CN113667000A

CN113667000A - 多肽在制备治疗2型免疫疾病的药物中的应用

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Publication number: CN113667000A
Application number: CN202111008545.3A
Authority: CN
Inventors: 王晨轩; 张罗; 莫珊珊; 王向东; 于兰兰; 赵妍; 李小璐; 张文博; 郝蕴
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS; Beijing Tongren Hospital
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS; Beijing Tongren Hospital
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2041-08-31
Also published as: CN113667000B

Abstract

本发明公开了多肽在制备治疗2型免疫疾病的药物中的应用，所述的多肽包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物。本发明为预防或治疗2型免疫疾病提供了一种新方法，具有潜在的临床应用价值。本发明还公开了一种检测夏科‑莱登晶体的方法。

Description

多肽在制备治疗2型免疫疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及多肽在制备治疗2型免疫疾病的药物中的应用。

背景技术

夏科-莱登晶体(Charcot-leyden crystals，CLCs)由法国神经病学家Charcot于1853年在一个死亡的白血病患者的心脏和脾脏组织中发现，是沉积在细胞外的双锥体六角形蛋白结晶，德国医师Leyden也于1872年在哮喘患者的痰液中发现，因此得名Charcot-leyden crystal。后人在慢性鼻-鼻窦炎、过敏性鼻炎、哮喘、蠕虫感染和一些癌症患者的病变部位中也观察到类似的结晶。经基因测序，CLCs蛋白的基因定位在19q13.2上，与半乳糖凝集素(galectin)的基因相似。而且CLCs的一级结构含有galectin的特征结构——糖识别域CRD。Leonidas等于1995年首次用X射线晶体学在

分辨率下测定了CLCs蛋白的结构，发现CLCs蛋白的立体构型与galectin-1和galectin-2的结构非常相似。根据上述发现，研究人员将CLCs前体蛋白列入galectin家族，命名为galectin-10，简称gal-10。

研究人员通过对细胞蛋白质组学的分析鉴定，发现gal-10在人嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及CD4⁺CD25⁺调节性T细胞和产生IL-22的CD4⁺T细胞中都有表达。特别是在嗜酸性粒细胞中，gal-10约占细胞总蛋白质的7％～10％，在嗜酸性粒细胞所含有的7086种已鉴定的蛋白质中含量排第5位。嗜酸性粒细胞裂解后，释放的gal-10自发形成CLCs，所以CLCs被公认为伴嗜酸性粒细胞浸润疾病的主要生物标志物之一。

2型免疫是一种包含先天性免疫和适应性免疫并促使在黏膜表面形成免疫屏障清除病原体的特殊免疫反应。在抗原的刺激下，树突状细胞(DC)活化后促使T细胞分化为Th2细胞，释放2型细胞因子，继而激发IgE产生和嗜酸性粒细胞聚集等。目前关于以夏科-莱登晶体为靶点的治疗的研究，已有文献报道该晶体的单克隆抗体可体外溶解晶体，并且可以抑制夏科-莱登晶体引起的小鼠的肺部先天免疫反应。本发明试图寻找可以靶向夏科-莱登晶体的小分子药物来用于治疗2型免疫疾病。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种可用于诊断、预防和/或治疗2型免疫疾病的多肽。

本发明的第二目的在于提供一种检测夏科-莱登晶体(CLCs)的方法。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种多肽，所述的多肽包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物。

所述的其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO.3的抑制CLCs诱导的免疫反应的活性。

术语“氨基酸”包括标准的20种遗传编码的氨基酸及其相应的“D”形式的立体异构体(与天然的“L”形式相比)、Ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常规的氨基酸(例如，α,α-双取代氨基酸、N-烃基氨基酸等)和经化学衍生化的氨基酸。

在明确列举氨基酸，诸如“丙氨酸”或“Ala”或“A”时，术语指L-丙氨酸和D-丙氨酸两者，除非另有明确规定。其它非常规的氨基酸也可以是适合于本发明多肽的组分，只要多肽保留期望的功能性特性。对于显示的肽，每个编码的氨基酸残基(在适当的情况中)由对应于常规氨基酸俗名的单字母名称代表。

多肽的“变体”包括插入、缺失和取代，其或是保守的或是非保守的。例如，保守取代指将相同通用类别(例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸)内的氨基酸用相同类别内的另一种氨基酸取代。如此，保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代的意义是本领域中公知的。特别地，包括展现出可抑制CLCs诱导的免疫反应的活性的多肽的变体。

在一些实施方案中，所述的变体包含与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列有至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的氨基酸序列。

多肽的“融合物”包括对应于与任何其它多肽融合的参照序列(例如SEQ ID NO.3，或其片段或变体)的氨基酸序列。例如，所述多肽可以与多肽诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或蛋白A融合以便于纯化所述多肽。此类融合物的例子是本领域技术人员公知的。类似地，所述多肽可以与寡组氨酸标签诸如His6或被抗体识别的表位诸如公知的Myc标签表位融合。另外，可以使用包含疏水性寡肽末端标签的融合物。本发明的范围中还包括与所述多肽的任何变体或衍生物的融合物。

融合物可以包含对本发明的所述多肽赋予期望特征的别的部分；例如，所述部分可用于检测或分离多肽，或促进多肽的细胞摄取。所述部分可以例如是生物素模块、链霉亲合素模块、放射性模块、荧光模块，例如小荧光团或绿色荧光蛋白(GFP)荧光团，如本领域技术人员公知的。模块可以是免疫原性标签，例如Myc标签，如本领域技术人员已知的，或者可以是能够促进多肽的细胞摄取的亲脂性分子或多肽域，如本领域技术人员已知的。

本领域技术人员应当领会，本发明的多肽可以包含一个或多个例如通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生化的氨基酸。

如本领域中领会的，PEG化的蛋白质可以展现出降低的肾清除和蛋白水解、降低的毒性、降低的免疫原性和升高的溶解度。

为了获得具有最大延长的半衰期和保留的生物学活性的成功PEG化的蛋白质，可以影响后果的几项参数是重要的，并且应当进行考虑。PEG分子可以存在不同，并且已经用于蛋白质PEG化的PEG变体包括PEG及单甲氧基-PEG。另外，它们可以或是线性的或是分支的。

已经显示了提高PEG化的程度导致体内半衰期延长。然而，本领域技术人员应当领会，PEG化过程会需要以个体为基础对特定蛋白质进行优化。

PEG可以在天然存在的二硫键处偶联，如记载于WO 2005/007197的。可以经由添加不损害多肽结构的化学桥来稳定二硫键。这允许利用构成二硫键的两个硫的缀合硫醇选择性来创建用于对PEG进行位点特异性附接的桥。由此，避开了需要将残基工程化改造到肽中以附接于靶分子。

本发明第二方面提供了一种核酸，所述的核酸编码本发明第一方面所述的多肽。

本发明第三方面提供了一种表达载体，所述的表达载体包含本发明第二方面所述的核酸。

本发明第四方面提供了一种细胞，所述的细胞包含本发明第三方面所述的表达载体。

进一步，所述的细胞包括原核细胞、真核细胞。

进一步，所述的原核细胞包括细菌细胞。

进一步，所述的真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞。

进一步，所述的动物细胞包括哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞。

用于生成本发明的多肽的方法是本领域中公知的。

便利地，多肽是或包含重组多肽。适合于生成此类重组多肽的方法是本领域中公知的，诸如在原核或真核细胞中表达(例如见Sambrook和Russell,2000,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor,New York,在此通过提及而收录该文件的相关公开内容)。

也可以使用商品化的体外翻译系统来生成本发明所述的多肽，诸如兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽裂解物(获自Promega)来生成本发明的多肽。优选地，翻译系统是兔网织红细胞裂解物。便利地，翻译系统可以与转录系统偶联，诸如TNT转录-翻译系统(Promega)。此系统具有在与翻译相同的反应中自编码DNA多核苷酸生成合适的mRNA转录物的优点。

本发明第五方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含本发明第一方面所述的多肽，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体，或第四方面所述的细胞。

药物组合物中也可以包含其它化合物，诸如其它肽、低分子量免疫调节剂、受体激动剂和拮抗剂、和抗微生物剂。其它例子包括螯合剂诸如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽。

进一步，所述的药物组合物还包括药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂。

“药学可接受的”意指不降低活性成分的无毒性材料。此类药学可接受缓冲液、载体或赋形剂是本领域中公知的(见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,A.RGennaro编,Mack Publishing Company(1990)及handbook of PharmaceuticalExcipients,第3版,A.Kibbe编,Pharmaceutical Press(2000))。

术语“缓冲液”意图指以稳定pH为目的的含有酸-碱混合物的水溶液。缓冲液的例子是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐(glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐(cacodylate)、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。

本发明所述的载体包括抗微生物剂、等渗试剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂。

赋形剂可以是下列一种或多种：碳水化合物、聚合物、脂质和矿物。碳水化合物的例子包括乳糖、蔗糖、甘露醇、和环状糊精，其被添加至组合物，例如以便于冻干。聚合物的例子是不同程度水解的淀粉、纤维素醚、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、丙基纤维素、藻酸盐(alginates)、角叉菜胶(carageenans)、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐(polysulphonate)、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚环氧丙烷共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或具有各种组成的其共聚物、及聚乙烯吡咯烷酮(它们都具有不同分子量)，其被添加至组合物，例如以控制粘性，实现生物粘着，或保护活性成分免于化学和蛋白水解降解。脂质的例子是脂肪酸、磷脂、甘油单、二和三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(均具有不同酰基链长度和饱和度)、卵卵磷脂(egg lecithin)、大豆卵磷脂、氢化的卵磷脂和大豆卵磷脂，其出于与聚合物相似的原因被添加至组合物。矿物的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其被添加至组合物以获得诸如降低液体积累或有利的色素特性等益处。

本发明第六方面提供了本发明第五方面所述的药物组合物在制备可用于预防或治疗2型免疫疾病的药物中的应用。

进一步，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染。

进一步，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病。

进一步，所述的过敏性疾病包括慢性鼻窦炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏。

进一步，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

本发明第七方面提供了一种可用于诊断2型免疫疾病的产品，所述的产品包含本发明第一方面所述的多肽，本发明第二方面所述的核酸，本发明第三方面所述的表达载体，或本发明第四方面所述的细胞。

进一步，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染。

进一步，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病。

进一步，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

本发明第八方面提供了一种非诊断目的的检测夏科-莱登晶体的方法，所述的方法包括：

(1)将样品与本发明第一方面所述的多肽接触；

(2)检测包含本发明第一方面所述的多肽的复合物的形成；

进一步，所述步骤(2)中检测包含本发明第一方面所述的多肽的复合物的形成的方法包括凝胶电泳、层析技术、免疫印迹分析、免疫组织化学、质谱和/或高压液相色谱。

本发明第九方面提供了本发明第一方面所述的多肽，本发明第二方面所述的核酸，本发明第三方面所述的表达载体，或本发明第四方面所述的细胞的应用，所述的应用包括如下任一方面所述的应用：

(1)在制备本发明第五方面所述的药物组合物中的应用；

(2)在制备本发明第七方面所述的产品中的应用；

(3)在非诊断目的的检测夏科-莱登晶体中的应用。

定义：

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明的技术领域中的本领域技术人员通常所理解的含义相同的含义。

术语“夏科-莱登晶体”、“CLCs”、“CLC晶体”在本文中可互换使用，是指由半乳糖凝集素-10形成的晶体。由半乳糖凝集素-10形成的晶体通常为双锥体六边形晶体，长度为大约20-40μm，宽度为大约2-4μm。

“半乳糖凝集素-10”如本文所用，术语“半乳糖凝集素-10”(或Gal10或Gal-10)是指小的疏水性聚糖结合蛋白，其自结晶形成夏科-莱登晶体。半乳糖凝集素-10也称为夏科-莱登晶体蛋白(CLCP)、嗜酸性粒细胞溶血磷脂酶和溶血卵磷脂酰基水解酶。术语“半乳糖凝集素-10”足够宽泛，可以涵盖人蛋白质和任何物种同源物。

术语“特异性”是指结合(例如，与之免疫反应)给定靶标(例如夏科-莱登晶体)的能力。多肽可以是单特异性的并且含有一个或多个特异性结合靶标的结合位点，或者多肽可以是多特异性的并且含有两个或更多个特异性结合相同或不同靶标的结合位点。

本发明的优点和有益效果如下：

本发明首次发现了一种与夏科-莱登晶体特异性结合的多肽，并提供了所述多肽在制备可用于诊断2型免疫疾病的产品中的应用。

本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括所述的多肽。本发明提供了所述药物组合物在制备可用于预防或治疗2型免疫疾病的药物中的应用。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测夏科-莱登晶体的方法。

附图说明

图1是RT-qPCR检测经不同浓度CLCs诱导的人鼻黏膜上皮细胞的基因表达变化实验结果图，其中，图A是IL-1β表达变化统计图，图B是TNF-α表达变化统计图，图C是IL-6表达变化统计图，图D是GM-CSF表达变化统计图，图E是IL-8表达变化统计图；

图2是CLCs(100μg/mL)诱导24h时人鼻黏膜上皮细胞的基因表达变化统计图，其中，图A是IL-1β表达变化统计图，图B是TNF-α表达变化统计图，图C是IL-6表达变化统计图，图D是IL-8表达变化统计图，图E是GM-CSF表达变化统计图；

图3是在细胞水平验证8种多肽抑制CLCs诱导的免疫反应实验结果图，其中，图A是IL-1β表达量统计图，图B是IL-6表达量统计图，图C是TNF-α表达量统计图，图D是IL-8表达量统计图；

图4是在细胞水平验证本发明所涉及的多肽抑制CLCs诱导的免疫反应实验结果图，其中，图A是IL-1β表达量统计图，图B是TNF-α表达量统计图，图C是IL-6表达量统计图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实验材料：

一、质粒：将Gal-10蛋白序列进行人源化密码子优化后，在其N末端加上促溶片段，通过NcoI/XhoI双酶切位点克隆到pET-28a载体质粒上形成pET-28a-Gal10-TEV-6XHis。Gal-10蛋白序列如表1所示，带促溶片段的Gal-10蛋白序列如表2所示。

表1 Gal-10蛋白序列

表2带促溶片段的Gal-10序列

二、试剂材料和仪器设备

1、化学试剂：卡那霉素(Kanamycin)和氨苄青霉素(Ampicillin)购自天根生物技术有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)和大肠杆菌BL21(DE3)购自北京全式金公司；SDS、Trizol和咪唑购自Sigma公司；TEV酶购自北京义翘神州有限公司；考马斯亮蓝染液(自制)；cDNA逆转录试剂购自Takara公司；实时荧光定量PCR试剂购自爱博泰克生物；多肽合成于国平药业有限公司，序列如表3所示。

表3多肽序列

2、耗材和仪器设备：10cm细胞培养皿、12孔细胞培养板购自CORNING公司；细胞培养用BEGM培养基购于Lonza公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清FBS、消化液(2.5g/L胰酶，0.02g/L EDTA，pH＝8.0，0.22μm过滤)、青霉素(20mg/mL)、链霉素(20000U/mL)购自GIBCO公司；Ni-NTA亲和层析柱购自GE公司；10kDa浓缩管购自Millipore公司。电热恒温培养箱(XMTD HH.B11-600)；PCR仪(Biometra Tgradient)；台式离心机(eppendorf，Centrifuge5415D)；电热恒温水箱(SHH W21600)；微量紫外分光光度计(NanoDrop 2000)；电子天平(Sartorius 2000S)；电子分析天平(Sartorius，BS110S)；光学倒置显微镜(XDS-1B)；微量移液器(eppendorfResearch plus)；细胞CO2培养箱(SANYO)；-80℃超低温冰箱(SANYO，MDF-382E)；pH计(Thermo Orion 868)；磁力搅拌器(IKA RH-KT/C)；酶标仪(Bio-Rad，680)；超声波破碎仪；

pure 25蛋白质纯化系统(superdex 75,GE Healthcare)；SDS-PAGE电泳仪(Bio-Rad)；凝胶成像仪(Molecular Imager Gel Doc XR,Bio-Rad)；ABIPCR仪器(ABI 7500)。

实施例1构建CLCs诱导人鼻黏膜上皮细胞的天然免疫因子激活的体外模型

一、实验方法：

1、Gal-10重组蛋白的表达与纯化和CLCs的产生

(1)转化：

A.取一支BL21(DE3)感受态细胞至于冰上融化；

B.将pET-28a-gal10-TEV-6His重组质粒0.5μL加入其中，冰上孵育15-20min；

C.热激：42℃水浴热激90s；

D.快速置于冰上，冰浴5min；

E.加入500μL无抗性LB，于37℃恒温培养箱培养40-50min；

F.取40μL菌液，接种于Kanamycin(25mg/mL)的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱培养过夜。

(2)细菌培养：

以Kanamycin(25mg/mL)作为选择标记，挑取上步平板上的阳性单克隆BL21(DE3)/pET-28a-gal10-TEV-6His，接种于20mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，于37℃、210r/min摇床振荡培养12h。将菌液按1∶100的比例接种含卡那霉素的1L LB液体培养基，37℃、210r/min振荡条件下培养。

(3)目的蛋白的诱导表达和获得：

A.当大肠杆菌的600nm(OD 600)的光密度为0.6-0.8h，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃下摇床培养过夜，诱导目的蛋白的表达；

B.将过夜表达的细菌培养液富集，6000×g、4℃离心20min，弃上清。用缓冲液Lysis Buffer重悬，将其集中于一个烧杯中，体积约为75-100mL，即可按1：100的比例加入PMSF(终浓度为1mM)，保护目的蛋白；

C.超声破碎细菌：功率25％，工作时间25min，超声开时间3s，超声关时间9s；离心(4℃、13,000×g、30min)除去细胞碎片，同时将细胞破碎后释放的核酸打碎，离心沉淀，使细胞裂解液不粘稠，有利于后续处理。收集上清液，可溶性目的蛋白即存在于上清液中。

(4)Gal-10蛋白的纯化：

A.Ni-NTA亲和柱层析

a.平衡Ni柱：用Lysis Buffer穿出Ni柱约2-3个柱体积的容量，即可开始洗脱蛋白；

b.离心得到的上清上样，穿出Ni柱2-3遍；

c.用含20mM咪唑和0.1％Empigen洗涤剂的Lysis Buffer洗柱子，洗脱杂蛋白；

d.用含500mM咪唑的Lysis Buffer洗柱子，使目的蛋白与镍柱去结合；

e.浓缩：将洗脱收集的目的蛋白置入10kDa浓缩管中，4℃，2000×g离心10min，浓缩过程中加入少量Lysis Buffer或PBS对咪唑进行稀释，防止目的蛋白聚集沉淀。

B.

pure 25蛋白纯化

a.清洗层析柱：使用无菌水对层析柱进行清洗，约清洗8mL。再将泵头放在PBS溶液中，重复上述步骤并执行，约清洗36mL；

b.参数：System flow:0.5mL/min；Column position:3；Alarm delta columnpressure enabled:1.5；Alarmpre columnpressure enabled:5；

c.上样：先用PBS冲洗两三次上样环，再将2mL浓度约为6.35mg/mL的样品打入上样环，最后稍微吸取PBS再打入上样环中，避免样品残留。将收集管摆好，选择injectvalve:inject；

d.收集：至代表蛋白含量的UV 280标识线出现上升时，利用样品自动收集器收集目标蛋白，设置每管的收集量为0.3mL；

e.清洗层析柱：待收集完样品后，将泵头置于PBS中，继续运行至通过20mL，替换为无菌水进行清洗，运行10ml，后替换为20％的乙醇溶液运行20mL，即可关机；

f.蛋白处理：将收集好的蛋白测出每管浓度并标记，置于液氮中速冻，于-80℃冰箱冷冻保存。实验前室温静置缓慢融化。

C.表达产物的SDS-PAGE鉴定

a.样品准备：全菌样品，离心后上清样品，蛋白上清穿出层析柱后样品，20mM咪唑穿出样品，500mM咪唑穿出样品，分子筛中峰头、峰尖和峰尾三处收集的蛋白样品；

b.配胶：5％浓缩胶；根据蛋白的大小，选择15％的分离胶；

c.制样：2×Loading Buffer与样品1:1混合；

d.上样：全菌样品5μL，marker 3μL，其余样品10μL；

e.染色：将蛋白胶置于考马斯亮蓝染液中，微波中高火，2min；

f.脱色：将染色完成后的蛋白胶置于自来水中，微波高火，20-40min。

(5)CLCs的产生与浓度测定：

A.TEV酶和pET-28a-gal10-TEV-6His重组蛋白按质量比1:10的比例混合，4℃摇床酶切孵育过夜；

B.600×g、4℃条件下离心10min，离心完成后吸去上清，并加入适量PBS重悬，重复三次，即得到纯净的CLCs。

C.BCA法检测CLCs的浓度。

2、人鼻息肉组织上皮细胞的获取

(1)组织酶切消化：

A.将手术取下的粘膜标本放入无菌生理盐水。

B.将标本取出用5mL组织冲洗液(含有青链霉素200μg/mL的生理盐水)浸泡4℃1小时。

C.将浸泡好的标本放入6cm的培养皿上，用PBS+双抗反复冲洗(可多冲洗几遍，一般≥10遍)，洗净标本上的血块和污物，可以放置在解剖显微镜下将标本上的粘液以及血管剔除。

D.将清理后的标本放入15mL离心管中，加入10mL人蛋白酶原溶液(collagenasetype 2和Dnase I)。

E.取人胎盘胶原(Collagen I)包被10cm培养皿，2mL/孔，37℃过夜。

(2)鼻黏膜上皮细胞接种：

A.在消化好的组织管中加入2mL全血清培养液，反复震荡20s。

B.取出上清，再次加入5mL全血清培养液，反复震荡20s，再次取出上清。

C.将取出的上清，800r 5min离心，去上清。

D.加入1mL全血清培养液，放入6cm培养皿预贴壁1h。

E.将包被的培养皿的人胎盘胶原吸出(包被≤3次的回收)，蒸馏水冲洗≥10遍(宁多不少)。紫外灯照射消毒20min。

F.6cm培养皿吸取上清，加入5mL全血清培养液，800r 5min离心。弃上清(尽量吸取干净)。

G.加入3mL红细胞裂解液混匀细胞，室温裂解5min，800r 5min离心，弃上清。

H.3mL无菌PBS清洗后，800r 5min离心，弃上清，用BEGM重悬。

I.取1μL，加9μLPBS，混匀后加入细胞计数板计数。

J.细胞计数：(细胞悬液细胞数)/mL＝(n个格细胞数/n)×16×10⁴

K.计数后按照2×10⁶加入至包被好的10cm培养皿中，加入12mLBEGM上皮培养基。

3、CLCs刺激人鼻黏膜上皮细胞

(1)鼻黏膜上皮细胞接种：

A.鼻息肉的原代鼻黏膜上皮细胞长至85-90％左右，弃去培养基，用2mL无菌PBS清细后用2mL 0.25％的胰蛋白酶37℃消化4-5min后加入1mL含有FBS的完全培养基终止。

B.将细胞吹打至单细胞悬液后，800r 5min离心，弃上清。

C.细胞计数后将2×10⁵个细胞铺至12孔板/孔，用1mLBEGM培养基培养。

(2)CLCs刺激鼻黏膜上皮细胞模型：

A.12孔板培养约2天，待原代鼻黏膜上皮细胞长至80％左右，弃去培养基，用含有不同CLC浓度的BEGE培养基继续培养24h。

B.收取细胞上清，4℃800r 5min离心后取上层液体-80℃冰箱冻存备用。

C.用1mL无菌PBS清洗细胞后加入1mLTrizol/孔裂解细胞，用于RNA提取。

4、RNA的提取和cDNA逆转录

(1)RNA提取：

A.将冻存于-80℃冰箱的细胞或组织保存在Trizol中的裂解液置于冰上缓慢解冻。

B.待RNA样品完全解冻后，将样品拿到室温放置10min，使RNA充分溶解。

C.按200μL氯仿/mLTrizol的体积比加入氯仿，并用力振荡使其充分混匀，室温放置15min。

D.4℃12000r·min^-1离心15min。

E.将上层水相转移至新的无RNase的1.5mL离心管中。

F.按800μL异丙醇/mL水相的体积比加入预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10-15min。

G.4℃12000r·min^-1离心10min，弃上清后可见离心管底部有RNA沉淀。

H.加入1mL 750mL/L用DEPC处理的H₂O配置的乙醇，温和振荡离心管，使沉淀重悬。

I.4℃12000r·min^-1离心5min，尽量弃上清。

J.重复步骤8-9。

K.室温晾干5-10min，待750mL/L乙醇蒸发完后即可。

L.根据RNA沉淀的大小用25-100μLDEPC处理过的H₂O来溶解RNA沉淀。

M.取1μLRNA样品用微量紫外分光光度计NanoDrop2000(Thermo Scientific)测定RNA浓度和纯度。并取1μL(大于100ng即可)混合7μLDEPC处理过的H₂O和2μL的5×RNALoading Buffer，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。若RNA完整性很好，其28S与18S的亮度比约为2:1。

(2)RNA逆转录成cDNA：

根据Takara公司的cDNA Reverse Transcription Kits(cat.no RR036A)的说明书进行cDNA的逆转录。

1)5×PrimeScript RTMaster Mix(Perfect Real Time):2μL

1×Total RNA:0.5μg

RNase Free dH₂O up to 10μL

2)轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:

37℃15min(反转录反应)

85℃5sec(反转录酶的失活反应)

4℃短期保存。

5、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测基因表达变化

实时荧光定量PCR实验步骤按照ABclonal SYBGreen Mix的说明书进行。

(1)在每个反应体系中加入的组分如下：

表3 RT-qPCR反应体系

(2)将反应体系加入到384孔板中，并在384孔板上平整贴好封膜，1500r·min^-1离心2min。

(3)将384孔板按照仪器的说明放入到反应托架上，并设置如下的反应程序。

(4)反应结束后，设置好样品顺序和检测的基因等信息，使用系统软件分析数据。系统程序将根据目的基因和内参基因的Ct值自动计算出该检测基因基因的相对表达值。

(5)使用的算法为：基因相对表达量值＝2^{(-(Ct目的基因-Ct内参))}，最后将对照达量设为1，即可算出其它样品该基因的相对表达值。

二、实验结果

如图1所示，不同浓度的CLC晶体可引起人鼻黏膜上皮细胞IL-1β、TNF-α、IL-6、GM-CSF和IL-8的表达增加，且呈浓度梯度依赖。如图2所示，CLCs(100μg/mL)诱导24h后，人鼻黏膜上皮细胞IL-1β、TNF-α、IL-6、GM-CSF和IL-8的表达显著增加，差异具有统计学意义。该实验结果证明成功构建CLCs诱导人鼻黏膜上皮细胞的天然免疫因子激活的体外模型。

实施例2可与CLCs或与Gal-10蛋白结合的多肽序列的筛选

一、实验方法

1、利用多肽芯片筛选可与CLCs结合的多肽：

实验室自制多肽芯片(含有400条不同的多肽序列)，通过分别将对照组-EGFP荧光蛋白和实验组-EGFP蛋白标记的CLCs与芯片孵育，筛选出可与CLCs作用的多肽序列。

(1)将多肽芯片用5％的BSA摇床孵育1h。

(2)弃去BSA，并用TBST清洗3次。

(3)分别对两块相同的多肽阵列加入EGFP荧光蛋白标记的Gal-10和EGFP蛋白，摇床室温孵育1h。

(4)用TBST清洗4次，每次摇床摇10min。

(5)使用Fluorescence Detection FLA9500进行荧光检测。

2、利用噬菌体展示技术筛选与Gal-10蛋白结合的多肽：

(1)淘洗：

A.以0.1M NaHCO₃(PH 8.6)稀释靶点蛋白(带促溶标签的Gal10蛋白)至100μg/mL，铺1.5mL在6cm的塑料培养皿中置于湿盒中，4℃震荡过夜。

B.将蛋白包被的平皿反扣在洁净的纸巾上，靶点蛋白，加1.5mLBlocking buffer(现用现配)至少1h。去除Blocking buffer，用TBST(TBS+0.1％Tween-20)快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。反扣在洁净纸巾上，洗涤要迅速，避免平皿干燥。

C.用1mL TBS稀释噬菌体(10μLphage+1mLTBS)，加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。

D.(4)1mL洗脱缓冲液(含BSA，现用现配)洗脱结合的噬菌体，轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μL 1M Tris-HCL(PH 9.1)中和。

E.测滴度以确定下一轮淘洗的稀释倍数。

(2)扩增噬菌体：

A.将洗脱物加入20mL ER2738培养物中(对数早期，按1：100的比例稀释过夜培养的大肠杆菌)，37℃剧烈振摇孵育4.5h。

B.将培养物转入微量离心管中，4℃，12000g，10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。

C.将80％的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的20％PEG/NaCl。4℃沉淀噬菌体过夜。

D.4℃，12000g，15min离心上清，倾去上清，再次离心，吸去多余的上清。

E.用1mLTBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中，4℃，14000rpm离心5min使残留的细胞沉淀，弃沉淀。

F.将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀，冰上孵育15-60min。4℃，14000rpm离心10min，弃上清，再次短暂离心，吸去残留的上清。

G.用200μLTBS，悬浮沉淀物，将上清转入新管中，即为扩增的洗脱液。(扩增的洗脱液用于下一轮淘洗)

(3)滴度测定：

A.微波炉融化上层琼脂，分成3mL等份于灭菌试管中，保存于45℃水浴锅中备用。37℃预温LB/IPTG/Xgal平板。

B.在LB中准备梯度稀释的噬菌体。

C.取OD6000.5时的ER2738，分成200μL等份于微量离心管中，每管加入10μL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。

D.将感染大肠杆菌加入45℃预温的上层琼脂培养管中，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。

E.待平板冷却后，倒置于37℃培养过夜。

F.次日计数有1-100个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。或用于挑取单克隆。

(4)提噬菌体DNA：

A.用200μL的枪头刺取单个蓝加入到OD0.05的菌液中，摇4.5h。

B.将培养物4℃，14000rpm，30s，转移上清，再次离心。转移80％的上清(可在4℃保存数周)。

C.转移500μL在新的微量离心管中，加入200μL的PEG，室温下静置10-20min。

D.4℃，14000rpm，10min，弃上清，再次离心。

E.加入100μL碘化物溶液，使沉淀物完全溶解，加入250μL的乙醇，室温10-20min。

F.4℃，14000rpm，10min，弃上清，加入70％的乙醇，再次离心，弃上清，真空干燥，使用30μLPCR级的纯水溶解DNA，即可送去测序。

G.根据测序结果即可获得与Gal-10可能存在相互作用的多肽。

3、在细胞水平验证多肽抑制CLCs诱导的免疫反应

将多肽(50μM)与CLCs(100μg/ml)共同刺激实施例1中步骤3的第(1)步所培养起来的细胞，24h后收集细胞RNA并进行逆转录和qPCR。

二、实验结果

基于上述方法，本发明共筛选了8种可能与Gal10蛋白存在相互作用的多肽，本发明所涉及的多肽(#1)可与CLCs结合。在细胞水平验证这8种多肽抑制CLCs诱导的免疫反应的实验结果，如图3所示(图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001)。如图4所示，本发明所涉及的多肽(#1)可以有效抑制CLCs(100μg/mL)导致的人鼻黏膜上皮细胞IL-1β、TNF-α、IL-6的表达升高。上述实验结果证明，本发明所涉及的多肽能够有效抑制CLC晶体激活的天然免疫反应。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

首都医科大学附属北京同仁医院

<120> 多肽在制备治疗2型免疫疾病的药物中的应用

<141> 2021-08-31

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Leu Leu Pro Val Pro Tyr Thr Glu Ala Ala Ser Leu Ser Thr

1 5 10 15

Gly Ser Thr Val Thr Ile Lys Gly Arg Pro Leu Ala Cys Phe Leu Asn

20 25 30

Glu Pro Tyr Leu Gln Val Asp Phe His Thr Glu Met Lys Glu Glu Ser

35 40 45

Asp Ile Val Phe His Phe Gln Val Cys Phe Gly Arg Arg Val Val Met

50 55 60

Asn Ser Arg Glu Tyr Gly Ala Trp Lys Gln Gln Val Glu Ser Lys Asn

65 70 75 80

Met Pro Phe Gln Asp Gly Gln Glu Phe Glu Leu Ser Ile Ser Val Leu

85 90 95

Pro Asp Lys Tyr Gln Val Met Val Asn Gly Gln Ser Ser Tyr Thr Phe

100 105 110

Asp His Arg Ile Lys Pro Glu Ala Val Lys Met Val Gln Val Trp Arg

115 120 125

Asp Ile Ser Leu Thr Lys Phe Asn Val Ser Tyr Leu Lys Arg

130 135 140

<210> 2

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ser Thr Thr His His His His His His Asp Thr Asp Ile Pro

1 5 10 15

Thr Thr Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Asp Asp Asp Asp Lys Glu Asn

20 25 30

Leu Tyr Phe Gln Gly His Met Met Ser Leu Leu Pro Val Pro Tyr Thr

35 40 45

Glu Ala Ala Ser Leu Ser Thr Gly Ser Thr Val Thr Ile Lys Gly Arg

50 55 60

Pro Leu Ala Cys Phe Leu Asn Glu Pro Tyr Leu Gln Val Asp Phe His

65 70 75 80

Thr Glu Met Lys Glu Glu Ser Asp Ile Val Phe His Phe Gln Val Cys

85 90 95

Phe Gly Arg Arg Val Val Met Asn Ser Arg Glu Tyr Gly Ala Trp Lys

100 105 110

Gln Gln Val Glu Ser Lys Asn Met Pro Phe Gln Asp Gly Gln Glu Phe

115 120 125

Glu Leu Ser Ile Ser Val Leu Pro Asp Lys Tyr Gln Val Met Val Asn

130 135 140

Gly Gln Ser Ser Tyr Thr Phe Asp His Arg Ile Lys Pro Glu Ala Val

145 150 155 160

Lys Met Val Gln Val Trp Arg Asp Ile Ser Leu Thr Lys Phe Asn Val

165 170 175

Ser Tyr Leu Lys Arg

180

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg

1 5 10

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物，优选的，所述变体包含与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列有至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的氨基酸序列。

2.一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的多肽。

3.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包含权利要求2所述的核酸。

4.一种细胞，其特征在于，所述的细胞包含权利要求3所述的表达载体，优选的，所述的细胞包括原核细胞、真核细胞，优选的，所述的原核细胞包括细菌细胞，优选的，所述的真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞，优选的，所述的动物细胞包括哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞。

5.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的表达载体、或权利要求4所述的细胞。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂，

优选的，所述的缓冲液包括Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐(glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐(cacodylate)、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES，

优选的，所述的载体包括抗微生物剂、等渗试剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂，

优选的，所述的赋形剂包括碳水化合物、聚合物、脂质或矿物。

7.权利要求5或6所述的药物组合物在制备可用于预防或治疗2型免疫疾病的药物中的应用，优选的，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染，优选的，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病，优选的，所述的过敏性疾病包括慢性鼻窦炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏，优选的，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

8.一种可用于诊断2型免疫疾病的产品，其特征在于，所述的产品包含权利要求1所述的多肽，权利要求2所述的核酸，权利要求3所述的表达载体，或权利要求4所述的细胞，优选的，所述的2型免疫疾病包括过敏性疾病、螨虫感染，优选的，所述的2型免疫疾病为过敏性疾病，优选的，所述的过敏性疾病包括慢性鼻窦炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏，优选的，所述的过敏性疾病为慢性鼻窦炎。

9.一种非诊断目的的检测夏科-莱登晶体的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)将样品与权利要求1所述的多肽接触；

(2)检测包含权利要求1所述的多肽的复合物的形成；

优选的，所述步骤(2)中检测包含权利要求1所述的多肽的复合物的形成的方法包括凝胶电泳、层析技术、免疫印迹分析、免疫组织化学、质谱和/或高压液相色谱。

10.权利要求1所述的多肽，权利要求2所述的核酸，权利要求3所述的表达载体，或权利要求4所述的细胞的应用，其特征在于，所述的应用包括如下任一方面所述的应用：

(1)在制备权利要求5或6所述的药物组合物中的应用；

(2)在制备权利要求8所述的产品中的应用；

(3)在非诊断目的的检测夏科-莱登晶体中的应用。