MX2012014711A - Tratamiento de enfermedades proliferativas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para prevenir o tratar enfermedades proliferativas. En particular, la presente invención se refiere al uso de composiciones derivadas o derivables de plantas, tales como defensinas de plantas, particularmente en métodos para la prevención o tratamiento de enfermedades proliferativas tales como cáncer. La presente invención también se refiere a usos asociados, sistemas y kits.

Description

TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES PROLIFERATIVAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para prevenir o tratar enfermedades proliferativas . En particular, la presente invención se refiere al uso de composiciones derivadas o derivables de plantas, tales como defensinas de plantas, particularmente en métodos para la prevención o tratamiento de enfermedades proliferativas tales como cáncer. La presente invención también se refiere a usos asociados, sistemas y kits.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se conocen plantas por producir una variedad de compuestos químicos, ya sea constitutivamente o induciblemente, para proteger las mismas contra estrés ambiental, heridas, o invasión microbiana.

De las proteínas antimicrobianas de plantas que han sido caracterizadas a la fecha, una gran proporción comparte características comunes. Son en general proteínas altamente básicas, pequeñas (<10 kDa) , y a menudo contienen un número par de residuos de cisteína (típicamente 4, 6 u 8). Estas cisteínas todas participan en enlaces disulfuro intramoleculares y le proporcionan estabilidad estructural y termodinámica a la proteína (Broekaert et al., (1997)). Con base en las identidades de secuencia de aminoácidos, principalmente con referencia al número y espaciamiento de los residuos de cisteina, se han definido un número de distintas familias. Incluyen las defensinas de plantas (Broekaert et al., 1995, 1997; Lay et al., 2003a), tioninas (Bohlmann, 1994), proteína de transferencia de lípidos (Kader, 1996, 1997), heveína. (Broekaert et al., 1992) y proteínas del tipo anudamiento o Knottin (Cammue et al., 1992), así como también proteínas antimicrobianas de Macadamia integrifolia (Marcus et al., 1997; McManus et al., 1999) e Impatiens balsamina (Tailor et al., 1997; Patel et al., 1998), (Tabla 1). Todas estas proteínas antimicrobianas parecen ejercer sus actividades al nivel de la membrana plasmática de los microorganismos objetivo, aunque es probable que las diferentes familias de proteína actúen vía diferentes mecanismos (Broekaert et al., 1997) . Los ciclótidos son una nueva familia de péptidos de plantas ricos en cisteina, pequeños, que son comunes en miembros de las familias Rubiaceae y Violaceae (revisado en Craik et al., 1999, 2004; Craik, 2001) . Estos péptidos cíclicos inusuales (Tabla 1) se les han adscrito varias actividades biológicas, que incluyen propiedades antibacteriana (Tam, et al., 1999), anti-HIV (Gustafson et al., 1994) e insecticidas (Jennings et al . , 2001) .

Tabla 1: Proteínas antimicrobianas ricas cisteína, pequeñas, en plantas El tamaño de la proteína madura y espaciamiento de los residuos de cisteína para miembros representativos de proteínas antimicrobianas de plantas se muestra en la Tabla 1. Los números en la secuencia consenso representan el número de aminoácidos entre los residuos de cisteína altamente conservados en el miembro representativo, pero otros miembros de la familia pueden variar ligeramente en las longitudes inter-cisteína . Las conectividades de disulfuro se proporcionan por líneas de conexión. El armazón cíclico de los ciclótidos se representa por la línea punteada (de Lay and Anderson, 2005) .

Defensinas El término "defensina" ha sido previamente usado en la técnica para describir una familia diversa de moléculas que son producidas por muchas especies diferentes y las cuales funcionan en defensa innata contra patógenos que incluyen bacterias, hongos, levaduras y virus.

Defensinas de plantas Las defensinas de plantas (también llamadas ?-tioninas) son proteínas básicas pequeñas (~5 kDa, 45 a 54 aminoácidos), con ocho residuos de cisterna que forman cuatro enlaces disulfuro estrictamente conservados con una configuración Cysi-Cysvm , Cysn-CysIV, Cysm-Cysvi y Cysv-Cysvn- Asi como también estos cuatro enlaces disulfuro estrictamente conservados, algunas defensinas de plantas tienen un enlace disulfuro adicional (Lay et al., 2003a, 2003b; Janssen et al., 2003).

El nombre "defensina de planta" se ideó en 1995 por Térras y colaboradores quienes aislaron dos proteínas antifúngicas a partir de semillas de rábano (Rs-AFPl y Rs-AFP2 ) y notaron que a un nivel estructural primario y tridimensional estas proteínas fueron distintas de las a-/ß-tioninas de la planta pero compartieron algunas similitudes estructurales a defensinas de insectos y mamíferos (Térras et al., 1995; Broekaert et al., 1995).

Las defensinas de planta presentan conservación de secuencia clara, aunque relativamente limitada. Los ocho residuos de cisteína y una glicina en la posición 34 se encuentran estrictamente conservados (numeración con relación a Rs-AFP2). En la mayoría de las secuencias, una serina en la posición 8, un residuo aromático en la posición 11, una glicina en la posición 13 y un ácido glutámico en la posición 29 son también conservados (Lay et al., 2003a; Lay and Anderson 2005) .

Las estructuras de solución tri-dimensional de las primeras defensinas de planta fueron elucidadas en 1993 por Bruix y colaboradores para yl-P y yl-H. Desde tal tiempo, se han determinado las estructuras de otras defensinas derivadas de semillas y derivadas de dos flores (NaDl and PhDl) (Lay et al., 2003b; Janssen et al., 2003) . Todas estas defensinas elaboran un motivo conocido como el pliegue ß estabilizado por cisteína (0=aß) y comparten estructuras tiri-dimensionales altamente superponibles que comprenden una hélice- bien definida y una lámina-ß antiparalela de triple hebra. Estos elementos están organizados en un arreglo ßaßß y están reforzados por cuatro puentes disulfuro.

El motivo ??aß también es exhibida por defensinas de insecto y toxinas de escorpión. En comparación con las secuencias de aminoácidos de las defensinas de planta estructuralmente caracterizadas, en las defensinas de insecto y toxinas de escorpión, es aparente que el andamiaje CSa es altamente permisivo al tamaño y diferencias composicionales .

La estructura de ?-tionina/defensina de planta contrasta con aquella la cual es adoptada por las a- y ß-tioninas. Las a-y ß-tioninas forman moléculas compactas, anfipáticas, en forma de L donde el brazo vertical largo de L está compuesto de dos hélices-a, y el brazo corto está formado por dos hebras-ß antiparalelas y los últimos residuos C-terminales (-10). Estas proteínas son también estabilizadas por tres o cuatro enlaces disulfu.ro (Bohlmann and Apel, 1991) .

Las defensinas de plantas tienen una distribución extensa a través del reino vegetal y es probable que estén presentes en la mayoría, si no en todas las plantas. La mayoría de las defensinas de plantas han sido aisladas de semillas donde son abundantes y han sido caracterizadas a niveles molecular, bioquímico y estructural (Broekaert et al., 1995; Thomma et al., 2003; Lay and Anderson, 2005). Las defensinas también han sido identificadas en otros tejidos incluyendo hojas, vainas, tubérculos, frutos, raíces, cortezas y tejidos florales (Lay and Anderson, 2005).

Lay and Anderson (2005) han publicado un alineamiento de secuencias de aminoácidos de varias defensinas que han sido identificadas, ya sea como proteina purificada o deducida a partir de ADNc's. Otras defensinas de planta han sido descritas en la Patente Estadounidense No. 6,911,577, Publicación de Patente Internacional No. WO 00/11196 y Publicación de Patente Internacional No. WO 00/68405, los contenidos completos de los cuales se incorporan en la presente por referencia.

Defensinas de mamífero Las defensinas de mamífero forman tres subfamilias estructurales distintas conocidas como las defensinas a-, ß-y T-. Contrario a las defensinas de plantas, las tres subfamilias contienen solamente seis residuos de cisteína los cuales difieren con respecto a su tamaño, la colocación y conectividad de sus cisteínas, la naturaleza de sus precursores y sus sitios de expresión (Selsted et al., 1993; Hancock and Lehrer, 1998; Tang et al., 1999a, b; Lehrer and Ganz, 2002). Todas las subfamilias tienen un papel implicado en la inmunidad hospedera innata y más recientemente, se han ligado con inmunidad adaptiva como agentes inmunoestimulantes (Tang et al., 1999b; Lehrer and Ganz, 2002). Fue en el contexto de su papel de defensa que se ideó el nombre "defensina" (Ganz et ai., 1985; Selsted et al., 1985).

Las a-defensinas (también conocidas como defensinas clásicas) son de 29-35 aminoácidos de longitud y sus seis residuos de cisterna forman tres enlaces disulfuro con una configuración Cysi-Cysvi, Cysn-Cysiv, y Cysm-Cysv (Tabla 2).

Contrario a las -defensinas , las ß-defensinas son más granes (36-42 aminoácidos en tamaño) y tienen un apareamiento de cisteina (Cysi-Cysv, C su-Cysiv, y Cysm-Cysvi) y espaciamiento diferente (Tang and Selsted, 1993). También son producidas como preprodefensinas . Sin embargo, sus prodominios son mucho más cortos. Análogo a las a-defensinas, la síntesis de ß-defensinas puede ser constitutiva o puede ser inducida después de la lesión o exposición a bacterias, protozoarios parasíticos, lipopolisacáridos bacterianos, y también en respuesta a mediadores humorales (es decir, citocinas) (Diamond et al., 1996; Russell et al., 1996; Tarver et al. , 1998) .

El tamaño de la proteína madura y espaciamiento de residuos de cisteina para miembros representativos de defensina y proteínas similares a defensina a partir de insectos y mamíferos se muestra en la Tabla 2. Los números en la secuencia consenso representan el número de aminoácidos entre los residuos de cisteina altamente conservados en el miembro representativo, pero otros miembros de la familia pueden variar ligeramente en las longitudes inter-cisteína .

Las conectividades de disulfuro se proporcionan por lineas de conexión. El armazón cíclico de las teta-defensinas de mamífero se representa por la línea punteada.

Tabla 2. Miembros representativos de defensina y proteínas similares a defensinas a partir de insectos y mamíferos Defensinas de insecto Un gran número de defensinas y proteínas similares a defensina han sido identificados en insectos. Estas proteínas son producidas en la grasa corporal (equivalente de hígado del mamífero) a partir del cual son subsecuentemente liberadas en la hemolinfa (Lamberty et al., 1999) . La mayoría de las defensinas de insecto tienen tres enlaces disulfuro. Sin embargo, un número de proteínas relacionadas, es decir, drosomicina de ürosophila melanoga ster, tienen cuatro disulfuros (Fehlbaum et al., 1994; Landon et al., 1997) (Tabla 2) .

Se han resuelto las estructuras tri-dimensionales de varias defensinas de insecto (por ejemplo Hanzawa et al., 1990; Bonmatin et al., 1992; Cornet et al., 1995; Lamberty et al., 2001; Da Silva et al., 2003).° Su plegamiento global, como se tipifica por la defensina de insecto A, caracteriza una a-hélice, una lámina-ß antiparalela de doble hebra, y un bucle largo N-terminal. Estos elementos de estructura secundaria son estabilizados por tres enlaces disulfuro que son arreglados en una configuración Cysi-CysiV, CySn-Cysv, y Cysin-Cysvi (Bonmatin et al., 1992; Cornet et al., 1995).

Dos clases de defensinas de planta Las defensinas de planta pueden ser divididas en dos clases principales de conformidad con la estructura de las proteínas precursoras predichas de clones de ADNc (Lay et al., 2003a) (Figura 8). En la primera y más grande clase, la proteina precursora está compuesta de una secuencia señal de retículo endoplásmico (ER) y un dominio maduro de defensina. Estas proteínas entran a la ruta secretora y no tienen señales obvias para modificación post-traduccional y direccionamiento subcelular (Figura 8A) .

La segunda clase de defensinas son producidas como precursores más grandes con prodominios o propéptidos C-terminales (CTPPs) de aproximadamente 33 aminoácidos (Figura 8B) . Las defensinas clase II han sido identificadas en especies solanáceas donde son expresadas constitutivamente en tejidos florales (Lay et al., 2003a; Gu et al., 1992; illigan et al., 1995; Brandstadter et al., 1996) y frutos (Aluru et al., 1999) y en hojas con estrés salino (Komori et al., 1997; Yamada et al., 1997). Los CTPP de las defensinas solanáceas de Nicotiana alata (NaDl) y Petunia hybrida (PhDl y PhD2) son removidos proteolíticamente durante la maduración (Lay et al. , 2003a) .

Los CTPPs en las defensinas solanáceas tienen un contenido inusualmente alto de aminoácidos hidrofóbicos y acídicos. De manera interesante, a pH neutral, la carga negativa del CTPP contrabalancea la carga positiva del dominio de defensina (Lay and Anderson, 2005).

Actividad biológica de defensinas de plantas Algunas actividades biológicas han sido atribuidas a defensinas de plantas, incluyendo efectos inhibidores de crecimiento en hongos (Broekaert et al., 1997; Lay et al., 2003a; Osborn et al., 1995; Térras et al., 1993), y bacterias Gram-positiva y Gram-negativa (Segura et al., 1998; Moreno et al., 1994; Zhang and Lewis, 1997). Algunas defensinas son también inhibidores efectivos de enzimas digestivas tales como a-amilasas (Zhang et al., 1997; Bloch et al., 1991) y serina proteasas ( ijaya et al., 2000; Meló et al., 2002), dos funciones consistentes con un papel en la protección contra insectos herbívoros. Esto es soportado por la observación de que defensina de frijol mungo expresada en bacterias VrCRP, es letal a los brúquidos Callosobruchus chinensis cuando se incorpora en una dieta artificial a 0.2% (p/p) (Chen et al., 2002). Algunas defensinas también inhiben la traducción de la proteína (Méndez et al., 1990; Colilla et al., 1990; Méndez et al., 1996) o se unen a canales iónicos (Kushmerick et al., 1998). Una defensina de ñrabidopsis halleri también confiere tolerancia al zinc, sugiriendo un papel en la adaptación al estrés (Mirouze et al., 2006). Más recientemente, una defensina de girasol mostró inducción de muerte celular en plantas parásitas de Orobanche (de Zélicourt et al., 2007); Actividad anti-fúngica La actividad mejor caracterizada de algunas pero no todas las defensinas de plantas es su capacidad para inhibir, con potencias variantes, un gran número de especies fúngicas (por ejemplo, véase Broekaert et al., 1997; Lay et al., 2003a; Osborn et al., 1995). Rs-AFP2, por ejemplo, inhibe el crecimiento de Phoma betae a 1 yg/ml, pero es inefectivo contra Sclerotinia sclerotíorum a 100 pg/ml (Térras et al., 1992) . Con base en sus efectos en el crecimiento y morfología del hongo Fusarium culmorum, se pueden distinguir dos grupos de defensinas. Las defensinas de planta "morfogénicas" causan elongación hifal reducida con un incremento concomitante en la ramificación hifal, mientras las defensinas de planta "no morfogénicas" reducen el índice de elongación hifal, pero no inducen distorsiones morfológicas marcadas (Osborn et al., 1995) .

Más recientemente, se ha demostrado que la defensina de chícharos Psdl se toma intracelularmente y entra al núcleo de Neurospora crassa donde interactúa con una proteína similar a ciclina nuclear involucrada en el control del ciclo celular (Lobo et al., 2007). Para MsDefl, una defensina de alfalfa, dos cascadas de señalización de proteína cinasa activada por mitógeno (MAP) tienen un papel principal en la regulación de la actividad de MsDefl, en Fusariu graminearum (Ramamoorthy et al., 2007).

La permeabilización de membranas fúngicas también ha sido reportada para algunas defensinas de plantas (Lay and Anderson, 2005). Por ejemplo, NaDl es una defensina de planta aislada de tejido floral de Nicotiana alata. Las secuencias codificantes y aminoácido de NaDl se describen en la Publicación de Patente Internacional No. WO 02/063011, los contenidos completos de las cuales se incorporan por referencia en la presente. La NaDl se probó in vitro por su actividad antifúngica contra el hongo filamentoso Fusarium oxysporum f. sp . vasinfectum (Fov), Verticillium dahliae, Thielaviopsis basicola , Aspergillus nidulans y Leptosphaeria maculans . A 1 µ?, NaDl retarda el crecimiento de Fov y L. maculans por 50% mientras V. dahliae, T. basicola , y A. nidulans fueron todos inhibidos por aproximadamente 65%. A 5 µ de NaDl, el crecimiento de todas las cinco especies se inhibió por más de 80%. Estas cinco especies fúngicas son todas miembros del filo ascomiceto y se encuentran distribuidas entre estas tres clases en el subfilo: pezizomicotiria . Estos hongos son patógenos fúngicos agronómicamente importantes. Todos .los hongos filamentosos probados de este modo son bastantes sensibles a la inhibición por NaDl (van der Weerden et al., 2008).

La importancia de los cuatro enlaces disulfuro en NaDl se investigó reduciendo y alquilando los residuos de cisteina. La NaDl reducida y alquilada (NaDlRSA) fue completamente inactiva en los ensayos inhibidores de crecimiento con Fov, aún a concentración diez veces superior que el IC50 para NaDl (van der Weerden et al., 2008).

Trabajo previo con péptidos antimicrobianos y células tumorales Uso de péptidos antimicrobianos pequeños catiónicos/ricos en cisteina en el tratamiento de enfermedades humanas Existe un cuerpo creciente de literatura que implica a- y ß-defensinas en varios aspectos de cáncer, tumorigénesis , angiogénesis e invasión. El uso de defensinas de mamífero también se ha propuesto para el tratamiento de infecciones fúngicas y virales y como una alternativa o adjunto al tratamiento antibiótico de infecciones bacterianas. Sin embargo, su citotoxicidad hacia células de mamífero permanece una barrera significativa. Moss et al., (Patente Estadounidense No. 7,511,015) ha mostrado que la modificación del péptido de defensina a través de ribosilación o ADP-ribosilación de residuos de arginina modifica la toxicidad del péptido y mejora sus propiedades antimicrobianas .

La revisión por Mader and Hoskin (2006) describe el uso de péptidos antimicrobianos catiónicos como nuevos agentes citotóxicos para el tratamiento de cáncer. Se debe notar sin embargo que una revisión por Peleqrini and Franco (2005) describe incorrectamente a-, ß-tioninas de muérdago, las cuales son moléculas anticancerígenas , como ?-tioninas (otro nombre para defensinas de planta) . La persona experta en la técnica podría entender que tal técnica previa no se refiere a defensinas de planta (?-tioninas) sino preferiblemente a las a- / ß-tioninas estructuralmente y funcionalmente distintas.

Reportes de defensinas de plantas con actividad antiproliferativa en células de cáncer humano Desde 2004, algunos reportes aislados han sugerido que las proteínas de defensina (similares) de plantas podrían también exhibir actividad antiproliferativa in vitzo contra varias líneas de células de tumor humano (con potencias diferentes) (véase, por ejemplo, Wong and Ng (2005), Ngai and Ng (2005), Ma et al., (2009) y Lin et ai., (2009)). Estas proteínas han sido ampliamente aisladas de plantas leguminosas (por ejemplo, frijol) . La asignación de estas proteínas, a la clase de defensinas de plantas se basa en su masa molecular estimada (-5 kDa) y en algunos casos, en similitudes de aminoácido N-terminal limitado a secuencias de defensina conocidas. Sin embargo, las proteínas como se describe en estas referencias carece de los residuos de cisterna estrictamente conservados y espaciamientos de cisterna que definen las defensinas. Además, las proteínas descritas en tales referencias no son defensinas Clase II, ni son de la familia Solanaceae .

Una revisión de la literatura indica que la defensina de Capsicum chínese (CcDl) es la única otra defensina Clase II de la familia Solanaceae que ha sido previamente implicada por tener el potencial para inhibir la viabilidad de las células de mamífero (Anaya-Lopez et al., 2006) . Se reporta que la transfección de un constructo de expresión que codifica una secuencia de longitud completa para CcDl en la línea de células endoteliales de bovino BE-E6E7 resulta en medio acondicionado que exhibe efectos anti-proliferativos en la línea de células transformadas humanas HeLa . Existe un número de defectos principales en el diseño experimental e interpretación de estos datos que hacen imposibles para la persona experta en la técnica extraer una conclusión válida a partir de los estudios descritos como si la CcDl exhibiera actividad anti-proliferativa . Estas incluyen: (i) aunque el ARNm para CcDl se sugirió en las células transíectadas , no se proporcionó evidencia para demostrar que la proteína de CcDl fue en realidad expresada en el medio acondicionado, (ii) el uso del marco de lectura abierto de longitud completa de CcDl en lugar que el dominio de codificación maduro podría requerir el procesamiento del precursor expresado por remoción del dominio CTPP para producir una defensina "activa" - este no fue demostrado-, (iii) el proceso de transfección puede resultar en cambios a una célula y el control; para el experimento de transfección no fue adecuado que se usaron células no transfectadas en lugar del control correcto de células transfectadas del vector solas, (iv) el uso del medio acondicionado en lugar de la proteína CcDl purificada podría influenciar la lectura experimental ya que componentes del medio u otras moléculas secretadas de las células transfectadas pueden, las mismas o en combinación con CcDl, tener actividad anti-proliferativa, (v) los niveles de expresión de AR m de CcDl en las varias poblaciones de células endoteliales transfectadas (Anaya-Lopez et al., 2006, Figura 2) no se correlacionan con la actividad anti-proliferativa propuesta del medio acondicionado de células transfectadas CcDl (Anaya-Lopez et al., 2006, Figura 4), ya que no existe diferencia estadísticamente significativa entre las respuestas anti-proliferativas observadas mediadas por las muestras de medio acondicionado diferente. Se debe notar también que estas deficiencias en el diseño experimental e interpretación fueron expresamente reconocidas en un documento publicado independientemente por los mismos autores en 2008 (Loenza-Angeles et al., 2008). Con base en estas observaciones, podría ser imposible para la persona experta en la técnica interpretar de Anaya-Lopez et: al., (2006) que la CcDl tiene alguna actividad anti-proliferativa contra células de mamífero .

Los inventores han descrito previamente en la Publicación de Patente Internacional No. WO 02/063011 ciertas defensinas novedosas y su uso en inducir resistencia en plantas o partes de plantas para infestación patogénica. Los contenidos completos del documento WO 02/063011 se incorporan en la presente por referencia.

Como un resultado de estudios adicionales en defensinas de plantas, se ha determinado de manera sorprendente que las defensinas Clase II de la familia de plantas Solanaceae tienen propiedades citotóxicas potentes. Estos hallazgos significativos por lo tanto describen una forma novedosa e importante en la cual las enfermedades proliferativas pueden ser prevenidas y tratadas. Por consiguiente, estos hallazgos proporcionan métodos para la prevención y tratamiento de enfermedades proliferat ivas tales como cáncer, así como también sistemas y kits asociados .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una defensina de planta para uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad proliferativa .

En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica la defensina de planta del primer aspecto.

En un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un vector que comprende el ácido nucleico del segundo aspecto.

En un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedera que comprende el vector del tercer aspecto.

En un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un producto de expresión producido por la célula hospedera del cuarto aspecto.

En un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad proliferativa, en donde la composición farmacéutica comprende la defensina de planta del primer aspecto, el ácido nucleico del segundo aspecto, el vector del tercer aspecto, la célula hospedera del cuarto aspecto o el producto de expresión del quinto aspecto, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa, en donde el método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la defensina de planta del primer aspecto, el ácido nucleico del segundo aspecto, el vector del tercer aspecto, la célula hospedera del cuarto aspecto, el producto de expresión del quinto aspecto o la composición farmacéutica del sexto aspecto, de este modo previniendo o tratando la enfermedad proliferativa .

En un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de la defensina de planta del primer aspecto, el ácido nucleico del segundo aspecto, el vector del tercer aspecto, la célula hospedera del cuarto aspecto, el producto de expresión del quinto aspecto o la composición farmacéutica del sexto aspecto, en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa .

En un noveno aspecto de la presente invención, se proporciona un kit para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa, en donde el kit comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la defensina de planta del primer aspecto, el ácido nucleico del segundo aspecto, el vector del tercer aspecto, la célula hospedera del cuarto aspecto, el producto de expresión del quinto aspecto o la composición farmacéutica del sexto aspecto.

En un décimo aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de], kit del noveno aspecto para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa , en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de la defensina de planta del primer aspecto, el ácido nucleico del segundo aspecto, el vector del tercer aspecto, la célula hospedera del cuarto aspecto, el producto de expresión del quinto aspecto o la composición farmacéutica del sexto aspecto se administra a un sujeto, de este modo previniendo o tratando la enfermedad proliferativa .

En un onceavo aspecto de la presente invención, se proporciona un método de selección para citotoxicidad de defensinas de plantas contra células tumorales de mamífero, en donde el método comprende poner en contacto la defensina de planta del primer aspecto, el ácido nucleico del segundo aspecto, el vector del tercer aspecto, la célula hospedera del cuarto aspecto, el producto de expresión del quinto aspecto o la composición farmacéutica del sexto aspecto con una línea de células de mamífero, y someter a ensayo para determinar la citotoxicidad contra la línea de células de mamífero debido al contacto con la defensina de planta.

En un doceavo aspecto de la presente invención, se proporciona una defensina de planta seleccionada por el método del onceavo aspecto.

En un treceavo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una defensina de planta con actividad hemolítica reducida, en donde el método comprende introducir en la defensina de planta al menos un residuo de alanina en o cerca del N-terminal de la defensina .

En un catorceavo aspecto de la presente invención, se proporciona una defensina de planta con actividad hemolítica reducida producida por el método de conformidad con el treceavo aspecto.

Definiciones El término "derivable" incluye, y puede ser usado intercambiablemente con, los términos "obtenible" y "aislable". Composiciones u otra materia de la presente invención que es "derivable", "obtenible" o "aislable" a partir de una fuente particular o procesos que incluyen no solamente composiciones u otra materia derivada, obtenida o aislada de tal fuente o proceso, sino también las mismas composiciones o tema sin embargo de origen o producidos.

Como se usa en la presente el término "polipéptido" significa un polímero elaborado de aminoácidos ligados en conjunto por péptido, uniones, e incluye fragmentos o análogos de los mismos. Los términos "polipéptido", "proteína", y "aminoácido", son usados intercambiablemente en la presente, aunque para los propósitos de la presente invención un "polipéptido" puede constituir un motivo de una proteína de longitud completa.

El término "ácido nucleico" como se usa en la presente se refiere a un polímero de hebra única o doble de desoxirribonucleótido, bases de ribonucleótido o análogos conocidos de nucleótidos naturales, o mezclas de los mismos, el término incluye referencia a la secuencia especificada así como también a la secuencia complementaria a esta, a menos que se indique de otro modo. Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "secuencia de polinucleótido" son usados intercambiablemente. Se entenderá que el "extremo 5'," como se usa en la presente con relación a un ácido nucleico corresponde al N-término del polipéptido codificado y el "extremo 3' , " corresponde al C-término del polipéptido codificado .

El término "purificado" significa que el material en cuestión ha sido removido de su ambiente natural u hospedero, e impurezas asociadas reducidas o eliminadas de manera que la molécula n cuestión es la especie predominante presente. El término "purificado" por lo tanto significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otras especies individuales en la composición) , y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde las especies objeto comprenden al menos aproximadamente 30 porciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 hasta 90 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. Muy preferiblemente, las especies objeto se purifican a homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente de una especie macromolecular única. Los términos "purificado" y "aislado" pueden ser usados intercambiablemente. La pureza y homogeneidad son típicamente determinados usando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líguida de alta resolución. Una proteína o ácido nucleico que es la especie predominante presente en una preparación es sustancialmente purificada. El término "purificado" en algunas modalidades denota que una proteína o ácido nucleico da origen a esencialmente una banda en un gel electroforético .

El término "fragmento" se refiere a un polipéptido o ácido nucleico que codifica un constituyente o es un constituyente de un polipéptido o ácido nucleico de la invención del mismo. Típicamente el fragmento posee actividad biológica cualitativa en común con el polipéptido o ácido nucleico del cual es un constituyente. Un fragmento peptídico puede ser entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, o entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. Alternativamente, el fragmento peptídico puede ser entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15 aminoácidos de longitud. El término "fragmento" por lo tanto incluye un polipéptido que es un constituyente de un polipéptido de defensina de planta de longitud completa y posee actividad biológica cualitativa en común con un polipéptido de defensina de planta de longitud completa. Un fragmento puede ser derivado de un polipéptido de defensina de planta de longitud completa o ? alternativamente puede ser sintetizado por algunos otros medios, por ejemplo síntesis química.

El término "fragmento" también puede referirse a un ácido nucleico que codifica un constituyente o es un constituyente de un polinucleótido de la invención. Fragmentos de un ácido nucleico no necesariamente necesitan codificar polipéptidos los cuales retienen la actividad biológica. Preferiblemente el fragmento puede, por ejemplo, ser útil como una sonda de hibridización o cebador PCR. El fragmento puede ser derivado de un polinucleótido de la invención o alternativamente puede ser sintetizado por algunos otros medios, por ejemplo síntesis química. Ácidos nucleicos de la presente invención y fragmentos de los mismos también pueden ser usados en la producción de moléculas antisentido usando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica.

El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o proteína o por la alteración de un ácido nucleico nativo o proteína, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Por consiguiente, células "recombinantes" expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la. célula o expresan genes nativos que son de otro modo anormalmente expresados, sobre expresados o no expresados en todos. Por el término "ácido nucleico recombinante" significa un ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, por la manipulación de un ácido nucleico, por ejemplo, usando polimerasas y endonucleasas , en una forma no encontrada normalmente en la naturaleza. De esta manera, se logra la unión operable de diferentes secuencias. De este modo un ácido nucleico aislado, en una forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro por ligación de moléculas de ADN que no son normalmente unidas, son ambos considerados "recombinantes" para el propósito de esta invención. Se entiende que una vez que un ácido nucleico recombinante se elabora y reintroduce en una célula hospedera u organismo, se replicará no recombinantemente, es decir, usando la maquinaria celular in vivo de la célula hospedera en lugar de manipulaciones in vitro. Sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez producidos recombinantemente, aunque subsecuentemente no recombinantemente replicados, son todavía considerados recombinantes para los propósitos de la invención. De manera similar, una "proteína recombinante" es una proteína elaborada usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se representa anteriormente.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos (o ácido nucleico) , se refiere a dos o más secuencias o sub-secuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido, (o nucleótidos) que son el mismo sobre una región especificada, cuando se compara y alinea para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región designada, como se mide usando algoritmos de comparación de secuencia, o por alineación manual e inspección visual, tales técnicas son bien conocidas por la persona experta en la técnica.

Como se usa en la presente el término "tratamiento" se refiere a cualquiera y todos los usos los cuales remedian un estado de enfermedad o síntomas, previenen el establecimiento de enfermedad, o de otro modo previenen, obstaculizan, retardan, alivian o invierten el progreso de la enfermedad u otros síntomas indeseables en cualquier forma alguna.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados como se entiende comúnmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica (por ejemplo, en biología celular, química, biología celular y cultivo celular) . Técnicas estándares usadas para métodos bioquímicos y moleculares se pueden encontrar en Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3Ed ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John iley & Sons, Inc. - y la versión completa titulada Current Protocols in Molecular Biology) .

A través de esta especificación la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprenden" será entendida por implicar la inclusión de un elemento declarado, integrante o etapa, o grupo de elementos, integrantes o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, integrante o etapa, o grupo de elementos, integrantes o etapas.

A través de esta especificación, la referencia a valores numéricos, a menos que se declare de otro modo, es tomada como significando "aproximadamente" tal valor, numérico. El término "aproximadamente" es usado para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo y el método es empleado para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

La referencia a cualquier técnica previa en esta especificación no es, y no debe ser tomada como un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que la técnica anterior forma parte del conocimiento general común de la persona experta en la técnica.

El contenido completo de todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, y otro material mencionado en esta especificación se incorpora en la presente por referencia .

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEC ID NO: 1 es una secuencia consenso de aminoácido para el dominio maduro de una defensina de planta Clase II.

La SEC ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos de longitud completa ejemplar para la defensina de planta NaDl, con la SEC ID NO: 3 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

La SEC ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos ejemplar para el dominio maduro de la defensina de planta NaDl, con la SEC ID NO: 5 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

La SEC ID NO: 6 es una secuencia de aminoácidos ejemplar para un dominio maduro recombinantemente alterado de la defensina de planta NaDl, que tiene un residuo alanina adicional en el N-terminal, con la SEC ID NO: 7 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

La SEC ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos de longitud completa ejemplar para la defensina de planta TPP3, con la SEC ID NO: 9 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente .

La SEC ID NO: 10 es una secuencia de aminoácidos ejemplar para el dominio maduro de la defensina de planta TPP3, con la SEC ID NO: 11 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

La SEC ID NO: 12 es una secuencia de aminoácidos ejemplar para un dominio maduro recombinantemente alterado de la defensina de planta TPP3, que tiene un residuo alanina adicional en el N-terminal, con la SEC ID NO: 13 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

La SEC ID NO: 14 es una secuencia de aminoácidos de longitud completa ejemplar para la defensina de planta PhDlA, correspondiente a la base de datos Sol Genomics Network de número de acceso SGN-U207537, con la SEC ID NO: 15 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

La SEC ID NO: .16 es un aminoácido de longitud completa ejemplar adicional para la defensina de planta PhDlA que se clonó y secuenció por los inventores, con la SEC ID NO: 17 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

La SEC ID NO: 18 es una secuencia de aminoácidos ejemplar para el dominio maduro de la defensina de planta PhDlA, con la SEC ID NO: 19 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

La SEC ID NO: 20 es una secuencia de aminoácidos de longitud completa ejemplar para la defensina de planta NsDl, con la SEC ID NO: 21 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente .

La SEC ID NO: 22 es una secuencia de aminoácidos ejemplar para el dominio maduro de la defensina de planta NsDl, con la SEC ID NO; 23 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

La SEC ID NO: 24 es una secuencia de aminoácidos de longitud completa ejemplar para la defensina de planta NsD2, con la SEC ID NO: 25 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente .

La SEC ID NO: 26 es una secuencia de aminoácidos ejemplar para el dominio maduro de la defensina de planta NsD2, con la SEC ID NO: 27 siendo la secuencia de ácido nucleico correspondiente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención será ahora descrita, por medio del ejemplo solamente, con referencia a las siguientes figuras .

Figura 1A: La Figura 1A es una expresión que representa inmunomanchado y purificación de NaDl recombinante (rNaDl) . Medios de expresión de P. pastorís recolectados a 48 h (30 µ?) asi como también muestras de varias etapas de purificación de sefarosa SP que incluyen la fracción no unida (30 µ?), fracción lavada (30 µ?) y las primeras cinco fracciones de elución de 1.5 mi (30 µ? de cada una) se separaron por SDS-PAGE y examinaron por inmunomanchado con el anticuerpo a-NaDl . La NaDl de flores (200 ng) se usó como un control positivo. La NaDl recombinante podría ser detectada en el medio de expresión de 48 horas así como también las fracciones de elución de sefarosa SP. Figura IB: es un rastro de HPLC de fase inversa que ilustra pureza de rNaDl purificada de P. pastoris usando sefarosa SP. Las fracciones de elución de sefarosa SP que contienen rNaDl se cargaron en una columna de RP-HPLC R8 analítica y eluyeron usando un gradiente lineal de 40 min, (0-100% de amortiguador B) . Las proteínas se detectaron por absorbencia a 215 nm. Se detectó una proteína principal única indicando que la proteína fue altamente pura. Figura 1C: La Figura 1C compara al estructura de rNaDl a NaDl nativa purificada de flores. El espectro de dicroísmo circular UV lejano de rNaDl (cuadrados abiertos) y NaDl nativa (rombos cerrados) se comparó y no demostró diferencias significativas indicando que rNaDl fue correctamente plegada. Figura ID: La Figura ID compara la actividad antifúngica de rNaDl a NaDl nativa purificada de flores. El crecimiento hifal de Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum en la presencia de rNaDt (cuadrados abiertos) o NaDl (rombos cerrados) es trazada con relación al crecimiento de una no proteína de control para el mismo periodo. La gráfica representa datos de tres experimentos separados realizados por cuadruplicado. Las barras de error representan el error estándar de la media.

Las Figuras 2A hasta 2E son representaciones gráficas que muestran el efecto de NaDI en la viabilidad de célula tumoral . (Figura 2A) carcinoma de mama humano MCF-7, (Figura 2B) carcinoma de colon humano HCT-116, (Figura 2C) melanoma humano MM170, (Figura 2D) carcinoma de próstata humano PC3, (Figura 2E) melanoma de ratón B16-F1. Se realizaron ensayos de viabilidad celular de MTT en células de tumor que han sido cultivadas en la presencia de concentraciones incrementadas (0 a 100 µ?) de NaDl, rNaDl, o StPinlA recombinante (rStPinlA). El % de viabilidad se muestra por tener células no tratadas designadas como 100% viables. La Figura 2F proporciona una comparación de la actividad de NaDl contra células tumorales y células normales. Las concentraciones inhibidoras (IC50) (µ?) de NaDl o rNaDl se determinaron de ensayos de viabilidad de células MTT en un rango de lineas de células de tumor de ratón y humano y lineas de células primarias normales humanas. La Figura 2G es una representación gráfica que muestra el efecto de NaDl y NaD2 contra el melanoma humano ??G70. Se realizaron ensayos de viabilidad de células MTT en células cultivadas en la presencia de concentraciones incrementadas (0 a ???µ?) de NaDl, rNaDl o NaD2: el % de viabilidad se muestra teniendo o células no tratadas designadas como 100% viables. Las Figuras 2H y 21 muestran el efecto de NaDl en células humanas primarias normales, (Figura 2H) células endoteliales de la vena umbilical (HUVEC) , (Figura 21) células del músculo liso de la arteria coronaria (CASMC) . Se realizaron ensayos de viabilidad de células MTT en células cultivadas en la presencia de concentraciones incrementadas (0 a 100 µ?) de NaDl, rNaDl, o rStPinlA. El % de viabilidad se muestra teniendo células no tratadas designadas como 100% viables. La Figura 2J muestra el efecto de una NaDl alquilada y reducida (NaDlRSA) en viabilidad de células de melanoma de ratón BT6-Fl . Se realizaron ensayos de viabilidad de células MTT en células que han sido cultivadas en la presencia de concentraciones incrementadas (0 a 30µ? ó 0 a 50 µ?) de NaDl, o NaDlRSA o rNaDl, respectivamente. El % de viabilidad se muestra, teniendo células no tratadas desiqnadas como 100% viables .

Las Figura 3A y 3B son representaciones gráficas que muestran el efecto de NaDl en la permeabilización de (Figura 3A) células mielomonociticas humanas U937 o (Figura 3B) células de cáncer de melanoma humano MM170. Las células se incubaron con concentraciones incrementadas de NaDl (0 a 100 µ?) por 30 min a 37 °C después de lo cual se agregó yoduro de propidio (PI). Los números de células que se tiñeron positivamente para PI (PI+) de determinaron por citometria de flujo. Las Figuras 3C y 3D muestran el efecto de (Figura 3C) NaDl y (Figura 3D) NaDlRSA en la liberación de ATP de células mielomonociticas humanas U937. Se agregaron NaDl y NaDlRS¾ a las células en salina amortiguada de fosfato (PBS) junto con un reactivo de detección de luciferasa ATP (Roche™) y la liberación de ATP detectada por más tiempo por espectrofotometria a una longitud de onda de 562 nm. Figura 3E Se usó microscopio de electrón de barrido de campo de emisión para la imagen de cambios morfológicos en células PC3 tratadas con NaDl. Los paneles izquierdo y derecho son imágenes de FE-SEM de células PCR tratadas con NaDl y no tratadas, respectivamente. Los paneles superiores son de células a l,200x de amplificación y la imagen baja de electrón secundario (LEI) del microscopio fue 10 µp a un voltaje de aceleración de 2.00 kV. Los paneles inferiores son de células a 3000x de amplificación y la imagen baja de electrón secundario (LEI) del microscopio fue 1 µ?? a un voltaje de aceleración de 2.00 kV.

La Figura 4 es una representación gráfica que muestra el efecto de NaDl y rNaDl en lisis de células rojas de la sangre (RBC) . Las RBCs humanas fueron incubadas con concentraciones incrementadas de NaDl, rNaDl, PBS solo, o agua, por 16 h a 37 °C. La hemoglobina liberada indicativa de lisis de RBC se determinó entonces por espectrofotometría a una longitud de onda de 412 nm. Los resultados han sido normalizados a RBCs tratadas con agua (designado 100% lisis) .

La Figura 5 es una representación gráfica que muestra el efecto de NaDl en la permeabilización de células tumorales en la presencia de suero. Se incubaron células U937 en la presencia de ??µ? de NaDl con concentraciones incrementadas de suero de bovino fetal (FCS) por 30 min a 37°C después de lo cual se agregó yoduro de propidio (PI). Los números de células que se tiñeron positivamente (PI+) o negativamente (PI-) se determinaron por citometria de flujo.

La Figura 6 es una representación gráfica del efecto de NaDl en crecimiento de tumor BT6-F1. Se establecieron subcutáneamente tumores sólidos de melanoma B16-F1 (-10 mm de diámetro) en ratones C57BL/6. Los tumores entonces se inyectaron intratumoralmente con 50 µ? de PBS que contiene 1 mg/ml de NaDl, NaDlRiA, o solo vehículo de PBS solo cada 2 días y el efecto en el crecimiento del tumor se determinó por medición del tamaño del tumor. El tamaño del tumor se normalizó a 1 para cada ratón al día 0. Los resultados representan el error estándar de la media en cinco ratones por tratamiento.

Las Figuras 7A hasta 7C son representaciones gráficas que muestran la unión de NaDl a lípidos celulares.

Las tiras lipidas Echelon™ se sometieron a sonda con NaDl y se detectó la unión con un anticuerpo anti-NaDl de conejo seguido por un anticuerpo IgG anti-conejo de mono conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) . (Figura 7A) Tira lipida de membrana™, (Figura 7B) tira lipida PIP™, (Figura 7C) Tira lipida SphingoStrip™. La unión de NaDl a lipidos individuales en cada tira se cuantificó por densitometria . Las Figuras 7D hasta 7F muestran la unión de NaD2 a lipidos celulares. Las tiras lipidas Echelon™ se sometieron a sonda con NaD2 y se detectó la unión con un anticuerpo anti-NaD2 de conejo seguido por un anticuerpo IgG anti-conejo de mono conjugado con HRP; (Figura 7D) Tira lipida de membrana™, (Figura 7E) Tira lipida PIP™, (Figura 7F) Tira lipida SphingoStrip™. La unión de NaD2 a lipidos individuales en cada tira se cuantificó por densitometria. La Figura 7G resume la especificidad de unión lipida, relativa y la intensidad de NaDl y NaD2 nativa, recombinante y reducida y alquilada, NsD3, NsDl, NsD2, PhDlA y TPP3 nativas. Las barras indican la intensidad de unión. PS, fosfatidilserina; PA, fosfatidilalanina ; PG, fosfatidilglicerol.

La Figura 8 es una representación diagramática de la estructura de las proteínas precursoras de las dos clases principales de defensinas de planta, como se predice de clones de ADNc. En la primera y más grande clase, la proteína precursora está compuesta de una secuencia de señal de retículo endoplá smico (li'.R) y un dominio maduro de defensina (Figura 8A) . La segunda clase de defensinas son producidas como precursores más grandes con propéptidos C-terminales (CTPPs) (Figura 8B) .

La Figura 9A es una representación gráfica que muestra el efecto de PhDlA en la permeabilización de células mielomonocíticas U937 humanas. Las células se incubaron con concentraciones incrementadas de PhDlA nativa (0 a 50 µ?) por 30 min a 37 °C después de lo cual se agregó yoduro de propidio (PI) . El número de células que se tiñeron positivamente para (PI+) se determinó por citometría de flujo. La Figura 9B es una representación gráfica que muestra el efecto de PhDlA en la liberación de ATP de células mielomonocíticas humanas U937. Se agregó PhDlA a células en PBS junto con un reactivo de detección de luciferasa ATP (Roche™) y la liberación de ATP se detectó con el tiempo por espetrofotometría a una longitud de onda de 562 nm. La Figura 9C es una representación gráfica que muestra el efecto recombinante (rTPP3) en la permeabilización de células mielomonocíticas humanas U937. Las células se incubaron con concentraciones incrementadas de rTPP3 (0 a 40 µ?) por 30 min a 37°C después de lo cual se agregó yoduro de propidio (PI) . El número de células que se tiñeron positivamente para PI (PI+) se determinó por citometria de flujo. La Figura 9D es una representación gráfica que muestra el efecto de rTPP3 en la liberación de ATP de células mielomonociti cas humanas U937. Se agregó TPP3 recombinante a las células en PBS junto con un reactivo de detección de luciferasa de ATP (Roche™) y la liberación de ATP se detectó con el tiempo por espetrofotometria a una longitud de onda de 562 nm.

La Figura 10 es una representación gráfica que muestra el efecto de defensinas Clase II de solanáceas (NaDl, PhDlA, TPP3) , defensinas Clase I no solanáceas de defensina Dm-AMP1 de Dahlia merckii , gamma-tionina ??-? de Hordeum vulgare, gamma-tionina ?2-? de Zea mays en la permeabilización de células mielomonociticas U937 humanas. Las células se incubaron con 10 µ? de cada molécula por 30 min a 37 °C después de lo cual se agregó yoduro de propidio (PI) . El número de células que se tiñeron positivamente para PI (PI+) se determinó por citometria de flujo. Los datos son la media de tres replicados ± SEM.

Las Figuras 11A y 11B son representaciones gráficas que muestran el efecto de PhDlA (Figura 11A) o rTPP3 (Figura 11B) en la permeabilización de células tumorales en la presencia de suero. Se incubaron células U937 en la presencia o ausencia de 10 µ? de PhDlA o rTPP3 con concentraciones incrementadas de suero de bovino fetal (FCS) por 30 min a 37°C después de lo cual se agregó yoduro de propidio (PI). El número de células que se tiñeron positivamente (PI+) o negativamente (PI") se determinó por citometria de flujo. El alto número de células permeabilizadas sin defensina a 0% de FCS es un resultado de la ausencia de suero.

La Figura 12A es una representación gráfica que muestra el efecto de NsD3, NsDl, NsD2 nativa comparada con NaDl nativa en la liberación de ATP de células mielomonociticas humanas U937. Cada defensina se agregó a las células a 10 µ? en PBS junto con un reactivo de detección de luciferasa ??? (Roche™) y la liberación de ATP se detectó con el tiempo por espectrofotometria a una longitud de onda de 562 nm. La Figura 12B es una representación gráfica que muestra el efecto de NsD3, NsDl, NsD2 comparado con NaDl en la permeabilizacion de células mielomonociticas U937 humanas. Las células se incubaron con 10µ por 30 min a 37 °C después de lo cual se agregó yoduro de propidio (PI) . El número de células que se tiñó positivamente para PI (PI+) se determinó por citometria de flujo.

La Figura 13 es una representación gráfica que muestra el efecto de las defensinas clase II NsDl, NsD2, PhDlA y NaDl en lisis de células rojas de la sangre (RBC) . Las RBCs humanas se incubaron con 10 µ? ó 30 µ? de cada defensina por 16h a 37 °C. La hemoglobina liberada indicativo de lisis de RBC se determinó entonces por espectrofotometria a una longitud de onda de 412 nm. Los resultados han sido normalizados a RBCs tratados con agua (designado 100% lisis). PBS = control negativo (o lisis antecedente) .

Las Figuras 14A hasta 14E son representaciones gráficas que muestran: la unión de NsDl (Figura 14A) , NsD2 (Figura 14B) , NsD3 (Figura 14C) , TPP3 (Figura 14D) y PhDla (Figura 14E) a lipidos celulares PIP. Tiras lipidas PIP Echelon™ se sometieron a sonda con defensinas y la unión se detectó con un anticuerpo anti-NaDl de conejo (para NsDl, NsD2, PhDlA, TPP3) o anticuerpo anti-NaD2 de conejo (para NsD3) seguido por un anticuerpo IgG anti-conejo de mono conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) . La unión de defensinas a lipidos individuales en cada tira se cuantificó por densitometria .

La Figura 15 en una alineación de secuencia de aminoácidos de los dominios maduros de defensinas de planta Clase I y Clase II. NaDl y NaD2 {Nicotiana alata) , NsDl, NsD2, NsD3 (Nicotiana suaveolens) , PhDlA [Petunia hybrida) , TPP3 {Solanum lycopersicum) , Dm-AMP1 (Dahlia merckii) . La identidad u homología se indican por residuos de cuatros negros o grises, respectivamente. Los enlaces disulfuro conservados son mostrados como líneas sólidas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores, han encontrado sorprendentemente que las defensinas, también conocidas como ?-tioninas, tienen propiedades citotóxicas potentes. Estos hallazgos significativas describen una forma novedosa e importante en la cual las enfermedades proliferativas pueden ser prevenidas y tratadas. Por consiguiente, estos hallazgos proporcionan métodos para la preparación o tratamiento de enfermedades proliferativas tales como cáncer, asi como también usos asociados, sistemas y kits.

Por ejemplo, NaDl es una defensina de planta aislada de tejido floral de Nicotiana alata. El aminoácido y secuencias codificantes de NaDl son descritos en la Publicación de Patente Internacional No. O 02/063011, los contenidos de la cual se incorporan por referencia en la presente .

La capacidad para producir grandes cantidades de defensinas activas tales como NaDl es de importancia fundamental cuando se consideran usos potenciales como un terapéutico en una instalación clínica. La purificación de las cantidades grandes requeridas de NaDl de su fuente natural (flores del tabaco ornamental N. alata) no es factible, necesitando la producción de proteína recombinante activa. Un sistema de expresión de Pichia. pastoris combinado con un procedimiento de purif cación de proteína definida ha sido exitosamente establecido para producir altos niveles de NaDl recombinante activo puro (Figuras 1A, B) . La NaDl recombinante tiene un pliegue estructural similar a aquel de NaDl nativa (Figura 1C) y retiene su capacidad para inhibir el crecimiento hifal de F. oxysporum (Figura ID) . Estos datos demuestran el establecimiento de un sistema eficiente para la producción de grandes cantidades de defensinas recombinantes activas puras tales como NaDl.

Las NaDl recombinante y nativa se mostraron por eliminar selec ivamente células tumorales in vitro a concentraciones µ? bajas (Figuras 2A-F) . Un rango de líneas de células tumorales humanas de diferente origen de tejido (carcinoma de próstata PC3, carcinoma de colon HCT-116, carcinoma de mama CF-7, y melanoma MM170) y la línea de células de melanoma de rar.ón B16-F1 fueron todas eliminadas a eficiencias similares por tanto NaDl recombinante o nativa a valores IC50 de entre 2 y 4.5µ?. Células primarias normales, (células endoteliales de la vena umbilical o músculo liso de la arteria coronaria humana) también se eliminaron por NaDl recombinante o nativa pero requieren concentraciones significativamente superiores (valores IC50 de 7.5-12 µ?) que para líneas de células tumorales. Estos datos indican que las defensinas de planta tales como NaDl exhiben potencial como agentes anti-cancerígenos que, cuando se usan a una concentración µ?? baja específica, podrían ser aplicadas para eliminar selectivamente células tumorales; pero no células normales. Contrario a NaDl (una defensina Clase II de solanácea) la defensina NaD2 Clase I de solanácea o el inhibidor de proteasa StPinlA no mostró capacidad para eliminar células tumorales (Figuras 2A-I), sugiriendo que las defensinas Clase II tienen una capacidad única para eliminar células tumorales (discutida abajo posteriormente). Una forma alquilada y reducida de NaDl no afecta la viabilidad de células tumorales, demostrando que una estructura terciaria intacta es crítica para la citotoxicidad de células tumorales de NaDl.

El mecanismo de acción de NaDl en células tumorales se investigó y encontró por involucrar la permeabilización de la membrana plasmática. La NaDl permeabiliza las líneas de células de tumor humano U937 y M 170 en una manera dependiente de la dosis como se demuestra por la capacidad de NaDl para mediar tanto la absorción del tinte fluorescente PI (Figuras 3A, 3B) como la liberación de ATP (Figuras 3C, 3D) . La permeabilización de las células tumorales fue rápida, con ATP siendo liberado inmediatamente después de la adición a células con el pico de ATP liberado a ~5 min. Una forma reducida y alquilada de NaDl no fue capaz de permeabilizar las células tumorales (Figura 3D) . El soporte adicional para la actividad de permeabilizacion de células tumorales de NaDl se proporciona por la examinación de células de carcinoma de próstata humano PC3 tratadas con NaDl usando microscopio de barrido de electrón (Figura 3E) . Estos datos muestran que la NaDl elimina células tumorales rápidamente desestabilizando la membrana plasmática conduciendo a permeabilizacion celular. El entendimiento del mecanismo de acción de NaDl proporciona información valiosa para usos terapéuticos de defensinas en aislamiento o en combinación con otros fármacos anti-cancerigenos .

El potencial para, la aplicación de defensinas tales como NaDl como agentes anti-cancerigenos también necesita que retenga actividad en suero/plasma y no muestra actividad litica en células rojas de la sangre; la NaDl no mostró actividad hemolitica contra células rojas de la sangre humana (RBC) a las concentraciones requeridas para eliminar células tumorales in vi tro. A concentraciones de 12.5 µ? y arriba, la NaDl nativa mostró actividad hemolitica, alcanzando un máximo a -50% de lisis de RBC a 100 µ?. De manera significativa la NaDl recombinante no mostró actividad hemolitica aún a concentraciones altas hasta 100 µ (Figura 4). La NaDl recombinante y nativa difiere en secuencia de aminoácidos primaria por la adición de un residuo de alanina único al N-término de la NaDl recombinante . Como parece no haber diferencia estructural principal entre la NaDl recombinante y nativa (Figura 1C) y ambas formas muestran actividad muy similar en permeabilización de células tumorales, la alanina adicional al N-término de la NaDl recombinante puede ser responsable de la pérdida de la actividad hemolitica de NaDl. Como tal, la producción de defensinas recombinantes tales como NaDl con una alanina en el N-término se predice por tener una ventaja significativa sobre secuencias de defensina nativa en términos de aplicación como un terapéutico con actividad hemolitica mínima. Se debe notar también que tanto la NaDl recombinante como nativa retienen la capacidad para eliminar células tumorales en la presencia de hasta 40% de suero (Figura 5) . La retención de la actividad de permeabilización de células tumorales de NaDl en la presencia de suero es una observación importante, ya que muchos péptidos catiónicos han sido mostrados por tener actividad mayormente reducida en la presencia de suero y son considerados inefectivos como agentes terapéuticos.

El potencial para defensinas tales como NaDl como agentes anti-cancerígenos se demostró además en un modelo in vivo de crecimiento de melanoma en ratones. El tratamiento de tumores B16F1 avanzados sólidos por la inyección intra-tumoral directa de 1 mg de NaDl/kg de peso corporal resultó en una reducción significativa en el crecimiento del tumor cuando se compara con tumores tratados con NaDl alquilado y reducido (inactivo) o vehículo solo (Figura 6). Además, la NaDl mostró no tener efectos adversos en ratones cuando se administra oralmente hasta 300 mg de NaDl/kg de peso corporal .

Los datos mostrados en la presente demuestran (i) amplia selectividad de células tumorales in vivo a baja concentración µ?, (ii) retención de actividad en la presencia de suero, y (iii) carencia de actividad hemolitica, y por lo tanto hace defensinas tales como NaDl modelos prometedores como agentes anti-cancerígenos .

La investigación de moléculas ineractuantes-NaDl candidatas conduce a la identificación de fosfolipidos como ligandos de NaDl. La NaDl se encontró por unirse específicamente a un rango de fosfoinositidos así como también fosfatidilserína (PS), fosfatidil alanina (PA), fosfatidilglicerol (PG) y sulfátida (Figuras 7A-C) . Tanto la NaDl recombinante como nativa mostraron especificidad de unión de lípido muy similar (Figura 7G) . De manera interesante, la defensina NaD2 clase I también se encontró por unirse a fosfolipidos pero con una especificidad muy distinta a NaDl, con fuerte unión observada a PA pero no a muchos de los fos foinositidos mostrados por unirse a NaDl (Figuras 7D-F) . La interacción de NaDl con este arreglo especifico de fosfolipidos puede contribuir a la actividad citotóxica de células tumorales de NaDl. Se debe notar también que la reducción y alquilación de NaDl resulta en pérdida de unión a fosfolipidos (Figura 7G) . Estos datos sugieren que la estructura terciaria de NaDl es esencial para tanto " unión de fosfolipidos como actividad anti-tumoral .

La capacidad de la defensina NaDl Clase II de solanácea para eliminar células tumorales pero no la defensina NaD2 Clase I sugiere que las defensinas Clase II de solanáceas pueden tener actividad citotóxica particular hacia las células tumorales. Sin embargo, las defensinas TPP3 y PhDlA Clase II de solanácea se encontraron ambas por tener actividad de permeabilización de células tumorales similares como NaDl (Figuras 9A-D) . Como se describe para NaDl, tanto TPP3 como PhDlA también se encontraron por retener la actividad de permeabilización de células tumorales en la presencia de suero (Figuras 11A y B) . Por el contrario, las defensinas Dm-AMP1, ??-? y ?2-? Clase I no solanáceas, no mostraron actividad de permeabilización de células tumorales (Figura 10) . Evidencia de soporte adicional de que la capacidad para eliminar células tumorales es única a las defensinas clase II de solanáceas y defensinas no clase I se demuestra en que las defensinas NsDl y NsD2 de solanácea clase II permeabilizan células tumorales pero las defensinas NsD3 clase I no (Figura 12). Se debe notar también que la carencia observada de actividad hemolítica de NaDl en células rojas de la sangre humana se conservó en otras defensinas Clase II. NsDl, NsD2 y PhDlA todas mostraron ninguna o muy poca disponibilidad para, lisar RBCs hasta concentraciones de 30µ (Figura 13) . Además, el patrón distinto de especificidad de unión de fosfolipidos identificado por la defensina NaDl clase II y defensina NaD2 clase I (Figura 7) también ser observó para otras defensinas Clase I y II de solanáceas. Las defensinas NsDl, NsD2, Tpp3 y PhDlA de clase II todas mostraron una preferencia general de unión a fosfoinositidos (Figura 14A-B, D-E) mientras la defensina NsD3 clase I se une muy fuertemente a PA (Figura 14C) .

Defensinas de planta para uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad proliferativa La presente invención proporciona, defensinas de plantas para uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad proliferativa .

En algunas modalidades, la defensina de planta es cualquier gamma-tionina de planta.

En otras modalidades, la defensina de planta tiene al menos ocho residuos canónicos de cisteina los cuales forman enlaces disulfuro en la configuración CySi-Cysvui, Cysn-Cysiv, Cysm-Cysvi y Cysv-CysVn.

En aún otras modalidades, la defensina de planta es una defensina de planta Clase II en o que previamente ha tenido un prodominio o propéptido C-terminal (CTPP) .

En modalidades particulares, la defensina de planta es derivada o derivable de Solanaceae, Poaceae o Asteraceae .

En algunas modalidades, la defensina de planta no es CcDl (base de datos NCBI acceso no. AF128239) .

En modalidades preferidas, la defensina de planta tiene al menos ocho residuos canónicos de cisteina los cuales forman enlaces disulfuro en la configuración Cys i -Cysvm , Cysn-Cysiv, Cysn I -CysVi y Cysv-CysVii c y es una defensina de planta Solanácea Clase II con o que previamente ha tenido un prodominio o propéptido C-terminal (CTPPs).

En algunas modalidades, la. defensina de planta comprende las secuencias de aminoácidos expuestas como SEC ID NOs:l, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ó 26 o un fragmento de las mismas.

En aún otras modalidades, la defensina de planta comprende una secuencia de aminoácidos que es 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% ó 60% idéntica a las secuencias de aminoácidos expuestas como SEC ID NOs : 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ó 26 o un fragmento de las mismas.

En todavía otras modalidades, la defensina de planta comprende una secuencia de aminoácidos que es 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, -64%, 63%,: 62%, 61% 60%; 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11 % , 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ó 1% idéntica a las secuencias de aminoácidos expuestas como SEC ID NOs: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ó 26 o un fragmento de las mismas.

En aún modalidades adicionales, la defensina de planta es una defensina Clase II de Solanácea.

En modalidades particulares, la defensina de planta se deriva o es derivable de Nicotiana alata, Nicotiana suaveolens, Petunia hybrida, Solanum lycopersicum, Nicotiana tabacum, Nicotiana attenuata, Nicotiana excelsior; Nicotiana paniculata , Solanum tuberosum, Capsicum chínense o Capsicum annuum.

En modalidades más particulares, la defensina de planta se deriva o es derivable de Nicotiana alata, Nicotiana suaveolens, Petunia hybrida o Solanum lycopersicum .

En algunas modalidades, la defensina se selecciona del grupo que comprende NaDl (Base de datos NCBI acceso no. A509566) , NsDl (SEC ID NO; 20 ó 22), NsD2 (SEC ID NO: 24 ó 26), PhDlA (Base de datos Sol Genomics Network acceso no. SGN-U207537 o SEC ID NO: 16), TPP3 (base de datos NCBI acceso no. SLU20591), F'ST (base de datos NCBI acceso no. Z11748), NatDl (base de datos NCBI acceso no. AY456268), NeThiol (base de datos NCBI acceso no. AB005265) , NeThio2 (base de datos NCBI acceso no. AB005266) , NpTiol (base de datos NCBI acceso no. AB005250), CcDl (base de datos NCBI acceso no. AF128239), PhDl (base de datos NCBI acceso no. A507975), PhD2 (base de datos NCBI acceso no. AF507976), cualquier defensina con secuencia de aminoácidos o ácido nucleico que corresponde a cualquiera de las secuencias expuestas bajo la base de datos NCBI números de acceso EU367112, EU560901, AF112869 o AF112443, o cualquier defensina con una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico correspondiente con cualquiera de las secuencias expuestas bajo la base de datos Sol Genomics Network números de acceso SGN-U448338, SGN-U449253, SGN-U448480, SGN-U447308, SGN-U578020, SGN-U577258, SGN-U286650, SGN-U268098, SGN-U268098, SGN-U198967, SGN-U196048 , SGN-U198968 o SGN-U198966.

En modalidades particularmente preferidas, la defensina de planta es NaDl, NsDl, NsD2, PhDlA o TPP3.

En algunas modalidades, la defensina de planta puede ser un fragmento de cualquier secuencia de aminoácidos o un fragmento o complemento de cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente.

En modalidades particulares, el fragmento puede comprender un dominio maduro.

En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos del dominio maduro se expone como SEC ID NOs: 4, 6, 10, 12, 18, 22 ó 26.

En algunas modalidades, la defensina de planta puede ser una defensina de planta aislada, purificada o recombinante .

En modalidades particulares, la defensina de planta recombinante tiene un residuo alanina adicional en o cerca del extremo N-terminal.

En modalidades preferidas, la defensina de planta recombinante tiene actividad hemolitica reducida.

En modalidades particularmente preferidas, la defensina de 'planta recombinante comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID NO: 6, 22 ó 26, o un fragmento de las mismas.

Polinucleótidos En modalidades donde las composiciones de la presente invención comprenden polipéptidos , la presente invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, o fragmentos o complementos de los mismos. Tales ácidos nucleicos pueden ser que se originan naturalmente o pueden ser sintéticos o recombinantes .

En algunas modalidades, los ácidos nucleicos pueden ser operablemente ligados a uno o más promotores. En modalidades particulares, los ácidos nucleicos pueden codificar polipéptidos que previenen o tratan enfermedades proliferativas .

En algunas modalidades, la defensina de planta es por lo tanto proporcionada en la forma de un ácido nucleico. En algunas modalidades, el ácido nucleico de defensina de planta codifica la secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID NOs: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ó 26 o un fragmento de las mismas. En aún otras modalidades, el ácido nucleico de defensina de planta comprende las secuencias de nucleótidos expuestas como SEC ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ó 27 o un fragmento o complemento de las mismas.

En aún otras modalidades, el ácido nucleico de defensina de planta comprende una secuencia de nucleótido que es 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% ó 60% idéntica a las secuencias de nucleótido expuestas como SEC ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ó 27 o un fragmento o complemento de las mismas.

En todavía otras modalidades, el ácido nucleico de defensina de planta comprende una secuencia de nucleótido que es 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%; 88% , 87% , 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76% , 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64% , 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55*61 54%, 53%, 52% , 51% , 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40% , 39%, 38 , 37%, 36%, O o , 34%, 33%, 32 % r 31%, 30%, 29%, 28% , 27% , 26%, 25% f 24%, 23%, 22¾ f 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16% , 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% , 0 o , 4%, 3%, 2% ó 1% idéntica a las secuencias de nucleótido expuestas como SEC ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ó 27 o un fragmento o complemento de las mismas.

Vectores, células hospederas y productos de expresión La presente invención también proporciona vectores que comprenden los ácidos nucleicos como se expone en la presente. El vector puede ser un vector plásmido, un vector viral, o cualquier otro vector adecuado adaptado para la inserción de secuencias extrañas, su introducción en células y la expresión de las secuencias introducidas. El vector puede ser un vector de expresión eucariótica y puede incluir secuencias de procesamiento y control de expresión tales como un promotor, un intensificador, sitios de unión al ribosoma, señales de poliadenilaclón y secuencias de terminación de la transcripción. En modalidades preferidas, el vector comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican operablemente cualquiera o más de las defensinas de plantas expuestas en la presente.

La presente invención además proporciona células hospederas que comprenden los vectores como se expone en la presente. Típicamente, una célula hospedera es transformada, transfectada o transducida con un vector, por ejemplo, usando electroporación seguida por selección subsecuente de células transformadas, transfectadas o transducidas en medios selectivos. Las secuencias de ácido nucleico heterólogas resultantes en la forma de vectores y ácidos nucleicos insertados ahí pueden ser mantenidas extracromosomalmente o pueden ser introducidas en el genoma de célula hospedera por recombinación homologa. Métodos para tal transformación, transfección o transducción celular son bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Se puede obtener guía por ejemplo, de textos estándares tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora tory. Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989 y Ausubel et al., Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publ . Assoc. and Wiley-lntersciences , 1992.

La presente invención sin embargo proporciona productos de expresión de células hospederas como se expone en la presente. En algunas modalidades, el producto de expresión pueden ser polipéptidos que previenen o tratan enfermedades proliferativas . En modalidades preferidas, el producto de expresión es cualquiera uno o más de las defensinas de plantas descritas en la presente.

Composiciones La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas para uso en la prevención o tratamiento de enfermedades proliferativas , en donde las composiciones farmacéuticas comprenden una defensina de planta, un ácido nucleico, un vector, una célula hospedera o un producto de expresión como se describe en la presente, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Composiciones de la presente invención pueden por lo tanto ser administrados terapéuticamente. En tales aplicaciones, las composiciones pueden ser administradas a un sujeto que ya sufre de una condición, en una cantidad suficiente para curar o al menos parcialmente detener la condición y algunas complicaciones. La cantidad de la composición debe ser suficiente para tratar efectivamente al paciente. Las composiciones pueden ser preparadas de conformidad con métodos los cuales son conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica y por consiguiente pueden incluir un portador, diluyente o excipiente cosméticamente o farmacéuticamente aceptable. Métodos para preparar composiciones administrables son aparentes para aquellos expertos en la técnica, y se describen en más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa . , incorporado por referencia en la presente.

La composición puede incorporar cualquier tensoactivo adecuado tal como un tensoactivo aniónico, catiónico o no iónico tal como ésteres de sorbitán o derivados de polioxietileno de los mismos. Agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silicáceas, y otros ingredientes tales como lanolina, también pueden ser incluidos .

Las composiciones también pueden ser administradas en la forma de liposomas. Las liposomas pueden ser derivadas de fosfolípidos u otras sustancias lípidas, y pueden ser formadas por cristales líquidos hidratados mono o multilaminares dispersos en un medio acuoso. Cualquier lípido metabolizable y fisiológicamente aceptable, no tóxico, capaz de formar liposomas puede ser usado. Las composiciones en forma de " liposoma pueden contener estabilizadores, preservativos y excipientes. Lipidos preferidos incluyen fosfolipidos y fosfatidilcolinas (lecitinas) , tanto naturales como sintéticos. Métodos para producir liposornas se conocen en la técnica, y en este sentido se hace referencia especifica a: Prescott, . Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq., los contenidos de la cual se incorporan en la presente por referencia .

En algunas modalidades, la composición puede estar en la forma de una tableta, liquido, loción,, crema, gel, pasta o emulsión.

Dosificaciones El nivel de dosis "terapéuticamente efectiva" para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la condición a ser tratada y la severidad de la condición, la actividad del compuesto o agente empleado, la composición empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente, el tiempo de administración, la ruta de administración, la velocidad de secuestramiento de la defensina de planta o composición, la duración del tratamiento, y cualquiera de los fármacos usados en combinación o coincidentes con el tratamiento, junto con otros factores relacionados bien conocidos en la técnica. Un experto en la técnica podría por lo tanto ser capaz, por experimentación de rutina, determinar una cantidad no tóxica, efectiva de la defensina de planta o composición la cual podría ser requerida para tratar condiciones aplicables.

Típicamente, en aplicaciones terapéuticas, el tratamiento podría ser por la duración del estado de enfermedad.

Además, será aparente para uno de habilidad ordinaria en la técnica que la cantidad óptima y espaciamiento de dosificaciones individuales de la composición, serán determinadas por la naturaleza y magnitud de la condición a ser tratada, la forma, ruta y sitio de administración, y la naturaleza del individuo particular a ser tratado. También, tales condiciones óptimas pueden ser determinadas por técnicas convencionales .

También será aparente para uno de habilidad ordinaria en la técnica que el curso óptimo de tratamiento, tal como el número de dosis de la composición dada por día por un número definido de días, puede ser valorada por aquellos expertos en la técnica usando curso convencional de pruebas de determinación de tratamiento.

En términos de peso, una dosificación terapéuticamente efectiva de una composición para administración a un paciente se espera esté en el rango de aproximadamente 0.01 mg hasta aproximadamente 150mg por kg de peso corporal por 24 horas; típicamente, aproximadamente 0. Img hasta aproximadamente ISOmg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente lOOmg por kg de peso corporal por 24 horas; aproximadamente 0.5mg hasta aproximadamente lOOmg por kg de peso corporal por 24 horas; o aproximadamente 1. Omg hasta aproximadamente lOOmg por kg de peso corporal por 24 horas. Más típicamente, un rango de dosis efectiva se espera esté en el rango de aproximadamente 5mg hasta aproximadamente 5 Omg por kg de peso corporal por 24 horas.

Alternativamente, una dosificación efectiva puede ser hasta aproximadamente 5000mg/m2. En general, una dosificación efectiva se espera esté en el rango de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 5000mg/m2, típicamente aproximadamente 10 hasta aproximadamente 2500mg/m2, aproximadamente 25 hasta aproximadamente 2000mg/m2, aproximadamente 50 hasta aproximadamente 1500mg/m2, aproximadamente 50 hasta aproximadamente 1000mg/m2, o aproximadamente 75 hasta aproximadamente 600mg/m2.

Rutas de administración Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas por rutas estándares. En general, las composiciones pueden ser administradas por la ruta parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal , subcutánea o intramuscular), oral o tópica.

En otras modalidades, las composiciones pueden ser administradas por otras rutas entéricas /entérales , tales como rectales, sublinguales o sublabiales, o vía el sistema nervioso central/tal como a través de rutas epidural, intracerebral o intracerebroventricular . Otras ubicaciones para administración pueden incluir via rutas epicutánea, transdermal, intradermal, nasal, intraarterial , intracardiaca, intraósea, intratecal, intraperitoneal, intravesical , intravitreal , intracavernosa, intravaginal o intrauterina .

Portadores, excipientes y diluyentes Los portadores, excipientes y diluyentes deben ser "aceptables" en términos de ser compatibles con los otros ingredientes de la composición, y no ser deletéreos al recipiente del mismo. Tales portadores, excipientes y diluyentes pueden ser usados para mejorar la integridad y vida media de las composiciones de la presente invención. También pueden ser usados para mejorar o proteger las actividades biológicas de las composiciones de la presente invención .

Ejemplos de portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables son desmineralizados o agua destilada; solución salina; aceites a base de vegetales tales como aceite de maní, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo, aceite de cacahuate o aceite de coco; aceites de silicona, que incluyen polisiloxanos , tales como metilpolisiloxano, fenilpolisiloxano y metilfenilpolisiloxano; siliconas volátiles; aceites minerales tales como parafina liquida, parafina suave o escualeno; derivados de celulosa tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa , carboximetilcelulosa de sodio o hidroxipropilmetilcelulosa; alcanoles inferiores, por ejemplo etanol o iso-propanol ; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol , 1,3-butilenglicol o glicerina; ásteres de ácido graso tales como isopropilpalmitato, isopropilmiristato o etiloleato; polivinilpirrolidona ; aga ; goma de tragacanto o goma de acacia, y gelatina de petróleo. Típicamente, el portador o portadores formará desde 10% 99.9% en peso de las composiciones.

Las composiciones de la invención pueden estar en una forma adecuada para administración por inyección, en la forma de una formulación adecuada para ingestión oral (tal como cápsulas, tabletas, capletas, elíxires, por ejemplo), en la forma de un ungüento, crema o loción adecuada para administración tópica, en una forma de aerosol adecuada para administración por inhalación, tal como por inhalación intranasal o inhalación oral, en una forma adecuada para administración parenteral, esto es, inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa.

Para administración como una solución o suspensión inyectable, diluyentes o portadores no tóxicos aceptables pueden incluir solución Ringer, salina isotónica, salina amortiguada de fosfato, etano, y 1 , 2-propilenglicol .

Métodos para prevenir o tratar enfermedades proliterativas La presente invención proporciona métodos para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa, en donde el método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una defensina de planta, un ácido nucleico, un vector, una célula hospedera, un producto de expresión o una composición farmacéutica como se describe en la presente, de este modo previniendo o tratando la enfermedad proliferativa .

La presente invención también proporciona el uso de defensinas de plantas, ácidos nucleicos, vectores, células hospederas y productos de expresión como se describe en la presente en la preparación de medicamentos para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa, En algunas modalidades, la enfermedad proliferativa puede ser una enfermedad de células proliferativas seleccionada del grupo que comprende una enfermedad angiogénica, una enfermedad metastásica, una enfermedad tumorigénica, una enfermedad neoplásica y cáncer.

En algunas modalidades, la enfermedad proliferativa puede ser cáncer. En modalidades particulares, el cáncer puede ser seleccionado del grupo que comprende carcinoma de células básales, cáncer de hueso, cáncer de intestino, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, leucemia, cáncer hepático, cáncer pulmonar, linfoma, melanoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata o cáncer de tiroides .

En otras modalidades, el cáncer puede ser seleccionado del grupo que comprende leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, linfoma de células B, carcinoma de células básales, cáncer de ducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer óseo, cáncer de intestino, glioma del tronco cerebral, tumor cerebral, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma Burkitti, tumor carcinoide, astrocitoma cerebral/glioma maligno, cáncer cervical, cánceres infantiles, leucemia linfocitica crónica, leucemia mielogenosa crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma de células-T cutáneas, tumor de células redondas pequeñas desmoplásicas , cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofageal, tumor de células germinales extracraneales , tumor de . células germinales extragonadales, cáncer de ducto biliar extrahepático, cáncer ocular, melanoma intraocular/retinoblastoma , cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (GIST) , tumor de células germinales, tumor trofoblásico gestacional, glioma, carcinoide gástrico, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, cáncer cardiaco, cáncer hepatocelular (hígado) , cáncer hipofaríngeo, glioma de trayectoria visual e hipotalámica , sarcoma Kaposi, cáncer renal, cáncer de laringe, leucemia (células pilosas /mielógenas crónicas /linfociticas crónicas /mieloides agudas/linfoblásicas agudas) , cáncer de la cavidad oral y/o labial, cáncer hepático, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma (relacionado con SIDA/Burkitt/células-? cutáneas/Hodgkin/no Hodgkin/sistema nervioso central primario) , macroglobulinemia , histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma , meduloblastoma , melanoma, carcinoma de células Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico, síndrome de neoplasia endocrina múltiple/cáncer de boca, miéloma múltiple/neoplasma de células del plasma, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos , enfermedades mieloproliferativas/mielodisplásicas, leucemia mielogenosa, leucemia mieloide, trastornos mieloproliferativos , cáncer de seno paranasal y/o cavidad nasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma , linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, cáncer pancreático, cáncer de células de isletas, cáncer de la cavidad nasal y seno paranasal, cáncer de paratiroides , cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma , astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y/o tumores neuroectodérmicos primitivos suprasensoriales , adenoma pituitario, neoplasia de células del plasma/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma del sistema nervioso central primario, cáncer de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma Ewing, sarcoma Kaposi, sarcoma de tejido blando, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, cáncer de piel (no melanoma) , cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel (células de Merkel), cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso con cáncer estomacal primario oculto metastásico, tumor neuroectodérmico primitivo suprasensorial, linfoma de células-T, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y/o carcinoma timico, cáncer de tiroides, cáncer transicional , tumor trofoblásico, cáncer de pelvis renal y/o uréter, cáncer uretral, cáncer endometrial uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, trayectoria visual y glioma hipotalámico, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom o tumor de ilms.

Kits La presente invención proporciona kits para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa , en donde el kits comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una defensina de planta, un ácido nucleico, un vector, una célula hospedera, un producto de expresión o una composición farmacéutica como se describe en la presente.

La presente invención también proporciona el uso de los kits descritos en la presente para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa , en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de una defensina de planta, un ácido nucleico, un vector, una célula hospedera, un producto de expresión o una composición farmacéutica como se describe en la presente se administra a un sujeto, de este modo previniendo o tratando la enfermedad proliferativa .

Los kits de la presente invención facilitan el empleo de los métodos de la presente invención. Típicamente, los kits para llevar a cabo el método de la invención contienen todos los reactivos necesarios para llevar a cabo el método. Por ejemplo, en una modalidad, el kit puede comprender una defensina de planta, un polipéptido, un polinucleótido, un vector, una célula hospedera, un producto de expresión o una composición farmacéutica como se describe en la presente.

Típicamente, los kits descritos en la presente también comprenderán uno o más contenedores. En el contexto de la presente invención, un kit con compartimentos incluye cualquier kit en el cual los compuestos o composiciones están contenidos en contenedores separacfos, y pueden incluir contenedores de vidrio pequeños, contenedores de plástico o tiras de plástico o papel. Tales contenedores pueden permitir la transferencia eficiente de compuestos o composiciones de un compartimiento a otro compartimiento mientras se evitan contaminación cruzada de las muestras, y la adición de agentes o soluciones de cada contenedor de un compartimiento a otro en una forma cuantitativa.

Típicamente, un kit de la presente invención también incluirá instrucciones para usar los componentes del kit para conducir los métodos apropiados.

Los métodos y kits de la presente invención son igualmente aplicables a cualquier animal, que incluye humanos y otros animales, por ejemplo que incluyen especies de primate no humano, equino, bovino, ovino, caprino, leporino, ave, felino y canino. Por consiguiente, para aplicación a diferentes especies, se puede requerir un kit único de la invención puede ser aplicable, o alternativamente diferentes kits, por ejemplo que contienen compuestos o composiciones especificas para cada una de las especies individuales.

Los métodos y kits de la presente invención encuentran aplicación en cualquier circunstancia en la cual es deseable prevenir o tratar una enfermedad proliferativa .

Selección para precursores y moduladores de composiciones La presente invención proporciona métodos de selección para determinar citotoxicidad de defensinas de plantas contra células tumorales de mamífero, en donde el método comprende poner en contacto una defensina de planta, un ácido nucleico, un vector, una célula hospedera, un producto de expresión o una composición farmacéutica como se describe en la presente con una línea de células de mamífero, y someter a ensayo para determinar la citotoxicidad contra la línea de células de mamífero debido al contacto con la defensina de planta.

La presente invención también contempla el uso de ácidos nucleicos descritos en la presente y fragmentos o complementos de los mismos para identificar y obtener secuencias completas y parciales correspondientes de otras especies usando métodos de ADN recombinante bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a hibridización southern, hibridización northern, reacción en cadena de la polimerasa (PGR) , reacción en cadena de la ligasa (LCR) y técnicas de mapeo de gen. Los ácidos nucleicos de la invención y fragmentos de los mismos pueden también ser usados en la producción de moléculas antisentido usando técnicas conocidas por aquellos expertos en el arte.

Por consiguiente, la presente invención contempla oligonucleótidos y fragmentos basados en las secuencias de los ácidos nucleicos descritos en la presente para uso como cebadores y sondas para la identificación de secuencias homologas. Los oligonucleótidos son tramos cortos de residuos de nucleótidos adecuados para uso en reacciones de amplificación de ácido nucleico tales como PCR, típicamente siendo al menos aproximadamente 10 nucleótidos hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, más típicamente aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. Las sondas son secuencias de nucleotido de longitud variable, por ejemplo entre aproximadamente 10 nucleótidos y varios miles de nucleótidos, para uso en la detección de secuencias homologas, típicamente por hibridización . El nivel de homología (identidad de secuencia) entre las secuencias ampliamente será determinado por la rigurosidad de las condiciones de hibridización. En particular, la secuencia de nucleotido usada como una sonda puede hibridizar a un homólogo u otra variante funcionalmente equivalente de un polinucleótido descrito en la presente bajo condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media o alta rigurosidad. Condiciones de hibridización de baja rigurosidad pueden corresponder a hibridización realizada a 50°C en 2 x SSC. Existen numerosas condiciones y factores, bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, que pueden ser empleados para alterar la rigurosidad de hibridización. Por ejemplo, la longitud y naturaleza (ADN, ARN, composición base) del ácido nucleico a ser hibridizado a un ácido nucleico específico, concentración de sales y otros componentes, tales como la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol etc.; y alterar la temperatura de la hibridización y/o etapas de lavado. Por ejemplo, un filtro de hibridización puede ser lavado dos veces por 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% de SDS y al menos 55°C (baja rigurosidad), al menos 60°C (rigurosidad media), al menos 65°C (rigurosidad media/alta), al menos 70°C (alta rigurosidad) o al menos 75°C (rigurosidad muy alta) .

En modalidades preferidas, la defensina es seleccionada usando un ensayo de ??? (bromuro de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il ) -2 , 5-difeniltetrazolio ) . El ensayo de MTT permite a la persona experta en la técnica valorar la viabilidad y proliferación de células. Por consiguiente, se puede usar para determinar la citotoxicidad de agentes terapéuticos potenciales en base a que tales agentes podrían ya sea estimular o inhibir la viabilidad y crecimiento celular. En el ensayo, el MTT es reducido a formazán púrpura en células vivas. Una solución de solubilización (usualmente ya sea dimetilsulfóxido , una solución acidificada de etanol, o una solución del detergente dodecilsulfato de sodio en ácido clorhídrico diluido se agrega para disolver el producto de formazán púrpura insoluble en una solución coloreada. La absorbancia de esta solución coloreada puede ser cuantificada por medición en, a una cierta longitud de onda (usualmente entre 500 y 600 nm) por un espectrofotómetro . La absorción máxima es dependiente del solvente empleado.

La presente invención también proporciona defensinas de plantas seleccionadas por los métodos descritos en la presente, para uso en la prevención o tratamiento de enfermedades proliferativas .

Métodos para producir defensinas de plantas con actividad hemolltica reducida La presente invención proporciona métodos para producir defensinas de plantas con actividad hemolltica reducida, en donde el método comprende introducir en la defensina de planta al menos un residuo de alanina en o cerca del N-terminal de la defensina. La persona experta en la técnica podrá entender que varios métodos pueden ser empleados para lograr tal adición de una alanina N-terminal, tal como mutagénesis dirigida al sitio, recombinación homologa, transposones y uniones de términos no homólogos.

La actividad hemolltica puede ser considerada como "reducida" si la actividad de la defensina de planta resulta en relativamente menos hemolisis que ocurre, o podría razonablemente esperarse que ocurra, a través del uso de una defensina de planta correspondiente que no ha sido modificada para reducir la actividad hemolltica.

La presente invención, también proporciona defensinas de plantas con actividad hemolltica reducida producidas por los métodos descritos en la presente.

Terapias de combinación Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos , ácidos nucleicos, vectores, células hospederas, productos de expresión y composiciones descritas en la presente pueden ser administrados como parte de un procedimiento de terapia de combinación, empleando uno o más de los polipéptidos , ácidos nucleicos, vectores, células hospederas, productos de expresión y composiciones descritas en la presente en conjunto con otros procedimientos terapéuticos a los métodos descritos en la presente. Para tales terapias de combinación, cada componente de la combinación puede ser administrado al mismo tiempo, o secuencialmente en cualquier orden, o en diferentes tiempos, para asi proporcionar el efecto terapéutico deseado. Cuando se administra separadamente, puede ser preferido para los componentes a ser administrados por la misma ruta de administración, aunque no es necesario para esto que sea asi. Alternativamente, los componentes pueden ser formulados en conjunto en una unidad de dosificación única como un producto de combinación. Los agentes adecuados los cuales pueden ser usados en combinación con las composiciones de la presente invención serán conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos , radioisótopos y terapias dirigidas tales como anticuerpos.

Los agentes quimioterapéuticos a ser usados en combinación con los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, células hospederas, productos de expresión y composiciones descritas en la presente pueden incluir agentes alquilantes tales como cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo e ifosfamida , anti-metabolitos tales como purina o piramidina, alcaloides y terpenoides de plantas tales como alcaloides vinca (que incluyen vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina) , y taxanos (que incluyen paclitaxel y docetaxel), podofilotoxina, inhibidores de topoisomerasa, tales como irinotecano, topotecano, amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido, anti-neoplásicos tales como doxorubicina , epirubicina y bleomicina, e inhibidores de tirosina cinasa.

Las terapias dirigidas para ser usadas en combinación con los polipéptidos , ácidos nucleicos, vectores, células hospederas, productos de expresión y composiciones descritas en la presente pueden incluir, por ejemplo, mesilato de imatinib, dasatinib, nilotinib, trastuzumab, lapatinib, gefitinib, erlotinib, cetuximab, panitumumab, temsirolimus , everolimus, vorinostat, romidepsina, bexaroteno, alitretinoina, tretinoina, bortezomib, pralatrexato, bevacizumab, sorafenib, sunitinib, pazopanib, rituximab, alemtuzumab, ofatumuab, tositumomab, 1311-tositumomab, ibritumomab tiuxetano, denileucina diftitox, tamoxifeno, toremifeno, fulvestrant, anastrozol, exemestano y letrozol .

Otras terapias también pueden ser usadas en combinación con los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, células hospederas, productos de expresión y composiciones descritas en la presente, que incluyen, por ejemplo, intervención quirúrgica, regímenes de dieta y suplementos, hipnoterapia, medicinas alternativas y terapia física.

Sincronización de Terapias Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos, polinucleótidos , vectores, células hospederas, productos de expresión y composiciones descritas en la presente pueden ser administrados como un agente único o como parte de un procedimiento de terapia, de combinación con los métodos descritos en la presente, ya sea en diagnóstico o subsecuentemente posteriormente, por ejemplo, como tratamiento de seguimiento o terapia de consolidación como un cumplimiento a terapias actualmente disponibles para tales tratamientos. Los polipéptidos, polinucleótidos, vectores, células hospederas, productos de expresión y composiciones descritas en la presente también pueden ser usados como terapias preventivas para sujetos quienes son genéticamente o ambientalmente predispuestos a desarrollar tales enfermedades .

La persona experta en la técnica entenderá y apreciará que diferentes características descritas en la presente pueden ser combinadas para formar combinaciones de características que están dentro del alcance de la presente invención .

La presente invención será ahora descrita además con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales son ilustrativos solamente y no limitantes.

Ej emplos Materiales y Métodos — Pu orificación de NaDl de Nicotiana a la ta Para aislar NaDl de su fuente natural, flores completas de N. alata hasta la etapa de coloración de pétalos del desarrollo de la flor se trituraron a un polvo fino y extrajeron con ácido sulfúrico diluto como se describe previamente (Lay et al., 2003a). Brevemente, se congelaron flores (760 g de peso húmedo) en nitrógeno líquido, trituraoas a un polvo fino en un mortero y mano de mortero, y homogenizaron en 50 mM de ácido sulfúrico (3 mi por g de peso fresco) por 5 min usando un homogenizador Ultra- urrax (Janke and Kunkel) . Después agitar por 1 h a 4°C, se removió el desecho celular por filtración a través de Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA) y centrifugación (25,000 x g, 15 min, 4°C) . El pH entonces se ajustó a 7.0 por adición de 10 M de NaOH y el extracto se agitó por 1 h a 4°C antes de la centrifugación (25, 000 x g, 15 min, 4°C) para remover las proteínas precipitadas. El sobrenadante (1.8 1) se aplicó a una columna de Flujo Rápido de SP Sepharose™ (GE Healthcare Bio-Sciences ) (2.5 x 2.5 cm) pre-equilibrada con 10 m de amortiguador de fosfato de sodio. Las proteínas no unidas se removieron lavando con 20 volúmenes de columna de 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio (pH 6.0) y las proteínas unidas se eluyeron en fracciones de 3 x 10 mi con 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio (pH. 6.0) que contiene 500 mM de NaCl. Las muestras de cada etapa de purificación se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e inmunomancharon con los anticuerpos anti-NaDl. Las fracciones de la columna de SP Sepharose que contienen NaDl se sometieron a cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) .

Cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa Se realizó cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) en un System Gold HPLC (Beckman) acoplado a un detector (modelo 166, Beckman) usando una columna C8 preparativa (22 x 250 mm, Vydac) con una columna de guardia unida. Las muestras de proteína se cargaron en el amortiguador A (0.1% [v/v] de ácido trifluoroacéti co) y eluyeron con un gradiente lineal de 0-100% (v/v) de amortiguador B (60% [v/v] de acetonitrilo en 0.089% [v/v] de ácido trifluoroacético) a una velocidad de flujo de 10 ml/min durante 40 min. Las proteínas se detectaron monitoreando la absorbancia a 215 nm (Figura IB). Los picos de proteina se colocaron y analizaron por SDS-PAGE.

Las muestras de cada etapa de purificación de aDl (30 µ?) se agregaron a amortiguador de carga de muestra LDS NuPAGE® (Marca Registrada) (10 µ?, Invitrogen) y calentaron a 70°C por 10 min. Las muestras se cargaron entonces en geles de poliacrilamida Bis-Tris al 4-12% prefundidos NuPAGE® (Invitrogen) y las proteínas se separaron usando un aparato de electroforesis XCell-Surelock (Invitrogen) que corre a' 200 V. Las proteínas se visualizaron por teñido de Azul Coomassie o transfirieron en nitrocelulosa para inmunomanchado con los anticuerpos anti-NaDl.

Aislamiento de otras defensinas de plantas (NsDl, NsD2, PhDlA) Se aislaron defensinas de semillas o flores usando el procedimiento descrito en la presente para purificación de NaDl de flores de Nicotiana alata. Brevemente, se colocaron semillas (500 g) en un homogeni zador Ultra-Turrax (Janke and Kunkel) y trituraron a un polvo fino antes de la adición de 50 mM de ácido sulfúrico (4 mi por g de peso fresco) . Las flores se trituraron a un polvo fino en nitrógeno líquido antes de la adición de 50 mM de ácido sulfúrico (3 mi por g de peso fresco) . La homogenización se continuó por 5 min antes de que el homogenado se transfiriera a un vaso de precipitado y agitó por 1 h a 4°C. Los desechos celulares se removieron por filtración a través de iracloth (Calbiochem, San Diego, CA) y centrifugación (25,000 x g, 15 min, 4°C). El pH entonces se ajustó a 7.0 por adición de 10 M de NaOH y el extracte se agitó por 1 h a 4°C antes de la centrifugación (25,000 x g, 15 min, °C) para remover las proteínas precipitadas. El sobrenadante se aplicó a una columna de Flujo Rápido de SP-Sepharose™ (GE Healthcare Bio-Sciences ) (2.5 x 2.5 cm) pre-equilibrada con 10 M de amortiguador de fosfato de sodio. Las proteínas no unidas se removieron lavando con 20 volúmenes de columna de 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio (pH 6:0) y las proteínas unidas se eluyeron en fracciones de 3 x 10 mi con 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio (pH 6.0) que contiene 500 mM de NaCl .

Las fracciones de la columna de SP Sepharose se sometieron a cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) usando ya sea una columna analítica Zorbax 300SB-C8 RP-HPLC y un sistema de seri.es Agilent Technologies 200 o una columna preparativa Vydac C8 RP-HPLC en un Beekman Coulter System Gold HPLC. Las muestras de proteína se cargaron en amortiguador A (0.1% (v/v) de ácido trifluoroacético) y eluyeron con un gradiente lineal de 0-100% (v/v) de amortiguador B (60% (v/v) de acetonitrilo en 0.089% (v/v) de ácido tri luoroacético . Las proteínas eluidas fueron detectadas monitoreando la absorbencia a 215nm. Los picos de proteína se recolectaron y las defensinas se identificaron usando SDS-PAGE y espectrometría de masas.

Expresión y purificación de defensinas recombinantes en Pichia pastoris El sistema de expresión de Pichia pastoris es bien conocido y comercialmente disponible de Invitrogen (Carlsbad, CA; véase el Manual de Expresión de Pichia del proveedor gue describe la secuencia del vector de expresión PIC9) . Las defensinas de interés, que incluyen NaDl, TPP3, j2-z, ??-?, Dm-A P1 fueron clonadas en el vector de expresión pPIC9 (las proteínas codificadas por estos clones fueron designadas rNaDl, rTPP3, ry2-z, ryl-H, rDm-AMPl, respectivamente). Estos constructos entonces se usaron para transformar células de P. pastoris GS115. Una colonia de cada clon se usó para inocular 10 mi de medio BMG (descrito en el Manual de Expresión de Pichia de Invitrogen) en un matraz de 100 mi e incubó durante la noche en una incubadora de agitación a 30°C (140 rpm) . El cultivo se usó para inocular 500 mi de BMG en un matraz con deflector de 2 litros el cual se colocó en una incubadora de agitación a 30°C (140 rpm) . Una vez que alcanzó el OD600 2.0 (~18 h) , las células se recolectaron por filtración (2,500 x g, 10 min) y resuspendieron en 1 litro de medio BMM (OD6oo = 1.0) en un matraz con deflectores de 5 litros e incubaron en una incubadora de agitación a 28 °C por 3 dias. El medio de expresión se separó de las células por centrifugación (4750 rpm, 20 min) y diluyó con un volumen igual de 20 mM de amortiguador de fosfato de potasio (pH 6.0) . El medio se ajustó a pH 6.0 con NaOH antes de que se aplique a una columna de SP Sepharose (1 era x 1 cm, Amersham Biosciences) pre-equilibrada con 10 mM de amortiguador de fosfato de potasio, pH 6.0. La columna entonces se lavó con 100 mi de 10 mM de amortiguador de fosfato de potasio, pH 6.0 y la proteina de unión se eluyó en 10 mi de 10 mM de amortiguador de fosfato de potasio que contiene 500 mM de NaCl (Figura 1A) . Las proteínas eluidas se sometieron a RP-HPLC usando un gradiente lineal de 40 minutos, como se describe en la presente abajo. Los picos de proteína se recolectaron y analizaron por SDS-PAGE e inmunomanchado con el anticuerpo anti-NaDl. Las fracciones que contienen la defensina se liofilizaron y resuspendieron en agua ultrapura milli Q estéril. La proteína, concentración de defensina expresada en Picha, se determinó usando el ensayo de proteína de ácido bicinicotínico (BCA) (Pierce Chemical Co . ) con albúmina de suero bovino (BSA) como el estándar de proteína.

Espectro de dicrolsmo circular de rNaDl Para examinar si la NaDl purificada de P. pastoris (rNaDl) fue correctamente plegada, se registró su espectro de dicroísmo circular UV bastante lejos (CD) y comparó con aquel de NaDl nativa (Figura 1C) . La similitud de los dos espectros indica que la estructura de rNaDl no fue significativamente alterada comparada con la NaDl nativa.

Actividad antifúngica de rNaDl El efecto de rNaDl en el crecimiento de Fusarium oxysporum f . sp. vasinfectum se comparó con aquel de NaDl nativa. La NaDl recombinante demostró actividad antifúngica a bajas concentraciones con un IC50 de ~1.6 µ . La NaDl fue ligeramente más efectiva con un IC50 de -1.0 µ? (Figura 1 D) .

Preparación de NaDl alquilada y reducida La NaDl liofilizada (500 µ?) se disolvió en 400 µ? de amortiguador de solución base (200 m de Tris-HCl pH 8.0, 2 mM de EDTA, 6 M de guanidina-HCl , 0.02% [v/v] de Tween®-20). Se agregó amortiguador de reducción (amortiguador de solución base con 15 mM de ditiotreitol [ DTT] ) (44 µ?) seguido por una incubación de 4.5 h a 40°C. La mezcla de reacción se enfrió a TA antes de que se agregara ácido yodoacético (0.5 M en 1 M de NaOH, 55 µ?) y la incubación se continuó en la oscuridad por 30 min a TA. Se usó una columna giratoria Nanosep omega© (Marca Registrada) (valor limite de peso molecular 3K, PALL Life Sciences) para remover las sales, DTT y ácido yodoacético y la concentración de la proteina se determinó usando el ensayo de proteína BCA (Pierce). El efecto de NaDl reducida y alquilada (NaDlRSA) en el crecimiento de Fov se midió como se describe en la presente .

Análisis de inmunomanchado Para análisis de inmunomanchado, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y sometieron a sonda con anticuerpos anti-NaDl de proteína-A purificada (dilución 1:3000 de 7.5 mg/ml) seguido por IgG anti-conejo de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (dilución 1:3500; Amersham Pharmacia Biotech) . Se usaron reactivos de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech) para visualizar anticuerpos unidos con un sistema de bioimagen ChemiGenius™ (Syngene) .

Para producir antisuero anti-NaDl o anti-NaD2, se conjugaron NaDl o NaD2 purificados (1.5 mg) a Hemocianina de Lapa californiana (0.5 mg, Sigma) respectivamente, con glutaraldehído como se describe por Harlow and Lañe (1988). Se inyectó un conejo con 1.5 mi de proteína (150 g de NaDl) en un volumen igual de adyuvante completo Freund (Sigma) . Las inmunizaciones de refuerzo de la proteina conjugada (100 µg de NaDl o NaD2) y adyuvante incompleto Freund ( Sigma-Aldrich ) se administraron cuatro y ocho semanas después. El suero pre- inmune se recolectó antes de la inyección y el suero inmune se recolectó 14 d después de la tercera y cuarta inmunizaciones. La fracción IgG de tanto suero inmune como pre-inmune se purificó usando Proteína-A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech) y se almacenó a -80 °C a o concentraciones de 3.4 mg/ml y 7.5 mg/ml, respectivamente.

Expresión bacteriana y purificación de rStPinlA El inhibidor de serina proteinasa tipo I StPinlA, aislado de papa (Solanum tuberosum) fue previamente descrito (como PotlA) en la Patente Estadounidense No. 7,462,695 "Quimiotripsina de insecto e inhibidores de la misma" y 11/753,072 "Vehículo de Expresión de Genes Múltiples" y se incorpora en la presente por referencia.

El fragmento de ADN que codifica el dominio maduro de StPinlA se amplificó por PCR por subclonacion en el vector pHUE para expresión de la proteína recombinante en E. coli (Baker et al., 2005, Cantanzariti et" al., 2004). Se usaron los siguientes cebadores: Sac2StPinlA5 ' : 5' CTC CGC GGT GGT AAG GAA TCG GAA TCT GAA TCT TG 3'; PotlSall3' : 5' GGT CGA CTT AAG CCA CCC TAG GAA TTT GTA CAA CAT C 3', los cuales incorporan sitios de restricción Sac II y Sal I en los extremos 5' y 3' , respectivamente. Las reacciones de PCR contienen 2x GoTaq Mastermix (25 µ?, Promega) , cebador Sac2Potl5' (10 µ , 2 µ?), cebador PotlSall3' (10 µ , 2 µ?) , agua destilada estéril (16 µ?) y ADN de plásmido pGEM-T Easy-StPinlA (-20 ng, 5 µ?) como plantilla. La desnaturalización inicial, ocurre a 94 °C por 2 min, seguido por 30 ciclos de 94°C por 1 min, 60°C por 1 min y 72°C por 1 min seguido por una etapa de elongación final de 72 °C por 10 min.

El producto de PGR se clonó en el vector pCR2.1-TOPO ( Invitrogen) el cual se usó entonces para transformar células TOP10 de E. coli químicamente competentes (Invitrogen) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El ADN de plásmido se aisló usando el kit Wizard Plus SV Miniprep (Promega) y los insertos del vector se secuenciaron (Macrogen) usando los cebadores reversos y delanteros M13 específicos de TOPO.

Los insertos se escindieron usando Sac II y Sal I, extraídos de geles de agarosa usando el kit Perfectprep (Eppendorf) y ligaron en pHUE el cual se usó entonces para transformar células TOP10 de E. coli. El ADN plásmido para StPinlA que contiene pHUE se aisló y después usó para transformar células CodonPlus-RIL BL21(DE3) de E. coli ( Stratagene ) .

Las colonias únicas de E. coli transformadas se usaron para inocular 20 mi de medio 2YT (10 mi, 16 g/1 de triptona, 10 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de NaCl) que contiene ampicilina (0.1 mg/ml) , cloranfenicol (0.034 mg/ml) y tetraciclina (0.01 mg/ml) y se hicieron crecer durante la noche con sacudimiento a 37 °C. Este cultivo se usó para inocular medio 2YT fresco (1 litro) que contienen antibióticos los cuales entonces se incubaron a 37 °C con sacudimiento hasta una densidad óptica (595 nm) de -0.8. Se agregó IPTG (1 mM de concentración final) y el cultivo se hizo crecer por una 3h adicionales.

Las células se recolectaron por centrifugación y la proteina recombinante soluble se purificó por cromatografía de afinidad en resina de ácido nitrilotriacético-niquel (Ni-NTA) (Qiagen) usando el protocolo de purificación de proteina nativa resumido en el Manual QiaExpressionist (Qiagen) . La proteina unida se eluyó de la resina en un amortiguador que contiene 250 mM de imidazol antes de la diálisis por 8-16 h a 4°C en una solución que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 8.0) y 300 mM de NaCl . La proteina de fusión dializada se escindió por incubación con la proteasa des-ubiquitilante , 6H.Usp2-cc (Catanzariti et al., 2004; Baker et al., 2005) por 1 h a 37 °C. La proteina escindida fue subsecuentemente purificada usando un System Gold HPLC (Beckman) acoplado a un detector (modelo 166, Beckman) y una columna C8 preparativa (22. x 250 mm, Vydac) . Las muestras de proteina se cargaron en amortiguador A (0.1% [v/v] de ácido trifluoroacético) y eluyeron con un gradiente de etapa de 0-60% de (v/v) amortiguador B (60% [v/v] de acetonitrilo en 0.089% [v/v] de ácido trifluoroacético) durante 5 min y 60-100% de amortiguador B durante 20 minutos con una velocidad de flujo de 10 mi /min. Las proteínas se detectaron monitoreando la absorbancia a 215 nm. Los picos de proteína se recolectaron manualmente y analizaron por SDS-PAGE.

Líneas y cultivos celulares Las líneas de células de mamífero usadas en este estudio fueron como sigue: células de cáncer de melanoma humano M 170, células Jurkat de linfocito T inmortalizadas, células de linfoma de monocito de leucemia humana U937, células de cáncer de próstata humano PC3, células de melanoma de ratón B16, células de ovario de hámster Chino (CHO) , células pgsA-745 mutantes CHO deficientes en GAGA, y células COS-7 de fibroblasto de riñon de mono verde Africano COS-7. Las células se hicieron crecer en matraces de cultivo de tejido a 37 °C bajo una atmósfera humidificada de 5% de C02/95% de aire, y sub-cultivaron rutinariamente dos a tres veces por semana de conformidad con la tasa de proliferación. Todas las células de mamífero se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS, invitrogen) , 100 U/ml de penicilina (Invitrogen) y 100 yg/ml de estreptomicina. Las a lineas de células adherentes se separaron del matraz agregando 3-5 mi de una mezcla que contiene 0.25% de tripsina y 0.5 µ? de EDTA (Invitrogen).

Aislamiento de Ficoll-paque de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) Se resuspendieron PBMCs a una concentración celular de 1 x 106 PBMCs /mi, después del aislamiento de ficoll-paque. Brevemente, se recolectó la sangre en tubos heparinizados, y diluyó 1 en 2 con PBS 1 x estéril/0.5% de BSA (D-PBS, Ca2+ y Mg2+ libre, Invitrogen) . Usando tubos estériles de 50 mi, sangre diluida (35 mi) se sobre puso en 15 mi de ficoll-paque, seguido por centrifugación por 30 min a 1800 rpm (rompimiento) . La capa superior de plasma se removió en un tubo fresco y re-centrifugó, previo a la remoción de la capa de PBMC y se dividieron las células entre cuatro tubos cubiertos con 1 x PBS/0.5% de BSA. Las células se centrifugaron por 10 min a 1000 rpm a TA con la pelotilla de cada tubo lavada (x3) con 50 mi de 1 x PBS/0.5% de BSA. Para remover más plaquetas, las células se centrifugaron por 15 min a 800 rpm.

Lisis de células rojas de la sangre (RBC) Después de la separación por ficoll-paque, se recolectaron RBCs y lavaron con 1 x PBS y formaron en pelotillas a 1000 x g por 10 min. Las RBCs se diluyeron 1 en 10 para el tratamiento con concentraciones incrementadas (0-100 µ?) de defensinas e incubaron durante la noche bajo una atmósfera humidificada de 5% de C02/95¾ de aire. 24 horas posteriores de la incubación, las células se centrifugaron por 10 min a 2000 rpm, con el sobrenadante diluido a 1 en 100 con 1 x PBS . El grado de lisis de células rojas de la sangre se midió como absorbancia a 412 nm.

Ensayos de viabilidad de células MTT Se sembraron células tumorales en cuadruplicado en cavidades de una placa microtituladora de 96 cavidades de fondo plano (50 µ?) a varias densidades partiendo a 2 x 106 células/cavidad. Cuatro cavidades que contienen el medio de cultivo completo solo se incluyeron en cada ensayo como un control antecedente. La placa microtituladora se incubó durante la noche a 37 °C bajo una atmósfera humidificada que contiene 5% de C02/95% de aire, previo a la adición de medio de cultivo completo (100 µ?) a cada cavidad y además se incubó a 37 °C por 48 h. Las densidades de células óptimas (30-50% de confluencia) para los ensayos de viabilidad celular se determinaron para cada linea celular por microscopio de luz.

Se sembraron células tumorales en una placa microtituladora de 96 cavidades (50 µ?/cavidad) a una densidad óptima determinada en el ensayo de optimización celular como anteriormente. Las cavidades de control antecedente (n = 8) que contienen el mismo volumen de medio de cultivo completo se incluyeron en el ensayo. La placa microtituladora se incubó durante la noche a 37 °C, previo a la adición de proteínas a varias concentraciones y la placa se incubó por unas 48 horas adicionales. El ensayo de viabilidad celular con bromuro de 3- ( 4 , 5-dimetil-2-tiazol.il ) -2, 5-difenil-2H-tetrazolio (MTT, Sigma-Aldrich ) se llevó a cabo como sigue: la solución de MTT (1 mg/ml) se agregó a cada cavidad (100 µ?) y la placa se incubó por 2-3 h a 37 °C bajo una atmósfera humidificada que contiene 5% de 002/95% de aire. Subsecuentemente, para líneas de células adherentes, el medio se removió y reemplazó con dimetilsulfóxido (100 µ?, DMSO, Sigma-Aldrich) , y colocó en un sacudidor por 5 min para disolver las sales de tet azolio. En el caso de células de suspensión, previo a la adición de DMSO las células son centrifugadas a 1500 rpm por 5 min. La absorbancia de cada cavidad se midió a 570 nm y los valores IC5o (la concentración de proteína para inhibir 50% del crecimiento celular) se determinaron usando el Programa de Software de Origen.

Ensayo de bioluminiscencia de ATP El ensayo de bioluminiscencia ATP (Roche Diagnostics, NSW Australia) se usó para cuantificar la liberación de ATP por células de tumor permeabilizadas . El reactivo de Luciferasa se disolvió como por las instrucciones del fabricante e incubó por 5 min a 4°C. Brevemente, las células fueron resuspendidas a una concentración de 1 x 106 células/ml en lxPBS/0.1% de BSA y se agregó (40 µ?/cavidad) a]. reactivo de Luciferasa (50 µ?/oavidad) a una placa microtituladora de blanco (Nunc™) que contiene 10 µ? de muestras de proteína. Simul áneamente, usando una pipeta de canales múltiples, la mezcla se agrego (90 µ?/cavidad) y las muestras se leyeron inmediatamente en un lector de placa microtituladora a 562 nm por 30 min con lecturas tomadas a intervalos de 30 s. Los datos se analizaron por software SoftMaxP.ro 4.0 (Molecular Devices Company) .

Ensayo de Permeabilidad Celular de Clasificación Celular Activada Fluorescente (FACS) A menos que se declare de otro modo, las células se resuspendieron a una concentración celular de 4 x 105 células/ml en medio de cultivo completo RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, y agregó a ya sea una placa de 96 cavidades de fondo en V o tubos micrófugos . Las células se mantuvieron a 37 °C, a menos que se declare de otro modo, durante la adición de proteína (5 µ?) a varias concentraciones o la concentración expuesta de 10 µ?.

Típicamente, las células se mezclaron con la proteína de interés e incubaron: a 37 °C por 30 min. En ciertos experimentos, las células también se incubaron a ya sea 4°C ó 37°C por 2-60 min previo al análisis de citometría de flujo. Las células se agregaron a un volumen igual de medio de cultivo completo que contiene 2 pg/ml de yoduro de propidio (PI, Kit de Detección de Apoptosis V-FITC Anexina, Invitrogen) y analizaron inmediatamente por citometría de flujo usando un clasificador celular F CSCanto (Becton Dickson, Fanklin Lakes, NJ) y Software . Cell Quest Pro (Becton Dickson) . Típicamente, se recolectaron 5000-10000 eventos por muestra y los datos resultantes se analizaron usando software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) . Las células fueron apropiadamente cerradas con base en la dispersión delantera (FSC) y dispersión lateral (SSC) , con las células viables determinadas por su capacidad para excluir PI . Para propósitos de análisis, todos los datos se estandarizaron con relación al control (el % de células normales varió desde aproximadamente 0-7%).

Microscopio de barrido de electrón de células permeabilizadas Se usó microscopio de barrido de electrón en este estudio para visualizar células pC3 cuando se tratan con NaDl (10 µ?) en comparación con el control no tratado. Una vez removidas de la incubadora las células se mantuvieron en hielo hasta que se requirieron. Cajas de petri de vidrio pequeñas se cubrieron con papel filtro remojado en agua destilada, y los cubre objetos se cargaron después en el disco. Las muestras se lavaron con el amortiguador de lavado (0.2 M de fosfato de sodio (pH 7.2) y 5.4% (p/v) de glucosa) previo a la fijación primaria, las muestras se sumergieron en partes iguales de 1.25% de glutaraldehido y 0.5% de fijativo de tetróxido de osmio por 30 min a. 4°C. Las muestras se lavaron dos veces por 15 minutos con amortiguador de lavado, seguido por inmersión en 2% de osmio por 1 h en hielo y en una caja de petri de vidrio hermética al aire/ligera. Las muestras entonces se lavaron tres veces por 5 minutos con amortiguador de lavado previo al procedimiento de deshidratación subsecuente. La etapa de deshidratación en el protocolo entonces se llevó a cabo y requiere inmersión secuencial en concentraciones incrementadas de etanol (EtOH) : 1 x 10 min en 50% de EtOH, 10 min en 70% de EtOH, 1 x 10 min 90% de EtOH, 1 x 10 min en 95% de EtOH, y finalmente · 2 x 10 min en 100% de EtOH. La fijación y deshidratación de las muestras se siguió por Secado por Congelamiento, donde las muestras se sumergieron por algunos segundos en nitrógeno de fusión después se colocaron en un bloque de cobre en un evaporador de vacio (Dynavac) . Después de 48 h de secado por congelamiento, la muestra se montó sobre un talón de metal y almacenó en un desecador. Las muestras fueron finalmente cubiertas con una capa delgada de metales (oro y paladio) usando un recubridor de depuración catódica automatizado (SC7640 Polaron) . Las muestras se analizaron usando un Microscopio de Electrón de Emisión-Barrido de Campo digital de alta resolución, FE-SEM (JSM-6340F, JEOL Ltd, Japón) .

Ensayo a base de tira de membrana recubierta con lipido Membrane Lipid Strips™, ??? Strips™ y Sphingo Strips™ (Echelon Biosciences, Salt Lake City, UT) se incubaron con PBS/3% de BSA por 1-2 horas a TA para bloquear la unión no especifica. Las tiras de membrana fueron entonces incubadas con defensinas (0.12 µ?) diluidas en PBS/1% de BSA durante la noche a 4°C, previo al lavado completo por 60 min a TA con PBS/0.1% de Twen-20. La proteina unida a la membrana se detectó sometiendo a sonda las tiras de membrana con un anticuerpo policlonal anti-NaDl de conejo (para detección de NaDl, NsDl, NsD2, rTPP3 o PhDlA) o un anticuerpo anti-NaD2 de conejo (para detección de NaD2 o NsD3) (en ambos casos diluido 1:2000 con PBS/1% de BSA) por 1 h a 4°C, seguido por un anticuerpo IgG anti-conejo de mono conjugado con HRP (diluido 1:2000 con PBS/1% de BSA) por 1 h a 4°C. Después de cada incubación de anticuerpo, las tiras de membrana se lavaron extensivamente por 60 min a TA con PBS/0.1% de Tween-20. Se detectó quimioluminiscencia usando el reactivo de manchado western de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (GE Healthcare Biosciences, NSW Australia) y expuso a Hyperfilm (GE Healthcare Biosciences, NSW, Australia) y desarrolló usando un Xomat (All-Pro-Imaging) .

Se realizó análisis de densitometria en imágenes obtenidas de tiras de lipido usando ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, Maryland) . Brevemente, los circuios de tamaño equivalente se trazaron alrededor de áreas de interés. Un circulo antecedente de igual tamaño también se colocó en el área en la membrana donde no existe lipido y se estableció como el antecedente. Las áreas de interés se cuantificaron con la intensidad de pixel promedio sustraída del antecedente.

Ejemplo 1: Actividad anti-tumo al in vitro de NaDl Ejemplo 1: Introducción El efecto de NaDl (ya sea proteína nativa purificada de las flores de N. alata o proteína recombinante purificada producida en P. pastoris) en la viabilidad de líneas de células tumorales y aislados de células humanas se determinó usando bromuro de 3- ( 4 , 5-dimetl-2-tiazolil) -2 , 5-difenil-2H-tetrazolio ( TT) en ensayo de viabilidad de cultivo celular in vitro. Las líneas de células tumorales probadas fueron HCT1.16 (cáncer de colon humano), MCF-7 (cáncer de mama humano) , MM170 (melanoma humano) , PC3 (cáncer de próstata humano), B16-F1 (melanoma de ratón), CASMC (células del músculo liso de la arteria coronaria humana) y HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana) . El NaDl se probó junto con las proteínas recombinantes de planta purificadas StPinlA (rStPinlA) o NaD2. Las células se sembraron en placas microtituladoras de fondo plano de 96 cavidades a los siguientes números: MM170 (2xl04/cavidad) , MCF-7 (2xlOVcavidad) , HCT-116 ( 5xl03/cavidad) , PC3 (5xl03/cavidad) , B16-F1 (2xl03/cavidad) , HUVEC (3xl03/cavidad) , CASMC ( 5xl03/cavidad) y cultivaron durante la o noche, se agregaron entonces NaDl, rNaDl o rStPinlA a las células a concentraciones finales que varían desde 1 hasta 100 µ? e incubaron por 48 h, después de lo cual los ensayos de TT se llevaron a cabo como se describe en Materiales y Métodos .

Ejemplo 1: Resultados NaDl y rNaDl reducen dramáticamente la viabilidad de todas las líneas de células de tumor probadas con valores IC50 a bajas concentraciones de µ? (2 a. 5µ?) (Figuras 2A a 2E) . Ambas formas de NaDl muestran efectos inhibidores muy similares, con NaDl que tiene solamente ligeramente actividad mayor que rNaDl (Figura 2F) . Por el contrario, la proteína de planta rStPinlA no mostró efecto significativa en la viabilidad de las lineas de células tumorales (Figuras 2A a 2E) . La NaD2 (una defensina Clase I de solanácea también aislada de las flores de N. alata) también se probó en células MM170 y no se observó efecto significativa en la viabilidad celular (Figuras 2G) . NaDl y rNaDl también se encontraron por reducir la viabilidad celular de CASM y HUVEC humana normal pero los valores IC50 fueron superiores (7.5 a 12 µ?) que aquellos para las lineas de células tumorales (Figura 2H y 21) . NaD2 o rStPinlA no mostraron efecto significativa en la viabilidad celular de CASMC y HUVEC (Figuras 2H y 21) . En comparación con NaDl, una forma alquilada y reducida de NaDl (NaDlR&A) no mostró efecto en la viabilidad de células tumorales cuando se prueba en el melanoma de ratón B16-F1 (Figura 2J) . Estos datos indican que NaDl en tanto formas nativas como recombinantes selectivamente elimina células tumorales a bajas concentraciones de µ?.

Ejemplo 2: Efecto de NaDl en la permeabilización de células humanas in vitro Ejemplo 2: Introducción La NaDl previamente ha sido mostrada por tener capacidad para permeabilizar las hifas de F. oxysporum f. sp. vasinfectum (van-der- eerden et al., 2008) . Para determinar si NaDl elimina las células tumorales en una manera similar a hongos, la capacidad de NaDl para permeabilizar las células tumorales se valoró usando dos diferentes procedimientos. El primero usa un ensayo de bioluminiscencia para medir la liberación del ATP intracelular . Se trataron células U937 (linea de células de tumor mielomonocitico humano) o células ??G70 (mieloma humano) 4xl04 con concentraciones incrementadas de NaDl nativa (0-20 µ?) y se midió ATP liberado a intervalos de 30 segundos para un total de 30 minutos determinando la absorbancia a 562 nm. El segundo procedimiento usa citometria de flujo para determinar la absorción del yoduro de propidio del tinte fluorescente (PI) (2 mg/ml) por células U937 y MM170 (4xl05/ml) después del tratamiento de células con concentraciones incrementadas de NaDl (0 a 100 µ?) por 30 min.

Además, el microscopio de electrón de barrido-emisión de campo (FE-SEM) se usó para observar cualesquiera cambios morfológicos en la membrana de células tumorales. Las células PC3 humanas (cáncer de próstata) se trataron con NaDl (10 µ?) o no por 30 minutos y subsecuentemente se fijaron y procesaron por FE-SEM.

Ejemplo 2: Resultados Las células U937 y MM170 mostraron una liberación de ATP en una manera dependiente de la concentración y dependiente del tiempo cuando se tratan con NaDl (Figuras 3C y 3D) . En ambos casos el ATP se liberó de las células casi inmediatamente después de la exposición a NaDl. La NaDlRSlA no mostró capacidad para permeabilizar U937 o M170 (Figuras-3D) . Estos resultados indican que la estructura intacta de NaDl es esencial para la permeabilizacion celular y se correlaciona con la capacidad de NaDl para eliminar células tumorales como se indica en el Ejemplo 2.

Para examinar además la permeabilizacion de células tumorales por NaDl, U937 y M 179, las células se trataron con concentraciones incrementadas de NaDl (0 a 100 µ ) por 30 min a 37 °C y después la absorción de PI se midió por citometria de flujo. Como se describe para la liberación de ATP mediada por NaDl, la absorción de PI por células tanto U937 como MM170 se incrementa con concentraciones incrementadas de NaDl. Como se muestra en las Figuras 3A y B el número de células PI+ U937 o MM170 fue similar después de la exposición a diferentes concentraciones de NaDl, con -30% de PI+ a 6.25 µ el cual se incrementa a 100% PI+ a 100 µ?.

La examinación de las células PC3 que fueron expuestas a NaDl por FE-SEM indica que mostraron una clara diferencia morfológica a células no tratadas. Las células tratadas con NaDl exhiben una membrana plasmática alterada como se demuestra por la superficie de células irregulares distorsionadas en comparación con la superficie intacta lisa de células no tratadas (Figura 3E) . Estos cambios son indicativos de una membrana plasmática desestabili zada y soporta los hallazgos descritos anteriormente que NaDl permeabiliza la membrana plasmática de células tumorales.

Ejemplo 3: Efecto de NaDl y NaDl recombinante en lisis de células rojas de la sangre Ejemplo 3: Introducción La capacidad de NaDl nativa o rNaDl para lisar células rojas de la sangre humana (RBCs) se investigó incubando 107 RBCs con concentraciones incrementadas de NaDl (0 a ???µ?) por 16 h a 37 °C y determinando la liberación de hemoglobina midiendo la absorbancia a 412 nm.

Ejemplo 3: Resultados NaDl a bajas concentraciones ( 12.5 µ ) no tiene efecto en lisis de RBC cuando se compara con el PBS de control solamente. Sin embargo, una concentración superior de NaDl (12.5 a 100 -µ?) induce lisis de RBCI, con los niveles de hemoglobina liberada alcanzando un máximo de -50% de lisis a 100 µ? (con relación al control positivo por medio del cual la lisis se induce a 100% de terminación con agua). Por el contrario, rNaDl no mostró capacidad para liberar RBC a concentraciones hasta 100 µ? (Figura 4) .

Ejemplo 4: Actividad de permeabilización de NaDl en la presencia de suero Ejemplo 4: Introducción Para valorar la capacidad de NaDl para permeabilizar células tumorales en la presencia de suero, se utilizó ensayo de citometria de flujo de absorción de PI como se describe en el Ejemplo 2 con las siguientes modificaciones: 4xl05/ml de células U937 se incubaron con 10 µ? de NaDl nativa en la presencia de concentraciones incrementadas de suero de bovino fetal (FCS) (0 a 40%) por 60 min seguido por adición de 2mg/ml de PI . El porcentaje de células PI+ entonces se determinó por citometria de flujo.

Ejemplo 4: Resultados La NaDl retiene la capacidad para permeabilizar células U937 en la presencia de suero como se demuestra por la detección de 70% de células PI+ en la presencia de 40% de FCS, el cual fue solamente marginalmente inferior que el 90% de células PI+ a 0% de FCS.

Ejemplo 5: Actividad anti-tumoral xn vivo de NaDl Ejemplo 5: Introducción El efecto de NaDl en el crecimiento tumoral se valoró en un modelo n vivo de crecimiento de melanoma sólido en ratones. Los ratones C57BL/6 se inyectaron subcutáneamente con células tumorales B16-F1 5xl05 y los tumores sólidos se hicieron crecer a un diámetro de -10 mm . Un mg/kg de peso corporal de NaDl o NaDlR&¾ en 50µ1 de PBS , ó 50 µ? de PBS solo entonces se inyectó intratumoralmente cada 2 días hasta que los ratones fueron sacrificados. El tamaño del tumor se midió antes de la inyección cada 2 días. Se usaron seis ratones en cada grupo.

Ejemplo 5: Resultados La inyección intratumoral de lmg/kg de peso corporal de NaDl resultó en una reducción significativa en el crecimiento del tumor cuando se compara con los controles de NaDlRSA y PBS solo. Por el dia 4 el tamaño del tumor promedio ha alcanzado solamente 1.8 ± 0.2 para ratones tratados con NaDl comparado con 4.0 ± 0.4 ó 3.7 ± 0.6 para ratones tratados con NaDlRSA o PBS solo, respectivamente (el tamaño del tumor se normalizó a 1 para cada ratón al día 0) . Se debe notar que los tumores B16-F1 fueron establecidos a una etapa altamente avanzada -cuando se inició el tratamiento.

Ejemplo 6: Pruebas de toxicidad oral aguda de NaDl en ratones Ejemplo 6: Introducción Este estudio se basa en las Directrices de Prueba OECD 423 (OECD [Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico]. 2001. Guideline 423: Acute Oral Toxicity - Acute Toxic Class Method. París: OECD) .

Ratones hembra sanos C57BL/6 derivados de la misma carnada se obtuvieron de ya sea el Central Animal House en La Trobe University (Bundoora Campus) o de Monash Animal Services. Los animales se identificaron por punción en la oreja y mantuvieron tres por jaula durante el estudio. Los animales serán alojados y mantenidos en grupos de tres en jaulas como para condiciones de alojamiento animal estándar en La Trobe University.

Al día de la dosificación, los ratones de prueba se pesaron y ayunaron por 4 horas previo a la administración de la dosis. Solo previo a la dosificación, los ratones se pesaron nuevamente. La solución de proteína (NaDl pura en agua) se preparó justo antes previo a la administración de manera que cada uno de los tres ratones de prueba recibió un total de 400 µ? de la solución de proteína al nivel de dosificación fijo de ya sea 0 (agua solamente vehículo de control), 20, 50 ó 300 mg de NaDl/kg de peso corporal. La solución de proteína se administró por alimentación forzada oral usando una aguja de cánula de punta redonda. La alimentación se reemplazó 1 hora después de la dosificación. Los ratones recibieron dieta de roedor estándar y agua a libre acceso.

Los ratones se observaron cada hora por 4 horas después de la dosificación al día 1 y al menos dos veces diariamente posteriormente hasta la eliminación programada al día 14. Los signos de toxicidad evidente, efectos farmacológicos adversos y cambios de comportamiento se valoraron y registraron diariamente como fue el consumo de alimento y agua. Los ratones se pesaron a los días 7 u 8 y 14. En al último día del estudio (día 14), los ratones se eliminaron por inhalación de dióxido de carbono y se sometieron a necropsia. Todos los ratones recibieron una examinación patológica bruta. Los pesos de los siguientes órganos se registraron: cerebro, corazón, hígado, pulmones, ríñones, tracto gastrointestinal, bazo y timo.

Subsecuentemente, las muestras se fijaron en 4% (v/v) de paraformaldehído hasta la incorporación de parafina, seccionamiento y examinación histopatológica por la Australian Phenomics Network, nodo de la University of Melbourne. El tracto gastrointestinal se dividió en las siguientes secciones: estómago, duodeno, yeyuno, íleo, ciego y colon.

Ejemplo 6: Resultados: Pesos corporales y signos clínicos Todos los animales parecen sanos, no mostraron signos de toxicidad evidente, efectos farmacológicos adversos o cambios de comportamiento y sobrevivieron a la terminación del estudio. No hubo efectos relacionados al tratamiento en peso corporal, con pesos cercanamente igualados a aquellos del peso de pre-ayuno, al comienzo del estudio.

Al final del estudio, los ratones fueron eliminados por asfixia con dióxido de carbono y los órganos fueron los siguientes órganos que se recolectaron: cerebro, corazón, hígado, pulmones, ríñones, tracto gastrointestinal, bazo y timo. Estos tejidos fueron fijados en 4% (v/v) - de paraformaldehído . El tracto gastrointestinal fue subsecuentemente dividido en las siguientes secciones: estómago, duodeno, yeyuno, íleo, ciego y colon. Todos los órganos se incorporaron en parafina, seccionaron y tiñeron con hematoxilina y eosina (y azul rápido de Luxol para las secciones del cerebro) por la Australian Phenomics Network, nodo de la University of Melbourne.

No se observaron patologías atribuibles a la administración de la proteína, en cualquiera de los ratones excepto para la ligera irritación posible al epitelio del estómago en la dosis más alta de 300 mg de NaDl/kg de peso corporal .

Ejemplo 7: Propiedades de unión lípida celular de NaDl y NaD2 Ejemplo 7: Introducción La interacción de NaDl y NaD2 a lípidos celulares se probó realizando ensayos de unión lípida de estado sólido usando tres diferentes tiras lipidas comercialmente disponibles de Echelon™ (Membrane, PIP, and Sphingolipid Strips) . Estas tiras son manchadas con 100 pmole de cada lipido en una forma biológicamente activa. NaDl, o NaD2, rNaDl o rNaD2 (0.12 µ ) se incubaron durante la noche a 4°C con las tiras lipidas y unión detectada con anticuerpos policlonales de conejo específicos a NaDl o NaD2 seguido por un anticuerpo anti-conejo de mono conjugado con HRP. La unión de NaDl o NaD2 se cuantificó llevando a cabo densitometría en las tiras lipidas desarrolladas.

Ejemplo 7: Resultados NaDl se une muy fuertemente a las fosfoinositidas Ptdlns(PIP2) y (PIP3) que incluyen Ptdlns ( 3, 5) P2, Ptdlns (3, 5) P2, Ptdlns ( 4 , 5 ) P2 y Ptdlns ( 3, 4 , 5) P3, pero también muestra fuerte unión a cardiolipina y a las Ptdlns (PIP) que incluyen Ptdlns (3) P, Ptdlns (4) P2, y Ptdlns (5) P (Figuras 7A y 7B) . La NaDl también mostró débil unión a la fosfatidilserina , fosfatidilalanina , fosfatidilglicerol , y sulfatida (Figurea 7A, B y C) . La NaDl recombinante mostró una especificidad de unión lípida similar a NaDl, con la excepción de que la unión más fuerte se observó a fosfatidilserina, fosfatidilalanina y fosfatidilglicerol (Figura 7C) . La NaDlRsA no mostró unión a cualquiera de los lípidos celulares (Figura 7G) .

La NaD2 también se encontró por unirse a lípidos celulares pero con especificidad distinta a aquella de NaDl. Contrario a NaDl, la NaD2 mostró fuerte unión a fosfatida ácida, pero no unión aparente a Ptdlns ( 3.5) P2, Ptdlns ( 3 , 5 ) P2 , Ptdlns (4, 5) P2 y Ptdlns ( 3 , 4 , 5 ) P3.

Sin embargo, como NaDl, la NaD2 también mostró unión a Ptdlns (3) P, Ptdlns (4) P, y Ptdlns (5) P2 (Figuras 7D, E y F) . Colectivamente, estos datos sugieren que las defensinas relacionadas NaDl y NaD2 ambas se unen a fosfolipidos celulares con especificidades traslapantes pero diferentes. La NaD2 recombinante mostró una especifi.cidad de unión lipida similar a NaD2, con la excepción de que se observó la unión más fuerte a fosfatidilserina (Figura 7G) . Contrario a rNaDl, la rNaD2 no mostró unión lipida (Figura 7G) .

Ejemplo 8. Efecto de la defensina de Petunia hybrida PhDlA o defensina de Solanum lycopersicum TPP3 en la permeabilización de células humanas in vitro Ejemplo 8: Introducción Para determinar si otras defensinas de la familia de plantas Solana ceae fueron también capaces de permeabili zar las células tumorales de mamífero en una manera similar a NaDl-, la capacidad de la defensina de Petunia hybrida PhDlA o defensina de Solanum tuberosum (tomate) TPP3 para permeabilizar células U937 se valoró usando dos procedimientos. El primero usa un ensayo de bioluminiscencia para medir la liberación de ATP intracelular . Se trataron U937 (linea de células de tumor mielomonocitico humano) 4xl04 con concentraciones incrementadas de PhDlA o rTPP3 (0-20 µ?) y la liberación de ATP se midió a intervalos de 30 segundos por un total de 30 minutos determinando la absorbancia a 562nm. El segundo procedimiento usa citometría de flujo para determinar la absorción de yoduro de propidio del tinte fluorescente (Pl) (2µ?/p?1) por U937 (4xl05/ml) siguiendo el tratamiento de las células con concentraciones incrementadas de PhDlA (0 a 50 µ?) o rTPP3 (0 a 40 µ?> por 30 minutos.

Ejemplo 8: Resultados Las células U937 mostraron una liberación de ATP en una manera dependiente de la concentración y dependiente del tiempo cuando se tratan con PhDlA nativa (Figura 9B) o rTPP3 (Figura 9D) . Similar a NaDl, la ATP se liberó de las células casi inmediatamente después de la exposición a PhDlA o rTPP3. Para examinar además la permeabilización de células tumorales por PhDlA o rTPP3, se trataron células U937 con concentraciones incrementadas de PhDlA (0 a 50 µ?) o rTPP3 (0 a 50 µ?) por 30 min a 37 °C y después se midió la absorción de PI por citometría de flujo. Como se describe para la liberación de ATP mediada por PhDlA o rTPP3, la absorción de PI por células U937 se incrementó con concentraciones incrementadas de PhDlA o rTPP3. Como se muestra en la Figura 9A, el número de células U937 de PI+ fue -35% a 6.25 µ? lo cual se incrementó a -90% de PI+ a 50 µ?. Para TPP3, el número de células U937 de PI+ fue -35% a 5 µ? el cual incrementó a -90% de PI+ a 40 µ? (Figura 9C) .

Ej emplo Comparación de actividad de permeabilización en células Ü937 por ?- tioninas/defensinas de solanáceas y no solanáceas Ejemplo 9: Introducción Para valorar la capacidad de las defensinas Clase II de solanáceas (NaDl, PhDlA y TPP3) para permeabili zar células tumorales con relación a defensinas no solanáceas y ?-tioninas relacionadas (defensina Dm-A.MP1 de Dahlia merckii , gamma-tionina ??-? de Hordeum vulgare, gamma-tionina ?2-? de Zea mayz) , el ensayo de citometría de flujo de absorción de PI se utilizó como se describe en el Ejemplo 2 con las siguientes modificaciones: se incubaron células U937 4xl05/ml con 10 µ? de defensina/y-tionina de cada planta (NaDl, PhDlA, TPP3 recombinante , yl-H recombinante y ?2-? recombinante ) por 60 minutos (en la ausencia de suero) seguido por la adición de 2 µg/ml de PI. El porcentaje de células PI+ fue entonces determinado por citometría de flujo.

Ej emp1o 9 : Resu11ados Las tres defensinas Clase II de solanácea, NaDl, PhDlA y rTPP3, todas mostraron la capacidad para permeabilizar células U937, como se representa por el número significativamente incrementado de células PI+ comparado con la célula solamente de control; el tratamiento de NaDl, PhDlA, y rTPP'3 a 10 µ? resultó en 56.07 ± 3.65%, 57.07 ± 2.76%, y 49.97 ± 2.93% de células PI+ (control 27.03 ± 0.52). Por el contrario, no se observó actividad significativa comparada con la célula solamente de control para Dm-APl, ??-H o ?2-? (Figura 10) .

Ejemplo 10: Actividad de permeabilización de la defensir.a PhDlA de Petunia ybrida o defensina TPP3 de Solanum lycopersicum en la presencia de suero Ejemplo 10: Introducción Para valorar la capacidad de PhDlA o rTPP3 para permeabilizar células tumorales en la presencia de suero, se utilizó el ensayo de ci tome tría de flujo de absorción de PI como se describe en el Ejemplo 2 con las siguientes modificaciones: se incubaron células U937 4xl05/ml con 10µ? de PhDlA o rTPP3 en la presencia de concentraciones incrementadas de suero bovino fetal (ECS) (0 a 40%) por 60 minutos seguido por adición de 2 pg/rnl de ?? . El porcentaje de células PI fue entonces determinado por citometría de flu o .

Ejemplo 10: Resultados Tanto PhDlA como rTPP3 retienen la capacidad para permeabilizar células U937 en la presencia de suero, ya sea a una actividad reducida. Para PhDlA, 40% de células PI+ se detectaron en la presencia de 40% de FCS comparado con 90% de células PI+ a 0% de FCS (Figura 11A) . La TPP3 recombinante parece mostrar mayor actividad en suero que PhDlA, como se exhibe por la retención de hasta 70% de actividad en la presencia de 5-40% de FCS (Figura 11B) . Se debe notar que el nivel superior de células positivas PI a 0% de FCS es un resultado de la completa ausencia de suero.

Ej emplo 11. Efecto de las defensinas NsDl, NsD2 y NsD3 de tabaco nativo {Nicotiana suaveolens) en la permeabilización de células tumorales humanas in vitro Ejemplo 11; Introducción Para investigar además si otras defensinas clase II de la familia de plantas Solanaceae son también capaces de permeabilizar células de tumor de mamífero en una manera similar a NaDl, y si otras defensinas clase I no pueden, la capacidad de las defensinas NsDl y NsD2 clase II de Nicotiana suaveolens, o la defensina NsD3 clase I, para permeabilizar células U937 se valoró en comparación con NaDl usando dos procedimientos. El primero usa un ensayo de bioluminiscencia 1 ].6 para medir la liberación de ATP intracelula . Se trataron células U937 4xl04 con 10 µ? de cada defensina y la liberación de ATP se midió a intervalos de 30 segundos por un total de 30 minutos determinando la absorbancia a 562nm. El segundo procedimiento usa citometria de flujo para determinar la absorción del yoduro de propidio del tinte fluorescente (PI) (2 g/ml) por U937 (4xl05/ml) siguiendo el tratamiento de células con 10 µ? de cada defensina por 30 minutos.

Ejemplo 11: Resultados Las células U937 mostraron una liberación de ATP en una manera dependiente de la concentración y dependiente del tiempo cuando se trata con NsDl y NsD2 nativa (F'igura 12A) . Similar a NaDl, la ATP se liberó de las células casi inmediatamente después de la exposición a NsDl y NsD2. Por el contrario, la NsD3 nativa no media la liberación de ATP cuando se compara con las células solamente de control (Figure 12A) . Para examinar además la permeabilización de células tumofales por NsDl y NsD2, contra NsD3, se trataron células U937 con 10 µ? de cada defensina por 30 min a 37° C y después la absorción de PI se midió por citometria de flujo. La NsDl y NsD2 median la absorción de PI por células U937 a niveles similares a NaDl (-60% PI+ a 10µ?) , mientras la NsD3 resultó en solamente baja absorción de PI (~10% de PI+ a o 10µ?) (Figura 12B) .

Ejemplo 12: Efecto de defensinas clase II de solanáceas en lisis de células rojas de la sangre Ejemplo 12: Introducción Para determinar si la incapacidad de NaDl para lisar células rojas de la sangre humana (RBGs) fue también conservada en otras defensinas clase .TI de Solanaceae, se investigó la capacidad de NsDl, NsD2 y PhDlA nativa para lisar RBCs incubando RBCs 107 RBCs con 10 µ? o 30 µ? de cada defensina por 16 horas a 37 °C y se determinó la liberación de hemoglobina midiendo la absorbancia a 412 nm.

Ejemplo 12: Resultados Tanto NsDl como PhDlA a 10 µ? y 30 µ? no tienen efecto en la lisis de RBC cuando se compara con el PBS de control solamente. En comparación, NsD2 mostró baja actividad hemolitica a 10 µ? (-17% de lisis) y 30 µ? (-23% de lisis) (Figura 13) .

Ejemplo 13: Propiedades de unión lipida celular de defensinas clase I y II de Solanaceae Ejemplo 13: Introducción La investigación adicional de la interacción de defensinas clase I y clase II de Solanaceae con lipidos celulares se llevó a cabo por ensayos de unión lipida de estado sólido usando Tiras PIP de Echelon™. La defensina NsD3 clase I, o las defensinas NsDl, NsD2, PhDl y rTPP3 clase II (0.12 µ?) se incubaron durante la noche a 4°C con tiras lipidas y la unión se detectó con anticuerpos policlonales de conejo específicos a NaD2 o NaDl (estos anticuerpos reaccionan cruzado con las defensinas clase I o la clase II, respectivamente) , seguido por un anticuerpo anti-conejo de mono conjugado con HRP. La unión de defensina se cuantificó por densitometría en las tiras lipidas desarrolladas.

Ejemplo 13: Resultados Como se describe para NaDl, en general todas las defensinas clase II se unen muy fuertemente a las fosfoinositidas Ptdlns(PIP2) y (PIP3) que incluyen Ptdlns (3, 4) P2, Ptdlns (3, 5 ) P2, Ptdlns ( 4 , 5) P2 y Ptdlns ( 3, 4 , 5) P3, pero también muestran unión a Ptdlns (PIP) que incluyen Ptdlns (3) P, Ptdlns (4) P, y Ptdlns (5) P (Figuras 14A, 14B, 14C y 14D) . La excepción fue PhDlA, la cual también se une fuertemente a ácido fosfatidico (Figura 14E). La defensina NsD3 clase I también se encontró por unirse a lípidos celulares pero con una especificidad distinta a aquella de las defensinas clase II. Contrario a las defensinas clase II (con la excepción de PhDlA) , la NsD3 mostró fuerte unión a ácido fosfatidico, y débil unión a Ptdlns (PIP), (PIP2) y (PIP3) (Figura 14E) . Colectivamente, estos datos sugieren que las defensinas clase I y clase II de Solanaceae se unen a fosfolipidos celulares con especificidades traslapantes pero diferentes, con unión de defensina clase I preferencialmente a ácido fosfatídico y defensinas clase II a Ptdlns(PIP), (PIP2) y (PIP3) (Figura 7G) .

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Claims (29)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa, caracterizado porque el método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de: (a) una defensina de planta Clase II de Solanácea; (b) un ácido nucleico que codifica la defensina de planta Clase II de Solanácea; (c) un vector que comprende el ácido nucleico; (d) una célula hospedera que comprende el vector; (e) un producto de expresión producido por la célula hospedera; o (f) una composición farmacéutica que comprende la planta, defensina, el ácido nucleico, el vector, la célula hospedera o el producto de expresión, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable; de este modo previniendo o tratando la enfermedad proliferativa .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la defensina de planta se deriva o es derivable de Nicotiana alata, Nicotiana suaveolens, Petunia hybrida o Solanum lycopersicum.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la defensina de planta se selecciona del grupo que comprende NaDl, NsDl, NsD2, PhDlA y TPP3.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la defensina de planta comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, o SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 o SEC ID NO: 26 o un fragmento funcional de la misma .

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la defensina de planta es codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15 o SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25 o SEC ID NO: 27 o un fragmento funcional o complemento del mismo, o una secuencia de ácido nucleico funcional que es 70% idéntica a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la enfermedad proliferativa es cáncer.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que comprende carcinoma de células básales, cáncer de hueso, cáncer de estómago, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, leucemia, cáncer hepático, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata o cáncer de tiroides.

8. Uso de: (a) una defensina de planta Clase II de Solanácea; (b) un ácido nucleico que codifica la defensina de planta Clase II de Solanácea; (c) un vector que comprende el ácido nucleico; (d) una célula hospedera que comprende el vector; o (e) un producto de expresión producido por la célula hospedera; en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa .

9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la defensina de planta se deriva o es derivadle de Nicotiana ala ta, Nicotiana suaveolens , Petunia hybrida o Solanum lycopersícum.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la defensina de planta se selecciona del grupo que comprende NaDl , NsDl, NsD2, PhDlA y TPP3.

11. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la defensina de planta comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID KO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, o SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 o SEC ID KO: 26 o un fragmento funcional de la misma.

12. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la defensina de planta es codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15 o SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25 o SEC ID NO: 27 o un fragmento funcional o complemento del mismo, o una secuencia de ácido nucleico funcional que es 70% idéntica a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente.

13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde la enfermedad proliferativa es cáncer.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 13 en donde el cáncer se selecciona del grupo que comprende, ¦ carcinoma de células básales, cáncer de hueso, cáncer de estómago, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, leucemia, cáncer hepático, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata o cáncer de tiroides.

15. Un kit cuando se usa para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa, caracterizado porque el kit comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de: (a) una defensina de planta Clase II de Solanácea; (b) un ácido nucleico que codifica la defensina de planta Clase II de Solanácea; (c) un vector que comprende el ácido nucleico; (d) una célula hospedera que comprende el vector; (e) un producto de expresión producido por la célula hospedera; o (f) una composición farmacéutica que comprende la defensina de planta, el ácido nucleico, el vector, la célula hospedera o el producto de expresión, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. El kit de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la defensina de planta se deriva o es derivable de Nicotiana alata, Nicotiana suaveolens , Petunia hybrida o Solanum lycopersicum .

17. El kit de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la defensina de planta se selecciona del grupo que comprende NaDl, NsDl, NsD2, PhDlA y TPP3.

18. El kit de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la defensina de planta comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEQ, ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, o SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 o SEC ID NO: 26 o un fragmento funcional de la misma.

19. El kit de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la defensina de planta es codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15 o SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25 o SEC ID NO: 27 o un fragmento funcional o complemento del mismo, o una secuencia de ácido nucleico funcional que es 70% idéntica a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente .

20. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque la enfermedad proliferativa es cáncer.

21. El kit de conformidad con la reivindicación 20 caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que comprende carcinoma de células básales, cáncer de hueso, cáncer de intestino, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, leucemia, cáncer hepático, cáncer pulmonar, linfoma, melanoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata o cáncer de tiroides.

22. Uso del kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21 para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa , en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de: (a) la defensina de planta Clase II de Solanácea; (b) el ácido nucleico que codifica la defensina de planta Clase II de Solanácea; (c) el vector que comprende el ácido nucleico; (d) la célula hospedera que comprende el vector; (e) el producto de expresión producido por la célula hospedera; o (f) la composición farmacéutica que comprende la defensina de planta, el ácido nucleico, el vector, la célula hospedera o el producto de expresión, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable; se administra a un sujeto, de este modo previniendo o tratando la enfermedad proliferativa .

23. Una composición farmacéutica cuando se usa para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa , caracterizada porque la composición farmacéutica comprende: (a) una defensina de planta Clase II de Solanácea; (b) un ácido nucleico que codifica la defensina de planta Clase II de Solanácea; (c) un vector que comprende el ácido nucleico; (d) una célula hospedera que comprende el vector; o (e) un producto de expresión producido por la célula hospedera; junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable .

24. Una defensina de planta Clase II de Solanácea cuando caracterizada porque se usa para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa .

25. Un método de selección para citotoxicidad de una defensina de planta Clase II de Solanácea contra células de tumor de mamífero, caracterizado porque el método comprende poner en contacto: (a) una defensina de planta Clase II de Solanácea; (b) un ácido nucleico que codifica la defensina de planta Clase II de Solanácea; (c) un vector que comprende el ácido nucleico; (d) una célula hospedera que comprende el vector; o (e) un producto de expresión producido por la célula hospedera, con una línea de células de mamífero, y someter a ensayo para determinar la citotoxicidad. contra la línea de 5. células de mamífero debido al contacto con la defensina de planta, de este modo seleccionando para determinar citotoxicidad de la defensina de planta Clase II de Solanácea contra células tumorales de mamífero.

26. Una defensina de planta Clase II de Solanácea, 0 caracterizada porque es seleccionada por el método de conformidad con la reivindicación 25.

27. Un método para producir una defensina de planta Clase II de Solanácea con actividad hemolítica reducida, caracterizado porque el método comprende introducir en la 5 defensina de planta al menos un residuo de alanina en o cerca del N-terminal de la defensina.

28. Una defensina de planta Clase II de Solanácea con actividad hemolítica reducida, caracterizada porque es producida por el método de conformidad con la reivindicación 0 27.

29. Una defensina de planta Clase II de Solanácea o con actividad hemolítica reducida, caracterizada porque es sustancialmente como se describe en la presente con referencia a cualquiera o más de los Ejemplos.