CN114672477A

CN114672477A - 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用

Info

Publication number: CN114672477A
Application number: CN202210135772.0A
Authority: CN
Inventors: 杨倩; 李昱辰; 王秀羽; 张恩
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2022-02-14
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2042-02-14
Also published as: CN114672477B; CN113621598A

Abstract

本发明公开了钙蛋白酶‑1（Calpain‑1）及其抑制猪流行性腹泻病毒感染方面的应用，属于生物工程技术领域。本发明在发现猪小肠黏液总蛋白能抑制PEDV感染的基础上，从猪小肠黏液中鉴定并纯化得到一种能够抑制PEDV侵入宿主细胞的蛋白酶‑1，该蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明进一步通过真核表达获得的猪源钙蛋白酶‑1同样具有显著的抗病毒功能，其主要通过酶解PEDV刺突蛋白抑制PEDV入侵宿主细胞。本发明所述的钙蛋白酶‑1还可以应用于抗PEDV感染药物或抗病毒饲料添加剂的制备。

Description

钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及猪小肠黏液蛋白钙蛋白酶-1的应用，从猪小肠黏液中筛选、分离和鉴定获得钙蛋白酶-1能够显著抑制PEDV感染，钙蛋白酶-1抗病毒的机制在于其能够酶解PEDV S蛋白，抑制病毒入侵宿主细胞。

背景技术

肠道黏膜构成了机体与外界接触的最大界面，是许多病原微生物侵入并建立感染的重要部位。覆盖于肠上皮细胞表面的黏液层，对于维持猪小肠黏膜结构和功能的完整性具有重要作用。黏液主要经肠道分泌型细胞，如杯状细胞、潘氏细胞等分泌形成，其成分复杂，由水、黏蛋白、无机盐、抗菌肽以及一些小分子蛋白构成。除在消化过程中承担润滑剂的作用以外，黏液在抵抗病原微生物的感染中同样也发挥着重要的作用，例如小肠黏液中的黏蛋白2(Mucin 2，MUC2)能够形成粘稠的凝胶型网状结构，直接阻碍病原微生物接触肠上皮细胞。除发挥物理屏障功能之外，黏液中还存在有大量的生物活性成分，使其能直接灭活病原微生物，发挥主动防御功能。但受提取方法和分析手段的限制，目前人们对黏液中具有保护活性物质认识仍十分有限，如何从黏液中有效筛选并鉴定出具有抗病毒活性的成分，将为新型抗病毒药物或抗病毒饲料添加剂的制备提供有效手段。

猪肠道冠状病毒主要感染哺乳仔猪的小肠(特别是新生仔猪)，并引起严重的胃肠道症状，其中以猪流行性腹泻病毒(PEDV)的危害最大。研究表明极低含量的PEDV 就能导致仔猪发病，其感染后能造成小肠绒毛的大量脱落和广泛坏死，最终引起新生仔猪的水样腹泻和脱水性死亡(死亡率高达100％)。目前，仍缺乏能为PEDV感染提供有效肠道黏膜保护力的免疫策略，预防和控制PEDV的发生已成为世界上研究难题。在此情况下，通过加固仔猪肠道黏膜屏障，直接阻断病毒经黏膜入侵，对于预防和控制 PEDV的发生具有重要的意义。作为肠道黏膜免疫的第一道防线，猪小肠黏液屏障在抵抗PEDV感染中的潜在作用值得进一步探究。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种从猪小肠黏液中纯化获得，具有抵抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染功能的黏液蛋白-钙蛋白酶-1。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或细胞系，其含有所述的核酸或基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种重组蛋白表达细胞系。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种重组钙蛋白酶-1及其制备方法和应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了猪钙蛋白酶-1、核酸或基因、表达盒、重组载体或细胞系，重组钙蛋白酶-1在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒相关疾病的药物或饲料添加剂中的应用。

技术方案：本发明内容包括一种钙蛋白酶-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明内容还包括核酸或基因，其编码所述的钙蛋白酶-1，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明内容还包括表达盒、重组载体、细胞系或菌株，其含有所述的核酸或基因。

其中，所述重组载体是将所述的核酸或基因插入到真核表达载体中得到含有猪钙蛋白酶-1的基因的表达载体。其中，所述真核表达载体包括但不仅限于pCDNA3.4或Ppic9K。

本发明内容还包括一种重组蛋白表达细胞系，所述细胞系是通过将所述的重组载体转入宿主细胞后获得。所述细胞系包括但不仅限于哺乳动物细胞。

本发明内容还包括两种重组钙蛋白酶-1，所述重组钙蛋白酶-1是通过将所述的表达载体转入细胞后表达、纯化获得。

其中，所述的猪钙蛋白酶-1、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、细胞系或菌株在生产重组钙蛋白酶-1中的应用。

本发明内容还包括两种重组钙蛋白酶-1的制备方法，包括以下步骤：

1)编码钙蛋白酶-1的基因的获得；

2)将编码钙蛋白酶-1的基因导入载体中获得表达载体；

3)将表达载体转染细胞后进行纯化即得；

其中，所述细胞为293F细胞或酵母GS115。

其中，所述的猪钙蛋白酶-1、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体或细胞系在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒相关疾病的药物或饲料添加剂中的应用。

其中，所述应用通过体外裂解PEDV S1蛋白，体内保护仔猪免受PEDV感染而实现。

有益效果：本发明首次通过分离纯化获得了猪钙蛋白酶-1，并进一步获得了该酶的核苷酸及氨基酸序列，通过实验研究发现，猪钙蛋白酶-1具有较高的活性，而且进一步进行重组钙蛋白酶-1的制备以及应用。本发明的重组钙蛋白酶-1具备较高的活性和显著的抗PEDV病毒的功能，以及具有高裂解PEDV S1蛋白的活性。

附图说明

图1为小肠黏液总蛋白对PEDV感染的影响；(A)猪小肠黏液收集示意图；(B) CCK8试验测定黏液总蛋白的细胞毒性测定；(C)噬斑中和试验检测不同浓度小肠黏液总蛋白的抗病毒作用；(D-F)排查黏液总蛋白抵抗PEDV感染的具体阶段；(E) 空斑形成试验检测培养各组上清中的病毒滴度；(F)RT-qPCR检测PEDV基因表达水平。

图2为小肠黏液总蛋白中具有抗病毒活性蛋白的筛选鉴定。(A)用非变性胶分离小肠黏液蛋白；采用Amicon超离过滤装置(截断量：100kDa)，将小肠黏液中小于100 kDa的蛋白通过非变性PAGE分离，收集为4个组分(I-IV)；(B)空斑抑制试验测定各蛋白组分的抗病毒活性；(C)排查蛋白组分III抑制PEDV感染的具体阶段；(D) 测定蛋白组分III处理后培养上清中(D)和细胞内(E)病毒含量，图中数字与图(C) 中各组编号对应。

图3为钙蛋白酶-1介导黏液蛋白组分III的抗病毒作用。(A)通过SEC-150凝胶过滤柱收集黏液蛋白组分III的主峰，其分子量在70KD左右；(B-D)纯化蛋白组分III 以一定的浓度梯度与PEDV孵育1h后，将混合物接种于Vero E6细胞。培养1h后，洗去混合溶液，空斑抑制试验测定蛋白组分III的抗病毒活性(C)或继续用维持培养基培养24h，为检测PEDV感染情况，通过Western blot(B)(一抗：PEDV-N蛋白单克隆抗体；二抗：HRP-标记山羊抗鼠抗体)和RT-qPCR检测病毒蛋白和mRNA表达量(D)； (E)采用LC-MS/MS法测定纯化的蛋白组分III的氨基酸信息。根据它们的肽段信息在气泡图上显示匹配的蛋白。以蛋白质分子量为X轴，蛋白质覆盖率为Y轴，颜色代表打分值；(F-H)用钙蛋白酶-1抑制剂处理收集的纯化蛋白组分III后，空斑试验(H) 和RT-qPCR(G)检测蛋白组分III的抗病毒作用；(I)SDS-PAGE分析亲和层析法从小肠黏液总蛋白中纯化的钙蛋白酶-1。(J-L)验证纯化的钙蛋白酶-1的抗病毒活性。用 (I)中纯化的蛋白预处理PEDV 1h后接种于Vero E6细胞，恒温培养箱中孵育24h后，检测细胞中PEDV的蛋白(一抗：PEDV-N蛋白单克隆抗体；二抗：HRP-标记山羊抗鼠抗体)(L)与mRNA(J)表达水平，并测定培养上清液中的病毒滴度(K)。

图4为PEDV刺突蛋白(S)钙蛋白酶-1水解位点及相互作用位点预测。(A)PEDV 经典株和变异株的spike(S)蛋白上钙蛋白酶-1切割位点的生物信息学预测，该裂解位点基于其氨基酸序列。柱状图中还显示了在不同毒株上测定的裂解得分值(高于默认的最大临界值0.654)；(B)利用ZDOCK算法预测了PEDV CV777 S蛋白与钙蛋白酶-1 的结合构象。PEDVCV777S蛋白由三个同源的亚基组成。Calpain-1与S1蛋白a、b、c 结构域的详细结合作用分别如图(a)、(b)和(c)所示，绿色图为PEDV CV777的 S1蛋白，紫色图为calpain-1，氢键相互作用用红色虚线表示。

图5为钙蛋白酶-1水解PEDV S蛋白功能验证。(A-B)采用表面等离子体共振(SPR)验证钙蛋白酶-1与PEDV CV777和PEDV OH851 S1的相互作用；(C)将钙蛋白酶-1 以1∶1和1∶100的比例，与PEDV经典毒株CV777和变异毒株OH851和AJ1102共孵育。通过Western blot检测钙蛋白酶-1对PEDV S1蛋白的裂解作用，以同样比例加入的 BSA作为阴性对照；(D)钙离子浓度对钙蛋白酶-1裂解PEDV S1蛋白的影响，(E) 孵育温度对钙蛋白酶-1裂解PEDV S1蛋白的影响；(F)透射电镜观察钙蛋白酶-1处理对PEDV冠状结构的影响；(比例尺＝100nm)。

图6为293F细胞表达猪钙蛋白酶-1及其抗病毒活性检测。(A)293F细胞表达质粒的构建及其鉴定。表达的钙蛋白酶-1质粒转化至Top10，挑取阳性菌落PCR验证结果。(B-C)细胞沉淀用20mM PBS pH7.40破碎后，离心过Ni柱纯化，咪唑洗脱蛋白后分别进行SDS-PAGE电泳(B)和Western blot(一抗：His-tag单克隆抗体；二抗： HRP-标记山羊抗鼠抗体)(C)验证纯化结果。(D)检测293F细胞表达纯化的钙蛋白酶-1的水解作用。浓度梯度的钙蛋白酶-1与PEDV S1蛋白37℃孵育1小时。用Western blot检测不同处理组的S1蛋白表达水平，以BSA作为阴性对照；(E-G)检测293F细胞表达的钙蛋白酶-1的抗病毒作用。培养上清和细胞样品在24hpi收集，空斑形成试验检测培养上清中的病毒滴度，并在柱状图中显示汇总结果(E)。(F)Western blot检测PEDVN蛋白的表达(一抗：PEDV-N蛋白单克隆抗体；二抗：HRP-标记山羊抗鼠抗体)。(G)RT-qPCR检测PEDV RNA载量。(H)293F细胞表达的钙蛋白酶-1活性测定。

图7为酵母表达猪钙蛋白酶-1及其抗病毒活性检测。(A)酵母表达质粒的构建及其鉴定。酵母表达钙蛋白酶-1质粒转化至Top10，挑取阳性菌落PCR验证结果。(B-C) 酵母沉淀用20mM PBS pH7.40破碎后，离心过Ni柱纯化，咪唑洗脱蛋白后分别进行 SDS-PAGE电泳(B)和Western blot(一抗：抗猪钙蛋白酶-1多克隆抗体；二抗：HRP- 标记山羊抗兔抗体)(C)验证纯化结果，其中，泳道1为酵母分泌上清中总蛋白；泳道2为酵母菌体破碎后的总蛋白；泳道3为Ni-NTA柱纯化的calpain-1；泳道4为阳性对照。(D)检测酵母表达钙蛋白酶-1的裂解作用。浓度梯度的酵母表达钙蛋白酶-1与 PEDV S1蛋白37℃孵育1小时。Westernblot检测不同处理组的S1蛋白表达水平，以 BSA作为阴性对照；(E-G)检测酵母表达的钙蛋白酶-1的抗病毒作用。培养上清和细胞样品在24hpi下收集，空斑形成试验检测培养上清中的病毒滴度，并在柱状图中显示汇总结果(E)。(F)Western blot检测PEDV N蛋白的表达(一抗：PEDV-N蛋白单克隆抗体；二抗：HRP-标记山羊抗鼠抗体)。(G)RT-qPCR检测PEDV RNA载量。 (H)酵母表达的钙蛋白酶-1活性检测。

图8为仔猪攻毒保护试验检测口服钙蛋白酶-1对PEDV感染的抑制效果。(A)仔猪攻毒保护试验中不同时间段仔猪处理示意图。五日龄仔猪被随机分为4组，包括PEDV 感染组(组I)，293F细胞表达钙蛋白酶-1治疗组(组II)，酵母表达钙蛋白酶-1治疗组(组III)和空白组(组IV)。组II和组III的仔猪口服钙蛋白酶-1的剂量为5mg，组I和组IV的仔猪同时口服相同体积的钙蛋白酶-1缓冲液。I组，II组和III组仔猪在6 h后，口服接种1mL PEDV(10⁴PFU/mL)。IV组仔猪同时口服相同体积的DMEM作为阴性对照。(B-C)RT-qPCR和Westernbolt检测各组仔猪空肠和回肠组织中(B)病毒 RNA载量和(C)蛋白表达水平。(D)各组仔猪的肠道剖检观察。(E)免疫荧光检测各组仔猪空肠和回肠中PEDV的表达水平和分布情况，一抗为抗PEDV单克隆抗体 (1∶200)，二抗为山羊抗兔Alexa Fluor 488(1∶200，绿色)，细胞核用DAPI(1∶1000) 染色(蓝色)(比例尺＝50μm)。

具体实施方式

现在详细地参照本发明的代表性实施方案描述本发明。这些实施方案仅仅是例示性的，不应理解为以任何方式限制本发明的范围。相反地，本发明意图涵盖权利要求书所限定的在本发明范围内的所有替代、修改和等同。

除非另外指明，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：

材料：Vero E6细胞(本实验室保存，是PEDV易感细胞)；新生仔猪的空肠，断奶仔猪的空肠；260日龄育肥猪的空肠黏液。

试剂：DMEM培养基(WISENT公司)；胎牛血清(gibco公司)；0.25％胰酶(碧云天生物技术有限公司)；RIPA强裂解液(Thermo Fisher Scientific)；Trizol(宝日医生物技术北京有限公司)；氯仿(深圳三品科技公司)；DEPC水(武汉市盖云天生物技术有限公司)；无水乙醇(深圳三品科技公司)；反转录试剂包(诺唯赞生物有限公司)；荧光定量试剂盒(诺唯赞生物有限公司)；10％蛋白预制胶(雅酶生物有限公司)； 5×SDS-PAGE(武汉市盖云天生物技术有限公司)；L.M.P低熔点琼脂糖胶(Thermo Fisher Scientific公司)；4×非变性蛋白上样缓冲液(上海翊圣公司)；PEDV-N蛋白单克隆抗体(Medgene Labs公司)；抗猪钙蛋白酶-1多克隆抗体(英国Abbexa公司)；抗Trx-tag 单克隆抗体(苏州百远生物科技有限公司)；HRP-标记的GAPDH(上海翊圣公司)； HRP-标记山羊抗兔(上海翊圣生物有限公司)；HRP-标记山羊抗鼠(上海翊圣生物有限公司)；猪钙蛋白酶-1蛋白(美国Abcam公司)；Calpain-1特异性抑制剂calpeptin (美国Selleck Chemicals公司)；猪胃Muc2(美国SIGMA公司)。

实施例1猪小肠黏液的提取以及抗病毒效果的评价

1.1猪小肠黏液的制备

260日龄育肥猪在宰杀之前禁食3h，通过静脉注射戊巴比妥钠(100mg/kg)采取安乐死。当猪的角膜反射消失，呼吸停止，心脏停止跳动时，可以确认猪的死亡。随后，立即剖杀，取样。小肠黏液的收集根据之前的研究报道进行，并做了适当的调整，具体步骤如下：首先，剪取长约10cm左右的小肠，将小肠外翻后套在玻璃柱上，充分拉伸铺平后置于冰上预冷的玻璃培养皿中；随后，加入5ml预冷的PBS(含1％蛋白酶抑制剂Cocktail)，一分钟之后轻轻刮取黏液，注意尽量不破坏肠黏膜上皮，刮取黏液后，立即再补充5ml预冷的PBS(含1％蛋白酶抑制剂Cocktail)；最后，收集刮取的黏液，于8,000rpm低温离心30min以去除肠道中的食物残渣和粪便，用移液器吸取上清液，使用0.45μm滤器(Millipore Millicup)过滤后获得猪小肠黏液，将收集到的黏液样品置于-70℃冰箱冻存备用(图1A)。

1.2猪小肠黏液总蛋白的提取

猪小肠黏液12,000rpm低温离心15min以去除沉淀，得到上清后根据体积在室温条件(25℃)下加硫酸铵至45％浓度，添加过程先快后慢且伴随缓慢搅拌，待全部添加完毕后，缓慢搅拌30min，然后静置过夜。次日离心，沉淀用20mM PBS(PH 7.40) 复溶，复溶后离心得上清，用20mM PBS(PH 7.40)透析，除去其中的硫酸铵。用BCA 试剂盒(BiosharpBL521A)测所得黏液蛋白浓度。

1.3猪小肠黏液总蛋白的细胞毒性试验

提取的猪小肠黏液总蛋白用BCA试剂盒测浓度后，运用CCK8试验对不同浓度(0、0.1、1、10、100、1000μg/mL)的黏液总蛋白进行细胞毒性的检测，具体步骤如下：

1)将PEDV易感细胞Vero E6以每孔大约1×10⁴的细胞量接种96孔细胞培养板。并于恒温培养箱中培养至细胞长到80％以上；

2)向96孔细胞板中加入10μL不同浓度的猪小肠黏液总蛋白(0、0.1、1、10、 100、1000μg/mL)，将培养板在恒温培养箱(37℃，5％CO₂)中培养12h；

3)向每孔加入10μL CCK8溶液(在加的过程中注意不要生成气泡，否则会影响最终结果)，将96孔培养板在恒温培养箱中孵育2h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

4)结果如图1B所示，与空白对照组相比，最高浓度(10mg/mL)的黏液总蛋白可造成部分细胞病变，细胞病变率在60％左右。而其他几个浓度，与空白对照组相比均未出现明显的病理变化。因此，试验选取0.1、1、10、100、1000μg/mL五个浓度进行接下来的抗病毒试验。

1.4猪小肠黏液总蛋白的抗病毒效果的评价

将猪小肠黏液总蛋白以及BSA对照(0.1、1、10、100、1000μg/mL)，在感染前与等体积的10³PFU的PEDV充分混合(37℃，1小时)，将病毒与小肠黏液总蛋白的混合物加入到12孔细胞培养板中，然后将培养板在恒温培养箱(37℃，5％CO₂) 中孵育1h；洗掉未黏附的混合物后，加入0.8％的琼脂糖低熔点胶(DMEM稀释)。待琼脂糖凝胶凝固后，置于恒温培养箱中培养72h，在12孔细胞培养板中加入4％的多聚甲醛，固定1h，弃掉多聚甲醛和琼脂糖凝胶，加入适量的0.5％的结晶紫染色2h，结果显示黏液总蛋白表现出明显的抗病毒效果(图1C)；而且10μg/mL的黏液总蛋白其对病毒的抑制效果可达到90％以上。表明猪小肠黏液总蛋白与PEDV孵育能够显著抑制PEDV在细胞中的感染。

1.5猪小肠黏液蛋白的抗病毒阶段和作用方式排查

为初步摸查猪小肠黏液抗PEDV作用的具体作用阶段和具体方式，选择1mg/mL 的猪小肠黏液蛋白进行以下试验：

将猪小肠黏液蛋白以及BSA对照，在感染前加入细胞或病毒，或4℃吸附过程、病毒入侵过程(37℃，1小时)、病毒复制过程(1～24hpi)，在感染后24小时收集样品(图1D)，检测细胞中病毒RNA(图1E)水平，并检测培养基上清中感染性颗粒(图1F)，结果显示黏液蛋白与PEDV在37℃提前孵育1h后或者在黏液蛋白存在于所有阶段的情况下，小肠黏液蛋白能够显著抑制PEDV在细胞中的复制和子代病毒的产生；而在病毒复制阶段加入黏液，其对病毒感染的抑制效果消失。

实施例2猪小肠黏液中各组分蛋白的抗病毒活性的鉴定

2.1猪小肠黏液中各蛋白组分的分离

将实施例1中制备的猪小肠黏液总蛋白(10mg/mL)加入Amicon Ultra 100kDa超滤管，通过离心将黏液总蛋白分为高分子量蛋白(HMWPs)和低分子量蛋白(LMWPs)，对获得的HMWPs和LMWPs进行以下处理：1)使用Protein A/G亲和柱去除HMWPs 中的免疫球蛋白，以排除免疫球蛋白对后续抗病毒效果检测的干扰；2)通过非变性胶分离将LMWPs分为分成4个蛋白质组分(I-IV)，切胶回收各蛋白组分后使用电洗脱法进行纯化和收集(图2A)。

2.2猪小肠黏液中各蛋白组分抗病毒效果的检测

通过空斑抑制试验初步检测黏液低分子量蛋白(LMWPs)中各蛋白组分的抗病毒效果(图2B)，结果可见LMWPs组分III具有显著的抗病毒效果。进一步探究了LMWPs 组分III的抗病毒阶段(图2C)：将LMWPs蛋白组分III以及BSA对照，分别于PEDV 的入侵(1)和复制阶段(2)加入，24h后收集细胞和上清样品；同时在接种病毒前将黏液蛋白组分III以及BSA对照分别与PEDV(10⁴PFU)37℃孵育1h(3)，孵育完成后将混合物接种Vero E6细胞孵育1h，用空白DMEM培养基洗去未结合的病毒和残留的蛋白，加入维持培养基(含2％FBS的DMEM)培养至24小时收集细胞和上清样品。如图2D-E可见黏液蛋白组分III与PEDV孵育后能显著抑制PEDV对Vero E6 细胞的感染，胞内病毒的蛋白水平显著降低，同时子代病毒的产生也受到明显抑制，而在其他阶段添加蛋白组分III对PEDV感染并没有明显影响。

实施例3猪小肠黏液LMWPs组分III中具有抗病毒活性蛋白的鉴定

使用分子筛(SEC，Zenix SEC-150)分析并纯化LMWPs组分III中的蛋白，在第8.313s检测到蛋白吸收主峰，约占蛋白质组分III总面积的74.79％(图3A)。收集主峰蛋白后，经SDS-PAGE电泳后发现其蛋白分子量在70kD左右，进一步对收集蛋白的抗病毒活性进行验证。纯化蛋白组分III以一定的浓度梯度(1，10，50，100μg/mL)与等体积PEDV(10⁴pFU)孵育1h，将混合物接种于Vero E6细胞。培养1h后，洗去混合溶液，空斑抑制试验测定蛋白组分III的抗病毒活性，由图3C结果显示收集蛋白能显著抑制PEDV对Vero E6细胞的感染，该作用具有明显的剂量依赖性，在浓度为100 ug/mL时，能使PEDV感染水平下降70％。同时，重复对Vero E6细胞的上述处理后，继续用维持培养基培养24h后，弃掉培养板中的液体。每孔加入200μL的含有1％PMSF 的RIPA强裂解液，吹吸混匀；将含有细胞样品的RIPA裂解液转移到1.5mL离心管，加入5×SDS Loading Buffer，煮沸变性样品，随后进行凝胶电泳；切取对应凝胶，湿转蛋白条带至活化的PVDF膜；5％脱脂奶常温封闭2h；TBST洗去残留的脱脂奶，加PEDV N蛋白单克隆抗体或HPR-GAPDH抗体，4℃孵育过夜；TBST洗去残留的抗体，加HRP- 标记的山羊抗鼠IgG常温孵育2h；ECL超敏发光液显色、曝光(按说明书配制)图3B 显示病毒蛋白表达水平明显降低。同样图3D显示出PEDV的mRNA的表达水平与上述结果一致，证明收集的蛋白具有显著的抗病毒效果。为了鉴定出主峰蛋白中具有抗病毒活性的具体成分，通过液相色谱串联质谱分析主峰蛋白。基于UniProt-数据库共识别了 142种蛋白质的873个肽段。根据肽段覆盖率，蛋白质匹配度以及蛋白分子量，将排名靠前的10种蛋白以气泡图展示(图3E)。通过不同蛋白抑制剂筛选验证，特异性猪钙蛋白酶-1抑制剂calpeptin(25μM，50μM)处理后蛋白组分III后(图3F)，将混合物与PEDV等体积孵育1h后接种于Vero E6细胞。空斑试验(3H)和RT-qPCR(3G) 检测蛋白组分III的抗病毒作用(检测步骤同3D与3F)。由此得出钙蛋白酶-1可能是猪小肠黏液中蛋白组分III中发挥抗病毒功能的主要成分。

实施例4猪小肠黏液中钙蛋白酶-1的分离、纯化以及抗病毒活性验证

4.1亲和纯化猪小肠黏液中的钙蛋白酶-1并检测其抗病毒效果

使用NHS活化介质(NHS-activated QZT 4FF)耦连抗猪钙蛋白酶-1多克隆抗体，制得亲和介质保存于4℃、20％乙醇溶液中备用。首先制备猪小肠黏液总蛋白中LMWPs 组分III(实施例2和3)，其次使用制备的亲和介质通过亲和层析的方法从LMWPs组分III中纯化获得猪钙蛋白酶-1，如图3I所示，目的蛋白分子量为70KDa，大部分被0.1M 甘氨酸(pH＝2)洗脱。将纯化获得的猪钙蛋白酶-1与病毒孵育后，检测病毒的感染能力(同实施例2的步骤2.2)，如图3J-L所示，纯化获得的猪钙蛋白酶-1处理能显著抑制病毒对Vero E6细胞的感染(蛋白和基因水平)以及上清中病毒颗粒的释放。此外，相比于LMWPs组分III，纯化获得的钙蛋白酶-1具有更强的抗病毒活性。

实施例5猪钙蛋白酶-1抑制PEDV感染的机制

5.1PEDV S蛋白上钙蛋白酶-1裂解位点的预测

PEDV进入细胞是由刺突蛋白(Spike S)介导的，它的三聚体结构介导病毒与靶细胞的黏附和随后的膜融合。钙蛋白酶-1只在病毒入侵阶段发挥抗病毒效果，其可能是通过影响病毒的S蛋白结构的稳定性，阻止病毒与受体的结合，进而影响病毒入侵过程中的膜融合。基于钙蛋白酶-1的属性和底物特征，我们使用GPS-CCD软件 ((http：//ccd.biocuckoo.org/))和GraphPad Prism7.0以条形图的方式显示每个裂解位置的分数。由图4A可得，PEDV S蛋白的S1和S2区域均有钙蛋白酶-1的裂解位点分布。

为了进一步确钙蛋白酶-1在PEDV S蛋白上的作用位点，我们从不同的PEDV毒株中挑选了最具代表性的流行毒株(PEDV CV777)，将购买的猪钙蛋白酶-1蛋白 (1.9mg/mL)(美国Abcam公司)与PEDV S蛋白进行分子对接，通过蛋白-蛋白分子对接及构象筛选，得到钙蛋白酶-1和PEDV CV777的最优结合构象(图4B)。钙蛋白酶-1的活性位点区域与PEDVCV777的S1蛋白结合，ZDock Score为29.98。PEDV CV777 S1蛋白由三个β-片状结构域组成(图4B)，分别记为a，b，c；进一步对钙蛋白酶-1的活性位点与PEDV CV777 S1蛋白结合分析。钙蛋白酶-1主要通过静电作用与 S1蛋白结合。在a结构域上，Y205与钙蛋白酶-1的Y387形成π-π相互作用。T69、D97、 S99、Y101、K183与钙蛋白酶-1的R473、R414、K229、E226形成氢键。F96与钙蛋白酶-1的R488形成π-阳离子相互作用。钙蛋白酶-1的活性位点主要与S1蛋白的b结构域结合。在b域，Y382、E329、T376-S379、A336、L416、N297、H298、K399、N442 与钙蛋白酶-1的L258、V257、E302、K270、Q109、A204、K79、K71形成氢键。Y377 与钙蛋白酶-1的H272形成π-π相互作用。在c域上，T555、Y552、Q565和P629与钙蛋白酶-1的Q182、D172和K86形成氢键。H492和D578与钙蛋白酶-1的N76和Y81 形成极性相互作用。综上可得，钙蛋白酶-1的活性位点主要与PEDV的S1蛋白相结合从而引起之后的裂解作用。

5.2猪钙蛋白酶-1对PEDV S1蛋白的裂解

表面等离子体共振(SPR)技术进一步检测猪钙蛋白酶-1蛋白(美国Abcam公司) 与PEDV S1蛋白的结合。原核表达分别制备了PEDV OH851(NO.KJ399978)和PEDV CV777(NO.KT3239979)的S1重组蛋白并用于后续实验。首先由南京擎科生物公司合成PEDVOH851和PEDV CV777的S1基因片段后(S1的基因序列参见SEQ ID NO：3 和SEQ ID NO：4所示)，经琼脂糖凝胶电泳后回收，使用限制性内切酶EcoRI和SalI 双酶切片段后，通过T4连接酶与线性化的pET-32a载体相连。将连接产物转化到BL21 感受态细菌中。通过菌落PCR获得阳性点摇菌测序正确(测序均由南京擎科生物公司完成)后用IPTG诱导重组PEDV OH851S1蛋白和PEDV CV777 S1蛋白的表达，离心收集菌体后进行超声破碎。收集的液体过Ni柱纯化提取得到重组PEDV OH851 S1蛋白和PEDV CV777 S1蛋白。通过BCA法测定蛋白浓度，纯化后得到的蛋白浓度为PEDV OH851 S1：1.3mg/ml，PEDV CV777 S1：1.0mg/ml。

猪钙蛋白酶-1与PEDV S1蛋白实时相互作用的动态传感图如图5A-B所示，描述了蛋白结合和解离的整个动态过程。SPR动力学分析表明，钙蛋白酶-1与PEDV CV777 S1 蛋白具有亲和性，其平衡解离常数(KD)为1.074^-6M。此外，钙蛋白酶-1与PEDV变异毒株OH851 S1蛋白相互作用的亲和力较高，KD值为7.872^-7M。

为了再次确认PEDV S1蛋白是猪钙蛋白酶-1的底物，我们通过商品化猪钙蛋白酶-1分别与PEDV OH851 S1、PEDV AJ1102 S1和PEDV CV777 S1蛋白以1∶1；1∶100的比例孵育(BSA组作为阴性对照)进行裂解试验。结果表明，钙蛋白酶-1处理后三种 PEDVS1蛋白水平(一抗：抗Trx-tag单克隆抗；体二抗：HRP-标记山羊抗鼠抗体)均显著降低，并存在剂量依赖(图5C)。钙蛋白酶-1对PEDV S1蛋白的裂解作用与钙离子浓度也有关(图5D)。值得注意的是，钙蛋白酶-1即使在4℃也保持水解活性，而在高温下(100℃)则失去了活性(图5E)。通过透射电镜观察钙蛋白酶-1处理PEDV 后其冠状结构的变化，为钙蛋白酶-1的裂解作用提供更多的证据(图5F)。BSA处理后不影响其形态结构，S蛋白在病毒表面有序排列。然而，钙蛋白酶-1处理后则导致病毒颗粒表面S蛋白明显脱落，尤其是在较高的钙蛋白酶-1浓度时。

实施例6钙蛋白酶-1的293F细胞表达及抗病毒活性的鉴定

6.1 293F细胞表达质粒的构建及其鉴定

为了研究PEDV与钙蛋白酶-1的关系，我们对猪钙蛋白酶-1进行了293F细胞表达与纯化。根据GenBank中calpain-1基因序列基因全合成猪钙蛋白酶-1，基因序列见序列表中的序列1。自主设计特异性引物P1和P2进行PCR扩增；

P1：5‘-ATAGGATCCCTGGGACGACATGAGAAC-3’，

P2：5‘-GTGCTCGAGTTATGCGAACATAGTGAGCTGG-3’。

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳并在紫外灯下快速割取含目的片段的凝胶，按DNA凝胶回收试剂盒说明书操作回收，得到目的基因calpain-1。合成与测序均由南京擎科生物公司完成。

将扩增的calpain-1插入表达载体pcDNA 3.4的多克隆位点。用HindIII和XhoI限制性内切酶对质粒进行酶切，胶回收目的片段和表达载体片段后，于16℃过夜连接，连接产物转入TOP10感受态细胞。将转化菌Top10接种于50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养12h。挑选单个菌落，接种于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h。按质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA，并进行BamHI和XhoI双酶切分析和PCR鉴定(图6A)，挑取PCR鉴定正确的阳性克隆送南京擎科生物科技有限公司测序，测序后将连接方式及碱基序列100％正确的质粒命名为pcDNA 3.4- calpain-1(HOCA)。

6.2 293F细胞培养及转染

在37℃，5％CO₂恒温培养箱中，用DMEM培养基+10％胎牛血清(FBS)的培养基培养293T细胞，待细胞融合度达到70％-90％且生长状态正常时可进行质粒转染；转染前使用Endo-free Plasmid Mini Kit II试剂盒提取去内毒素HOCA质粒，使用

3000Transfection Kit试剂盒将2μg去内毒素质粒HOCA转染至293F 细胞中，具体操作按试剂盒说明书进行；转染后孵育2h，加入培养基，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。

6.3猪钙蛋白酶-1的纯化及验证

转染48h后，收取上清进行Western blot验证诱导表达的上清中有钙蛋白酶-1，证明诱导表达成功，然后进行纯化。

预先制备四种缓冲液，分别为：平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0；预洗缓冲液：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0；洗脱缓冲液1：20mM Tris-HCl， 300mMNaCl，20mM Imi(咪唑)，pH8.0；洗脱缓冲液2：20mM Tris-HCl，300mM NaCl， 80mM Imi(咪唑)，pH8.0；洗脱缓冲液3：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，500mM Imi (咪唑)，pH8.0；透析缓冲液：20mM Tris-HCl，pH8.0。

HOCA质粒转染293F细胞12h后，用空白DMEM培养基继续培养48h后，收集细胞培养液。细胞上清透析过夜后离心，留取上清，过Ni柱纯化。细胞沉淀用20mM PBS pH7.40破碎后，离心过Ni柱纯化。根据Ni-NTA Spin Kit说明书，将两种上清分别与预先平衡好的Ni-NTA于4℃旋转孵育3h。用洗脱缓冲液2洗涤，收集沉淀，之后与洗脱缓冲液3洗脱目的蛋白。离心，将上清放入透析袋，透析8h。最后透析袋中蛋白溶液为纯化的目的蛋白。用SDS-PAGE电泳和Western blot进一步鉴定纯化的蛋白(图 6B-C)。

6.4猪钙蛋白酶-1活性的检测

根据制造商的说明，使用商用钙蛋白酶活性荧光测定试剂盒(Biovision，Mountain View，California)对表达的猪钙蛋白酶-1活性进行测定。将表达的钙蛋白酶-1稀释到85μL缓冲液中，在85μL缓冲液中加入1～2μL活性钙蛋白酶-1作为阳性对照。阴性对照为添加1μL钙蛋白酶抑制剂的钙蛋白酶-1缓冲液。加入10μL的10X反应缓冲液和 5μL的钙蛋白酶底物，避光孵育1小时后将体系转移至96孔板中，在装有400nm激发滤光片和505nm发射滤光片的荧光仪中读取样品荧光值。由图6H比较样品和阴性对照的结果，样品平均荧光值为21544.3，阴性对照荧光值为273，阳性对照荧光值为50784，可以确定293F细胞表达的钙蛋白酶-1具有较高的活性。

6.5纯化的猪钙蛋白酶-1抗病毒活性的鉴定

为验证纯化获得的猪钙蛋白酶-1(293F细胞表达)在体外是否具有裂解PEDV S1蛋白的活性，将50，100，300μg/mL 293F细胞表达的猪钙蛋白酶-1分别与PEDV CV777 S1以1∶1的比例于37℃孵育1h(BSA组作为阴性对照)，通过使用抗Trx-tag抗体检测 PEDV S蛋白的水平。从图6C中的Westernblot结果可见，当使用300μg/mL纯化的钙蛋白酶-1处理后，接近40％的PEDV S1蛋白被水解。这表明293F细胞表达的猪钙蛋白酶-1具有裂解PEDV S1蛋白的活性。

为了验证293F细胞表达的猪钙蛋白酶-1对PEDV感染的抑制作用。将BSA(阴性对照)，293F细胞表达的猪钙蛋白酶-1(1，10，100μg/mL)与分别与等体积PEDV(10³ PFU)37℃孵育1h，孵育完成后将混合物接种Vero E6细胞孵育1h，用空白DMEM培养基洗去未结合的病毒和残留的蛋白，加入维持培养基(含2％FBS的DMEM)培养24 小时后收集细胞和上清样品。如图6E-G可见，与对照组相比，293F细胞表达的猪钙蛋白酶-1与PEDV孵育后能显著抑制PEDV对Vero E6细胞的感染，胞内病毒的蛋白和 mRNA水平均显著降低，同时子代病毒的产生也受到明显抑制。这些数据表明293F细胞表达的猪钙蛋白酶-1具有抑制PEDV感染的活性。

实施例7钙蛋白酶-1的酵母表达及抗病毒活性的鉴定

7.1酵母表达质粒的构建及其鉴定

酵母表达系统表达水平高，外源蛋白基因遗传稳定且培养成本低、产物易分离，因此本实施例利用毕赤酵母菌GS115对猪钙蛋白酶-1进行表达与纯化。

将实施例6扩增的calpain-1插入酵母表达载体Ppic9K的多克隆位点。用EcoRI和NotI限制性内切酶对质粒进行酶切，胶回收目的片段和酵母表达载体片段后，于16℃ 过夜连接，连接产物转入TOP10感受态细胞。将转化菌Top10接种于50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养12h。挑选单个菌落，接种于含100μg/mL卡那霉素的 LB液体培养基中，37℃培养12h。按质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA，并进行EcoRI 和NotI双酶切分析和PCR鉴定，挑取PCR鉴定正确的阳性克隆送南京擎科生物科技有限公司测序，测序后将连接方式及碱基序列100％正确的质粒命名为Ppic9K-calpain-1。

7.2毕赤酵母菌的电击感受态制备和转化

1)将冻存的酵母菌株GS115在YPD平板上进行划线，放置在30℃培养箱里进行培养。48h后挑取单菌落置于含有2-3mL YPD液体培养基的试管中，放置在30℃的摇床上进行扩培，16h，220rpm。

2)将试管中的新鲜菌液以1∶100的比例接种到含有50mL YPD液体培养基的锥形瓶中。将锥形瓶放置在30℃摇床上扩培，12-16h，200rpm。

3)将扩培好的酵母培养基收集到50mL的离心管中，用封口膜将盖子边缘封闭好。在提前预冷的离心机中离心，4℃，3000rpm，3min。

4)离心后，将上清倒掉，加入1-2m的ddH2O进行悬浮，将菌液转移到2M1离心管中。在提前预冷的4℃离心机中离心，5000rpm，3min。

5)离心后，倒掉上清，加入1mL的ddH₂O进行悬浮，放入4℃离心机中离心，5000rpm，3min。

6)重复步骤5)两次。

7)离心后将上清去掉，加入1mL Sobital(1M/L)到EP管中。放入到离心机中离心，4℃，5000rpm，3min。

8)重复步骤7)两次。

9)离心结束后去掉上清，加入180μL的sobital悬浮酵母菌液。加入20μL的线性化质粒。

10)电击杯用清水和无水乙醇依次清洗后，再用1M的sobital加入电击杯清洗三次。

11)将电击仪的参数设置为“manual”位置，将电压调节到1.5kV。

12)将含有质粒的酵母感受态加入到电击杯中，按下电击键，迅速向里面加入1mLSobital。轻轻吸打混匀，从电击杯中转移到之前的EP管中。

13)将EP管放入到30℃摇床中，220rpm，扩培2h。

14)扩培完成后离心。倒掉部分上清，将剩余部分涂布到酵母单缺His的培养基上。放置于30℃培养箱中静置培养3天。

15)挑取平板上长出来的阳性单菌落，进行菌落PCR验证(图7A)，所用calpain-1引物为：

F：5‘-CCGGAATTCGCAGAAGAAGTTATTAC-3’，

R：5‘-GTGGCGGCCGCTGCGAACATAGTGAGCTGG-3’。

7.3猪钙蛋白酶-1在毕赤酵母菌中的诱导表达

1)挑取阳性转化子加入含有2-3mL YPD液体培养基的试管中，30℃摇床培养12h，速度为220rpm。

2)将扩培的菌液以1∶100接种到含有50mL液体BMMY的250mL锥形瓶中，将锥形瓶放在30℃摇床中，220rpm培养24h。

3)将BMMY培养基置换为BMGY培养基。用BMMY培养的酵母菌液在室温下静置3-4h。酵母菌沉淀到锥形瓶底部后弃掉上清，加入诱导性培养基BMGY，并加入甲醇溶液(总体积的0.5％)。放入30℃摇床中进行诱导表达。

4)每隔24h补充一次甲醇。

5)诱导表达第三天后，吸取1mL菌液4℃，12000rpm离心10min后，加入5×的蛋白loading buffer，煮沸10min，进行Western bolt验证诱导表达成功(图7C)。

7.4酵母液的硫酸铵沉淀浓缩

诱导表达第四天分进行蛋白纯化。

1)将离心机提前遇冷至4℃，将酵母液收集到离心管中，8000rpm离心30min。

2)分别收取培养上清和酵母菌体沉淀。酵母沉淀用20mM PBS pH7.40破碎后，离心留取上清。

3)两种上清一起边搅拌边慢慢加入硫酸铵固体，添加过程中液体中心漩涡出现泡沫意味着蛋白质出现变性，减慢添加速度。添加量为472g/L。

4)将上清液搅拌30min后放入4℃冰箱静置过夜。

5)次日，将蛋白溶液离心，8000rpm，30min。

6)离心结束后弃掉上清，用ddH₂O将沉淀复溶。

7.5酵母表达的猪钙蛋白酶-1的纯化

复溶的沉淀透析过夜后离心，留取上清，过Ni柱纯化。方法同实施例6.3，用洗脱缓冲2洗脱目的蛋白，待检测到蛋白的紫外吸收峰向上增加时迅速收集蛋白。峰值恢复至原来位置时停止收集，直到紫外吸收峰达到稳定基线。收集的蛋白离心，将上清放入透析袋，透析8h。最后透析袋中蛋白溶液为纯化的目的蛋。用碧云天P0012S试剂盒测定蛋白浓度，检测原理为BCA法，具体步骤见说明书。用SDS-PAGE电泳和Western blot 试验进一步鉴定纯化的蛋白(图7B-C)。

7.6酵母表达纯化的猪钙蛋白酶-1活性检测

方法同实施例6.4，由图7H比较样品和阴性对照的结果，样品平均荧光值为41643，阴性对照荧光值为273，阳性对照荧光值为48972，可以确定酵母表达的钙蛋白酶-1具有活性。

7.7酵母表达与纯化的猪钙蛋白酶-1抗病毒活性的鉴定

为验证纯化获得的猪钙蛋白酶-1(酵母表达)在体外是否具有裂解PEDV S1蛋白的活性，操作步骤同实施例6.5。图7D中Western blot检测结果显示酵母表达的钙蛋白酶 -1对于PEDV S1蛋白的水解作用具有明显的剂量依赖性，其在使用浓度为300μg/mL时能几乎完全水解PEDV S1蛋白。这表明酵母表达的猪钙蛋白酶-1具有裂解PEDV S1蛋白的活性。

为了验证酵母表达的猪钙蛋白酶-1对PEDV感染的抑制作用。将BSA(阴性对照)，实施例7.5中纯化的猪钙蛋白酶-1(1，10和100μg/mL)与分别与等体积PEDV(10³PFU) 37℃孵育1h，试验方法同实施例6.5。结果如图7E-G，与对照组相比，使用100μg/mL 酵母表达的猪钙蛋白酶-1与PEDV孵育后能显著抑制PEDV对Vero E6细胞的感染，胞内病毒的蛋白和mRNA水平均显著降低，同时子代病毒的产生也受到明显抑制。这些数据表明真核表达的猪钙蛋白酶-1具有抑制PEDV感染的活性。

实施例8仔猪攻毒保护试验检测钙蛋白酶-1对新生仔猪的保护效果

8.1试验分组以及免疫程序

为进一步验证钙蛋白酶-1对仔猪肠道的保护作用，利用实施例6和7中各自表达并纯化的重组猪钙蛋白酶-1来评价其对感染PEDV仔猪的保护作用。12头PEDV阴性的新生仔猪随机平均分为4组，分别为PEDV感染组(组I)，293F细胞表达的钙蛋白酶 -1治疗组(组II)，酵母表达钙蛋白酶-1治疗组(组III)和空白组(组IV)，为避免交叉污染，4组的新生仔猪在相同的条件下分开进行饲养。II组仔猪口服5mg 293F细胞表达纯化的钙蛋白酶-1；III组仔猪口服5mg酵母表达钙蛋白酶-1；I组和IV组仔猪饲喂相同体积的钙蛋白酶缓冲液(25mM HEPES，pH＝7.0，100mM NaCl，3mM DTT和 5mM CaCl₂)。6小时后I、II、III组仔猪分别口服接种1mL 10⁴PFU PEDV；空白组口服相同体积的空白DMEM作为阴性对照。攻毒6h后，II组和III组仔猪分别再次口服 5mg 293F细胞或酵母表达纯化的重组猪钙蛋白酶-1；I组和IV组仔猪补喂相同体积的钙蛋白酶缓冲液(图8A)。每天观察仔猪状态。

8.2试验动物的剖杀及取样

当I组仔猪出现严重的水样腹泻伴随呕吐症状后，通过静脉注射戊巴比妥钠(100mg/kg)麻醉所有仔猪。当仔猪角膜反射消失，呼吸停止，心脏停止跳动时，可以确认猪的死亡。随后，立即剖杀。剖开腹腔进行肠道剖检观察(图8D)和组织标本采集。

8.3石蜡包埋肠道组织

1)将小肠组织置于4％多聚甲醛中固定24h；

2)将肠道组织转移至75％乙醇中过夜；

3)将组织从75％乙醇中转移至85％乙醇，脱水1h；

4)将组织从85％乙醇中转移至95％乙醇，脱水1h；

5)将组织从95％乙醇中转移至100％乙醇，脱水2h；

6)将组织从乙醇中转移至二甲苯中，脱去乙醇5min；

7)将组织从二甲苯中转移至液体石蜡中，60℃浸透2h；

8)包埋组织，冷却凝固后，用石蜡切片机将组织切成5μm的组织切片；

9)切片37℃烘干后备用。

8.4仔猪肠道内PEDV基因和蛋白表达水平的检测

将小肠各段组织置于组织研磨管中，并在管中加入500μL TRIzol试剂或含有1％PMSF的RIPA强裂解液。随后于组织研磨仪中研磨成匀质。使用磁珠组织匀浆仪匀浆，离心后收集上清。

TRIzol样提取RNA、根据RNA浓度值调整统一后进行反转录以及荧光定量的检测，结果显示，两个calpain-1治疗组(II组和III组)仔猪空肠和回肠内PEDV的mRNA表达水平明显低于I组仔猪(图8B)。

蛋白样品使用BCA法测定浓度。根据浓度数值调整目的蛋白上样量，SDS变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳(电泳条件为70V，30min；110V，1h)，电泳完成后将蛋白转印至甲醇活化的PVDF膜，然后在25℃条件下用5％脱脂奶封闭2h。封闭结束后加入PEDV N蛋白的单克隆抗体(SD6-29，Medgene Labs)(1∶1000)4℃孵育12， TBST洗膜5次；加入HRP标记的羊抗小鼠的二抗(1∶5000)，室温孵育2h；TBST 洗膜5次；使用ECL发光液显色并拍摄照片。使用Image J图像分析系统对蛋白条带进行灰度分析。试验结果与荧光定量结果一致，口服calpain-1治疗组(II组和III组)仔猪空肠和回肠中PEDV蛋白表达水平均显著低于I组(图8C)。

8.5免疫荧光染色检测仔猪小肠中PEDV分布

通过免疫荧光染色对小肠中PEDV表达与分布进行检测，方法步骤具体如下：

组织切片脱腊水化后PBS洗3遍，加入0.4％Triton X-100中破膜通透5min，继续用PBS洗3次。滴加5％BSA在切片组织上，于37℃封闭2h。封闭完成后PBS清洗切片3次，随后在切片的组织上滴加PEDVN蛋白的单克隆抗体(SD6-29，Medgene Labs) (1∶200)作为一抗在4℃孵育12h。孵育结束后用PBS洗3次，滴加羊抗鼠Dylight 488-IGG (1∶200)作为二抗，37℃孵育1h。结束后用PBS洗3次，滴加DAPI(1∶1000)孵育5 min，进行细胞核染色，随后PBS再次清洗，用10％甘油封片。通过激光共聚焦显微镜 Zeiss LSM710观察组织。通过免疫荧光观察发现I组仔猪中空肠肠绒毛中存在大量 PEDV阳性细胞，并且PEDV抗原主要存在于绒毛上皮细胞的细胞质中；回肠肠绒毛表面也聚集了大量PEDV抗原。然而，II组和III组以及IV组仔猪均未检出PEDV(图8E)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2181

<212> DNA

<213> 钙蛋白酶-1(Calpain-1)

<400> 1

aagcttgcca ccatggcaga agaagttatt acccccgttt attgcacagg cgtttcagcc 60

caagttcaga agctcagagc taaagagctg ggactgggac gacatgagaa cgccattaag 120

tacttgggcc aggactatga acaactcaga gctcactgtc tccagtctgg ctcactgttt 180

cgcgatgagg cttttccacc cgtgcctcag agtctcgggt ttaaggagct gggccccaat 240

tccagcaaaa catacggggt gaagtggaag cggccgactg aactcttctc taacccccag 300

ttcatcgtcg atggggccac aaggacagat atttgtcagg gcgctctcgg agactgttgg 360

ctgctcgcag ccatcgctag tctgacactg aacgacactc tgctgcaccg cgtggtgcca 420

catggacagt cattccagaa tgggtacgct ggcattttcc acttccagct ctggcagttc 480

ggggagtggg tggatgtagt tgttgacgac ttgctgccaa caaaggacgg caagctggta 540

ttcgtgcaca gcgcacaggg caatgagttc tggtccgccc tgctggaaaa ggcatacgcc 600

aaagtgaatg gctcatacga agctctgtct ggcggttcca caagtgaagg ttttgaggat 660

tttacgggag gagtgacaga gtggtacgaa ctccgaaaag caccttccga cctgtatagc 720

atcatcctga aggcacttga gcgaggcagc ttgctggggt gcagcattga catcagcagc 780

gtgctcgaca tggaggctgt gactttcaag aagctcgtaa agggacatgc ttactccgtg 840

accggggcca aacaagtcaa ttatcagggc cagatggtga acctcatcag aatgcgaaac 900

ccctggggtg aggtggagtg gacaggcgcc tggtctgatg gctcttccga gtggaatggg 960

gtggacccct accagcgcga ccaactgcgg gtgaggatgg aagacgggga gttttggatg 1020

tcattcagag actttctgcg cgagttcaca agacttgaga tctgcaacct cacacccgac 1080

gctctgaaaa gtcagcgcgt gcgcaattgg aacaccacgc tgtatgaagg gacatggagg 1140

cgggggagca cagcaggagg gtgtaggaat tatcccgcta ccttttgggt caatccgcaa 1200

ttcaagatca ggctggagga aacggatgac ccagaggatg attatggtgg cagagagagt 1260

ggatgctcct ttgttcttgc actcatgcag aagcatcggc ggagggaaag acggttcggc 1320

agggatatgg agacgatcgg cttcgccgtc tacgaagtcc cacctgagct cgtgggtcag 1380

ccagtgcacc tcaagcggga cttcttcttg gcaaacgcga gtcgggccag gtcagaacag 1440

tttatcaacc ttcgcgaagt gtccactagg tttcgcctgc ctcccggaga atacgtggtg 1500

gttccgtcaa catttgagcc gaacaaagaa ggcgatttcg ttctgcgatt tttcagtgag 1560

aaaaaggcgg gcactcagga gcttgatgat caggtccagg ctatcctccc ggacgaacag 1620

gtgctgtcag aggaggagat tgacgagaac ttcaaagcac tcttccggca gctggcaggg 1680

gaagatatgg agatctcagt acgagagctg cggaccatat tgaatcgaat aatatcaaag 1740

cataaggacc tgaggacaaa ggggtttagc ttggaaagtt gcaggagcat ggtgaatctg 1800

atggacagag atggcaacgg aaaattggga ctggtggaat ttaacatact gtggaatcgc 1860

atccgaaact acttgtcaat ctttagaaaa tttgacctgg acaagtcagg cagcatgtcc 1920

gcatacgaaa tgagaatggc catcgagtca gctgggttta agctgaataa gaaactgttc 1980

gaactgatca ttacaaggta ttctgagcct gatctggccg tcgatttcga taattttgtg 2040

tgttgtctcg tgcggctgga aacaatgttc agatttttca agacactgga taccgacctt 2100

gacggggtcg tcacctttga tctcttcaaa tggctccagc tcactatgtt cgcacatcat 2160

caccatcacc attaactcga g 2181

<210> 2

<211> 724

<212> PRT

<213> 钙蛋白酶-1(Calpain-1)

<400> 2

Lys Leu Ala Thr Met Ala Glu Glu Val Ile Thr Pro Val Tyr Cys Thr

1 5 10 15

Gly Val Ser Ala Gln Val Gln Lys Leu Arg Ala Lys Glu Leu Gly Leu

20 25 30

Gly Arg His Glu Asn Ala Ile Lys Tyr Leu Gly Gln Asp Tyr Glu Gln

35 40 45

Leu Arg Ala His Cys Leu Gln Ser Gly Ser Leu Phe Arg Asp Glu Ala

50 55 60

Phe Pro Pro Val Pro Gln Ser Leu Gly Phe Lys Glu Leu Gly Pro Asn

65 70 75 80

Ser Ser Lys Thr Tyr Gly Val Lys Trp Lys Arg Pro Thr Glu Leu Phe

85 90 95

Ser Asn Pro Gln Phe Ile Val Asp Gly Ala Thr Arg Thr Asp Ile Cys

100 105 110

Gln Gly Ala Leu Gly Asp Cys Trp Leu Leu Ala Ala Ile Ala Ser Leu

115 120 125

Thr Leu Asn Asp Thr Leu Leu His Arg Val Val Pro His Gly Gln Ser

130 135 140

Phe Gln Asn Gly Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Gln Leu Trp Gln Phe

145 150 155 160

Gly Glu Trp Val Asp Val Val Val Asp Asp Leu Leu Pro Thr Lys Asp

165 170 175

Gly Lys Leu Val Phe Val His Ser Ala Gln Gly Asn Glu Phe Trp Ser

180 185 190

Ala Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Val Asn Gly Ser Tyr Glu Ala

195 200 205

Leu Ser Gly Gly Ser Thr Ser Glu Gly Phe Glu Asp Phe Thr Gly Gly

210 215 220

Val Thr Glu Trp Tyr Glu Leu Arg Lys Ala Pro Ser Asp Leu Tyr Ser

225 230 235 240

Ile Ile Leu Lys Ala Leu Glu Arg Gly Ser Leu Leu Gly Cys Ser Ile

245 250 255

Asp Ile Ser Ser Val Leu Asp Met Glu Ala Val Thr Phe Lys Lys Leu

260 265 270

Val Lys Gly His Ala Tyr Ser Val Thr Gly Ala Lys Gln Val Asn Tyr

275 280 285

Gln Gly Gln Met Val Asn Leu Ile Arg Met Arg Asn Pro Trp Gly Glu

290 295 300

Val Glu Trp Thr Gly Ala Trp Ser Asp Gly Ser Ser Glu Trp Asn Gly

305 310 315 320

Val Asp Pro Tyr Gln Arg Asp Gln Leu Arg Val Arg Met Glu Asp Gly

325 330 335

Glu Phe Trp Met Ser Phe Arg Asp Phe Leu Arg Glu Phe Thr Arg Leu

340 345 350

Glu Ile Cys Asn Leu Thr Pro Asp Ala Leu Lys Ser Gln Arg Val Arg

355 360 365

Asn Trp Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Gly Thr Trp Arg Arg Gly Ser Thr

370 375 380

Ala Gly Gly Cys Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Phe Trp Val Asn Pro Gln

385 390 395 400

Phe Lys Ile Arg Leu Glu Glu Thr Asp Asp Pro Glu Asp Asp Tyr Gly

405 410 415

Gly Arg Glu Ser Gly Cys Ser Phe Val Leu Ala Leu Met Gln Lys His

420 425 430

Arg Arg Arg Glu Arg Arg Phe Gly Arg Asp Met Glu Thr Ile Gly Phe

435 440 445

Ala Val Tyr Glu Val Pro Pro Glu Leu Val Gly Gln Pro Val His Leu

450 455 460

Lys Arg Asp Phe Phe Leu Ala Asn Ala Ser Arg Ala Arg Ser Glu Gln

465 470 475 480

Phe Ile Asn Leu Arg Glu Val Ser Thr Arg Phe Arg Leu Pro Pro Gly

485 490 495

Glu Tyr Val Val Val Pro Ser Thr Phe Glu Pro Asn Lys Glu Gly Asp

500 505 510

Phe Val Leu Arg Phe Phe Ser Glu Lys Lys Ala Gly Thr Gln Glu Leu

515 520 525

Asp Asp Gln Val Gln Ala Ile Leu Pro Asp Glu Gln Val Leu Ser Glu

530 535 540

Glu Glu Ile Asp Glu Asn Phe Lys Ala Leu Phe Arg Gln Leu Ala Gly

545 550 555 560

Glu Asp Met Glu Ile Ser Val Arg Glu Leu Arg Thr Ile Leu Asn Arg

565 570 575

Ile Ile Ser Lys His Lys Asp Leu Arg Thr Lys Gly Phe Ser Leu Glu

580 585 590

Ser Cys Arg Ser Met Val Asn Leu Met Asp Arg Asp Gly Asn Gly Lys

595 600 605

Leu Gly Leu Val Glu Phe Asn Ile Leu Trp Asn Arg Ile Arg Asn Tyr

610 615 620

Leu Ser Ile Phe Arg Lys Phe Asp Leu Asp Lys Ser Gly Ser Met Ser

625 630 635 640

Ala Tyr Glu Met Arg Met Ala Ile Glu Ser Ala Gly Phe Lys Leu Asn

645 650 655

Lys Lys Leu Phe Glu Leu Ile Ile Thr Arg Tyr Ser Glu Pro Asp Leu

660 665 670

Ala Val Asp Phe Asp Asn Phe Val Cys Cys Leu Val Arg Leu Glu Thr

675 680 685

Met Phe Arg Phe Phe Lys Thr Leu Asp Thr Asp Leu Asp Gly Val Val

690 695 700

Thr Phe Asp Leu Phe Lys Trp Leu Gln Leu Thr Met Phe Ala His His

705 710 715 720

His His His His

<210> 3

<211> 2048

<212> DNA

<213> PEDV OH851 S1 (S1)

<400> 3

atgaagtctc tgaactattt ttggctgttt ctgccggtgc tgtctactct gagcctgccg 60

caagacgtta cccgctgtca gagcaccatc aacttccgcc gtttcttttc caaattcaat 120

gtgcaggccc ctgccgtcgt ggttctgggt ggttacctgc cgtccatgaa ctcttccagc 180

tggtactgtg gcaccggcct ggaaaccgca tccggtgtac acggcatttt cctgtcttac 240

atcgatgcag gccagggttt cgaaatcggt atcagccagg agccgtttga cccttctggc 300

tatcagctgt acctgcataa agccaccaac ggcaaccata acgctatcgc tcgcctgcgc 360

atttgtcagt tcccggataa caaaaccctg ggtccgaccg tcaacgatgt tactaccggt 420

cgtaactgcc tgtttaataa ggcgatcccg gcttacatgc aggacggtaa gaacatcgtt 480

gtaggtatta cgtgggataa cgaccgtgtc acggtgttcg cggataagat ctaccacttc 540

tacctgaaaa acgactggtc ccgtgtcgca acccgctgct acaataaacg ttcctgtgct 600

atgcagtacg tgtacacccc gacttactat atgctgaacg taacctccgc aggcgaagac 660

ggcatttatt acgaaccgtg tacggcgaac tgctctggct atgccgctaa cgtgttcgcc 720

accgactcta acggccacat ccctgagggt ttttccttca acaactggtt tctgctgtcc 780

aacgattcca ccctgctgca tggtaaagtg gtttctaacc agccgctgct ggtaaactgc 840

ctgctggcga ttcctaaaat ctatggcctg ggtcagtttt tcagcttcaa ccaaaccatg 900

gacggtgtat gcaacggtgc ggctgctcag cgtgcaccgg aagcactgcg cttcaacatc 960

aacgatacct ctgttatcct ggcggaaggc tccatcgtac tgcacacggc tctgggtacc 1020

aacctgtcct tcgtttgcag caactctagc gacccgcatc tggctacttt tgccatcccg 1080

ctgggtgcca ctcaggtacc atattattgc ttcctgaaag ttgatactta caatagcacc 1140

gtctacaaat ttctggcagt tctgccgcca acggtgcgtg agatcgtaat caccaaatac 1200

ggcgatgtat atgttaatgg ttttggttat ctgcacctgg gtctgctgga cgctgttacc 1260

attaacttca ccggccacgg tactgacgac gacgtcagcg gcttctggac tattgcctcc 1320

accaactttg tagatgcgct gatcgaagtt cagggtaccg caattcagcg tatcctgtac 1380

tgtgacgacc cagtgtctca gctgaaatgc agccaagtag cattcgatct ggacgacggc 1440

ttctatccaa tcagcagccg caatctgctg tctcacgaac agccgatcag ctttgttacc 1500

ctgccgtcct ttaacgacca ctccttcgtt aatatcaccg tttctgcttc cttcggtggt 1560

cacagcggcg ctaacctgat tgcttccgac accaccatta acggtttctc cagcttctgc 1620

gttgataccc gtcagttcac catctctctg ttttataacg tgaccaacag ctatggttac 1680

gtcagcaaaa gccaagatag caactgcccg ttcactctgc agagcgtaaa cgattacctg 1740

tctttctcta aattctgcgt atctactagc ctgctggcca gcgcgtgtac catcgacctg 1800

tttggctacc cagagtttgg cagcggtgtc aaattcacct ccctgtactt tcagttcact 1860

aagggcgaac tgatcaccgg taccccgaaa ccgctggaag gcgtaaccga cgtctccttt 1920

atgacgctgg atgtttgcac caaatatacc atctatggtt tcaaaggtga gggtatcatt 1980

accctgacta actctagctt cctggcgggc gtttactata ctagcgactc cggccaactg 2040

ctggcgtt 2048

<210> 4

<211> 2373

<212> DNA

<213> PEDV CV777 S1(S1)

<400> 4

ggatccatgc gttctctgat ctatttctgg ctgctgctgc ctgttctgcc tacgctgagc 60

ctgccgcagg acgtgactcg ttgccagtct acgacgaatt tccgtcgctt cttctctaaa 120

ttcaacgttc aggcaccggc ggttgttgtt ctgggcggct acctgccatc catgaactct 180

agctcctggt actgtggtac cggtatcgaa actgcgtctg gcgttcacgg tattttcctg 240

tcctacattg actctggtca gggtttcgag atcggcatct ctcaggaacc gttcgatccg 300

tctggctacc agctgtacct gcacaaagca actaacggca acaccaacgc aatcgctcgt 360

ctgcgtatct gtcagtttcc ggacaacaaa accctgggcc cgacggtgaa cgatgtaact 420

accggccgta actgtctgtt caacaaggcg atcccggcgt acatgcgcga cggtaaagac 480

atcgttgttg gcattacctg ggacaacgac cgtgtgactg tattcgcaga caagatctac 540

cacttctatc tgaaaaacga ctggtctcgt gttgcgaccc gttgttacaa ccgtcgtagc 600

tgcgccatgc aatacgtgta caccccgacc tactacatgc tgaacgtaac ctctgccggc 660

gaagacggta tctactacga accgtgtact gccaactgca ccggttacgc tgctaacgtt 720

ttcgctaccg attccaacgg ccatatccca gaaggcttct ctttcaacaa ttggtttctg 780

ctgtctaacg atagcaccct gctgcatggt aaagttgttt ccaaccagcc gctgctggtt 840

aactgcctgc tggccatccc gaaaatctac ggtctgggtc agttcttcag cttcaaccac 900

accatggacg gtgtttgtaa cggtgcagcc gtggaccgtg cgccggaagc tctgcgtttt 960

aacattaacg acacctctgt tattctggcg gaaggctcca ttgtactgca taccgcactg 1020

ggtactaacc tgagcttcgt ttgttccaat tctagcgacc cgcacctggc gatcttcgct 1080

attccgctgg gcgccactga agtgccgtac tattgctttc tgaaagtaga cacctataac 1140

tctactgtat acaaattcct ggccgtcctg ccgccgactg tgcgtgaaat tgtgattact 1200

aaatacggcg atgtttatgt caacggcttc ggttatctgc acctgggtct gctggacgcg 1260

gtgaccatca acttcactgg tcacggcacc gatgacgatg tatccggctt ctggaccatc 1320

gccagcacga acttcgttga cgcgctgatc gaagtccaag gcacgtccat tcagcgtatc 1380

ctgtactgtg acgatccggt atcccagctg aaatgctctc aggtcgcttt tgatctggat 1440

gacggttttt accctatttc tagccgtaac ctgctgtccc acgaacagcc gatttccttt 1500

gtcaccctgc cgtcctttaa cgaccattct tttgtgaaca tcactgtcag cgcagcattt 1560

ggtggtctgt cttctgcgaa cctggtcgcg tctgacacta ctattaatgg cttctccagc 1620

ttctgcgtcg atactcgtca gttcaccatc actctgttct acaacgtcac taactcctac 1680

ggttatgtaa gcaaaagcca ggatagcaac tgcccgttca ctctgcagtc cgttaacgat 1740

tacctgtctt tctccaaatt ctgtgtttct acctctctgc tggcaggcgc ttgtacgatc 1800

gatctgttcg gctatccagc tttcggctct ggtgttaaac tgacgtccct gtatttccag 1860

tttacgaaag gcgaactgat cacgggtact ccaaaaccgc tggaaggcat tactgatgtt 1920

agcttcatga ccctggacgt ttgcaccaaa tatactatct atggtttcaa aggtgagggc 1980

atcattactc tgaccaactc ttccattctg gccggtgttt attacaccag cgactccggc 2040

cagctgctgg cgtttaagaa cgttaccagc ggtgcggtgt actctgtgac cccgtgttcc 2100

tttagcgaac aggcagcgta tgttaacgac gacattgtcg gcgtcatttc ttccctgtct 2160

aattccacct tcaacaacac tcgtgaactg ccgggtttct tttaccactc taacgacggc 2220

tctaactgta ctgaaccagt gctggtttac agcaacattg gcgtttgtaa aagcggttcc 2280

atcggttacg taccgtccca gtacggtcag gtcaaaatcg caccgaccgt cactggtaac 2340

atctctatcc caaccaactt ctcctaactc gag 2373

Claims

1.一种钙蛋白酶-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.核酸或基因，其编码权利要求1所述的钙蛋白酶-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.表达盒、重组载体或细胞系，其含有权利要求2所述的核酸或基因。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将权利要求2所述的核酸或基因插入到真核表达载体中得到含有猪钙蛋白酶-1的基因的表达载体。

5.一种重组蛋白表达细胞系，其特征在于，所述细胞系是通过将权利要求4所述的重组载体转入宿主细胞后获得。

6.一种重组钙蛋白酶-1，其特征在于，所述重组钙蛋白酶-1是通过将权利要求4所述的表达载体转入后表达、纯化获得。

7.权利要求1所述的猪钙蛋白酶-1、权利要求2所述的核酸或基因、权利要求3所述的表达盒、重组载体或细胞系在生产重组钙蛋白酶-1中的应用。

8.一种重组钙蛋白酶-1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）编码钙蛋白酶-1的基因的获得；

2）将编码钙蛋白酶-1的基因导入载体中获得表达载体；

3）将表达载体转染细胞后进行纯化即得。

9.权利要求1所述的猪钙蛋白酶-1、权利要求2所述的核酸或基因、权利要求3所述的表达盒、重组载体或细胞系，权利要求5所述的细胞系，权利要求6所述的重组钙蛋白酶-1在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒相关疾病的药物或饲料添加剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用通过裂解PEDV S1蛋白而实现。