CN108969762B - IgD-Fc-Ig融合蛋白用于制备治疗类风湿关节炎药物的应用 - Google Patents

IgD-Fc-Ig融合蛋白用于制备治疗类风湿关节炎药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了IgD‑Fc‑Ig融合蛋白用于制备治疗类风湿关节炎药物的应用，其中IgD‑Fc‑Ig融合蛋白如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

Description

IgD-Fc-Ig融合蛋白用于制备治疗类风湿关节炎药物的应用
技术领域
本发明涉及应用以IgD/IgDR为靶点，将人IgD-Fc段与人IgG-Fc段连接并合成的IgD-Fc-Ig融合蛋白治疗自身免疫病领域，尤其涉及IgD-Fc-Ig融合蛋白用于治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)药物的应用。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一类常见的、慢性自身免疫性疾病，其病理特征为关节滑膜组织炎性增生和关节软骨进行性破坏，全世界的发病率约为1％，其病因至今尚未真正明确。RA临床表现为多发性小关节炎，早期呈现手、腕、足等关节红、肿、热、痛和功能障碍，晚期可出现关节软骨和软骨下骨破坏，关节畸形和失去功能。我国RA的患病率约为0.5％，发病1年内未治疗的RA患者将有20％～30％导致永久性功能丧失，严重影响健康和生活质量，故临床上强调早期诊断早期治疗。目前临床用于治疗RA的药物主要有非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、激素类药、改善病情抗风湿药(disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs)以及生物制剂等。NSAIDs不能阻止RA的病情进展仅是对症治疗，缓解炎症的同时也产生较强胃肠道、肝肾等不良反应；激素类药不良反应多；DMARDs起效慢且不良反应多。近20年来利用生物技术针对细胞因子或受体制成的单抗类药物和融合蛋白类药物获得了较大发展，如TNF-α抑制剂，包括单抗类药物英利昔单抗(Infliximab)、阿达木单抗(Adalimumab)等及融合蛋白类药物依那西普(Etanercept)；IL-6受体单抗托西珠单抗(Tocilizumab)，CD20单抗利妥昔单抗(Rituximab)等，有较好疗效，但同时也抑制了细胞因子及其受体信号对细胞的生理调控功能，导致免疫功能抑制，造成感染发生率高和诱发肿瘤风险性高等不良反应。因此，在免疫反应中对过度活化T、B细胞的下调和抑制是高选择性免疫抑制药物的研究方向，发现特异性更高的RA治疗靶点、探究RA发病新机制、开发新型治疗药物具有十分重要的临床意义。
免疫球蛋白D(Immunoglobulin D,IgD)是1965年发现的免疫球蛋白，包括分泌型IgD(secreted IgD,sIgD)和膜结合型IgD(membrane IgD,mIgD)，mIgD比sIgD的C末端多了跨膜区和胞内区。相关研究提示：IgD虽然体内含量很少，但在免疫系统中发挥重要的调控作用，如增强IgM、IgG和IgA参与的保护性抗原反应；参与对抗外来病毒的入侵的粘膜免疫；参与记忆B细胞的生成与转化过程等。
临床发现，IgD在自身免疫病如RA、系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)等患者中异常升高。RA患者外周血中sIgD和mIgD水平均高于健康对照者，而且RA患者血清中高水平的sIgD与其血清中人可溶性核因子κB受体活化因子配基(nuclear factor-κB ligand,sRANKL)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平正相关。体外实验进一步发现sIgD能明显促进RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的增殖，促进外周血T细胞上早期活化标志CD69和共刺激信号分子CD40L(CD154)的表达，促进外周血成熟B细胞和浆细胞的百分比。这些发现均提示IgD可能在RA的T、B细胞活化中发挥重要作用。IgD在自身免疫病的免疫应答中具有重要作用，IgD水平的升高可导致炎症和免疫性组织损伤。
IgD需要通过与特异性膜受体即IgD受体(IgD receptor，IgDR)结合发挥功能，人类IgDR分子量约为70kDa，但至今IgDR尚未被克隆，编码基因序列仍未知，但能通过玫瑰花结实验及基于荧光标记的流式细胞术对其进行间接检测。利用流式细胞术检测到RA患者外周血T、B细胞以及关节组织中成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)表面上均有IgDR的表达，且相比健康对照者表达更高。体外实验发现sIgD可以诱导人T、B和FLS细胞上IgDR的表达异常增加。但IgD/IgDR相关功能尚不明确，关于IgD/IgDR相关信号通路的研究也很少。
综合已有文献报道和课题组前期实验结果，申请人推测IgD/IgDR通路可能与RA的发生发展密切相关，高表达IgD/IgDR可能成为治疗RA的理想靶点，研发针对IgD/IgDR为靶点的药物可能成为高选择性治疗RA的新策略。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种IgD-Fc-Ig融合蛋白用于制备治疗类风湿关节炎药物的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，IgD-Fc-Ig融合蛋白用于制备治疗类风湿关节炎(RA)药物的应用，IgD-Fc-Ig融合蛋白如SEQID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明研究了IgD-Fc-Ig融合蛋白的具体作用机制并确定其对类风湿关节炎(RA)的疗效，所涉及的IgD-Fc-Ig融合蛋白具有以下独特的优势：
(1)IgD-Fc-Ig融合蛋白主要阻断IgD与活化的T、B淋巴细胞上IgDR的结合，并不影响循环中IgD的水平；
(2)IgD-Fc-Ig融合蛋白是来源于人的DNA重组产物，基本没有免疫原性；
(3)IgD-Fc-Ig融合蛋白由于加入了IgG-Fc段，可以提高蛋白药物的半衰期，比单独的IgD-Fc重组蛋白稳定性好。
申请人通过流式细胞术检测配体IgD-Fc-Ig融合蛋白或IgD蛋白与其受体(IgDR)结合的亲和力，以及IgD-Fc-Ig与IgD竞争性结合IgDR受体的能力。本发明中IgD-Fc-Ig融合蛋白可以特异性的与IgDR结合，阻断过度表达的IgD与其受体的结合。结果显示：在CD4+T细胞上IgD-Fc-Ig融合蛋白结合IgDR的亲和力大于IgD结合IgDR，并且IgD-Fc-Ig融合蛋白可以与IgD竞争性的结合IgDR。
本发明的体外实验结果发现IgD可促进RA患者和健康人外周血中T细胞的增殖和活化，引起Th17/Treg细胞亚群的失衡。IgD-Fc-Ig融合蛋白能下调IgD引起的促T细胞增殖、活化作用，恢复IgD诱导的Th17/Treg细胞亚群的失衡，且IgD-Fc-Ig融合蛋白单独作用对T细胞活性无明显影响。
本发明通过II型胶原所致DBA/1雄性小鼠胶原性关节炎(collagen inducedarthritis,CIA)模型揭示了IgD-Fc-Ig融合蛋白对RA的治疗作用，以及药物起效剂量及相关的作用机制。
在实验中，造模d29小鼠足爪出现红肿，CIA组足爪红肿从d29到d58天，d35-d47为肿胀高峰。在d47-d58，IgD-Fc-Ig(3.25、6.5mg/kg)可明显降低CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数。d50后，IgD-Fc-Ig(13mg/kg)也降低CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数。IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)组以及IgG-Fc(13mg/kg)阴性对照组对CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数无明显影响。d58，脱臼处死小鼠，取足爪踝关节和脾脏，进行HE染色，观察组织病理变化。关节病理结果显示：正常鼠关节腔可以看到滑膜组织无增生，衬覆1-2层滑膜细胞，无炎细胞浸润，无血管扩张充血，无血管翳；模型鼠关节腔明显可以看到滑膜组织增生，衬覆多层滑膜细胞，炎细胞浸润，血管扩张充血，血管翳出现，甚至出现骨和软骨破坏；IgD-Fc-Ig(3.25mg/kg、6.5mg/kg、13mg/kg)剂量组滑膜细胞增生明显减少，覆盖2-3层滑膜细胞，炎细胞浸润、血管扩张充血、血管翳生成等均有明显改善。脾脏病理结果显示：正常小鼠脾脏由白髓和红髓组成，白髓由中央动脉和动脉周围的淋巴鞘构成，红髓由脾索和血窦组成。与正常组比较，模型鼠可见白髓增生，生发中心出现；红髓增生，淤血(红细胞增加)，范围增大，淋巴滤泡增生，炎症细胞浸润。IgD-Fc-Ig(3.25mg/kg、6.5mg/kg、13mg/kg)剂量组与模型组比较，淋巴滤泡增生和炎症细胞浸润明显减轻，生发中心减少。药效学实验结果表明IgD-Fc-Ig对小鼠CIA有明显的治疗作用。
CIA小鼠胸腺和脾脏指数明显高于正常组，T、B淋巴细胞增殖反应也明显增加。IgD-Fc-Ig(3.25、6.5和13mg/kg)剂量组对胸腺指数均有明显下调作用，但对脾脏指数没有显著影响。IgD-Fc-Ig(3.25、6.5mg/kg)组能明显下调CIA小鼠T淋巴细胞增殖反应，IgD-Fc-Ig(3.25、6.5、13mg/kg)组能明显下调CIA小鼠B淋巴细胞增殖反应。这些结果提示IgD-Fc-Ig对小鼠CIA治疗作用与其抑制T/B细胞增殖反应密切相关。
与正常组比较，CIA组脾脏总Th细胞(CD3+CD4+)、表达CD40L的Th细胞(CD4+CD154+)、Th1细胞(CD4+IFN-γ+)、Th17细胞(CD4+IL-17+)比例显著升高，Th2细胞(CD4+IL-4+)、Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)比例显著降低，IgD-Fc-Ig(3.25、6.5、13mg/kg)组可明显下调总Th细胞、表达CD40L的Th细胞、Th1细胞、Th17细胞；IgD-Fc-Ig(3.25、6.5mg/kg)组可明显上调Th2细胞的百分含量；IgD-Fc-Ig(6.5、13mg/kg)组可明显上调Treg细胞的百分含量。与正常组比较，CIA组脾脏成熟B细胞(B220+IgD+)比例显著升高，IgD-Fc-Ig(3.25、6.5、13mg/kg)组可明显下调成熟B细胞的百分含量。提示IgD-Fc-Ig融合蛋白调节CIA小鼠T、B细胞亚群及活性是其发挥治疗作用的重要机制之一。
IgD-Fc-Ig融合蛋白对CIA小鼠关节炎的影响实验结果指示IgD-Fc-Ig对CIA小鼠的无效剂量≤1.625mg/kg，起效剂量3.25mg/kg，有效剂量范围在3.25-13.0mg/kg。根据上述量效结果，IgD-Fc-Ig融合蛋白的用量可以是3.25-13.0mg/kg。
本发明的有益效果是：
通过IgD-Fc-Ig融合蛋白开发为高选择性治疗RA新靶向治疗药物提供了实验依据。
具体实施方式
实施例1：IgD、IgD-Fc-Ig融合蛋白竞争结合实验
1.1实验方法
利用免疫磁珠分选人外周血CD4+T细胞，以2×106/孔的细胞密度铺6孔板，分别加入FITC-IgD(10μg/ml)和不同浓度的IgD-Fc-Ig融合蛋白(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30μg/ml)，37℃孵育2h。PBS洗涤两次，300g×10min，弃上清，再用适量PBS重悬细胞，上机检测荧光强度。配体IgD、IgD-Fc-Ig融合蛋白与IgDR的结合特性用荧光强度(FluorescentIntensity,FI)值来计算。根据流式细胞仪检测结果，分别以不同浓度IgD-Fc-Ig融合蛋白为X轴，对应的IgD特异性结合的量为Y轴，绘制竞争结合曲线。根据结合曲线，可计算出IgD-Fc-Ig融合蛋白抑制IgD与IgDR结合的IC50。
1.2实验结果
申请人检测了IgD-Fc-Ig融合蛋白与IgDR的亲和力及其是否能与IgD竞争结合IgDR，采用不同浓度IgD-Fc-Ig融合蛋白与10μg/ml FITC-IgD共同孵育细胞，孵育条件是37℃，1h，PBS清洗细胞后，流式细胞仪检测FITC荧光强度。结果表明随着IgD-Fc-Ig融合蛋白浓度的增加，细胞表面FITC强度逐渐减弱，提示IgD-Fc-Ig融合蛋白浓度依赖性的降低了IgD与IgDR的结合。根据FITC荧光强度的变化绘制IgD-Fc-Ig融合蛋白针对IgD/IgDR结合的抑制曲线，结合抑制曲线，分别计算IC50。由结果可知,在CD4+T细胞上IgD-Fc-Ig融合蛋白结合IgDR的亲和力大于IgD结合IgDR，并且IgD-Fc-Ig融合蛋白可以与IgD竞争性的结合IgDR。
实施例2：IgD及IgD-Fc-Ig融合蛋白对RA患者和健康对照者外周血T细胞增殖和活性的影响
2.1实验方法
2.1.1 CCK-8法检测IgD及IgD-Fc-Ig对CD4+T细胞活力的影响
采用CCK-8法测CD4+T细胞活力来反映细胞增殖情况。取分选后的CD4+T细胞，将细胞浓度调至5×106/ml，96孔板中加入100μl细胞悬液培养，分组加入IgD(3μg/ml)并IgD-Fc-Ig(1、3、10μg/ml)以及T细胞刺激剂抗CD3/CD28抗体刺激，每组设3个复孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h、48h，终止培养后，每孔加入10μl CCK-8，4h后用酶标仪检测A450nm值。
2.1.2流式细胞术检测IgD及IgD-Fc-Ig对人外周血T细胞表面活化分子的影响
将人CD4+T细胞铺于96孔板中，细胞密度为1×106/孔，分别依次加入终浓度为1、3、10μg/ml IgD-Fc-Ig以及刺激剂IgD(3μg/ml)并设空白对照组(Control组)、IgD(1、3、10μg/ml)刺激组和CD3/CD28组，置37℃、5％CO2培养箱培养24h、48h，将培养后的细胞收集置EP管中，PBS离心2000r/min，10min，弃上清，加入FITC-CD69抗体和PE-CD154抗体，孵育30min，PBS洗涤细胞一遍后流式细胞仪上机检测。
2.1.3流式细胞术检测IgD及IgD-Fc-Ig对人外周血T细胞亚群的影响
将分离后的人PBMC细胞密度调整为2-3×106/ml，每孔分别加入300μl培养液接种于24孔培养板中。分别依次加入终浓度为1、3、10μg/ml IgD-Fc-Ig以及刺激剂IgD(3μg/ml)并设空白对照组(Control组)、IgD(1、3、10μg/ml)刺激组和CD3/CD28组，置37℃、5％CO2培养箱培养24h、48h后收集细胞，其中检测的Th17细胞亚群在培养结束前4-6h每孔加入细胞刺激剂Cell Stimulation Cocktail(plus protein transport inhibitors)0.8μl；培养终止后PBS清洗一遍后破膜检测T细胞各亚群。
2.1.4 QPCR技术检测IgD及IgD-Fc-Ig对T细胞相关核转录因子mRNA表达的影响
2.1.4.1人PBMC RNA的提取及检测
(1)取约10ml健康人新鲜血分离出PBMC，每孔分别加入300μl培养液接种于24孔培养板中；
(2)分别依次加入IgD-Fc-Ig(终浓度为1、3、10μg/ml)以及刺激剂IgD(3μg/ml)并设空白对照组(Control组)、IgD(1、3、10μg/ml)刺激组和CD3/CD28组，置37℃、5％CO2培养箱培养24h、48h；
(3)将培养后的细胞分别收集到RNase-free 1.5ml EP管中，加入PBS离心2000r/min，10min，弃上清，每管再加入1ml Trizol，颠倒混匀使细胞充分裂解，室温5min；
(4)每管加入200μl氯仿，剧烈振荡，冰上放置10-15min后离心，4℃，12000r/min，10min；
(5)离心后可见分三层，最下层为枚红色有机层，中间乳白色蛋白层，最上层无色水相层，将最上层仔细吸出转移至新的RNase-free 1.5ml EP管中，加入等体积冰冷的异丙醇，冰上放置15min后再4℃，12000r/min，离心10min；
(6)弃上清可见白色沉淀(即RNA)，向沉淀中加入1ml 75％乙醇(无水乙醇与0.1％DEPC水配置)，温和振荡，再4℃，8000r/min，离心5min；
(7)弃上清，吸干液体，晾干，最后加入30μl 0.1％DEPC水溶解RNA，放置冰上。取2μl RNA用多功能酶标仪测OD值，检测出RNA浓度及纯度，OD260/OD280在1.8-2.1之间即为合格的RNA。
2.1.4.2 RNA反转录成cDNA
将RNase-free 0.5ml EP放置冰上，分别加入以下试剂：
Figure GDA0003155868470000081
放入SimpliAmp PCR热循环仪中进行逆转录反应25℃10min，50℃30min，85℃5min结束反应，-20℃保存备用。
2.1.4.3 QPCR检测mRNA的表达
(1)引物的合成：由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，序列如下：
人ROR-γt：
上游引物：5’-GTCCCGAGATGCTGTCAAGT-3’
下游引物：5’-GACCACTGGTTCCTGTTGCT-3’
人Foxp3：
上游引物：5’-GACAGTTTCCCACAAGCCAG-3’
下游引物：5’-TGGTGAAGTGGACTGACAGA-3’
(2)Foxp3和ROR-γt目的基因的PCR扩增反应：
20μl qPCR反应体系：
Figure GDA0003155868470000091
扩增条件：预变性95℃5min，变性95℃10sec，退火延伸60℃35sec，40个循环，融解曲线形成95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec。反应结束后根据扩增曲线和融解曲线判断反应质量。
2.2实验结果
2.2.1 IgD及IgD-Fc-Ig对健康人CD4+T细胞增殖的影响
用IgD(3μg/ml)体外刺激健康人CD4+T细胞，并设IgD-Fc-Ig(1、3、10μg/ml)合用IgD(3μg/ml)组、Lck抑制剂A770041合用IgD(3μg/ml)组、IgG-Fc(3μg/ml)合用IgD(3μg/ml)组、T细胞刺激剂(抗CD3/CD28抗体)组以及IgD-Fc-Ig(1、3、10μg/ml)合用抗CD3/CD28刺激组，分别培养24h、48h后，CCK-8检测其细胞活力进而来反映其增殖能力，测定450nm吸光度值。结果显示：IgD能在24h、48h明显促进正常人CD4+T细胞的增殖，IgD-Fc-Ig(10μg/ml)能下调IgD对T细胞的促增殖作用，对CD3/CD28的促增殖作用无明显作用。提示IgD-Fc-Ig高选择性抑制IgD对T细胞的促增殖作用。IgD-Fc-Ig单独作用对健康人CD4+T细胞增殖无明显影响。
2.2.2 IgD及IgD-Fc-Ig对RA患者PBMC细胞增殖的影响
用IgD(3μg/ml)体外刺激RA患者PBMC细胞48h，并设IgD-Fc-Ig(1、3、10μg/ml)合用IgD(3μg/ml)组，IgD(3μg/ml)可明显PBMC的增殖，IgD-Fc-Ig(10μg/ml)可显著抑制IgD诱导的细胞增殖。
2.2.3 IgD及IgD-Fc-Ig对RA患者和健康人T细胞表面活化分子CD69、CD154的影响
IgD能显著上调RA患者和健康人T细胞表面活化分子CD69和CD154的表达。IgD-Fc-Ig能下调IgD增加的CD69和CD154的表达，对抗CD3/CD28抗体所上调的CD69和CD154的表达无明显影响。提示IgD-Fc-Ig高选择性抑制IgD对T细胞的促增殖作用。
2.2.4 IgD及IgD-Fc-Ig对RA患者和健康人PBMC中T细胞亚群的影响
不同浓度的IgD(1、3、10μg/ml)体外刺激RA患者和健康人PBMC，流式细胞术检测Th17和Treg细胞的表达。结果显示：IgD(10μg/ml)能显著上调Th17细胞表达的百分比，下调Treg细胞表达的百分比，导致Th17/Treg的失衡。IgD-Fc-Ig(3μg/ml)能恢复IgD所致的Th17/Treg的失衡。
2.2.5 IgD及IgD-Fc-Ig对RA患者和健康人PBMC中T细胞相关核转录因子mRNA表达的影响
IgD(3、10μg/ml)显著上调RA患者和健康人PBMC中ROR-γt的mRNA的表达，下调Foxp3 mRNA的表达。IgD-Fc-Ig能下调IgD所上调的人ROR-γtmRNA的表达，上调IgD所下调的人Foxp3 mRNA的表达。
实施例3：IgD-Fc-Ig融合蛋白对小鼠胶原性关节炎(collagen inducedarthritis,CIA)的主要药效学研究
3.1实验方法
3.1.1小鼠胶原性关节炎(CIA)模型的制备
待小鼠适应环境(一周左右)，开始造模，将CCII溶于0.01mol/L的冰乙酸中，并在冰上充分研磨成乳剂，同时将卡介苗溶于液体石蜡中研磨成弗氏完全佐剂，预冷后加入到磨好的等体积胶原中，再次充分研磨成乳剂，使CCII和卡介苗终浓度均为2mg/ml(冰上)。将0.15ml乳液皮内注射到尾根部或背部的多个部位，21天，制备相同的乳剂，0.1ml再次对小鼠进行加强注射。将第一次免疫日定义为第0天，加强注射后每周2次对小鼠的整体指标进行评价。
3.1.2实验分组及给药
根据关节炎指数将造模成功的DBA/1小鼠，随机分为8组，即正常组、模型组、IgD-Fc-Ig融合蛋白(DG)四个剂量组(1.625、3.25、6.5、13mg/kg/次，尾静脉注射，每周两次，用药4周)、阳性对照组Etanercept(rhTNFR:Fc，4.5mg/kg，尾静脉注射，每周两次，用药4周)，并设IgG-Fc(13mg/kg，尾静脉注射，每周两次，用药4周)阴性对照组。其中正常组、模型组尾静脉注射生理盐水。每组10只。
3.1.3小鼠整体指标评价
根据继发性炎症建立的标准，每周两次检查小鼠并记录和分析，全面评估关节炎指数、关节肿胀数。小鼠全身病变：每周两次测量体重变化，观察前后足爪和尾部病变的发生率和严重度。关节肿胀数和关节指数评分：致炎后d21开始每周两次记录关节肿胀数，并进行关节炎指数评分。
关节肿胀数：每只足趾计1个踝关节和5个指(趾)关节，每只鼠最多24个关节肿胀。
关节炎指数：每只足趾按下列标准评分：0＝正常；1＝踝关节出现红斑和轻微肿胀；2＝踝关节到跖关节或掌关节红斑和轻微肿胀；3＝踝关节到跖趾关节或掌关节出现红斑和中度肿胀；4＝踝关节到趾关节出现红斑和重度肿胀。最大评分为16分。
3.1.4 H&E染色检测CIA小鼠踝关节的病理改变
(1)踝关节病理检查：处死小鼠，取后2炎性踝关节进行HE染色，观察炎性关节组织的病理改变：根据严重程度对滑膜增生、炎症、血管翳、软骨破坏进行评分。
(2)脾脏病理检查：处死小鼠，取脾脏进行HE染色，观察脾脏的病理改变：从动脉周围淋巴鞘的细胞密度、淋巴小结增生(淋巴样滤泡)、边缘区增生、红髓充血和生发中心的总数量进行判定，按照病变从轻到重进行0～3(0＝正常)级病理评分。
3.1.5胸腺指数和脾脏指数测定
称小鼠体重，脱颈处死小鼠，剥离胸腺和脾脏，分别称重，以胸腺或脾脏的重量比上小鼠的体重，而得到胸腺指数或脾脏指数。
3.1.6淋巴细胞增殖检测
LPS和ConA诱导的B和T淋巴细胞增殖反应：无菌取脾脏用RPMI1640制备淋巴细胞悬液，在96孔培养板上，每孔加入50μl细胞悬液(终浓度为1×107/ml)及50μl LPS(终浓度5mg/L)或ConA(终浓度5mg/L)，终容积为100μl，各设3个复孔，置37℃、5％CO2培养箱培养48h，诱导T、B淋巴细胞增殖。后每孔加入10μl CCK，避光孵育，每半小时酶标仪检测吸光度值，结果以3个副孔的均值表示。
3.1.7 T、B细胞亚群检测
处死小鼠后，无菌分离得到脾脏，剪碎，200目纱网轻轻研磨，制得细胞悬液，2000rpm离心10min，弃上清后加入2ml红细胞裂解液，避光裂红3-5min，加入10ml PBS终止裂红，2000rpm离心10min，1ml RPMI1640制备淋巴细胞悬液，取部分细胞悬液加入PBS使细胞密度达107/ml，每管100μl细胞悬液，分3管分别加入1.5μl相应的荧光一抗，避光孵育30min，流式细胞仪检测总Th细胞(CD3+CD4+)、表达CD40L的Th细胞(CD4+CD154+)、成熟B细胞(B220+IgM+IgD+)百分含量。另取500μl细胞悬液，密度调至5×107/ml，6孔板中每孔加入1ml悬液，每只小鼠设Th1/Th2/Th17孔以及Treg孔，检测的Th17细胞亚群在培养结束前6h每孔加入细胞刺激剂Cell Stimulation Cocktail(plus protein transport inhibitors)2μl，分别破膜检测Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)、Th17(CD4+IL-17+)、Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)百分含量。
3.2实验结果
3.2.1 IgD-Fc-Ig融合蛋白对CIA小鼠整体指标的影响
将CⅡ乳剂于DBA/1小鼠的尾根部及背部皮内注射0.15ml致炎，d21将相同剂量CⅡ乳剂0.1ml在尾根部皮内注射，作为激发。d29观察发现，小鼠足爪开始出现首先是前足红肿，以后延伸到后足，CIA组足爪红肿从d29到d58天，d35-d47为肿胀高峰。d30开始IgD-Fc-Ig(1.625、3.25、6.5、13mg/kg)、Etanercept(4.5mg/kg)、IgG-Fc(13mg/kg)尾静脉给药4周，每周2次，正常组和CIA组腹腔注射生理盐水。d21开始，CIA组小鼠体重开始下降，体重增加值与正常组体重增加值比较，从d33开始差异显著，一直持续到d44，d44后体重增加与正常组体重增加值比较，无明显差异。d41-d58，Etanercept可明显降低CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数。d47-d58，IgD-Fc-Ig(3.25、6.5mg/kg)可明显降低CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数。d50后，IgD-Fc-Ig(13mg/kg)也降低CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数。IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)组以及IgG-Fc(13mg/kg)阴性对照组对CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数无明显影响。
3.2.2 IgD-Fc-Ig融合蛋白对CIA小鼠足爪病理变化的影响
d58，脱臼处死小鼠，取足爪踝关节和脾脏，进行HE染色，观察组织病理变化。关节病理结果显示：正常鼠关节腔可以看到滑膜组织无增生，衬覆1-2层滑膜细胞，无炎细胞浸润，无血管扩张充血，无血管翳；模型鼠关节腔明显可以看到滑膜组织增生，衬覆多层滑膜细胞，炎细胞浸润，血管扩张充血，血管翳出现，甚至出现骨和软骨破坏；IgG-Fc(13mg/kg)和IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)也存在滑膜组织增生，炎细胞浸润，血管扩张充血，血管翳出现，无明显治疗作用；IgD-Fc-Ig(3.25mg/kg、6.5mg/kg、13mg/kg)剂量组滑膜细胞增生明显减少，覆盖2-3层滑膜细胞，炎细胞浸润、血管扩张充血、血管翳生成等均有明显改善。
3.2.3 IgD-Fc-Ig融合蛋白对CIA小鼠脾脏病理变化的影响
d58脱臼处死小鼠，分离脾脏，进行HE染色，观察组织病理变化。正常小鼠脾脏由白髓和红髓组成，白髓由中央动脉和动脉周围的淋巴鞘构成，红髓由脾索和血窦组成。与正常组比较，CIA鼠可见白髓增生，生发中心出现；红髓增生，淤血(红细胞增加)，范围增大，淋巴滤泡增生，炎症细胞浸润。IgG-Fc(13mg/kg)和IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)剂量组白髓增生，红髓充血和炎症细胞浸润，无明显改善趋势。IgD-Fc-Ig(3.25mg/kg、6.5mg/kg、13mg/kg)剂量组、Etanercept组与模型组比较，淋巴滤泡增生和炎症细胞浸润明显减轻，生发中心减少。
3.2.4 IgD-Fc-Ig融合蛋白对CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
致炎后d58，称小鼠体重，处死小鼠，称取胸腺和脾脏重量，计算胸腺指数和脾脏指数，并进行各组统计分析。与正常组相比，CIA小鼠胸腺和脾脏明显肿大，指数增加。IgD-Fc-Ig(3.25、6.5和13mg/kg)剂量组对胸腺指数均有明显下调作用，但对脾脏指数没有显著影响。
3.2.5 IgD-Fc-Ig融合蛋白对CIA小鼠胸腺T淋巴细胞和脾脏B淋巴细胞增殖反应的影响
致炎后d58，检测T、B淋巴细胞增殖反应，CIA小鼠T、B淋巴细胞增殖反应明显增高，IgD-Fc-Ig(3.25、6.5mg/kg)组能明显下调CIA小鼠T淋巴细胞增殖反应，IgD-Fc-Ig(3.25、6.5、13mg/kg)组能明显下调CIA小鼠B淋巴细胞增殖反应。
3.2.6 IgD-Fc-Ig融合蛋白对CIA小鼠T、B淋巴细胞亚群的影响
与正常组比较，CIA组脾脏总Th细胞(CD3+CD4+)、表达CD40L的Th细胞(CD4+CD154+)、Th1细胞(CD4+IFN-γ+)、Th17细胞(CD4+IL-17+)比例显著升高，Th2细胞(CD4+IL-4+)、Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)比例显著降低，IgD-Fc-Ig(3.25、6.5、13mg/kg)组、Etanercept(4.5mg/kg)组可明显下调总Th细胞、表达CD40L的Th细胞、Th1细胞、Th17细胞；IgD-Fc-Ig(3.25、6.5mg/kg)组、Etanercept(4.5mg/kg)组可明显上调Th2细胞的百分含量；IgD-Fc-Ig(6.5、13mg/kg)组、Etanercept(4.5mg/kg)组可明显上调Treg细胞的百分含量。
与正常组比较，CIA组脾脏成熟B细胞(B220+IgD+)比例显著升高，IgD-Fc-Ig(3.25、6.5、13mg/kg)组、Etanercept(4.5mg/kg)组可明显下调成熟B细胞的百分含量。
通过实施例1-3的实验证明，IgD-Fc-Ig融合蛋白具有很好的生物学活性，可以高选择性抑制RA中高水平IgD引起的T细胞异常活化的作用，药效学实验结果表明IgD-Fc-Ig融合蛋白对CIA小鼠有明显的治疗作用，IgD-Fc-Ig融合蛋白调节CIA小鼠T、B细胞亚群的增殖及活性是其发挥治疗作用的重要机制之一。IgD-Fc-Ig融合蛋白对治疗RA有潜在的治疗前景。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序 列 表
<110> 魏伟
<120> IgD-Fc-Ig融合蛋白用于制备治疗类风湿关节炎药物的应用
<130> NO
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln Asp
1 5 10 15 20
Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp
25 30 35 40
Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu
45 50 55 60
Leu Glu Arg His Ser Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser
65 70 75 80
Leu Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro Gln
85 90 95 100
Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu
105 110 115 120
Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe
125 130 135 140
Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser Val
165 170 175 180
Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr Cys Val Val Ser His
185 190 195 200
Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
205 210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
245 250 255 260
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
265 270 275 280
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
285 290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
305 310 315 320
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
325 330 335 340
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
345 350 355 360
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
365 370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
405 410 415 420
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
425 430 435 440

Claims (1)

1.IgD-Fc-Ig融合蛋白用于制备治疗类风湿关节炎药物的应用，所述IgD-Fc-Ig融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Function of IgD on lymphocyte activation and effect of hIgD-Fc-Ig fusion protein on human PBMC proliferation;Wen-sheng CHEN等;《中国药理学与毒理学杂志》;20171015;第31卷(第10期);第1017-1018页 *
IgD对类风湿关节炎患者T、B细胞功能及成纤维样滑膜细胞的影响及机制;吴育晶;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20170415;摘要 *

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