaD1的体外抗肿瘤活性

实施例1:引言

在体外，利用（3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物）（MTT）细胞培养存活实验测定NaD1（源自花烟草花的纯化的天然蛋白或毕赤酵母中产生的纯化的重组蛋白）对肿瘤细胞系活性以及原代人细胞分离物的影响。测定的肿瘤细胞系为HCT 116（人结肠癌），MCF-7（人乳腺癌），MM170（人类黑色素瘤），PC3（人类前列腺癌），B16-F1（小鼠黑色素瘤），CASMC（人类冠状动脉平滑肌细胞）和HUVEC（人脐静脉内皮细胞）。测定纯化的植物蛋白重组StPin1A (rStPin1A)或NaD2和NaD1。将以下所述细胞数量的细胞接种至96孔的平底微量滴定板:MM170(2×10⁴/孔),MCF-7(2×10⁴/孔),HCT-116(5×10³/孔),PC3(5×10³/孔),B16-F1(2×10³/孔),HUVEC(3×10³/孔),CASMC(5×10³/孔)并培养过夜，然后将NaD1,rNaD1或rStPin1A加入细胞，使最后的浓度范围在1至100μM之间并孵育48h，利用材料和方法中所述MTT方法进行分析。

实施例1:结果

NaD1和rNaD1显著降低全部肿瘤细胞系的活性，测定IC₅₀值在低μM浓度（2至5μM）（图2A至2E）。NaD1的两种形式显示出非常相似的抑制作用，NaD1的活性仅比rNaD1稍大（图2F）。相反地，植物蛋白rStPin1A对肿瘤细胞系的细胞存活不产生显著影响（图2A至2E）。在MM170细胞测定NaD2（为也可分离自花烟草花的茄科I类防御素），发现NaD2对细胞活力没有显著影响（图2G）。还发现NaD1和rNaD1降低了正常人CASMC和HUVEC的细胞活性，但其IC₅₀比肿瘤细胞系的IC₅₀高（7.5至12μM）（图2H和2I）。NaD2或rStPin1A不显著影响CASMC和HUVEC的细胞活性（图2H和2I）。在小鼠黑色素瘤B16-F1上测试发现，相比NaD1，还原和烷基化形式的NaD1（NaD1_R&A）对肿瘤细胞的细胞活性不产生影响（图2J）。这些数据表明天然和重组形式的NaD1均可在低μM浓度下，选择性地杀死肿瘤细胞。

实施例2:在体外，NaD1对人细胞透化作用的影响

实施例2:引言

之前已证明NaD1可透化棉花枯萎病菌的菌丝（van-der-Weerden等，2008）。为了测定NaD1是否以对真菌相似的方式杀死肿瘤细胞，利用两种方法评估NaD1对肿瘤细胞透化的能力。第一个是利用生物发光检测，测定细胞内ATP的释放。利用浓度增加的天然NaD1（0至20μM）处理4×10⁴U937（人粒单细胞肿瘤细胞系）或MM170（人骨髓瘤）细胞，通过测定562nm处的吸光度，每隔30秒测定ATP释放，总共30min。第二种方法是利用流式细胞仪，利用浓度增加的NaD1（0至100μM）对细胞处理30min后，测定U937和MM170细胞（4×10⁵/mL）对荧光染料碘化丙啶（PI）（2mg/mL）的吸收。

另外，利用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察肿瘤细胞膜上的任何形态改变。利用NaD1（10μM）处理或不处理人PC3细胞（前列腺癌细胞），时间30min，随后对其进行固定并进行FE-SEM分析。

实施例2:结果

利用NaD1处理后，U937和MM170细胞显示出时间依赖和浓度依赖的ATP释放（图3C和3D）。在这两种情况下，当与NaD1接触，细胞几乎立即释放出ATP。NaD1_R&A不能透化U937或MM170（图3D）。这些结果表明NaD1的完整结构对细胞透化是非常重要的且与NaD1杀死肿瘤细胞的能力相关，如实施例2所示。

为了进一步研究NaD1对肿瘤细胞的透化作用，在37℃，利用浓度增加的NaD1（0至100μM）对U937和MM179细胞处理30min，然后通过流式细胞仪检测PI吸收。如上NaD1介导ATP释放所述，随着NaD1浓度增加，U937和MM170细胞的PI吸收增加。如图3A和3B所示，当暴露于不同浓度的NaD1时，PI⁺U937或MM170细胞数量相似，在6.25μM，PI⁺为~30%，在100μM，增加至100%。

当暴露于NaD1，利用FE-SEM检测PC3细胞发现其与未处理细胞存在明显的形态差异。NaD1处理的细胞存在破裂的质膜，相对未处理细胞的光滑完整表面，其为扭曲的不规则表面（图3E）。这些变化表明其为不稳定质膜，如上述发现，NaD1可透化肿瘤细胞质膜。

实施例3:NaD1和重组NaD1对红血细胞溶解的影响

实施例3:引言

在37℃，将10⁷RBC于浓度增加的NaD1（0至100μM）中孵育16h，观察天然NaD1或rNaD1对人红血细胞（RBC）的溶解能力。通过测量412nm处的吸光度，测定血红蛋白的释放。

实施例3:结果

在低浓度（小于12.5μM），相比仅PBS对照组，NaD1对RBC溶解不产生影响。但在较高浓度（NaD1为12.5至100μM），NaD1可诱导RBC溶解，在100μM，释放的血红蛋白达到最大水平，为~50%溶解（相对于由水诱导100%完全溶解的阳性对照）。相反地，当浓度高达100μM，rNaD1未显示出RBC溶解作用（图4）。

实施例4:存在血清时，NaD1的透化作用

实施例4:引言

为了评估存在血清时NaD1对肿瘤细胞的透化能力，参照下述修改，如实施例2所述，利用PI吸收流式细胞仪进行分析:在存在浓度增加的胎牛血清（FCS）（0至40%）和天然NaD1下，对4×10⁵/mL U937细胞孵育60min，然后加入2mg/mL的PI。再利用流式细胞仪检测PI⁺细胞的百分数。

实施例4:结果

在存在血清时，NaD1仍具有透化U937细胞的能力，当FSC为40%，检测出70%的PI⁺细胞，仅稍低于0%FSC时的90%PI⁺。

实施例5:NaD1的体内抗肿瘤活性

实施例5:引言

通过小鼠体内的固体黑色素瘤生长模型，评估NaD1对肿瘤生长的影响。向C57BL/6小鼠皮下注入5×10⁵个B16-F1肿瘤细胞，实体肿瘤生长至直径~10mm。然后每两天向瘤内注射50μL PBS中1mg NaD1或NaDl_R&A/kg体重或仅注射50μL的PBS，直至小鼠死亡。注射前每两天测量一次肿瘤大小。将六个小鼠作为一组。

实施例5:结果

相比NaDl_R&A和仅PBS对照组，瘤内注射1mgNaD1/kg体重可显著降低肿瘤生长。第四天，NaD1_R&A或仅PBS治疗的小鼠的平均肿瘤大小分别为4.0±0.4或3.7±0.6，而NaD1治疗的小鼠的平均肿瘤大小只达到了1.8±0.2（将每个小鼠0天的肿瘤大小定为1）。应该注意当治疗开始，B16-F1肿瘤就建立在高度发达的阶段。

实施例6:小鼠的NaD1急性经口毒性实验

实施例6:引言

这项研究是基于OECD试验指导423（OECD（经济合作与发展组织）.2001.指导423:急性经口毒性-急性毒性分类方法。巴黎:OECD）。

选自同一窝的健康雌性C57BL/6小鼠来自La Trobe大学（Bundoora分校）的中央动物之家或来自Monash动物服务中心。研究期间，通过给耳朵打孔将其区分开，每笼放3个动物。在La Trobe大学，动物安置和养护在笼中，将笼中的三只作为一组，根据标准动物居养条件。

每天给药，并对实验小鼠进行称重，剂量给药前将其禁食4小时。给药前，对小鼠进行重新称重。制备蛋白质溶液（将纯的NaD1溶于水）后立即进行给药，将三只实验小鼠中的每只小鼠注入总共400μL的蛋白质溶液，剂量水平固定为0（水，仅载体对照）、20、50或300mg NaD1/kg体重。通过经口管饲法，利用圆尖套管针进行蛋白溶液给药。用药1小时后更换饲料。并随意地为这些小鼠提供标准的啮齿动物饮食和水。

第一天给药后，每小时观察小鼠，持续4小时且每天至少保持两次，直至第14天按计划处死。对总的毒性迹象，不良的药理作用和行为变化进行评估，并记录每天的食物和水消耗。在第7或第8和第14天对小鼠进行重新称重。在实验最后一天（第14天），为小鼠吸入二氧化碳，杀死小鼠并进行剖检。对所有的小鼠都进行粗略病理检查。记录以下器官的重量:脑、心、肝、肺、肾、胃肠道、脾脏和胸腺。随后，将样品固定在4%（v/v）的多聚甲醛中，然后利用澳大利亚表型组学网络系统（Melbournenode大学）进行石蜡包埋、切片和组织病理学检查。胃肠道分为以下几个部分:胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠。

实施例6:结果:体重和临床症状

所有动物都显示健康，直至研究终止，没有显示任何的总毒性症状、不良的药理作用或行为变化。对体重也不产生治疗相关的影响，在研究开始，体重与禁食前体重密切相匹配。

研究结束时，利用二氧化碳使小鼠窒息并处死，收集下述器官:脑、心、肝、肺、肾、胃肠道、脾脏和胸腺。将这些组织固定在4%（v/v）的多聚甲醛中。胃肠道随后分为以下几个部分:胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠。利用澳大利亚表型组学网络系统（Melbourne node大学）将所有器官包埋在石蜡中，并进行切片和苏木精和曙红染色（脑切片用髓鞘蓝（Luxol fast blue））。

除了最高剂量300mg NaD1/kg体重时可能对胃上皮轻微的刺激外，任何小鼠都没有观察到由蛋白质给药产生的病理症状。

实施例7:NaD1和NaD2的细胞脂质结合性能

实施例7:引言

实施固态脂质结合分析，利用三种售自Echelon^TM（膜、PIP和鞘脂条）的不同脂质条测定NaD1和NaD2与细胞脂质的相互作用。这些条上都点有100皮摩尔生物活性形式的脂质。在4℃，将脂质条与NaD1或NaD2，rNaD1或rNaD2（0.12μM）孵育过夜，借助NaD1或NaD2的特异性兔多克隆抗体检测结合作用，然后再利用HRP结合的驴抗兔抗体。通过对显影脂质条进行密度测定，定量地测定出NaD1或NaD2的结合作用。

实施例7:结果

NaD1与磷脂肌醇Ptdlns（PIP2）和（PIP3）显示出最强结合，其中包括Ptdlns(3,5)P2，Ptdlns(3,5)P2，Ptdlns(4,5)P2和Ptdlns(3,4,5)P3，但还与心磷脂和Ptdlns(PIP)显示出强结合，包括Ptdlns(3)P，Ptdlns(4)P2和Ptdlns(5)P（图7A和7B）。NaD1与磷脂酰丝氨酸、磷脂酰丙氨酸、磷脂酰甘油和硫脂显示出弱结合（图7A和7B和7C）。重组NaD1显示出与NaD1类似的脂质结合特异性，但其与磷脂酰丝氨酸、磷脂酰丙氨酸和磷脂酰甘油的结合则更强（图7G）。NaD1_R&A不能与任何细胞脂质结合（图7G）。

还发现NaD2可与细胞脂质结合，但与NaD1的特异性不同。相比NaD1，NaD2可与磷脂酸发生强结合，但表面上不能与(3.5)P2，Ptdlns(3,5)P2，Ptdlns(4,5)P2和Ptdlns(3,4,5)P3发生结合。

但是，与NaD1类似，NaD2也可与Ptdlns(3)P，Ptdlns(4)P和Ptdlns(5)P₂结合（图7D、7E和7F）。总体地，这些数据表明相关防御素NaD1和NaD2都可与重叠的细胞磷脂结合，但存在不同的特异性。重组NaD2显示出与NaD2类似的脂质结合特异性，但其与磷脂酰丝氨酸的结合则更强（图7G）。相比rNaD1，rNaD2不与脂质结合（图7G）。

实施例8:在体外，矮牵牛防御素PhD1A或番茄防御素TPP3对人细胞透化作用的影响

实施例8:引言

为了测定其他的茄科植物家族防御素是否也具有与NaD1相似的哺乳动物肿瘤细胞透化作用，利用两种方法评估矮牵牛防御素PhD1A或番茄防御素TPP3对U937细胞的透化作用。第一个是利用生物发光检测，测定细胞内ATP的释放。利用浓度增加的PhD1A或rTPP3（0至20μM）处理4×10⁴U937（人粒单细胞肿瘤细胞系），通过测定562nm处的吸光度，每隔30秒测定ATP释放，总共30min。第二种方法是利用流式细胞仪，利用浓度增加的PhD1A（0至50μM）或rTPP3（0至40μM）对细胞处理30min后，测定U937（4×10⁵/mL）对荧光染料碘化丙啶（PI）（2μg/mL）的吸收。

实施例8:结果

利用天然PhD1A（图9B）或rTPP3（图9D）处理后，U937细胞显示出时间依赖和浓度依赖的ATP释放。类似于NaD1，当与PhD1A或rTPP3接触，细胞几乎立即释放出ATP。为了进一步研究PhD1A或rTPP3对肿瘤细胞的透化作用，在37℃，利用浓度增加的PhD1A（0至50μM）或rTPP3（0至50μM）对U937细胞处理30min，然后通过流式细胞仪检测PI吸收。如上PhD1A或rTPP3介导ATP释放所述，随着PhD1A或rTPP3浓度增加，U937细胞的PI吸收增加。如图9A所示，在6.25μM，PI⁺U937细胞数为~35%，在50μM，增加至~90%。对于TPP3，在5μM，PI⁺U937细胞数为~35%，在40μM，增加至~90%（图9C）。

实施例9:茄科和非茄科植物防御素/γ-硫素对U937细胞透化活性的比较

实施例9:引言

为了评估茄科II类防御素（NaD1,PhD1A和TPP3）相对于非茄科防御素和相关的γ-硫素，对肿瘤细胞透化作用（大丽花防御素Dm-AMP1、大麦γ-硫素γ1-H、玉米γ-硫素γ2-Z），参照下述修改，如实施例2所述利用PI吸收流式细胞仪分析:在每个植物防御素/γ-硫素（NaD1，PhD1A，重组TPP3，重组γ1-H和重组γ2-Z）为10μM下，对4×10⁵/mL U937细胞孵育60min（不存在血清），然后加入2μg/mL的PI。再利用流式细胞仪检测PI⁺细胞的百分数。

实施例9:结果

三种茄科II类防御素（NaD1,PhD1A和rTPP3）都可透化U937细胞，相对于仅细胞的对照组，其PI⁺细胞数显著提高；当NaD1,PhD1A和rTPP3为10μM，PI⁺细胞分别为56.07±3.65%、57.07±2.76%和49.97±2.93%（对照组为27.03±0.52）。相反地，相对于仅细胞的对照组，Dm-AMP1、γ1-H、或γ2-Z未显出显著活性（图10）。

实施例10:存在血清时，矮牵牛防御素PhD1A或番茄防御素TPP3的透化活性

实施例10:引言

为了评估血清存在时，PhD1A或rTPP3对肿瘤细胞的透化能力，参照下述修改，如实施例2所述利用PI吸收流式细胞仪分析:在存在浓度增加的胎牛血清（FCS）（0至40%）下，设定PhD1A或rTPP3为10μM，对4×10⁵/mL U937细胞孵育60min，然后加入2μg/mL的PI。再利用流式细胞仪检测PI⁺细胞的百分数。

实施例10:结果

存在血清时，PhD1A和rTPP3都保留了对U937细胞的透化活性，但活性降低。对于PhD1A，相对于FCS为0%时，PI⁺细胞为90%，当FCS为40%，检测出的PI⁺细胞为40%（图11A）。血清中的重组TPP3活性比PhD1A更大，当FCS为5-40%，保留的活性高达70%（图11B）。应该注意由于完全不存在血清，所以当FCS为0%时，PI阳性细胞的水平较高。

实施例11:在体外，天然烟草（野生烟草）防御素NsD1，NsD2和NsD3对人肿瘤细胞透化作用的影响

实施例11:引言

为了进一步评估茄科植物家族的其他II类防御素是否也具有与NaD1相似的哺乳动物肿瘤细胞透化作用以及其他的I类防御素是否不具有该能力，相对于NaD1，利用两种方法评估野生烟草的II类防御素NsD1和NsD2或I类防御素NsD3对U937细胞的透化作用。第一个是利用生物发光检测，测定细胞内ATP的释放。利用10μM的植物防御素处理4×10⁴U937，通过测定562nm处的吸光度，每隔30秒测定ATP释放，总共30min。第二种方法是利用流式细胞仪，利用10μM的每种植物防御素对细胞处理30min后，测定U937（4×10⁵/mL）对荧光染料碘化丙啶（PI）（2μg/mL）的吸收。

实施例11:结果

利用天然NsD1和NsD2处理后（图12A），U937细胞显示出时间依赖和浓度依赖的ATP释放。类似于NaD1，当与NsD1和NsD2接触，细胞几乎立即释放出ATP。相反地，相对于仅细胞的对照组，天然NsD3不介导ATP释放（图12A）。为了进一步研究NsD1和NsD2与NsD3对肿瘤细胞的透化作用，在37℃，利用10μM的每种植物防御素对U937细胞处理30min，然后通过流式细胞仪检测PI吸收。NsD1和NsD2介导U937细胞PI吸收的水平与NaD1介导U937细胞PI吸收的水平相似（在10μM，PI⁺为~60%），而NsD3仅导致低的PI吸收（在10μM，PI⁺为~10%）（图12B）。

实施例12:茄科II类防御素对红血细胞溶解的影响

实施例12:引言

为了检测其他的茄科II类防御素是否也与NaD1类似不能溶解红血细胞（RBC），在37℃，将10⁷RBC于10μM或30μM的植物防御素孵育16h，观察天然NsD1、NsD2或PhD1A对人红血细胞（RBC）的溶解作用。通过测量412nm处的吸光度，检测血红蛋白的释放。

实施例12:结果

相比仅PBS的对照组，在10μM和30μM，NsD1和PhD1A均不显示对RBC溶解的影响。相比之下，在10μM（~17%溶解）和30μM（~23%溶解），NsD2显示出低的溶解活性（图13）。

实施例13:茄科I类和II类防御素的细胞脂质结合特性

实施例13:引言

进一步研究茄科I类和II类防御素与细胞脂质的相互作用，利用Echelon^TM PIP带，进行固态脂质结合分析。在4℃，将脂质条与I类防御素NsD3或II类防御素NsD1、NsD2、PhD1A和rTPP3（0.12μM）孵育过夜，借助NaD2或NaD1的特异兔多克隆抗体检测结合作用（这些抗体分别与I类或II类防御素发生交叉反应），然后再利用HRP结合的驴抗兔抗体。通过对显影脂质条进行密度计量，定量地测定出防御素的结合作用。

实施例13:结果

如针对NaD1所述，一般而言，所有的II类防御素均与磷脂肌醇Ptdlns（PIP2）和（PIP3）显示出最强结合，其中包括Ptdlns(3,4)P2，Ptdlns(3,5)P2，Ptdlns(4,5)P2和Ptdlns(3,4,5)P3，但还可与Ptdlns(PIP)结合，包括Ptdlns(3)P，Ptdlns(4)P和Ptdlns(5)P（图14A、14B、14C和14D）。但PhD1A除外，其还可与磷脂酸发生强结合（图14E）。还发现I类防御素NsD3可与细胞脂质发生结合，但与II类防御素的特异性不同。相比II类防御素（PhD1A除外），NsD3可与磷脂酸发生强结合，与Ptdlns（PIP），（PIP2）和（PIP3）发生弱结合（图14E）。总体地，这些数据表明茄科I类防御素和II类防御素都可与细胞磷脂结合，存在重叠性但存在不同的特异性，I类防御素优先地与磷脂酸结合，而II类防御素优先地与Ptdlns（PIP），（PIP2）和（PIP3）结合（图7G）。

参考文献

Aluru等(1999)Plant Physiol 120:633

Anaya-Lopez等,(2006)Biotechnol Lett 28:1101-8

Baker等(2005)Methods Enzymol 398:540-554

Bensch等，(1995)FEBS Let.368:331-335

Bloch等，(1991)FEBS Lett 279:101-104

Bohlmann(1994)Crit Rev Plant Sci13:1-16

Bohlmann和Apel(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42:227-240

Bonmatin等，(1992)J Biomol NMR 2:235-256

Brandstadter等，(1996)Mol Gen Genet 252:146-154

Broekaert等，(1992)Biochemistry 32:4308-4314

Broekaert等，(1995)Plant Physiol 108:1353-1358

Broekaert等，(1997)Crit Rev Plant Sci16:297-323

Bruix等，(1993)Biochemistry 32:715-724

Cammue等，(1992)J Biol Chem 267:2228-2233

Catanzariti等，(2004)Protein Sci13:1331-1339

Chen等，(2002)J Agric Food Chem 50:7258-63

Colilla等，(1990)FEBS Lett 270:191-4

Cornet等，(1995)Structure 3:435-448

Craik等，(1999)J Mol Biol 294:1327-1336

Craik(2001)Toxicon39:1809-1813

Craik等(2004)Curr Prot Pept Sci 5:297-315

Da Silva等，(2003)Protein Sci12:438-446

de Zelicourt等，(2007)Planta 226:591-600

Diamond等(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93:5156-5160

Fehlbaum等(1994)J Biol Chem 269:33159-33163

Ganz等，(1985)J Glin Invest 76;1427-1435

Gu等，(1992)Mol Gen Genet 234:89-96

Gustafson等，(1994)JAm Chem Soc 116:9337-9338

Hancock和Lehrer(1998)Trends Biotech 16:82-88

Hanzawa等，(1990)FEBS Lett 269:413-420

Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York

Harwig等，(1992)Blood 79:1532-1537

Janssen etai.(2003)Biochemistry42:8214-8222

Jennings等，(2001)Proc Natl Acad Sci U.S.A.98:10614-10619

Kader(1996)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47:627-654

Kader(1997)Trends Plant Sci 2:66-70

Komori等，(1997)Plant Physiol 115:314

Kushmerick等，(1998)FEBS Lett 440:302-306

Lamberty等，(1999)J Biol Chem 274:9320-9326

Lamberty等，(2001)Biochemistry 40:11995-12003

Landon等，(1997)Protein Sci 6:1878-1884

Lay和Anderson(2005)Curr Protein Pept Sci 6:85-101

Lay等，(2003a)Plant Physiol.131:1283-1293

Lay等，(2003b)J Mol Biol 325:175-188

Lehrer和Ganz(2002)Curr Opin Immunol 14:96-102

Lin等(2009)Biosci Rep 30:101-109

Lobo等，(2007)Biochemistry 46:987-9630

Loenza-Angeles等，(2008)30:1713-1719

Ma等，(2009)Peptides 30:2089-2094

Mader和Hoskin(2006)Expert Opin Investig Drugs 15:933-46.ReviewMarcus等，(1997)Eur J Biochem 244:743-749

McManus等，(1999)J Mol Biol 293:629-638

Melo等，(2002)Proteins 48:311-319

Mendez等(1990)EurJ Biochem 194:533-539

Mendez等，(1996)Eur J Biochem 239:67-73

Milligan等，(1995)Plant Mol Biol 28:691-711

Mirouze等，(2006)Plant J 47:329-342

Moreno等(1994)Eur J Biochem 223:135-139

Ngai和Ng(2005)Biochem Cell Biol 83:212-20

Osborn等，(1995)FEBS Lett 368:257-262

Patel等，(1998)Biochemistry 37:983-990

Pelegrini和Franco(2005)Int J Biochem Cell Biol 37:2239-53

Ramamoorthy等(2007)Mol Microbiol 66:771-786

Russell等，(1996)Infect Immun 64:1565-1568

Segura等(1998)FEBS Lett 435:159-162

Selsted等，(1985)J Clin Invest 76:1436-1439

Selsted等，(1993)J Biol Chem 268:6641-6648

Tailor等，(1997)J Biol Chem 272:24480-24487

Tam等，(1999)Proc Natl Acad Sci U.S.A.96:8913-8918

Tang和Selsted(1993)J Biol Chem 268:6649-6653

Tang等，(1999a)Science 286:498-502

Tang等(1999b)Infect Immun 67:6139-6144

Tarver等，(1998)Infect Immun 66:1045-1056

Terras等，(1992)J Biol Chem 267:15301-15309

Terras等，(1993)FEBS Lett 316:233-240

Terras等，(1995)Plant Cell 7:573-588

Thomma等，(2003)Curr Drug Targets-Infect.Dis.3:1-8

Trabi等，(2001)Biochemistry 40:4211-4221

van der Weerden(2008)J Biol Chem 283:14445-14452

Wijaya等，(2000)Plant Sci159:243-255

Wong和Ng(2005)Int J Biochem Cell Biol 37:1626-32

Yamada等，(1997)Plant Physiol 115:314

Zhang和Lewis(1997)FEMS Microbiol Lett 149:59-64

Zhang等，(1997)Cereal Chem 74:119-122。

Claims (29)

1.一种用于预防或治疗增生性疾病的方法，其中，所述方法包括为受试者给予治疗有效量的:

（a）茄科II类植物防御素；

（b）编码所述茄科II类植物防御素的核酸；

（c）包含所述核酸的载体；

（d）包含所述载体的宿主细胞；

（e）由所述宿主细胞产生的表达产物；或

（f）包含所述植物防御素、所述核酸、所述载体、所述宿主细胞或所述表达产物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物；

由此预防或治疗所述增生性疾病。

2.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述植物防御素源自或可源自花烟草（Nicotiana alata）、野生烟草（Nicotiana suaveolens）、矮牵牛（Petunia hybrida）或番茄（Solanum lycopersicum）。

3.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述植物防御素选自包含NaD1、NsD1、NsD2、PhD1A和TPP3的组。

4.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述植物防御素包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:26构成的组的氨基酸序列或其功能片段。

5.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述植物防御素由选自由SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27构成的组的核酸序列或其功能片段或补体、或与上述任一核酸序列具有70%同一性的功能核酸序列所编码。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述增生性疾病是癌症。

7.根据权利要求6中所述的方法，其中，所述癌症选自包括基底细胞癌、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌的组。

8.以下各项在制备用于预防或治疗增生性疾病的药物中的应用：

（a）茄科II类植物防御素；

（b）编码所述茄科II类植物防御素的核酸；

（c）包含所述核酸的载体；

（d）包含所述载体的宿主细胞；或

（e）由所述宿主细胞产生的表达产物。

9.根据权利要求8中所述的应用，其中，所述植物防御素源自或可源自花烟草、野生烟草、矮牵牛或番茄。

10.根据权利要求8中所述的应用，其中，所述植物防御素选自包含NaD1、NsD1、NsD2、PhD1A和TPP3的组。

11.根据权利要求8中所述的应用，其中，所述植物防御素包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:26构成的组的氨基酸序列或其功能片段。

12.根据权利要求8中所述的应用，其中，所述植物防御素由选自由SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27构成的组的核酸序列或其功能片段或补体、或与上述任一核酸序列具有70%同一性的功能核酸序列所编码。

13.根据权利要求8至12中任一项所述的应用，其中，所述增生性疾病是癌症。

14.根据权利要求13中所述的应用，其中，所述癌症选自包括基底细胞癌、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌的组。

15.一种在用于预防或治疗增生性疾病时的试剂盒，其中，所述试剂盒包含治疗有效量的:

（a）茄科II类植物防御素；

（b）编码所述茄科II类植物防御素的核酸；

（c）包含所述核酸的载体；

（d）包含所述载体的宿主细胞；

（e）由所述宿主细胞产生的表达产物；或

（f）包含所述植物防御素、所述核酸、所述载体、所述宿主细胞或所述表达产物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

16.根据权利要求15中所述的试剂盒，其中，所述植物防御素源自或可源自花烟草、野生烟草、矮牵牛或番茄。

17.根据权利要求15中所述的试剂盒，其中，所述植物防御素选自包含NaD1、NsD1、NsD2、PhD1A和TPP3的组。

18.根据权利要求15中所述的试剂盒，其中，所述植物防御素包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26构成的组的氨基酸序列或其功能片段。

19.根据权利要求15中所述的试剂盒，其中，所述植物防御素由选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27构成的组的核酸序列或其功能片段或补体、或与上述任一核酸序列具有70%同一性的功能核酸序列所编码。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的试剂盒，其中，所述增生性疾病是癌症。

21.根据权利要求20中所述的试剂盒，其中，所述癌症选自包括基底细胞癌、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌的组。

22.权利要求15至21中任一项所述的试剂盒在预防或治疗增生性疾病中的应用，其中，将治疗有效量的

（a）所述茄科II类植物防御素；

（b）编码所述茄科II类植物防御素的所述核酸；

（c）包含所述核酸的所述载体；

（d）包含所述载体的所述宿主细胞；

（e）由所述宿主细胞产生的所述表达产物；或

（f）包含所述植物防御素、所述核酸、所述载体、所述宿主细胞或所述表达产物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的所述药物组合物；

给予受试者，由此预防或治疗所述增生性疾病。

23.一种在用于预防或治疗增生性疾病时的药物组合物，其中，所述药物组合物包含:

（a）茄科II类植物防御素；

（b）编码所述茄科II类植物防御素的核酸；

（c）包含所述核酸的载体；

（d）包含所述载体的宿主细胞；

（e）由所述宿主细胞产生的表达产物；

以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

24.一种在用于预防或治疗增生性疾病时的茄科II类植物防御素。

25.一种用于筛选茄科II类植物防御素对哺乳动物肿瘤细胞的细胞毒性的方法，其中，所述方法包括使

（a）茄科II类植物防御素；

（b）编码所述茄科II类植物防御素的核酸；

（c）包含所述核酸的载体；

（d）包含所述载体的宿主细胞；或

（e）由所述宿主细胞产生的表达产物

与哺乳动物细胞系接触，并测定因与所述植物防御素接触而对所述哺乳动物细胞系的细胞毒性，由此筛选所述茄科II类植物防御素对哺乳动物肿瘤细胞的细胞毒性。

26.通过根据权利要求25中所述的方法筛选出的茄科II类植物防御素。

27.一种用于产生具有降低的溶血活性的茄科II类植物防御素的方法，其中，所述方法包括在所述防御素的N-末端处或N-末端附近向所述植物防御素引入至少一个丙氨酸残基。

28.通过根据权利要求27中所述的方法产生的具有降低的溶血活性的茄科II类植物防御素。

29.一种具有降低的溶血活性的茄科II类植物防御素，其基本上如本文中参照一个或多个实施例描述的。

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