CN110746501A - 猪白细胞介素11在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种猪白细胞介素11及其在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的用途，猪流行性腹泻感染后，仔猪肠道分泌明显升高的细胞因子猪pIL‑11，该细胞因子的表达与病毒感染水平具有高度相关性。本发明公开了构建重组pIL‑11的原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21，以及纯化获得高纯度重组pIL‑11的具体方法。重组pIL‑11能够抑制PEDV对宿主细胞的感染，并具有明显的剂量依赖性。重组pIL‑11通过激活STAT3信号，抑制PEDV感染后诱导的宿主细胞凋亡，进而发挥抵抗病毒感染的作用。猪源IL‑11兼具抵抗病毒感染和缓解仔猪肠道损伤的功能，未来有望成为一种有效抵抗PEDV肠道感染的药物。

Description

猪白细胞介素11在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的用途

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，涉及猪白细胞介素11的抗病毒用途，具体涉及猪白细胞介素11在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的用途。

背景技术

1、猪白细胞介素11的研究进展

白细胞介素IL-11(Interleukin-11，IL-11)属于IL-6家族成员，其可由体内多种细胞，如免疫细胞、成纤维母细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、上皮细胞和骨髓基质细胞所分泌。最初有关IL-11生理作用的研究主要集中在其对造血功能、T、B淋巴细胞免疫功能以及神经系统发育的调节作用等方面。近年来的一些研究表明IL-11在肠道黏膜屏障的维护中同样扮演重要作用，其能在多种原因造成的肠道损伤中，发挥抗凋亡、促增殖、抑制炎症性损伤和营养肠上皮细胞等保护作用。例如在物理性肠损伤中(中子照射或缺血性肠坏死)，IL-11能够抑制肠上皮的凋亡，并促进肠道隐窝细胞的增殖，进而缓解肠道损伤；而在炎症性肠病(IBD)和新生儿坏死性肠炎(NEC)中，IL-11具有明显抗炎作用，能够通过抑制促炎症因子TNF-a，IL-1β和IL-6的产生缓解肠道损伤。但目前对IL-11的研究主要集中在人和小鼠，猪IL-11是否具有类似功能的尚不清楚。

2、猪白细胞介素11在抗病毒PEDV感染中的作用

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以仔猪呕吐，水样腹泻和急性脱水为主要致病症状的高度接触传染性消化道疾病，近年来该病的暴发给我国乃至全球的养猪业都造成了巨大的经济损失。研究表明哺乳仔猪感染PEDV高死亡率的主要原因在于：哺乳仔猪肠道黏膜先天性免疫水平较低，病毒感染后能够迅速建立感染，大量繁殖后造成肠道的炎性损伤，导致仔猪出现明显的肠道物质吸收障碍，最终引起仔猪的脱水性死亡。因此在提高仔猪肠道黏膜的先天性免疫水平的同时，缓解PEDV感染造成的肠道炎性损伤，对于降低PEDV引起哺乳仔猪腹泻后的高死亡率具有重要意义。目前也并没有研究表明IL11是否能够缓解PEDV的所引起的肠道炎性损伤。

发明内容

本发明人首次发现PEDV感染Vero E6细胞后能够明显促进IL-11的转录、表达和分泌。通过动物实验验证，发现感染PEDV的仔猪肠道黏膜的IL-11同样明显升高，并且IL-11的分泌水平与PEDV的感染进程具有明显相关性。进一步的研究显示，重组猪IL-11能够抑制PEDV干扰Vero E6细胞，并具有明显的量效关系。研究发现，IL-11发挥抗病毒作用主要是通过激活IL-11/IL-11R/STAT3信号通路，进而抑制病毒诱导的宿主细胞凋亡实现的。

因此，本发明所要解决的技术问题是提供了一种猪白细胞介素11。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种编码所述的猪白细胞介素11的基因或核酸。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体、细胞或重组菌株。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种重组质粒pET-32a(+)-pIL-11的构建。

本发明还要解决的技术问题是提供了猪白细胞介素11、所述的猪白细胞介素11的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、细胞或重组菌株在生产重组猪白细胞介素11中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了所述的猪白细胞介素11、所述的猪白细胞介素11的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体或细胞，所述的宿主细胞，所述的重组蛋白在制备抗病毒药物中的应用和抗凋亡和激活IL-11/IL-11R/STAT3信号通路的药物中的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种猪白细胞介素11，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了编码所述的猪白细胞介素11的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明还提供了表达盒、重组载体、细胞或重组菌株，其含有所述的核酸或基因。

其中，所述重组载体是将所述的核酸或基因插入到大肠杆菌表达载体中得到含有猪白细胞介素11的基因的表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞是将所述的重组表达载体导入细胞中得到。

本发明还提供了一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白是通过所述的宿主细胞表达得到。

本发明还提供了所述的猪白细胞介素11、所述的猪白细胞介素11的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、细胞或重组菌株在生产重组猪白细胞介素11中的应用。

本发明还提供了所述的猪白细胞介素11、所述的猪白细胞介素11的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、细胞或重组菌株，所述的宿主细胞，所述的重组蛋白在制备抗病毒药物中的应用。

其中，所述病毒为猪流行性腹泻病毒。

本发明还提供了所述的猪白细胞介素11、所述的猪白细胞介素11的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、细胞或重组菌株，所述的宿主细胞，所述的重组蛋白在制备抗凋亡和激活IL-11/IL-11R/STAT3信号通路的药物中的应用。

附图说明

图1：PEDV感染后促进Vero E6细胞IL-11的表达。PEDV(MOI＝0.1)感染Vero E6细胞后，收集细胞总RNA，总蛋白和细胞上清。(A)荧光定量检测Vero E6细胞中IL-11mRNA的转录水平；(B)ELISA法测定上清液中IL-11蛋白的表达；(C)Western-blot检测Vero E6细胞中IL-11蛋白的表达。(D)Western-blot灰度值的统计。

图2：PEDV对仔猪小肠黏膜IL-11分泌的影响。(A)PEDV口服攻毒后发病仔猪的剖检观察。(B)PEDV病毒在仔猪小肠组织中的分布。(C)仔猪空肠组织的病理切片和免疫组化染色(PEDV N蛋白作为1抗)。黑色箭头代表了PEDV抗原阳性的细胞。标尺，20微米。(D)免疫荧光染色显示PEDV感染后，仔猪空肠中PEDV与IL-11的分布。蓝色，细胞核；绿色，PEDV N蛋白；红色，IL-11。标尺，25微米。进一步采集PEDV口服感染后，不同时间点仔猪的空肠组织，同时采集口服等量DMEM培养基仔猪的空肠组织作为阴性对照。(E)荧光定量PCR检测口服攻毒组和阴性对照组仔猪空肠中IL-11mRNA的表达水平。(F)ELISA检测攻毒组(24h、48h、60h)和阴性对照组仔猪空肠涮洗液中IL-11的分泌情况。(G)PEDV感染Vero E6细胞后病毒基因水平与IL-11转录水平的相关性分析；(H)PEDV感染仔猪后，空肠中病毒基因水平与IL-11转录水平的相关性分析；G图和H图中实线代表线性增长趋势；r值代表相关性系数；通过皮尔逊相关性分析确定r值；独立t检验确定p值。

图3：构建的大肠杆菌重组表达质粒pET-32a(+)-pIL-11示意图；

图4：重组猪白细胞介素11的SDS-PAGE电泳图；(A)泳道1：空pET-30a载体的总蛋白。2：含His-Trx-pIL-11的蛋白上清液；3：亲和性His-Trx-pIL-11纯化的蛋白；4：肠激酶消化后未标记的pIL-11蛋白。(B)通过Western-blot验证图4A中1-4泳道蛋白His标签的表达。

图5：pIL-11对PEDV复制的影响。使用不同浓度重组猪白细胞介素11预处理VeroE6细胞18h。(A)空斑试验检测培养上清液中病毒滴度；(B)Western-blot检测PEDV感染24小时后各处理组Vero E6细胞中PEDV核衣壳(N)蛋白表达，内参为GAPDH。

图6：干扰IL-11对PEDV复制的影响。(A)通过Western-blot验证2株稳定转染针对不同靶点IL-11shRNA的Vero E6细胞中IL-11的表达，IL-11的表达量以GAPDH进行校正，各细胞组的灰度比值记录在图下方。NC，KD1和KD2分别代表shRNA阴性对照，shRNA-IL-11-1和shRNA-IL-11-2稳定转染的Vero E6细胞；(B)空斑试验检测NC，KD1和KD2细胞上清中病毒滴度；(C)Western-blot检测病毒在NC，KD1和KD2细胞中蛋白表达；(D)空斑形成试验检测病毒的滴度；(E)荧光定量PCR检测病毒的RNA表达水平。

图7：pIL-11通过IL-11/IL-11R/STAT3信号途径抑制PEDV感染。(A)Western-blot检测不同浓度pIL-11(0到100ng/ml)处理以及稳定干扰IL-11表达后，Vero E6细胞中IL-11信号通路下游STAT3，AKT和ERK的活化情况，以GAPDH作为内参蛋白进行校正；(B)各处理组Vero E6细胞中STAT3，AKT和ERK总蛋白和磷酸蛋白表达量的统计结果；(C)使用50ng/mlpIL-11预处理Vero E6细胞18h后，分别使用STAT3磷酸化抑制剂S3I-201(20μM)，PI3K抑制剂LY294002(20μM)和AKT磷酸化抑制剂MK-22062HCl(10μM)处理Vero E6细胞，接种PEDV到各处理组的Vero E6细胞中，通过空斑试验检测不同组病毒滴度。(D)Western-blot检测STAT3磷酸化抑制剂S3I-201处理后，pIL-11对Vero E6中STAT3磷酸化和PEDV N蛋白表达的影响。

图8：IL-11/IL-11R/STAT3信号途径对PEDV诱导Vero E6细胞凋亡的影响。(A)使用不同浓度pIL-11预处理Vero E6细胞后，加入STAT3抑制剂或DMSO对照处理24h后接种PEDV，36h后收获Vero E6细胞，使用Annexin V和PI双染检测细胞凋亡情况，并进行FACS分析；(B)对A图中不同处理组各象限的百分比进行统计；(C)通过荧光定量PCR检测pIL-11以及STAT3抑制剂处理后，PEDV感染对细胞凋亡相关基因Bcl2，Mcl-1和Bcl-W转录的影响。

具体实施方式

现在详细地参照本发明的代表性实施方案描述本发明。这些实施方案仅仅是例示性的，不应理解为以任何方式限制本发明的范围。相反地，本发明意图涵盖权利要求书所限定的在本发明范围内的所有替代、修改和等同。

除非另外指明，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：

材料：Vero E6细胞；人工感染仔猪的小肠黏膜；大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自诺唯赞生物科技有限公司；pET-32a(+)质粒购自Life Technologies；

试剂：DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)；胎牛血清(gibco公司)；0.25％胰酶(碧云天生物技术有限公司)；0.05％胰酶(碧云天生物技术有限公司)；TRIzol(宝日医生物技术北京有限公司)；氯仿(深圳三品科技公司)；DEPC水(武汉市盖云天生物技术有限公司)；无水乙醇(深圳三品科技公司)；反转录试剂包(诺唯赞生物有限公司)；荧光定量试剂包(诺唯赞生物有限公司)；10％蛋白预制胶(上海翊圣生物有限公司)；5×SDS-PAGE(武汉市盖云天生物技术有限公司)；IL-11ELISA检测试剂盒(南京翼飞雪生物有限公司)；L.M.P低熔点琼脂糖胶(Thermo Fisher Scientific公司)；OMEGA质粒提取试剂盒(广州飞扬生物工程有限公司)；OMEGA无内毒素小量质粒提取试剂盒(广州飞扬生物工程有限公司)；琼脂糖(上海翊圣生物有限公司)；50×TAE(南京寿德生物科技有限公司)；pMD18-T载体(宝日医生物技术北京有限公司)；人IL-11多克隆抗体(Abcam公司)；PEDV-N蛋白单克隆抗体；Western一抗二抗去除液(碧云天生物技术有限公司)；过氧化物酶标记山羊抗兔(上海翊圣生物有限公司)；过氧化物酶标记山羊抗鼠(上海翊圣生物有限公司)；氨苄青霉素(广州飞扬生物工程有限公司)；

II One Step(南京诺唯赞生物科技有限公司)；RNAios Plus(宝生物工程(大连)有限公司)；Agarose Gel DNA Purification Kit(宝生物工程(大连)有限公司)；限制性内切酶(宝生物工程(大连)有限公司)；反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)。

实施例1 PEDV感染后对IL-11分泌的影响

1、PEDV感染对Vero E6细胞IL-11分泌的影响

使用MOI＝0.1PEDV感染Vero E6细胞后，于不同时间分别收取细胞RNA(Trizol法)和蛋白样品(RIPA裂解)以及细胞上清。通过荧光定量PCR检测病毒感染不同时间点Vero E6细胞中IL-11mRNA的表达，IL-11的定量引物和内参基因GAPDH的引物见表1。结果表明PEDV感染后不同时间(8h，24h，36h和48h)，Vero E6细胞中IL-11mRNA的表达水平相比于阴性对照组(Mock)均显著升高，其中PEDV感染24h后IL-11mRNA的表达水平与对照组相比具有极显著差异(P＜0.01)(图1A)。使用ELISA方法检测细胞上清中IL-11的分泌水平，结果显示PEDV感染后Vero E6细胞培养基中IL-11的分泌水平均显著上升，其中24h的分泌量达到最高，到48h略有下降(图1B)。Western-blot方法检测细胞内IL-11蛋白的变化趋势(图1C)，所得条带经灰度分析后进行统计作图(图1D)，结果显示尽管PEDV感染能够促进胞内IL-11蛋白水平的升高，但其变化趋势与上清中IL-11的分泌具有较大差异，大量的IL-11在病毒感染48h后在细胞内积累，这说明PEDV感染后期可能影响了IL-11蛋白的释放。

表1

2、PEDV感染仔猪对空肠pIL-11分泌的影响

通过体内攻毒试验进一步验证IL-11表达与PEDV感染的关系。5日龄仔猪口服感染PEDV(10⁶PFU/mL)54h后出现典型的PEDV症状，包括急性的水样腹泻，精神沉郁，食欲降低和呕吐，发病猪的肛门周围污染恶臭的水样粪便。口服感染60h后剖检腹泻仔猪，可见仔猪的小肠膨胀，肠壁变薄，且肠腔中充满了黄色的水样内容物，个别小肠黏膜还存在散在出血点(图2A)，通过荧光定量PCR检测后发现PEDV在空肠中的含量要显著高于十二指肠和回肠(图2B)，使用PEDV囊膜基因(M)定量引物，引物序列见下表。将空肠组织固定并制作病理切片后，经HE染色后可见发病仔猪的肠绒毛萎缩、融合，上皮细胞的纹状缘不规则缺损(图2C)，经免疫组化检测可见空肠绒毛上皮细胞中有大量的PEDV病毒抗原的存在。进一步通过免疫荧光染色可见在PEDV阳性的肠上皮细胞(绿色)中有IL-11的高表达(红色)(图2D)。随后我们采集了PEDV攻毒后不同时间仔猪空肠组织样品，通过荧光定量PCR和ELISA分别检测了PEDV感染后空肠中组织和涮洗液中IL-11mRNA(IL-11荧光定量检测的引物及GAPDH内参基因引物见表2)和蛋白水平的表达，结果显示随着PEDV感染的进展，IL-11的表达水平逐渐升高(图2E和2F)。进一步为验证PEDV感染与IL-11表达的相关性，对PEDV感染后PEDV M基因的拷贝数(Vero E6细胞和空肠组织)与IL-11基因的拷贝数进行Spearman相关性分析，结果显示PEDV感染与IL-11的表达具有正相关性(图2G和2F)。

表2

实施例2重组质粒pET-32a(+)-pIL-11的构建

1、重组猪白细胞介素11基因片段的获得

使用Trziol法从猪小肠提取总mRNA，按照反转录试剂包说明书，合成总cDNA。通过引物扩增cDNA中猪IL-11的cDNA，参考NCBI中猪IL-11mRNA(XM_021095008.1)设计引物如下：

P1：GTGGTGGTGCTCGAGCAGCCGAGTCTT(SEQ ID NO：17)

P2：GCTGATATCGGATCCATGAACAGTGTTT(SEQ ID NO：18)

以上引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成。

2、重组质粒pET-32a(+)-pIL-11的构建

利用猪肠道cDNA成功扩增出全长600bp的IL-11基因片段后，经琼脂糖凝胶电泳后回收，使用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切片段后，通过T4连接酶与线性化的pET-32载体相连。将连接产物转化到BL21感受态细菌中，转化方法如下：从负70度冰箱中取出商品化的感受态细菌，冰上融化后按体积比1∶10的比例加入构建好的新质粒，冰上作用30min后，放到42℃的温水中热激45秒，然后迅速放到冰中静置3-5min。加入1ml无抗性的普通液体LB，在摇床中以180rpm，37℃的条件摇晃45min。摇晃结束后以5000rpm的速度离心3min，然后在超净台中吸走900μl的上清，剩余100μl体积的LB用于重悬沉淀。将重悬后的液体滴加到氨苄抗性的LB平板中，涂布均匀，置于37℃培养箱中培养过夜。通过菌落PCR获得阳性点后，摇菌后送金斯瑞测序，测序结果见SEQ ID NO：1，最终成功构建pET-32a(+)-pIL-11融合表达质粒如图3所示。

本发明分别从猪小肠组织样品以及猪回肠上皮细胞IPI-2I扩增猪IL-11cDNA序列，测序后发现与NCBI上已有猪IL-11的cDNA序列(XM_021095008.1)同源性只有87.1％，由于NCBI上猪IL-11的mRNA序列为预测序列，因此本发明中获得的猪IL-11cDNA序列应为猪IL-11的实际序列。

实施例3表达猪白细胞介素11重组大肠杆菌E.coli BL21的验证

将构建好的猪IL-11重组菌挑取单菌落接种到5ml具有氨苄抗性(50μg/m1)的液体LB中，在摇床中以180rpm，37℃的条件摇晃过夜，取500μl过夜培养的菌液于100ml新的具有氨苄抗性(50μg/ml)LB液体培养基中，以相同条件培养至OD600为0、6、8。此时开始进行分组培养，实验组加入终浓度为1mmol/L的IPTG，对照组不加，以相同条件在摇床中诱导培养6h。然后，取出菌液，8000rpm离心5min，收集细菌，用1×PBS缓冲液悬浮。冰上超声波破碎，功率300W，工作4s停止6s，总时间3min，4℃，12000rpm，离心破碎后的菌液10min，分离上清和沉淀，取100μl上清与等体积的2×上样缓冲液混合，沸水加热10min，进行SDS-PAGE检测。

通过SDS-PAGE和Western-blot分析，我们成功利用原核表达系统表达出重组猪IL-11，未切除TRX和His标签的目标蛋白大小为39.6Kda，经纯化后，经肠激酶(EK)在37℃下裂解4h后目标蛋白大小为22(图4A)。3Kda(图4B)，纯度为95.7％。通过用小鼠抗his单克隆抗体Western-blot技术分析进一步确定表达的蛋白为pIL-11。

实施例4猪pIL-11对PEDV感染Vero E6细胞的影响

将不同浓度的重组pIL-11(实施例3中纯化获得，纯度95.7％)以提前处理18h的方式加入Vero E6细胞，18h后按MOI＝0.1的量对Vero E6细胞进行PEDV接毒。通过病毒空斑实验分析(图5A)，我们发现，pIL-11可以抑制病毒释放，且存在一定的剂量依赖性。与对照组Vero E6细胞相比，用1ng、10ng、100ng重组pIL-11预处理的细胞病毒释放量显著下降(0.01＜P＜0.05)，但400ng预处理组则不存在显著性差异。通过Western-blot技术及其灰度分析(图5B)，我们发现，PEDV在细胞中的含量随着预处理pIL-11的剂量增加而降低，说明pIL-11对PEDV的感染具有抑制作用，且存在剂量依赖性。

实施例5干扰IL-11对细胞系的PEDV的复制量的影响

筛选稳定转染IL-11干扰质粒shRNA-IL-11-1和shRNA-IL-11-2的Vero E6细胞系(KD1和KD2)后，通过Western-blot鉴定IL-11的干扰效果(图6A)，选取了当中干扰效果显著的一株细胞系(KD1)进行后续实验。按MOI＝0.1的病毒含量接种PEDV至KD1细胞后，通过空斑形成试验和Western-blot技术检测PEDV病毒含量(图6B和图6C)。结果显示干扰IL-11的表达后，Vero E6细胞上清中PEDV的滴度和胞内病毒蛋白的表达都明显升高(P＜0.01)。随后我们又使用pIL-11(实施例3中纯化获得，纯度＞95％)预处理KD1细胞，结果显示pIL-11处理能够明显抑制PEDV在KD1细胞中的复制(图6D和图6E)。

实施例6 IL-11通过IL-11/IL-11R/STAT3信号途径抑制PEDV感染

当IL-11与IL-11R受体结合时，会激活多条信号通路。为了确定哪条通路能够参与到与IL-11对PEDV感染的抑制作用，我们分别检测了不同浓度的IL-11(范围从0到100ng/ml)分别处理Vero E6细胞，以及IL-11稳定干扰细胞系KD1和KD2下游重要激酶分子的激活情况。

结果表明，pIL-11可以诱导Vero E6细胞中的Akt(Ser 473)和STAT3(Ser727和Tyr705)的磷酸化，并且和pIL-11的剂量具有明显的量效关系。同样，Akt和STAT3的磷酸化在IL-11表达受干扰的KD1和KD2细胞中受到明显抑制。但是，pIL-11处理和IL-11敲低(KD1和KD2)均不能引起ERK磷酸化水平的明显变化(图7A和7B)。以上结果表明pIL-11可以激活Vero E6细胞中的Akt(Ser 473)和STAT3(Ser727和Tyr705)的磷酸化。

为了确定IL-11对PEDV的抑制具体与具体哪条信号通路的激活相关，IL-11刺激后，我们使用了三种信号通路抑制剂(均购自Selleck公司)，包括S3I-201(STAT3特异性抑制剂)、LY294002(PI3K特异性抑制剂)和MK2206(AKT特异性抑制剂)处理Vero E6细胞后，接种PEDV再次检测病毒的复制水平。结果表明STAT3抑制剂S3I-201处理后，能够明显逆转pIL-11诱导产生的抗病毒作用(图7C)，但是LY294002和MK2206两种抑制剂处理后并没有类似效果。此外Western-blot结果进一步表明，S3I-201处理后可以显著干扰pIL-11刺激引起的STAT3磷酸化和抗病毒活性(图7D)。这些结果表明pIL-11可能通过激活IL-11/IL-11R/STAT3信号通路抑制PEDV感染。

实施例7 pIL-11抑制PEDV感染后诱导的宿主细胞凋亡

IL-11可以抑制小肠粘膜的凋亡，还可以促进小肠黏膜的修复。PEDV诱导的细胞凋亡可以促进病毒复制并且在发病过程中起着重要作用。经过IL-11处理后，采用Annexin V/PI流式细胞术定量评价PEDV诱导的细胞凋亡。在PEDV感染过程中，IL-11诱导的早期凋亡细胞百分比为9.78％～11.9％(图8A)，经过pIL-11预处理后能够显著降低PEDV感染诱导的早期凋亡细胞百分比。

接下来，我们研究了pIL-11诱导的抗凋亡功能是否由其下游STAT3信号通路所介导。Vero E6细胞经pIL-11及STAT3抑制剂处理后接种PEDV，并于36h收集细胞分子样，通过荧光定量PCR检测Vero E6细胞中抗凋亡基因Bcl-2、MCL-1和Bcl-W表达，荧光定量所用引物序列如下表3所示。结果表明pIL-11处理可诱导IL-11/IL-11R/STAT3信号通路下游的抗凋亡基因Bcl-2、MCL-1和Bcl-W的高表达，该作用具有明显的剂量依赖效应，而使用STAT3的抑制剂S3I-201确能够逆转IL-11的抗凋亡功能(图8A和B)。上述现象表明IL-11诱导的抗凋亡作用是通过STAT3信号通路发挥作用的，因此pIL-11能够通过激活STAT3信号通路阻断PEDV诱导的细胞凋亡，进而抑制PEDV的复制。

表3

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 猪白细胞介素11在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的用途

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 猪白细胞介素11(IL-11)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(600)

<400> 1

atg aac agt gtt tgt tgc ctg gtc ctg gtc gtg ctg agc ctg tgg cca 48

Met Asn Ser Val Cys Cys Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro

1 5 10 15

gat aca gct gtt gcc cct ggg cca cca cct ggc tcc cct cga gct tcc 96

Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Ser Pro Arg Ala Ser

20 25 30

cca gac cct cgg gcc gag ctg gac agc acc gtg ctc ctg acc cgc tct 144

Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser

35 40 45

ctc ctg gag gac acg cgg cag ctg act ata cag ctg aag gac aaa ttc 192

Leu Leu Glu Asp Thr Arg Gln Leu Thr Ile Gln Leu Lys Asp Lys Phe

50 55 60

cca gct gac ggg gac cac aac ctg gat tcc ctg ccc acc ctg gcc atg 240

Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met

65 70 75 80

agc gcg ggg gca ctg gga gct cta cag ctc ccg agt gtg ctg aca agg 288

Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Ser Val Leu Thr Arg

85 90 95

ctg cga gcg gac cta ctg tcc tac ctg cgg cat gtg cag tgg ctg cgt 336

Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg

100 105 110

cgg gca atg ggc tct tcc ctg aag acc ctg gag cca gag ctg ggc acc 384

Arg Ala Met Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr

115 120 125

ctg cag acc cgg ctg gac cgg ctg ctg cgc cgg ctg cag ctc ctg atg 432

Leu Gln Thr Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met

130 135 140

tcc cgc ctg gcc ctg ccc cag ctg ccc cca gac ccg ccg gcg ccc ccg 480

Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Leu Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro

145 150 155 160

ctg gcg ccc ccc tcc tca acc tgg ggg ggc atc agg gcc gcc cac gcc 528

Leu Ala Pro Pro Ser Ser Thr Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala

165 170 175

atc ctg ggg ggg ctg cac ctg aca ctt gac tgg gct gtg agg ggg cta 576

Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu

180 185 190

ctg ctg ctg aag act cgg ctg tga 600

Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu

195

<210> 2

<211> 199

<212> PRT

<213> 猪白细胞介素11(IL-11)

<400> 2

Met Ala Ser Val Cys Cys Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Thr Pro

1 5 10 15

Ala Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Ser Pro Ala Ala Ser

20 25 30

Pro Ala Pro Ala Ala Gly Leu Ala Ser Thr Val Leu Leu Thr Ala Ser

35 40 45

Leu Leu Gly Ala Thr Ala Gly Leu Thr Ile Gly Leu Leu Ala Leu Pro

50 55 60

Pro Ala Ala Gly Ala His Ala Leu Ala Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met

65 70 75 80

Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gly Leu Pro Ser Val Leu Thr Ala

85 90 95

Leu Ala Ala Ala Leu Leu Ser Thr Leu Ala His Val Gly Thr Leu Ala

100 105 110

Ala Ala Met Gly Ser Ser Leu Leu Thr Leu Gly Pro Gly Leu Gly Thr

115 120 125

Leu Gly Thr Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Met

130 135 140

Ser Ala Leu Ala Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Ala Pro Pro

145 150 155 160

Leu Ala Pro Pro Ser Ser Thr Thr Gly Gly Ile Ala Ala Ala His Ala

165 170 175

Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Ala Thr Ala Val Ala Gly Leu

180 185 190

Leu Leu Leu Leu Thr Ala Leu

195

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 上游同源臂(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgatatcg gatcc 15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 下游同源臂(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggtggtgc tcgag 15

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH-1的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 5

tcatcatctc tgccccttct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcatgagtc cctccacgat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> PEDV-M的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 7

atgcatgggc tagcttccag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> PEDV-M的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 8

gtagtgagaa gcgcgtcagt 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> IL-11的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 9

cccgagtgtg ctgacaagg 19

<210> 10

<211> 3

<212> DNA

<213> IL-11的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Bcl-2的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 11

atgtgtgtgg agagcgtcaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Bcl-2的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 12

gggccgtaca gttccacaaa 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Bcl-W的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaggtattg gtgagtcgga 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Bcl-W的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 14

ataaaccttg cacctctccc ag 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> MCL-1的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 15

gcaggtattg gtgagtcgga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> MCL-1 的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 16

ctgaaaacat ggaccatcac 20

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> P1(Artificial Sequence)

<400> 17

gtggtggtgc tcgagcagcc gagtctt 27

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> P2(Artificial Sequence)

<400> 18

gctgatatcg gatccatgaa cagtgttt 28

Claims (10)

1.一种猪白细胞介素11，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述的猪白细胞介素11的核酸或基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.表达盒、重组载体、细胞或重组菌株，其含有权利要求2所述的核酸或基因。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将权利要求2所述的核酸或基因插入到大肠杆菌表达载体中得到含有猪白细胞介素11的基因的表达载体。

5.一种宿主细胞，所述宿主细胞是将权利要求4所述的重组表达载体导入细胞中得到。

6.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白是通过权利要求5所述的宿主细胞表达得到。

7.权利要求1所述的猪白细胞介素11、权利要求2所述的猪白细胞介素11的核酸或基因、权利要求3所述的表达盒、重组载体、细胞或重组菌株在生产重组猪白细胞介素11中的应用。

8.权利要求1所述的猪白细胞介素11、权利要求2所述的猪白细胞介素11的核酸或基因、权利要求3所述的表达盒、重组载体、细胞或重组菌株，权利要求5所述的宿主细胞，权利要求6所述的重组蛋白在制备抗病毒药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病毒为猪流行性腹泻病毒。

10.权利要求1所述的猪白细胞介素11、权利要求2所述的猪白细胞介素11的核酸或基因、权利要求3所述的表达盒、重组载体、细胞或重组菌株，权利要求5所述的宿主细胞，权利要求6所述的重组蛋白在制备抗凋亡和激活IL-11/IL-11R/STAT3信号通路的药物中的应用。

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