CN116284261B - 一种非洲猪瘟病毒结构蛋白组合物及其制备的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非洲猪瘟病毒结构蛋白组合物及其制备的疫苗，属于兽用生物制品技术领域。本发明所要解决的技术问题是如何预防非洲猪瘟。本发明所提供了包括氨基酸序列分别是SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7这7种蛋白质的组合物。本发明还提供了表达上述7种蛋白的基因疫苗、mRNA疫苗和重组病毒疫苗的组合物，用本发明的疫苗免疫猪以后，可保护易感猪免受ASFV的自然感染或人为攻击，可用于非洲猪瘟的预防。
Description
技术领域
本发明涉及一种非洲猪瘟病毒结构蛋白组合物及其制备的疫苗，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是猪的一种高度接触性烈性传染病，死亡率近100％，是养猪业的主要威胁和危害，世界动物卫生组织(World Organization forAnimal Health，OIE)规定为必须通报的传染病，我国规定为I类动物传染病。非洲猪瘟的病原是非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)。由于ASFV复杂的免疫逃逸机制和庞大的基因结构，目前非洲猪瘟的防控还没有安全、有效的疫苗，一直以来都是采取扑杀和尸体清除净化的方法，并采取严格的生物安全措施进行防范。
非洲猪瘟基因缺失活疫苗长期应用存在生物安全问题，传统灭活疫苗目前被证明无效。同时，由于非洲猪瘟病毒的特殊性，目前尚不清楚病毒的哪一种或哪几种病毒蛋白具有免疫保护原性。因此，针对非洲猪瘟亚单位和活载体疫苗的研究是目前最活跃的方向之一。非洲猪瘟病毒基因组全长170～193kb，含有150～180个开放阅读框(ORFs)，推测可编码约165种蛋白。除了60种以上结构蛋白基因以外，还鉴定和发现了包括多基因家族基因等在内的大量与病毒毒力、免疫抑制、抑制细胞凋亡等相关的基因。研究认为，ASFV毒力因子包括9GL、UK、I177L等，免疫抑制因子包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360以及MGF505等，血吸附因子包括CD2v、EP153R等。MGF360、MGF505、CD2v、UK、A238L、MGF/CD2v、I177L、I226R、A137R等毒力相关基因的缺失可以产生毒力致弱株，从攻毒保护的角度来看都可以作为潜在的疫苗侯选株。但是这些毒株在长时间的田间试验中证明可产生明显的不良反应，如皮肤溃疡、发热、关节肿胀、僵猪、母猪流产等。利用病毒的结构蛋白p30、p54、p72、p12等构建的重组疫苗和亚单位疫苗据报道有一定的免疫效果，但未见效果更好的重组疫苗和亚单位疫苗应用推广，主要是这些一种或几种蛋白组成的疫苗都不能提供完全的免疫攻毒保护作用。因此，探索更为安全有效的亚单位蛋白组合、或基因疫苗组合、或mRNA疫苗组合、或重组病毒活载体疫苗组合，一直都是养猪行业中ASF防控面临的重要而现实的课题。鉴于此，为确保生猪养殖产业的健康发展，开发更安全高效的疫苗产品成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何预防非洲猪瘟。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于预防非洲猪瘟的蛋白质组合物，所述蛋白质组合物可包括pF317L、p72、pA104R、pM1249L、pB438L、pCP530R和p10这7种蛋白质，或所述7种蛋白质中的任意6种、任意5种或任意4种，所述pF317L可为下述任一种蛋白质：
H1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
H2)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
H3)在H1)或H2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述p72可为下述任一种蛋白质：
H4)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
H5)将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H4)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
H6)在H4)或H5)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述pA104R可为下述任一种蛋白质：
H7)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
H8)将SEQ ID No.3的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H7)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
H9)在H7)或H8)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述pM1249L可为下述任一种蛋白质：
H10)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
H11)将SEQ ID No.4的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H10)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
H12)在H10)或H11)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述pB438L可为下述任一种蛋白质：
H13)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
H14)将SEQ ID No.5的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H13)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
H15)在H13)或H14)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述pCP530R可为下述任一种蛋白质：
H16)氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；
H17)将SEQ ID No.6的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H16)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
H18)在H16)或H17)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述p10可为下述任一种蛋白质：
H19)氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质；
H20)将SEQ ID No.7的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H19)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
H21)在H19)或H20)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
进一步地，所述蛋白质组合物可包括pF317L、p72、pA104R、pM1249L、pB438L、pCP530R和p10；或包括p72、pA104R、pM1249L、pB438L和pCP530R但不限于此。
进一步地，所述蛋白质组合物可由pF317L、p72、pA104R、pM1249L、pB438L、pCP530R和p10组成；或由p72、pA104R、pM1249L、pB438L和pCP530R组成；或由pF317L、p72、pA104R、pM1249L、pB438L、pCP530R、p10和p54组成；或由pF317L、pA104R、pM1249L、pB438L、pCP530R和p10组成；或由pF317L、p72、pA104R、pM1249L、pB438L和pCP530R组成但不限于此。
进一步地，所述蛋白质组合物(ASFV结构蛋白组合物)可由氨基酸序列分别是SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7所示的蛋白质组成；或所述蛋白质组合物可由氨基酸序列分别是SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的蛋白质组成。
SEQ ID No.1-SEQ ID No.7所示的蛋白质来源于非洲猪瘟病毒(African SwineFever Virus，ASFV)，是非洲猪瘟病毒(ASFV)的结构蛋白。
进一步地，所述蛋白质包括所述蛋白质本身以及所述蛋白质的任何功能等同蛋白，所述蛋白质可为全长蛋白质或具有相同功能的截短的蛋白质或与所述蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能且来源于非洲猪瘟病毒的蛋白。
本领域技术人员所知晓的是，为了使蛋白质便于纯化或检测，可在蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白，所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。连接了标签蛋白的融合蛋白质，均是衍生于本发明的蛋白质并且等同于本发明的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对编码本发明蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码本发明蛋白质且具有本发明蛋白质的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
虽然本发明实施例中的蛋白质组合物(ASFV结构蛋白组合物)为SEQ ID No.1-SEQID No.7所示的蛋白质的组合物，但本领域技术人员可在SEQ ID No.1-SEQ ID No.7所示的蛋白质的组合物的基础上，增加1、2或3种及以上其他蛋白或减少其中任1、2或3种ASFV结构蛋白而不从根本上改变本发明ASFV结构蛋白组合物的免疫攻毒保护效果，增加或减少后的替代组合物也可用于实现本发明所述的技术效果，这些替代组合物未脱离本发明的保护范围，本发明应包括这些替代组合物。
本发明还提供了用于预防非洲猪瘟的核酸分子组合物，所述核酸分子组合物可包括编码所述pF317L的核酸分子、编码所述p72的核酸分子、编码所述pA104R的核酸分子、编码所述pM1249L的核酸分子、编码所述pB438L的核酸分子、编码所述pCP530R的核酸分子和编码所述p10的核酸分子中的至少任意四种。
所述至少任意四种可为任意四种、任意五种、任意六种或七种。
进一步地，所述核酸分子组合物可包括编码所述pF317L的核酸分子、编码所述p72的核酸分子、编码所述pA104R的核酸分子、编码所述pM1249L的核酸分子、编码所述pB438L的核酸分子、编码所述pCP530R的核酸分子和编码所述p10的核酸分子；或包括编码所述p72的核酸分子、编码所述pA104R的核酸分子、编码所述pM1249L的核酸分子、编码所述pB438L的核酸分子和编码所述pCP530R的核酸分子但不限于此。
进一步地，所述核酸分子组合物可由编码所述pF317L的核酸分子、编码所述p72的核酸分子、编码所述pA104R的核酸分子、编码所述pM1249L的核酸分子、编码所述pB438L的核酸分子、编码所述pCP530R的核酸分子和编码所述p10的核酸分子组成；或由编码所述p72的核酸分子、编码所述pA104R的核酸分子、编码所述pM1249L的核酸分子、编码所述pB438L的核酸分子和编码所述pCP530R的核酸分子组成。
进一步地，所述核酸分子组合物可由编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子组成；或所述核酸分子组合物可由编码氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示蛋白质的核酸分子组成。
进一步地，所述核酸分子组合物可为下述任一种：
A1)所述核酸分子组合物可包括核苷酸序列分别是SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14的DNA分子中的至少任意四种；
A2)所述核酸分子组合物可包括核苷酸序列分别是SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21的mRNA分子中的至少任意四种。
进一步地，所述核酸分子组合物可包括核苷酸序列分别是SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14的DNA分子；或包括核苷酸序列分别是SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13的DNA分子但不限于此。
进一步地，所述核酸分子组合物可包括核苷酸序列分别是SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21的mRNA分子；或包括核苷酸序列分别是SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.19和SEQ ID No.20的mRNA分子但不限于此。
进一步地，所述核酸分子组合物可由核苷酸序列分别是SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14的DNA分子组成；或所述核酸分子组合物可由核苷酸序列分别是SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13的DNA分子组成。
进一步地，所述核酸分子组合物可由核苷酸序列分别是SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21的mRNA分子组成；或所述核酸分子组合物可由核苷酸序列分别是SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20的mRNA分子组成。
SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质pF317L；SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质p72；SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质pA104R；SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质pM1249L；SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)编码氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质pB438L；SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质pCP530R；SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)编码氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质p10。
SEQ ID No.15所示的mRNA分子(mF317L)由基因F317L转录而来，翻译为氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质pF317L；SEQ ID No.16所示的mRNA分子(mp72)由基因p72转录而来，翻译为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质p72；SEQ ID No.17所示的mRNA分子(mA104R)由基因A104R转录而来，翻译为氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质pA104R；SEQID No.18所示的mRNA分子(mM1249L)由基因M1249L转录而来，翻译为氨基酸序列是SEQ IDNo.4的蛋白质pM1249L；SEQ ID No.19所示的mRNA分子(mB438L)由基因B438L转录而来，翻译为氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质pB438L；SEQ ID No.20所示的mRNA分子(mCP530R)由基因CP530R转录而来，翻译为氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质pCP530R；SEQ IDNo.21所示的mRNA分子(mp10)由基因p10转录而来，翻译为氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质p10。
本文所述核酸分子可以是DNA或mRNA，包括在本发明所述核苷酸分子序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子或与本发明所述核酸分子序列一致性为50％以上且来源相同种属的核酸分子。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明所述的核酸分子。
本文所述核酸分子组合物可为DNA分子组合物和/或mRNA分子组合物。
本发明还提供了用于预防非洲猪瘟的生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
B1)表达所述蛋白质组合物的重组载体组合物或重组载体；
B2)表达所述蛋白质组合物的重组微生物组合物或重组微生物；
B3)表达所述蛋白质组合物的重组细胞组合物或重组细胞。
所述重组微生物组合物可为重组病毒组合物(如重组腺病毒组合物或重组狂犬病病毒组合物)。
B1)中所述重组载体组合物可包括含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子的重组载体中的至少任意四种。
进一步地，B1)中所述重组载体组合物可包括含有编码氨基酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子的重组载体；或包括含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示蛋白质的核酸分子的重组载体但不限于此。
B1)中所述重组载体可含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子中的至少任意四种。
进一步地，B1)中所述重组载体可含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子；或含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示蛋白质的核酸分子。
B2)中所述重组微生物组合物可包括含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子的重组微生物中的至少任意四种。
进一步地，B2)中所述重组微生物组合物可包括含有编码氨基酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子的重组微生物；或包括含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示蛋白质的核酸分子的重组微生物。
B2)中所述重组微生物可含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子中的至少任意四种。
进一步地，B2)中所述重组微生物可含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子；或含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示蛋白质的核酸分子。
B3)中所述重组细胞组合物可包括含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子的重组细胞中的至少任意四种。
进一步地，B3)中所述重组细胞组合物可包括含有编码氨基酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子的重组细胞；或包括含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示蛋白质的核酸分子的重组细胞。
B3)中所述重组细胞可含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子中的至少任意四种。
进一步地，B3)中所述重组细胞可含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示蛋白质的核酸分子；或含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示蛋白质的核酸分子。
本文所述至少任意四种可为任意四种、任意五种、任意六种或七种。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述核酸分子组合物、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。在本发明的实施方案中，所述载体具体可为pCMV-Sec载体、pcDNA3.1载体、pUC57质粒、pacAd5CMVK-NpA载体或pcDNA3.1-SRV9-PacI质粒(在pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点中连入HamRZ-SRV9-pacI-HdvRZ序列(SEQ ID No.85)改造而来)。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻、真菌或病毒。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述病毒可为逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、狂犬病病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、杆状病毒或痘苗病毒。在本发明的实施方案中，所述微生物具体可为大肠杆菌，所述病毒具体可为腺病毒和/或狂犬病病毒。
本文所述细胞是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞(如大肠杆菌或枯草杆菌)。在本发明的实施方案中，所述细胞具体可为DH5α感受态细胞、HEK293细胞和/或细胞BSR。
进一步地，上文中B1)所述重组载体组合物可为下述任一种：
(1)所述重组载体组合物包括pCMV-Sec-F317L、pCMV-Sec-p72、pCMV-Sec-A104R、pCMV-Sec-M1249L、pCMV-Sec-B438L、pCMV-Sec-CP530R和pCMV-Sec-p10。其中，重组载体pCMV-Sec-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)，重组载体pCMV-Sec-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)，重组载体pCMV-Sec-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)，重组载体pCMV-Sec-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)，重组载体pCMV-Sec-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)，重组载体pCMV-Sec-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)，重组载体pCMV-Sec-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)；该重组载体组合物用于制备基因工程亚单位疫苗(即本发明所述预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗)；
(2)所述重组载体组合物包括重组载体pcDNA3.1-F317L、pcDNA3.1-p72、pcDNA3.1-A104R、pcDNA3.1-M1249L、pcDNA3.1-B438L、pcDNA3.1-CP530R和pcDNA3.1-p10。其中，重组载体pcDNA3.1-F317L是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的F317L基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质pF317L；重组载体pcDNA3.1-p72是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的p72基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)，表达氨基酸序列是SEQ IDNo.2的蛋白质p72；重组载体pcDNA3.1-A104R是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的A104R基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质pA104R；重组载体pcDNA3.1-M1249L是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的M1249L基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质pM1249L；重组载体pcDNA3.1-B438L是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的B438L基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)，表达氨基酸序列是SEQID No.5的蛋白质pB438L；重组载体pcDNA3.1-CP530R是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的CP530R基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-CP530R含有SEQ IDNo.13所示的DNA分子(基因CP530R)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质pCP530R；重组载体pcDNA3.1-p10是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的p10基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质p10；该重组载体组合物用于制备DNA疫苗(即本发明所述预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗)；
(3)所述重组载体组合物包括重组载体pUC57-F317L-mRNA、pUC57-p72-mRNA、pUC57-A104R-mRNA、pUC57-M1249L-mRNA、pUC57-B438L-mRNA、pUC57-CP530R-mRNA和pUC57-p10-mRNA。其中，重组载体pUC57-F317L-mRNA含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)，重组载体pUC57-p72-mRNA含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)，重组载体pUC57-A104R-mRNA含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)，重组载体pUC57-M1249L-mRNA含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)，重组载体pUC57-B438L-mRNA含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)，重组载体pUC57-CP530R-mRNA含有SEQ IDNo.13所示的DNA分子(基因CP530R)，重组载体pUC57-p10-mRNA含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)；该重组载体组合物中的各个重组载体还含有转录相关元件，所述重组载体组合物用于制备mRNA疫苗(即本发明所述预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗)；
(4)所述重组载体组合物包括重组载体pAdCMV-F317L、pAdCMV-p72、pAdCMV-A104R、pAdCMV-M1249L、pAdCMV-B438L、pAdCMV-CP530R和pAdCMV-p10。其中，重组载体pAdCMV-F317L是使用同源重组的方法，将带有同源臂的F317L基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)；重组载体pAdCMV-p72是使用同源重组的方法，将带有同源臂的p72基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)；重组载体pAdCMV-A104R是使用同源重组的方法，将带有同源臂的A104R基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)；重组载体pAdCMV-M1249L是使用同源重组的克隆方法，将带有同源臂的M1249L基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)；重组载体pAdCMV-B438L是使用同源重组的方法，将带有同源臂的B438L基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)；重组载体pAdCMV-CP530R是使用同源重组的方法，将带有同源臂的CP530R基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-CP530R含有SEQ IDNo.13所示的DNA分子(基因CP530R)；重组载体pAdCMV-p10是使用同源重组的方法，将带有同源臂的p10基因连接在pacAd5CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-p10含有SEQ IDNo.14所示的DNA分子(基因p10)。该重组载体组合物用于制备重组腺病毒疫苗(即本发明所述预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗)；
(5)所述重组载体组合物包括重组载体pcDNA3.1-SRV9-F317L、pcDNA3.1-SRV9-p72、pcDNA3.1-SRV9-A104R、pcDNA3.1-SRV9-M1249L、pcDNA3.1-SRV9-B438L、pcDNA3.1-SRV9-CP530R和pcDNA3.1-SRV9-p10。其中，重组载体pcDNA3.1-SRV9-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)，重组载体pcDNA3.1-SRV9-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)，重组载体pcDNA3.1-SRV9-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)，重组载体pcDNA3.1-SRV9-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)，重组载体pcDNA3.1-SRV9-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)，重组载体pcDNA3.1-SRV9-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)，重组载体pcDNA3.1-SRV9-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)；该重组载体组合物用于制备重组狂犬病病毒疫苗(即本发明所述预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗)；
(6)所述重组载体组合物包括pCMV-Sec-p72、pCMV-Sec-A104R、pCMV-Sec-M1249L、pCMV-Sec-B438L和pCMV-Sec-CP530R；
(7)所述重组载体组合物包括pcDNA3.1-p72、pcDNA3.1-A104R、pcDNA3.1-M1249L、pcDNA3.1-B438L和pcDNA3.1-CP530R；
(8)所述重组载体组合物包括pUC57-p72-mRNA、pUC57-A104R-mRNA、pUC57-M1249L-mRNA、pUC57-B438L-mRNA和pUC57-CP530R-mRNA；
(9)所述重组载体组合物包括pAdCMV-p72、pAdCMV-A104R、pAdCMV-M1249L、pAdCMV-B438L和pAdCMV-CP530R；
(10)所述重组载体组合物包括pcDNA3.1-SRV9-p72、pcDNA3.1-SRV9-A104R、pcDNA3.1-SRV9-M1249L、pcDNA3.1-SRV9-B438L和pcDNA3.1-SRV9-CP530R。
进一步地，上文中B2)所述重组微生物组合物可为下述任一种：
(1)所述重组微生物组合物为重组腺病毒组合物，所述重组腺病毒组合物包括重组腺病毒ΔrAdv5-p72、ΔrAdv5-M1249L、ΔrAdv5-B438L、ΔrAdv5-p10、ΔrAdv5-CP530R、ΔrAdv5-A104R和ΔrAdv5-F317L。其中，ΔrAdv5-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)；ΔrAdv5-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)；ΔrAdv5-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)；ΔrAdv5-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)；ΔrAdv5-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)；ΔrAdv5-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)；ΔrAdv5-F317L含有SEQ IDNo.8所示的DNA分子(基因F317L)；
(2)所述重组微生物组合物为重组狂犬病病毒组合物，所述重组狂犬病病毒组合物包括重组狂犬病病毒SRV9-p72、SRV9-F317L、SRV9-A104R、SRV9-M1249L、SRV9-B438L、SRV9-CP530R和SRV9-p10。其中，SRV9-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)；SRV9-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)；SRV9-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)；SRV9-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)；SRV9-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)；SRV9-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)；SRV9-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)；
(3)所述重组微生物组合物包括ΔrAdv5-p72、ΔrAdv5-A104R、ΔrAdv5-M1249L、ΔrAdv5-B438L和ΔrAdv5-CP530R；
(4)所述重组微生物组合物包括SRV9-p72、SRV9-A104R、SRV9-M1249L、SRV9-B438L和SRV9-CP530R。
进一步地，上文中B2)所述重组微生物可为重组腺病毒，所述重组腺病毒可为ΔrAdv5-F317L-A104R、ΔrAdv5-p72-p10-B438L、ΔrAdv5-M1249L或ΔrAdv5-CP530R。重组腺病毒ΔrAdv5-F317L-A104R含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)和SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)；重组腺病毒ΔrAdv5-p72-p10-B438L含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)、SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)和SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)。重组腺病毒ΔrAdv5-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)；重组腺病毒ΔrAdv5-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)。
本发明所述重组病毒为将表达各个基因重组载体或串联表达多个基因的重组载体分别包装得到的重组病毒。
本发明各个基因单独或多个串联分布在各个重组病毒上；即每个重组病毒可以表达单独的基因，也可以表达多个基因的串联基因。
本发明所述重组病毒组合物可以为同类载体重组病毒的组合物，也可以为不同类载体重组病毒的组合物。
在本发明的实施例中，7种ASFV结构蛋白组合的举例为HEK293细胞表达的蛋白组合，其他任何表达系统表达的这些结构蛋白的组合都是本专利公开和保护的内容；在本发明的实施例中，7种ASFV结构蛋白的基因疫苗(或基因表达载体)组合的举例为由pcDNA3.1质粒表达系统构建的基因疫苗，其他任何质粒表达系统构建的基因疫苗的组合都是本专利公开和保护的内容；在本发明的实施例中，7种ASFV结构蛋白的mRNA疫苗(或表达mRNA的表达载体)组合的举例为由T7启动子、5'-UTR、基因(X：分别为F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10基因)、3'-UTR、polyA序列的先后顺序，通过同源重组(in-fusion技术)插入pUC57质粒中，得到重组mRNA表达质粒pUC57-X-mRNA，构建的mRNA疫苗，由其他任何质粒转录系统构建的mRNA疫苗的组合都是本专利公开和保护的内容；在本发明的实施例中，7种ASFV结构蛋白的重组微生物的举例为7个结构蛋白的重组腺病毒载体或7个结构蛋白的重组狂犬病病毒载体的组合，其他任何重组微生物载体系统(包括但不限于：痘病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖呼吸综合征病毒、猪腺病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、狂犬病病毒、逆转录病毒、副粘病毒或其他可在哺乳动物体内产生一过性感染、稳定性感染或持续表达外源基因但不引起任何异常临床症状的病毒载体系统)构建的7个结构蛋白的重组微生物疫苗的组合都是本专利公开和保护的内容。
本发明还提供了所述蛋白质组合物的下述任一种应用：
C1)在制备用于预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；
C2)在制备用于诱导非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂中的应用；
C3)在制备预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗中的应用；
C4)在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用；
C5)在非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的防控中的应用。
本发明还提供了所述核酸分子组合物的下述任一种应用：
D1)在制备用于预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；
D2)在制备用于诱导非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂中的应用；
D3)在制备预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗中的应用；
D4)在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用；
D5)在非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的防控中的应用。
本发明还提供了所述生物材料的下述任一种应用：
E1)在制备用于预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；
E2)在制备用于诱导非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂中的应用；
E3)在制备预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗中的应用；
E4)在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用；
E5)在非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的防控中的应用。
本发明还提供了非洲猪瘟疫苗，所述非洲猪瘟疫苗可为下述任一种：
F1)所述非洲猪瘟疫苗包括所述蛋白质组合物；
F2)所述非洲猪瘟疫苗包括所述核酸分子组合物；
F3)所述非洲猪瘟疫苗包括所述生物材料(重组载体组合物、重组载体、重组微生物组合物、重组微生物、重组细胞组合物或重组细胞)。
所述非洲猪瘟疫苗用于提供抗非洲猪瘟的免疫应答。
进一步地，所述非洲猪瘟疫苗还可包括佐剂(adjuvant)和/或疫苗递送系统(vaccine delivery system)。
术语“佐剂”是指一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。在本发明的实施方案中，所述佐剂为茯苓多糖。
术语“疫苗递送系统”是指一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为吕盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。
本领域技术人员所熟知的是，为了增强抗原蛋白的免疫原性，除了加入具有免疫增强作用的化合物作为佐剂外，还可通过调整基因组合使之表达成颗粒性结构；或在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球中。
进一步地，所述非洲猪瘟疫苗可为亚单位疫苗、核酸疫苗或重组微生物疫苗。
进一步地，所述非洲猪瘟疫苗中的活性成分可为下述任一种：
P1)所述蛋白质组合物；
P2)所述核酸分子组合物；
P3)所述生物材料(重组载体组合物、重组载体、重组微生物组合物、重组微生物、重组细胞组合物或重组细胞)。
进一步地，所述非洲猪瘟疫苗中的活性成分为组合物时，所述组合物中的各组分的比例可为等质量比。
所述亚单位疫苗可为基因工程亚单位疫苗。
所述核酸疫苗可为DNA疫苗或RNA疫苗，所述RNA疫苗可为mRNA疫苗。
所述重组微生物疫苗可为重组腺病毒疫苗或重组狂犬病病毒疫苗。
本发明还提供了所述疫苗在非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的防控中的应用。
本文所述亚单位疫苗可为基因工程亚单位疫苗(gene engineered subunitvaccine)，所述基因工程亚单位疫苗是利用基因工程表达的蛋白抗原经纯化后，配合相应的佐剂制备而成的疫苗。
本文所述核酸疫苗(nucleic acid vaccine)包括DNA疫苗和mRNA疫苗。所述核酸疫苗是指将含有编码抗原蛋白基因序列的重组质粒直接导入机体细胞内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导机体产生特异性的免疫应答，使机体获得相应的免疫保护而达到预防或治疗疾病的目的。
在本发明实施例中的基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、重组腺病毒疫苗、重组狂犬病病毒疫苗的活性成分为SEQ ID No.1-SEQ ID No.7所示的蛋白质的组合物，或表达SEQ ID No.1-SEQ ID No.7所示的蛋白质的载体或微生物(如病毒)的组合物，本领域技术人员可在此基础上，增加1、2或3种及以上其他蛋白(如p54、p72、p12或p30蛋白)或表达所述蛋白的载体或病毒或减少其中任意1、2或3种ASFV结构蛋白或表达所述蛋白的载体或病毒而不从根本上改变本发明ASFV结构蛋白组合物的免疫攻毒保护效果，增加或减少后的替代组合物也可用于实现本发明所述的技术效果，这些替代组合物未脱离本发明的保护范围，本发明应包括这些替代组合物。
在本发明的一个实施方案中，所述重组腺病毒疫苗的活性成分为SEQ ID No.1-SEQ ID No.7所示的蛋白质和p54蛋白。
包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.7所示的蛋白质和p54蛋白的组合物也在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种具有预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染引发的疾病的产品。
本发明提供的产品，其活性成分为上述表达的ASFV结构蛋白、表达ASFV结构蛋白的基因表达载体(即基因疫苗)、表达的ASFV结构蛋白的mRNA转录载体及其表达的mRNA(即mRNA疫苗)和表达ASFV结构蛋白的重组病毒的组合。
在该产品中，上述蛋白、基因、mRNA和重组病毒的组合可以混合在一起直接使用或分批使用。
上述产品中还包括佐剂或免疫增强剂或免疫调节剂或其他疫苗。
上述佐剂可以为如铝胶等盐类佐剂、不同的多糖佐剂、生物蛋白佐剂、核酸佐剂或纳米材料佐剂等；在本发明的实施例中，进一步的，所述佐剂为多糖佐剂，具体为茯苓多糖。
上述非洲猪瘟病毒结构蛋白组合或上述的基因表达载体(基因疫苗)组合或上述mRNA转录载体(及其转录的mRNA即mRNA疫苗)组合或上述结构蛋白基因的重组病毒的组合或所述产品在制备具有如下功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：
1)治疗或抗非洲猪瘟病毒引发的疾病；
2)预防非洲猪瘟病毒引发的疾病，即非洲猪瘟。
上述产品具体可为疫苗。
本发明还提供一种预防非洲猪瘟病毒的方法，为将上述产品免疫动物后，实现免疫。在本发明的实施例中，所述产品中各个结构蛋白、或各个结构蛋白的基因疫苗、或各个结构蛋白的mRNA疫苗、或各个结构蛋白的重组病毒疫苗按照一定比例(如可为等比例混合)混合后免疫。
本发明提供了一种ASFV结构蛋白的组合及由其制备的疫苗，即利用ASFV的pF317L、p72、pA104R、pM1249L、pB438L、pCP530R、p10等蛋白作为目标蛋白，分别表达这些蛋白、或表达这些蛋白的重组表达载体(即DNA疫苗)、或表达这些蛋白的mRNA(即mRNA疫苗)或其mRNA转录载体、或表达这些蛋白的重组病毒，这些蛋白、基因、mRNA或重组病毒分别组合，混合后直接使用，或与佐剂、或免疫增强剂、或免疫调节剂一起混合后使用，免疫易感动物，都可呈现良好的对非洲猪瘟病毒的免疫攻毒保护作用，可保护易感猪免受ASFV强毒的自然感染或人为攻毒，用于非洲猪瘟的预防。
本发明的实验证明了，本发明提供的一种基于7种ASFV结构蛋白的组合及由其制备的疫苗，用该类疫苗免疫猪以后，可保护易感猪免受ASFV的自然感染或人为攻击，用于非洲猪瘟的预防，即由这类结构蛋白、或表达这类蛋白的基因表达载体、或表达这类蛋白的mRNA、或表达这类蛋白的重组病毒分别组合在一起，免疫猪以后，可完全抵抗强毒的攻击而不发病。
附图说明
图1为实施例1中7个结构蛋白基因扩增引物序列及预期产物大小。其中斜体字部分表示同源臂。
图2为实施例1中加压20d后的正常HEK293细胞和转染(pCMV-Sec-F317L)细胞。图2中A为正常HEK293细胞，图2中B为转染后出现的细胞克隆。
图3为实施例1中表达产物的ELISA检测结果。其中ASFV血清为抗ASFV阳性血清，His单抗为抗his标签抗体。
图4为实施例1中7个重组结构蛋白免疫及各对照组攻毒结果。
图5为实施例2中7个结构蛋白基因扩增引物序列及预期产物大小。其中斜体部分为同源臂，目的片段大小为目的基因加同源臂后的大小。
图6为实施例2中ASFV 7个结构蛋白基因疫苗的构建示意图。
图7为实施例2中ASFV 7个结构蛋白基因疫苗及对照免疫猪攻毒结果。
图8为实施例3中ASFV结构蛋白基因mRNA疫苗构建流程示意图。其中T7 promotor为T7启动子序列；5’-UTR为5’-端非翻译区；MCS为多克隆位点；3’-UTR为3’-端非翻译区；polyA为多聚A信号区；ASFV gene分别表示F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10七个基因。
图9为实施例3中ASFV 7个结构蛋白mRNA疫苗及对照免疫猪攻毒结果。
图10为实施例4中各基因(F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10)扩增引物及预期产物大小。其中斜体标注部分为同源臂序列，片段大小为目的基因加同源臂后大小。
图11为实施例4中重组腺病毒滴度测定结果。
图12为实施例4中非洲猪瘟病毒结构蛋白基因-重组腺病毒构建示意图。其中ASFVgene可以分别是F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10等基因单独或2个及以上独立或融合的基因片段。
图13为实施例4中p30、p54、p72和pCD2v基因扩增引物及产物大小。其中斜体标注部分为同源臂序列，扩增产物大小为目的基因加同源臂后大小。
图14为实施例4中ASFV 7个结构蛋白重组腺病毒疫苗及对照免疫猪攻毒结果。
图15为实施例5中重组病毒特异性扩增引物及产物大小。斜体标注部分为同源臂序列，扩增产物大小为目的基因加同源臂后大小。
图16为实施例5中二、三基因融合重组病毒细胞培养滴度。
图17为实施例5中ASFV 7个结构蛋白多基因融合重组腺病毒疫苗及对照免疫猪攻毒结果。
图18为实施例6中7个ASFV结构蛋白基因扩增引物及片段大小、鉴定引物扩增产物大小。其中斜体字部分表示同源臂序列。
图19为实施例6中非洲猪瘟病毒结构蛋白基因-重组狂犬病病毒的构建和拯救过程示意图。
图20为实施例6中非洲猪瘟病毒基因-重组RABV滴度测定结果。
图21为实施例6中ASFV 7个结构蛋白重组狂犬病病毒疫苗及对照免疫猪攻毒结果。
图22为实施例7中ASFV 7个结构蛋白基因-重组腺病毒、重组狂犬病病毒联合免疫猪攻毒结果。
图23位实施例8中表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组腺病毒不同组合的免疫和攻毒试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中采用的细胞、毒株和载体如下：
1、HEK293细胞(购自美国Invitrogen公司)需在含有1％～10％胎牛血清的DMEM培养基或全悬浮培养基中培养。BHK-21细胞、Vero细胞(均购自中国兽医药品监查所)需在含有1％～10％胎牛血清的DMEM培养基或全悬浮培养基中培养。
2、外源基因的表达质粒载体pacAd5 CMVK-NpA、骨架质粒pacAd5 9.2-100、pCMV-Sec载体(均购自美国Invitrogen公司)均在大肠杆菌中扩增和提取。
3、狂犬病病毒疫苗株SRV9记载于如下文献中：岳军明，侯世宽，殷震.狂犬病疫苗口服免疫的研究现状[J].中国人兽共患病杂志,1994,10(3):32-35.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
4、非洲猪瘟病毒SY18株(记载在如下文献中：Zhou X,Li N,Luo Y,Liu Y,Miao F,Chen T,Zhang S,Cao P,Li X,Tian K,Qiu HJ,Hu R(2018)Emergence of African SwineFever in China,2018.Transboundary and emerging diseases 65(6):1482-1484.doi:10.1111/tbed.12989)，由军事兽医研究所流行病学研究室于2018年分离。本病毒的基因组序列的GenBank登录号：MH766894(2018年8月17日提交)，本申请使用毒株为采用PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。
下述实施例中的蛋白质和核酸分子的序列如下：
蛋白质pF317L的氨基酸序列为SEQ ID No.1；蛋白质p72的氨基酸序列为SEQ IDNo.2；蛋白质pA104R的氨基酸序列为SEQ ID No.3；蛋白质pM1249L的氨基酸序列为SEQ IDNo.4；蛋白质pB438L的氨基酸序列为SEQ ID No.5；蛋白质pCP530R的氨基酸序列为SEQ IDNo.6；蛋白质p10的氨基酸序列为SEQ ID No.7。
基因F317L的核苷酸序列为SEQ ID No.8；基因p72的核苷酸序列为SEQ ID No.9；基因A104R的核苷酸序列为SEQ ID No.10；基因M1249L的核苷酸序列为SEQ ID No.11；基因B438L的核苷酸序列为SEQ ID No.12；基因CP530R的核苷酸序列为SEQ ID No.13；基因p10的核苷酸序列为SEQ ID No.14。
mRNA分子mF317L的核苷酸序列为SEQ ID No.15；mRNA分子mp72的核苷酸序列为SEQ ID No.16；mRNA分子mA104R的核苷酸序列为SEQ ID No.17；mRNA分子mM1249L的核苷酸序列为SEQ ID No.18；mRNA分子mB438L的核苷酸序列为SEQ ID No.19；mRNA分子mCP530R的核苷酸序列为SEQ ID No.20；mRNA分子mp10的核苷酸序列为SEQ ID No.21。
下述实施例中的抗ASFV阳性血清为ASFV耐过猪血清，ASFV抗体强阳性。
实施例1、非洲猪瘟病毒7个目标基因表达蛋白的获得及免疫攻毒保护试验
一、ASFV7个结构蛋白基因重组质粒pCMV-Sec-X的构建及鉴定
1.采用普通PCR方法，分别以ASFV基因组为模板，扩增7个目标结构蛋白基因，扩增基因所用引物(SEQ ID No.22-SEQ ID No.35)分别如图1所示，图1中斜体字部分表示同源臂。扩增产物为结构蛋白基因X片段(即分别为结构蛋白基因F317L片段、结构蛋白基因p72片段、结构蛋白基因A104R片段、结构蛋白基因M1249L片段、结构蛋白基因B438L片段、结构蛋白基因CP530R片段、结构蛋白基因p10片段)。
2.连接
PCR扩增的结构蛋白基因X片段，与通过PCR扩增或酶切等方法获得的pCMV-Sec载体线性化片段，使用infusion同源重组方法将两者进行连接，以获得重组质粒。其中，pCMV-Sec载体线性化片段由限制性内切核酸酶SfiI和ApaI酶切pCMV-Sec载体得到，结构蛋白基因X片段的两端具有载体酶切位点两侧的同源臂。
连接完成后，连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃温箱中倒置培养16-24h，待阳性菌落长出。
3.鉴定
从培养的LB平板中挑取有抗性的菌落，微量培养后，进行菌液PCR鉴定，鉴定引物选择载体通用引物。菌液PCR阳性菌液，继续扩大培养、提取质粒，质粒经测序验证正确后，命名为重组载体pCMV-Sec-X(X分别代表：F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10)。重组载体pCMV-Sec-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)，重组载体pCMV-Sec-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)，重组载体pCMV-Sec-A104R含有SEQ IDNo.10所示的DNA分子(基因A104R)，重组载体pCMV-Sec-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)，重组载体pCMV-Sec-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)，重组载体pCMV-Sec-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)，重组载体pCMV-Sec-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)。
二、七个目标蛋白的获得
1.细胞培养及对博来霉素(zeocin)敏感性测定
HEK293细胞在培养时使用含5％胎牛血清的DMEM培养基维持并传代。
预先配制含不同浓度zeocin(0、400、500、600、700、800μg/ml)的DMEM培养基(血清浓度仍为5％)；将细胞均匀铺于24孔板(4×6)各孔，待细胞密度约80％时，将各列培养基更换为含不同浓度zeocin的DMEM培养基；期间每隔3～4天换液，如此培养14d，观察细胞的变化，确定10～14天内使细胞全部死亡的最低浓度为最佳筛选浓度。
2.重组质粒转染HEK293细胞和阳性克隆的筛选
(1)将HEK293细胞铺于六孔板中，待细胞状态良好，分布均匀，密度约85％时，将待转染孔细胞的培养基更换为双无(无血清、无抗生素)的DMEM培养基，转染重组质粒pCMV-Sec-X(约3μg)。
(2)于37℃温箱中继续培养4～6h后，更换为正常含5％胎牛血清的DMEM培养基。
(3)约24h后，将转染孔细胞消化，以适当的比例与正常HEK293细胞混合并稀释，铺于96孔板；待细胞贴壁后，将培养基更换为含zeocin压力(最佳筛选浓度下)的DMEM培养基，进行加压筛选。每3～4d换液，待培养10d后，将血清浓度提高至10％，以保证阳性克隆在低密度条件下的生长；培养约20d后，标记观察到的阳性克隆，待克隆长满孔后，转移至24孔板中，待细胞贴壁后再加压，如此逐步进行细胞的扩大。待细胞培养至一定数量时，将贴壁后细胞的培养上清更换为不含血清的DMEM加压培养基，用于无血清上清的收集和表达产物的鉴定。
3.表达产物的直接ELISA方法鉴定
由于表达载体特点，表达产物的末端带有his标签，因此分别使用抗his标签抗体和抗ASFV阳性血清对无血清培养后收集的上清进行ELISA检测。
(1)包被：按照表1中所示顺序，分别向ELISA板中每孔加入100μL阳性对照(ASFV细胞培养物)、阴性对照(PBS、DMEM培养基、正常细胞上清)及待检样品(各细胞株表达上清)，每个样品做两个重复，于37℃温箱中包被2h。
表1、ELISA检测加样顺序
| 编号 | 样品名称 |
| A | PBS-1、PBS-2 |
| B | DMEM培养基-1、DMEM培养基-2 |
| C | 正常细胞上清-1、正常细胞上清-2 |
| D | 病毒对照-1、病毒对照-2 |
| E | p72-1、p72-2 |
| F | F317L-1、F317L-2 |
| G | A104R-1、A104R-2 |
| H | M1249L-1、M1249L-2 |
| I | p10-1、p10-2 |
| J | B438L-1、B438L-2 |
| K | CP530R-1、CP530R-2 |
表1中，A为PBS(磷酸盐缓冲液)，B为DMEM培养基，C为HEK293细胞培养上清液，D为阳性对照(ASFV细胞培养物)，E-K分别表示含有重组质粒pCMV-Sec-X的各细胞株表达上清。样品名称中的后缀“1”和“2”表示2个重复的编号。
(2)封闭：使用PBST洗涤三次后，每孔加入200μL 5％的脱脂奶粉封闭液，37℃条件下封闭2h。
(3)一抗：PBST洗涤三次后，2孔分别加入100μL工作浓度为1/10000倍稀释的抗his标签抗体和1/400倍稀释的抗ASFV阳性血清，37℃孵育1h。
(4)PBST洗去抗体后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色10min后，加入2M硫酸溶液终止显色。读取450nm下各孔吸光光度值(OD值)，记录并分析结果。
4.结果
4.1HEK293细胞对zeocin敏感性的测定
结果显示，600μg/ml的zeocin即可抑制正常HEK293细胞的生长。为更精确的筛选到阳性克隆，最终选取略高于此临界浓度的700μg/ml作为转染后筛选阳性克隆的最佳药物浓度；在完成阳性细胞系的鉴定后，使用600μg/ml的药物浓度维持阳性细胞系在加压条件下的生长和传代。
4.2阳性克隆的筛选
在将转染后的细胞与正常细胞混合铺板并施加以zeocin药物压力后，在14天左右可观察到部分存活下来并有分裂能力的疑似阳性细胞，到第20天左右，这些单个细胞依靠自身不断分裂聚成一小块细胞集合，镜下观察如图2所示。最终每种结构蛋白获得1个克隆，共获得7个此类细胞克隆，不断维持其生长传代后，收集表达产物进行免疫原性鉴定。
4.3七个结构蛋白表达产物ELISA检测
将7个结构蛋白基因转化细胞株的培养上清分别包被于ELISA反应板，按照间接ELISA操作程序，分别与抗ASFV阳性血清和抗his标签抗体进行反应，再分别与HRP标记的兔抗猪二抗及HRP标记兔抗鼠二抗进行反应，同时设空白PBS、空白细胞培养上清、培养基DMEM对照。反应后进行显色。结果显示，全部对照均成立。表达不同结构蛋白的7个细胞株的上清与抗ASFV阳性血清均发生了明显的特异性免疫反应(图3)。
4.4蛋白质的纯化
各细胞株表达上清200ml 12000×g离心10min，0.45μm滤膜过滤；Ni填料平衡液洗3次(除去20％乙醇保存液)；将处理好的上清，加到浓缩柱里，过滤完之后加入50ml平衡缓冲液，将黏附在膜上的蛋白清洗下来，得到蛋白预处理液；50ml蛋白预处理液与3ml Ni填料结合，4℃孵育颠倒摇晃过夜；将孵育过后的溶液加入到蛋白纯化柱内，待液体漏下纯化柱内只剩Ni填料，用20mM洗涤液和40mM洗涤液各洗3次，期间颠倒混匀1min，收集第一次洗脱液(目的是除杂)；向柱子内加入3ml洗脱液，洗三次，期间剧烈震荡，得到纯化后的带有his标签的重组蛋白pF317L、重组蛋白p72、重组蛋白pA104R、重组蛋白pM1249L、重组蛋白pB438L、重组蛋白pCP530R和重组蛋白p10。
四、七个结构蛋白组合物对猪的免疫攻毒效果
1.猪的免疫和攻毒
采用上述各个目标基因表达的带有his标签的重组蛋白pF317L、重组蛋白p72、重组蛋白pA104R、重组蛋白pM1249L、重组蛋白pB438L、重组蛋白pCP530R和重组蛋白p10，组合后进行免疫试验。具体步骤如下：
重组蛋白pF317L、重组蛋白p72、重组蛋白pA104R、重组蛋白pM1249L、重组蛋白pB438L、重组蛋白pCP530R和重组蛋白p10这7种重组结构蛋白各100μg，茯苓多糖100μg，用生理盐水溶解，定容至2ml，得到7种重组结构蛋白组合疫苗。每头份疫苗2ml。
重组蛋白p30、p54、p72和pCD2v这4种重组结构蛋白各100μg，茯苓多糖100μg，用生理盐水溶解，定容至2ml，得到4种重组结构蛋白组合疫苗。每头份疫苗2ml。其中，重组蛋白p30、p54、p72和pCD2v的制备方法同上，重组表达载体含有的p30基因的核苷酸序列如GenBank Accession No.59226957(Update Date 2020.10.13)，重组表达载体含有的p54基因的核苷酸序列如GenBank Accession No.59226978(Update Date 2020.10.13)，重组表达载体含有的p72基因的核苷酸序列如GenBank Accession No.59226937(UpdateDate2020.10.13)，重组表达载体含有的pCD2v基因的核苷酸序列如GenBank AccessionNo.59226986(Update Date 2020.10.13)。
15头长白猪，体重为15kg左右，随机分为3组，每组5头。
实验组(7个病毒结构蛋白疫苗免疫组)：将上述7种重组结构蛋白组合疫苗颈部肌肉注射5头猪。
对照免疫组(其他病毒蛋白疫苗免疫对照组)：将上述4种重组结构蛋白组合疫苗颈部肌肉注射5头猪。
上述两组分别免疫2次，间隔14日，每次免疫剂量一致，每头猪一次注射2ml。
空白攻毒对照组：以不注射任何ASFV蛋白或核酸、只注射等体积生理盐水的5头猪作为攻毒对照。按照日常饲养。
2.攻毒
第二次免疫后的第14日，对上述7个病毒结构蛋白疫苗免疫组(实验组)、其他病毒蛋白疫苗免疫对照组(对照免疫组)和空白攻毒对照组进行强毒攻毒：每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株。观察猪的存活情况。
组合的7个重组结构蛋白的免疫攻毒结果及各对照组攻毒结果如图4所示，可以看出，组合的7个重组结构蛋白免疫猪全部获得了攻毒保护，其他组包括空白攻毒对照组均无保护效果。表明选择的非洲猪瘟病毒7个结构蛋白组合(pF317L、p72、pA104R、pM1249L、pB438L、pCP530R、p10)具有明显的攻毒保护效果。
实施例2、非洲猪瘟病毒7个目标蛋白基因疫苗的获得及免疫攻毒保护试验
一、非洲猪瘟病毒7个目标蛋白DNA疫苗(基因疫苗)构建及鉴定
1.采用普通PCR方法，用图5中所示的引物(含载体同源臂，SEQ ID No.36-SEQ IDNo.49)，分别以基因F317L、基因p72、基因A104R、基因M1249L、基因B438L、基因CP530R和基因p10为模板，扩增F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10共7个基因片段。
2.通过In-fusion方法，将步骤1扩增的7个基因片段分别克隆到pcDNA3.1质粒载体(invitrogen公司产品)的EcoRV位点中(图6)，转化DH5α感受态细胞，通过抗性筛选、菌液PCR鉴定和序列测定，获得正确的重组质粒(重组载体)，分别命名为pcDNA3.1-F317L、pcDNA3.1-p72、pcDNA3.1-A104R、pcDNA3.1-M1249L、pcDNA3.1-B438L、pcDNA3.1-CP530R、pcDNA3.1-p10。
重组载体pcDNA3.1-F317L是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的F317L基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质pF317L。
重组载体pcDNA3.1-p72是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的p72基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质p72。
重组载体pcDNA3.1-A104R是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的A104R基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质pA104R。
重组载体pcDNA3.1-M1249L是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的M1249L基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质pM1249L。
重组载体pcDNA3.1-B438L是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的B438L基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质pB438L。
重组载体pcDNA3.1-CP530R是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的CP530R基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质pCP530R。
重组载体pcDNA3.1-p10是使用In-fusion克隆方法，将带有同源臂的p10基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，pcDNA3.1-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质p10。
二、非洲猪瘟病毒7个目标结构蛋白基因疫苗效力评价
1.免疫
针对七个目标结构蛋白的重组载体pcDNA3.1-F317L、pcDNA3.1-p72、pcDNA3.1-A104R、pcDNA3.1-M1249L、pcDNA3.1-B438L、pcDNA3.1-CP530R、pcDNA3.1-p10以100μg/头份/种的量等量混合(总体积2ml，溶剂为生理盐水)，得到含有重组载体组合物的DNA疫苗(基因疫苗)。每头份疫苗2ml。
15头长白猪，体重为15kg左右，随机分为3组，每组5头。
设置三个实验组如下：
实验组(7个病毒结构蛋白基因疫苗免疫组)：将上述7个结构蛋白DNA疫苗采用颈部肌肉注射免疫5头猪，先后免疫两次，间隔21日。
对照免疫组(其他病毒蛋白基因疫苗免疫对照组)：利用其他病毒蛋白(p30、p54、p72、pCD2v)基因疫苗作为对照(构建制备方法同以上基因疫苗方法)，采用颈部肌肉注射免疫5头猪，先后免疫两次，间隔21日。
空白攻毒对照组：以不注射任何ASFV蛋白或核酸、只注射等体积生理盐水的5头猪作为攻毒对照。按照日常饲养。
2.攻毒
7个结构蛋白的基因疫苗组合疫苗第二次免疫后21日，免疫猪连同不免疫攻毒对照猪每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株，观察28日，记录临床表现和最终结局。
3.结果
通过28日内观察，空白攻毒对照组和其他病毒蛋白(p30、p54、p72、pCD2v)基因疫苗(pcDNA3.1-p30、pcDNA3.1-p54、pcDNA3.1-p72、pcDNA3.1-pCD2v)免疫对照组的猪全部发病、死亡，发病时表现高烧、厌食、精神沉郁、便血等，但7个病毒结构蛋白基因疫苗免疫组的5头猪全部健活，没有厌食、精神沉郁、卧地、出血等任何异常临床表现，无体温升高。结果汇总如图7所示。图7中7个病毒结构蛋白基因疫苗组合为pcDNA3.1-F317L、pcDNA3.1-p72、pcDNA3.1-A104R、pcDNA3.1-M1249L、pcDNA3.1-B438L、pcDNA3.1-CP530R、pcDNA3.1-p10。其他病毒蛋白基因疫苗组合为pcDNA3.1-p30、pcDNA3.1-p54、pcDNA3.1-p72、pcDNA3.1-pCD2v。
实施例3、非洲猪瘟病毒7个目标蛋白mRNA疫苗的获得及免疫攻毒保护试验
一、F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10基因mRNA表达重组质粒的构建
1.基因的扩增或合成：利用F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10基因作为mRNA疫苗的制备基因，基因序列如SEQ ID No.8-SEQ ID No.14所示。在mRNA疫苗重组载体构建中位于第三段。
2.T7启动子序列：共21个核苷酸，通过合成获得。在重组载体构建中位于第一段。T7启动子的核苷酸序列见SEQ ID No.50。
3.基因的上、下游增加非编码序列(UTR)：上游非编码序列(UTR)为人转铁蛋白(transferrin)mRNA的5'-UTR，长30个碱基，核苷酸序列见SEQ ID No.51，在重组载体构建中位于第二段；下游非编码序列(UTR)为人转铁蛋白(transferrin)mRNA的3'-UTR，长171碱基，核苷酸序列见SEQ ID No.52，在重组载体构建中位于第四段。均为人工合成。
4.polyA序列：在3'-UTR的下游共有225个polyA信号序列，为牛生长激素polyA信号序列。核苷酸序列见SEQ ID No.53，在重组载体构建中位于第五段。人工合成。
5.表达单元的克隆：利用上述核苷酸元件，按照T7启动子、5'-UTR、基因X(X分别代表F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10基因)、3'-UTR、polyA序列的先后顺序，通过同源重组(in-fusion技术)插入pUC57质粒中，得到重组质粒pUC57-X-mRNA(pUC57-F317L-mRNA、pUC57-p72-mRNA、pUC57-A104R-mRNA、pUC57-M1249L-mRNA、pUC57-B438L-mRNA、pUC57-CP530R-mRNA、pUC57-p10-mRNA)。构建策略如图8。测序正确后备用。
重组载体pUC57-F317L-mRNA含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)，重组载体pUC57-p72-mRNA含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)，重组载体pUC57-A104R-mRNA含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)，重组载体pUC57-M1249L-mRNA含有SEQID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)，重组载体pUC57-B438L-mRNA含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)，重组载体pUC57-CP530R-mRNA含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)，重组载体pUC57-p10-mRNA含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)。
二、基因X-mRNA的制备(X代表7种结构蛋白基因)
1.取7种结构蛋白基因的重组质粒pUC57-X-mRNA，采用限制性内切酶Mlu I(NewEngland Biolab)进行酶切，回收7种线性化质粒。
2.转录得到mRNA：针对7种线性化质粒，分别利用转录试剂盒(mMESSAGEmMACHINETM T7 ULTRA Transcription Kit，货号AM1345，Thermofisher)建立反应体系(20μ1，可根据需要依次放大)为：1μg线性化质粒、2μl NTPs混合物(ATP、CTP、GTP和p-UTP浓度均为100mM)、2μ1 10×反应buffer、1μ1T7转录酶(含100IU)，其余为DEPC水。在37℃水浴中反应16h。
3.采用RNA纯化试剂盒(MEGAclearTM Transcription Clear-Up Kit，货号:AM1908，Thermofisher)分别纯化7种mRNA。
4.加帽：分别将纯化的7种mRNA在65℃孵育5min，用加帽试剂盒(T7 ARCA mRNA invitro Synthesis Kit即mRNA合成试剂盒(加帽加尾)，货号：MT0125，北京百奥莱博科技有限公司)进行加帽反应(可根据需要按照比例放大)。反应体系(均为试剂盒提供)组成包括：10×ScriptCap Capping buffer 10μ1、10mM GTP 10μ1、20mM SAM 2.5μl、RNaseInhibitor 2.5μ1、ScriptCap methyltransferase 4μl、ScriptCap Capping Enzyme 4μl、mRNA5μg，补足DEPC水。在37℃反应1h。
5.DNA模板去除：在7种反应产物中加入DNase I(每1μg mRNA加入1IU的DNase I)(DNase I，货号：D7073，上海碧云天生物技术有限公司)，37℃孵育1h。
6.用mRNA纯化试剂盒(MEGAclearTM Transcription Clear-Up Kit，货号：AM1908，Thermofisher)进行纯化，分别得到7种mRNA(mF317L、mp72、mA104R、mM1249L、mB438L、mCP530R、mp10)。
mRNA分子mF317L的核苷酸序列为SEQ ID No.15；mRNA分子mp72的核苷酸序列为SEQ ID No.16；mRNA分子mA104R的核苷酸序列为SEQ ID No.17；mRNA分子mM1249L的核苷酸序列为SEQ ID No.18；mRNA分子mB438L的核苷酸序列为SEQ ID No.19；mRNA分子mCP530R的核苷酸序列为SEQ ID No.20；mRNA分子mp10的核苷酸序列为SEQ ID No.21。
三、纳米脂质颗粒mRNA疫苗的制备
1.分别从-80℃保存的纯化的无核酸酶水溶解的mF317L、mp72、mA104R、mM1249L、mB438L、mCP530R、mp10各约30μg/头份，7种mRNA等量混合，溶剂为生理盐水，得到mRNA混合物溶液。
2.用纳米脂质颗粒包裹RNA疫苗：将分别含有32.5mg/ml、33.0mg/mL、32.5mg/mL、34.0mg/mL、33.2mg/mL、34.7mg/mL、33.0mg/mL的F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10基因的mRNA混合物溶液置于离心管中，将BHEM-Chol、PEG5k-b-PLGA11k、PLGA11k分别溶于色谱级三氯甲烷溶液中，按照每头份100μL BHEM-Chol(2mg)、350μL PEG5k-b-PLGA11k(21.875mg)和50μL PLGA11k(1.925mg)，加入到含mRNA混合物溶液的离心管中混合，总体积550μL(可根据需要按比例放大)。
3.将装有mRNA疫苗和BHEM-Chol、PEG5k-b-PLGA11k、PLGA11k的离心管置于冰水中，用经DEPC水冲洗的超声探头插入离心管溶液中，在80W功率条件下，以超声7s停3s的频率，超声乳化溶液70s，获得油相-水相初乳液；将5mL DEPC水沿管壁缓慢加到初乳液中，在80W功率条件下，以超声10s停3s的方式再次乳化70s，形成水相-油相-水相复乳液。
4.将复乳液转移到经DEPC处理并高压灭菌的无核酸酶的100ml圆底烧瓶中，用旋转蒸发器在低温条件下缓慢减压旋蒸，以除去乳液中的三氯甲烷，浓缩，其水相体积到1ml(可根据需要按比例放大)，即得到纳米脂质颗粒包裹的mRNA疫苗(含有mRNA分子组合物的mRNA疫苗)，转移到经DEPC处理的贮存瓶内于-80℃保存待用。
制备的mRNA疫苗含有mRNA分子组合物，mRNA分子组合物包括mRNA分子mF317L(SEQID No.15)、mp72(SEQ ID No.16)、mA104R(SEQ ID No.17)、mM1249L(SEQ ID No.18)、mB438L(SEQ ID No.19)、mCP530R(SEQ ID No.20)和mp10(SEQ ID No.21)。
四、非洲猪瘟病毒7个结构蛋白mRNA疫苗效力评价
1.免疫
F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10基因的mRNA混合mRNA疫苗的免疫和攻毒试验：将制备的纳米脂质颗粒包裹的mRNA疫苗(含7种mRNA)等量混合物550微升，进一步稀释至2ml/头份，15头长白猪，体重为15kg左右，随机分为3组，每组5头，每头猪一次注射2ml。设置三个实验组如下：
实验组(7个病毒结构蛋白mRNA疫苗免疫组)：将上述步骤三得到的mRNA疫苗通过颈部肌肉注射免疫5头猪，免疫一次。
对照免疫组(其他病毒蛋白mRNA疫苗免疫对照组)：利用其他病毒蛋白(p30、p54、p72、pCD2v)mRNA疫苗作为对照(构建制备方法同以上mRNA疫苗方法)，通过颈部肌肉注射免疫5头猪，免疫一次。
攻毒对照组(空白对照组)：以不注射任何ASFV蛋白或核酸、只注射等体积生理盐水的5头猪作为攻毒对照，按照日常饲养。
2.攻毒
mRNA组合疫苗在免疫后21日，免疫猪连同不免疫攻毒对照猪每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株，观察28日，记录临床表现和最终结局。
3.结果
通过28日内观察，不免疫攻毒对照组(空白对照组)和其他病毒蛋白(p30、p54、p72、pCD2v)mRNA疫苗免疫对照组的猪全部发病、死亡，7个结构蛋白的mRNA疫苗免疫的5头猪全部健活。结果汇总如图9所示。
实施例4、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组腺病毒及免疫效果
一、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组腺病毒构建
本实施例是提供表达非洲猪瘟病毒目标基因F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10的重组腺病毒的构建(其他复制缺陷型和可复制型载体DNA病毒的ASFV基因重组毒的构建和使用策略相似)。
1、同源重组质粒的构建
采用常规方法提取非洲猪瘟病毒SY18株基因组，分别设计带有表达质粒载体pacAd5CMVK-NpA同源臂的ASFV F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10目标基因的引物(SEQ ID No.54-SEQ ID No.67)，引物序列如图10所示。以SY18株基因组为模板，采用PCR方法分别扩增，获得各个基因的同源重组基因片段。
下述重组质粒为将各个基因片段插入质粒pacAd5 CMVK-NpA(人5型腺病毒表达载体)的EcoRI位点得到的质粒。
将上述各个基因的同源重组基因片段分别与EcoRI酶切后得到的线性化pacAd5CMVK-NpA质粒连接，再转化大肠杆菌感受态细胞，进行同源重组，分别获得如下7种重组质粒：pAdCMV-F317L、pAdCMV-p72、pAdCMV-A104R、pAdCMV-M1249L、pAdCMV-B438L、pAdCMV-CP530R、pAdCMV-p10。
上述7种重组质粒为分别将ASFV的F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10这些目标基因通过各个基因的同源重组基因片段插入pacAd5 CMVK-NpA质粒的EcoRI酶切位点中得到的载体。
重组载体pAdCMV-F317L是使用同源重组的方法，将带有同源臂的F317L基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)。
重组载体pAdCMV-p72是使用同源重组的方法，将带有同源臂的p72基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)。
重组载体pAdCMV-A104R是使用同源重组的方法，将带有同源臂的A104R基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)。
重组载体pAdCMV-M1249L是使用同源重组的克隆方法，将带有同源臂的M1249L基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)。
重组载体pAdCMV-B438L是使用同源重组的方法，将带有同源臂的B438L基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)。
重组载体pAdCMV-CP530R是使用同源重组的方法，将带有同源臂的CP530R基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)。
重组载体pAdCMV-p10是使用同源重组的方法，将带有同源臂的p10基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，pAdCMV-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)。
2、重组病毒的拯救和鉴定
将重组质粒pAdCMV-F317L、pAdCMV-p72、pAdCMV-A104R、pAdCMV-M1249L、pAdCMV-B438L、pAdCMV-CP530R、pAdCMV-p10和骨架质粒pacAd5 9.2-100分别采用PacI酶进行线性化，得到7种酶切后的重组质粒和酶切后的骨架质粒pacAd5 9.2-100。
分别将上述各个酶切后的重组质粒以一定比例(2微克)和酶切骨架质粒pacAd59.2-100(4微克)混合，再与12微升转染试剂(2000)混合后，加入2ml细胞培养液，均匀加入到细胞单层上，转染25cm2的长成单层的HEK293细胞，3天后，对转染的细胞进行传代，长至单层后，按照上述步骤分别进行第二次转染。
按以上步骤转染3次，观察到细胞有大量变圆等病变时，冻融细胞，收集并保存冻融液，分别记为P0代重组腺病毒，不同的基因片段记为不同的重组腺病毒；将P0代重组腺病毒按照一定比例(MOI值为0.1)接入25cm2细胞瓶(10ml培养液)的新鲜HEK293细胞中，2天病变后冻融，并收集保存冻融液，此为P1代重组腺病毒；重复上述步骤收集到P2、P3代重组腺病毒。
3、检测
将上述步骤2获得的表达各个目标基因的P3代重组腺病毒进行滴度测定，测定方法为：将病毒培养液作10倍系列稀释，共作12次稀释，每个稀释度接种8个重复孔，接种到96孔板的HEK293细胞上，接种量0.1ml/孔，接种后37℃培养5～6日时，在光镜下观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果如图11所示。
提取表达各个目标基因的P3代重组腺病毒的核酸，使用鉴定引物(SEQ ID No.54-SEQ ID No.67)进行重组腺病毒鉴定，引物序列和预期鉴定产物大小如图10中所示，扩增出目标大小片段则为目标重组腺病毒。
将上述表达各个目标基因的重组腺病毒分别命名ΔrAdv5-F317L、ΔrAdv5-p72、ΔrAdv5-A104R、ΔrAdv5-M1249L、ΔrAdv5-B438L、ΔrAdv5-CP530R、ΔrAdv5-p10。
重组腺病毒ΔrAdv5-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)；重组腺病毒ΔrAdv5-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)；重组腺病毒ΔrAdv5-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)；重组腺病毒ΔrAdv5-M1249L含有SEQ IDNo.11所示的DNA分子(基因M1249L)；重组腺病毒ΔrAdv5-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)；重组腺病毒ΔrAdv5-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)；重组腺病毒ΔrAdv5-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)。
非洲猪瘟病毒基因-重组腺病毒的构建过程示意图见图12。
二、表达非洲猪瘟病毒7个目标基因的重组腺病毒的免疫保护试验
采用上述步骤一制备的表达各个目标基因的重组腺病毒ΔrAdv5-F317L、ΔrAdv5-p72、ΔrAdv5-A104R、ΔrAdv5-M1249L、ΔrAdv5-B438L、ΔrAdv5-CP530R、ΔrAdv5-p10这7个重组腺病毒组合进行免疫和攻毒试验(其他复制缺陷型和可复制型载体DNA病毒以及这些基因的其他组合和使用策略相似)，具体如下：
1、免疫
7种结构蛋白重组病毒每种病毒均使用108.0TCID50，得到组合的疫苗(重组腺病毒疫苗)，总体积2ml，溶剂为生理盐水，且在每头份疫苗中加入100微克茯苓多糖。
15头长白猪，体重为15kg左右，随机分为3组，每组5头。
实验组(7个病毒结构蛋白重组腺病毒疫苗免疫组)：将上述添加了茯苓多糖的组合形式的疫苗分别注射猪颈部肌肉(每种病毒均使用108.0TCID50，每种病毒混合后每头份(总体积2ml)再加100微克茯苓多糖)，每组5头。
对照免疫组(其他病毒蛋白重组腺病毒疫苗免疫对照组)：利用分别表达p30、p54、p72和pCD2v基因的重组腺病毒的混合物作为对照(每种病毒均使用108.0TCID50，混合后每头份(2ml)再加100微克茯苓多糖)，每组5头。
分别表达p30、p54、p72和pCD2v基因的重组腺病毒分别按照步骤一中的重组腺病毒的构建方法制备，模板为非洲猪瘟病毒SY18株基因组，引物序列(SEQ ID No.68-SEQ IDNo.75)和扩增基因大小如图13。
提取表达p30、p54、p72和pCD2v基因的P3代重组腺病毒的核酸，使用鉴定引物(上游引物：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQ ID No.76)，下游引物：5’-CACTGCATTCTAGTTGTGGTTT-3’(SEQ ID No.77)进行重组腺病毒鉴定，预期鉴定产物大小如图13中所示，扩增出目标大小片段则为目标重组腺病毒。
上述两组(实验组、对照免疫组)分别免疫2次，间隔14日，每次免疫剂量一致。
攻毒对照组(空白对照组)：以不注射任何病毒、只注射等体积生理盐水的5头猪作为攻毒对照，按照日常饲养。
2、攻毒
第二次免疫后的第14日(以第二次免疫第一天记作第1日)采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述各个实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒：每头口服103.0TCID50/2mlASFV强毒SY18株。观察猪的存活情况。
组合的重组腺病毒的免疫攻毒结果如图14所示，可以看出，组合的7种结构蛋白的重组腺病毒有显著的攻毒保护效果，表明选择的非洲猪瘟病毒7个结构蛋白组合具有明显的攻毒保护效果。
实施例5、表达非洲猪瘟病毒多目标基因的重组腺病毒构建及免疫效果
本实施例提供了4个表达ASFV 1、2、3个结构蛋白基因融合重组腺病毒的构建和免疫效果(任意2个及以上结构蛋白基因串联表达的其他复制缺陷型和可复制型载体DNA重组病毒的构建和组合使用策略相似)，具体如下：
一、ASFV三基因融合重组腺病毒的构建
将p72基因序列+linker序列+p10基因序列+linker序列+B438L基因序列共3个基因的编码区依次通过overlap方法串联连接，得到三基因融合片段(A组，p72-p10-B438L)。
将F317L基因序列+linker序列+A104R基因序列共2个基因的编码区依次通过overlap方法串联连接，得到二基因融合片段(B组，F317L-A104R)。
上述linker序列为：
5’-gcaacaaacttctctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggaccg-3’(SEQID No.78)。
按照实施例4的步骤一中的重组腺病毒构建方法分别构建三基因融合重组腺病毒和二基因融合重组腺病毒：先将各个二、三基因融合片段扩增后得到同源重组片段(以二、三基因融合片段为模板，扩增所需引物和产物大小如图15所示)，通过同源重组构建到pacAd5CMVK-NpA质粒的EcoRI酶切位点中，得到重组质粒，再将重组质粒和骨架质粒pacAd59.2-100转染到HEK293细胞，收获冻融液，直到得到各个P3代二、三基因融合重组腺病毒，分别命名为ΔrAdv5-p72-p10-B438L(A)和ΔrAdv5-F317L-A104R(B)。
ΔrAdv5-M1249L和ΔrAdv5-CP530R为实施例4步骤一中制备的重组腺病毒。
上述重组腺病毒ΔrAdv5-F317L-A104R含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)和SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)；重组腺病毒ΔrAdv5-p72-p10-B438L含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)、SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)和SEQID No.12所示的DNA分子(基因B438L)。
每种融合基因(p72-p10-B438L和F317L-A104R)的扩增引物(SEQ ID No.79-SEQID No.82)及产物大小见图15。
提取表达各个融合基因的P3代重组腺病毒的核酸，使用鉴定引物(上游引物：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQ ID No.76)，下游引物：5’-CACTGCATTCTAGTTGTGGTTT-3’(SEQ ID No.77)进行重组腺病毒鉴定，预期鉴定产物大小如图15中所示，扩增出目标大小片段则为目标重组腺病毒。
按照常规方法测定各重组病毒的滴度，测定时，将获得的每个病毒培养液分别作10倍系列稀释，共作12次稀释，每个稀释度接种8个重复，接种到96孔板的HEK293细胞上，接种量0.1ml/孔，接种后37℃培养5～6日时，在光镜下观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果如图16所示。
二、基因融合重组腺病毒的免疫保护试验
1、免疫
15头长白猪，体重为15kg左右，随机分为3组，每组5头。
实验组：上述步骤一制备的各个二、三基因融合重组腺病毒(ΔrAdv5-p72-p10-B438L(A)和ΔrAdv5-F317L-A104R(B)、ΔrAdv5-M1249L和ΔrAdv5-CP530R分别取108.0TCID50，以A+B+ΔrAdv5-M1249L+ΔrAdv5-CP530R混合后(每种病毒均使用108.0TCID50，总体积2ml，溶剂为生理盐水)再加100微克茯苓多糖；注射猪颈部肌肉，免疫5头。
对照免疫组(其他病毒蛋白重组腺病毒疫苗免疫对照组)：用分别表达p30、p54、p72、pCD2v的重组腺病毒(同实施例4)的4种病毒混合物作为对照，每种病毒均使用108.0TCID50，总体积2ml，溶剂为生理盐水，混合后再加100微克茯苓多糖，免疫5头。
上述两组分别免疫2次，间隔14日，每次免疫途径和剂量一致，每头猪一次注射2ml。
攻毒对照组(空白对照组)：以不注射任何病毒、只注射等体积生理盐水的5头猪作为攻毒对照，按照日常饲养。
2、攻毒
攻毒第二次免疫后的第14日(以第二次免疫第一天记作第1日)采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒，口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株。观察猪的生存情况。
3、结果
7个结构蛋白基因的4个重组病毒(2个为单基因重组病毒、2个分别为二、三基因融合重组病毒)的免疫保护效果如图17所示，可以看出，不免疫对照猪全部发病、死亡，免疫传统载体疫苗组合的猪全部死亡，7个结构蛋白的融合基因的重组病毒组合免疫的5头猪全部健活。说明选择的7个结构蛋白基因及融合组合具有明显的攻毒保护效果，不同于传统的目的基因的选择。
实施例6、ASFV基因重组狂犬病病毒的构建及免疫原性检测
由ASFV F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10基因构建的可复制型重组狂犬病病毒的构建(其他可复制型RNA病毒载体构建策略类似)。
一、ASFV基因重组SRV9病毒的构建
1.狂犬病病毒(RABV)全长基因组转录载体的构建
(1)pcDNA3.1-SRV9-PacI质粒的线性化
以PacI酶切pcDNA3.1-SRV9-PacI质粒(在pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点中连入HamRZ-SRV9-pacI-HdvRZ序列(SEQ ID No.83)，包含核酶和SRV9毒株全长基因组cDNA序列，且在全长基因组的P和M基因之间引入PacI酶切位点，以便后续的外源基因克隆)，获得pcDNA3.1-SRV9-PacI线性化载体。
(2)表达外源基因重组载体质粒构建
扩增获得F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10基因片段(引物序列SEQID No.84-SEQ ID No.97和目的条带大小如图18所示)，两侧含有狂犬病病毒(RABV)同源臂。
用各基因片段分别与pcDNA3.1-SRV9-PacI线性化载体进行in-fusion连接，菌液PCR鉴定和核酸片段测序正确的质粒分别命名为pcDNA3.1-SRV9-F317L、pcDNA3.1-SRV9-p72、pc DNA3.1-SRV9-A104R、pcDNA3.1-SRV9-M1249L、pcDNA3.1-SRV9-B438L、pcDNA3.1-SRV9-CP530R、pcDNA3.1-SRV9-p10。上述重组质粒为将各个基因片段同源重组插入质粒pcDNA3.1-SRV9-PacI的PacI酶切位点间得到的质粒。
pcDNA3.1-SRV9-F317L含有SEQ ID No.8所示的DNA分子(基因F317L)，pcDNA3.1-SRV9-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)，pcDNA3.1-SRV9-A104R含有SEQ IDNo.10所示的DNA分子(基因A104R)，pcDNA3.1-SRV9-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)，pcDNA3.1-SRV9-B438L含有SEQ ID No.12所示的DNA分子(基因B438L)，pcDNA3.1-SRV9-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)，pcDNA3.1-SRV9-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)。
2、辅助质粒的构建
以EcoRV酶切线性化载体pcDNA3.1(购自Invitrogen)；以全长转录载体pcDNA3.1-SRV9-PacI为模板扩增获得SRV9-N、SRV9-P、SRV9-G和SRV9-L结构基因片段；将4个结构基因片段分别与线性化的载体质粒pcDNA3.1进行同源重组连接，转化大肠杆菌，测序鉴定出正确的质粒，分别命名为pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G和pcDNA3.1-L。备用于病毒的转染拯救。
pcDNA3.1-N为将SRV9-N基因(提交日为Jun 22,2004，GenBank:AF499686.2，第71～1423bp)插入到pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点间得到的质粒；
pcDNA3.1-P为将SRV9-P基因(提交日为Jun 22,2004，GenBank:AF499686.2，第1514～2407bp)插入到pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点间得到的质粒；
pcDNA3.1-G为将SRV9-G基因(提交日为Jun 22,2004，GenBank:AF499686.2，第3317～4891bp)插入到pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点间得到的质粒；
pcDNA3.1-L为将SRV9-L基因(提交日为Jun 22,2004，GenBank:AF499686.2，第5414～11797bp)插入到pcDNA3.1载体的EcoRV酶切位点间得到的质粒。
3.重组病毒的拯救
(1)提前12-24h，铺细胞BSR(金黄仓鼠肾细胞，上海细胞库，货号-BFN60810674)，于6孔板中，共准备2孔细胞，其中1个用于转染，1个用于空白对照。
(2)转染：待BSR细胞长至单层后，准备进行转染。转染体系如下表2(以p72基因为例，其余重组病毒的拯救方法相同)。
表2转染液的配制
(3)每天观察转染细胞状况，5～7天(根据细胞状态)，直接刮取细胞，吹打均匀，一部分接到新的单层BSR细胞中继续扩大培养，接种量为5％(V/V)；一部分用于直接免疫荧光鉴定(针对SRV9-N基因和p72基因)：根据孔中是否有荧光信号判定病毒是否拯救成功，外源基因p72是否正确表达。
(4)遗传稳定性鉴定：重组病毒连续传代10次，选取2、4、6、8、10共5个代次的病毒进行序列、滴度测定和免疫荧光鉴定。结果病毒传代后序列和蛋白特性表现稳定。最终获得的重组病毒命名为SRV9-p72。
以同样的方法，分别用其他重组质粒(pcDNA3.1-SRV9-F317L、pcDNA3.1-SRV9-A104R、pcDNA3.1-SRV9-M1249L、pcDNA3.1-SRV9-B438L、pcDNA3.1-SRV9-CP530R、pcDNA3.1-SR V9-p10)进行重组病毒的拯救，获得重组病毒SRV9-F317L、SRV9-A104R、SRV9-M1249L、SRV9-B438L、SRV9-CP530R、SRV9-p10。
上述SRV9-p72含有SEQ ID No.9所示的DNA分子(基因p72)；SRV9-F317L含有SEQ IDNo.8所示的DNA分子(基因F317L)；SRV9-A104R含有SEQ ID No.10所示的DNA分子(基因A104R)；SRV9-M1249L含有SEQ ID No.11所示的DNA分子(基因M1249L)；SRV9-B438L含有SEQID No.12所示的DNA分子(基因B438L)；SRV9-CP530R含有SEQ ID No.13所示的DNA分子(基因CP530R)；SRV9-p10含有SEQ ID No.14所示的DNA分子(基因p10)。
免疫荧光鉴定所需要的FITC标记RABV抗体购自吉林紫荆神州生物技术有限公司，产品目录号为ZJ-023-016。
提取表达各个目标基因的P3代重组狂犬病病毒的核酸，使用鉴定引物(上游引物：5’-TGGTGAGATAGCCAAGGTG-3’(SEQ ID No.98)，下游引物：5’-AACTCAGTATCATCAT CCCAAG-3’(SEQ ID No.99)进行外源基因鉴定，预期鉴定产物大小如图18中所示，扩增出目标大小片段则为目标重组腺病毒。
非洲猪瘟病毒结构蛋白基因-重组狂犬病病毒的构建和拯救过程见图19。
测定非洲猪瘟病毒基因-重组狂犬病病毒的滴度，测定时，将获得的每个重组病毒的培养液分别作10倍系列稀释，共作12次稀释，每个稀释度接种8个重复，接种到96孔板的BHK-21细胞上，接种量0.1ml/孔，接种后37℃培养4～5日时，进行荧光抗体染色。在荧光显微镜下观察病毒增殖情况，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果如图20所示。
二、表达非洲猪瘟病毒目标基因的重组SRV9病毒不同组合的免疫保护试验
ASFV F317L、p72、A104R、M1249L、B438L、CP530R、p10基因重狂犬病病毒的免疫和攻毒试验如下：
1、免疫
15头长白猪，体重为15kg左右，随机分为3组，每组5头。
实验组(7个病毒结构蛋白重组狂犬病病毒疫苗免疫组)：将SRV9-F317L、SRV9-p72、SRV9-A104R、SRV9-M1249L、SRV9-B438L、SRV9-CP530R、SRV9-p10共7个病毒各取108.0TCID50/ml，每种重组病毒等比例混合，每种病毒0.1ml，混合后(总体积2ml，溶剂为生理盐水)直接进行注射猪颈部肌肉，免疫5头。
免疫传统载体疫苗组合组(其他病毒蛋白重组狂犬病病毒免疫对照组)：分别用表达p30、p54、p72和pCD2v重组狂犬病病毒(构建方法和策略同上)的混合物作为对照，每种病毒均使用108.0TCID50，混合后(总体积2ml，溶剂为生理盐水)直接进行注射，免疫5头。
上述两组分别免疫2次，间隔14日，每次免疫途径和免疫剂量一致，每头猪一次注射2ml。
不免疫攻毒对照组(空白对照组)：以不注射任何病毒、只注射等体积生理盐水的5头猪作为攻毒对照，按照日常饲养。
2、攻毒
第二次免疫后的第14日(以第二次免疫第一天记作第1日)采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒(每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株)。观察28日，记录临床表现和最终结局。
结果如图21所示，攻毒结果通过28日内观察，不免疫对照猪全部发病、死亡，免疫传统载体疫苗组合的猪全部死亡，7个结构蛋白的重组狂犬病病毒实验免疫组5头猪全部健活。
实施例7、重组腺病毒和重组狂犬病病毒的免疫和攻毒试验
ASFV SRV9-F317L、SRV9-p72、SRV9-A104R、SRV9-M1249L、SRV9-B438L、SRV9-CP530R、SRV9-p10共7个重组狂犬病病毒和ΔrAdv5-p72、ΔrAdv5-F317L、ΔrAdv5-B438L、ΔrAdv5-M1249L、ΔrAdv-p10、ΔrAdv5-CP530R、ΔrAdv5-A104R共7个重组腺病毒的联合免疫和攻毒试验具体如下：
1、免疫
15头长白猪，体重为15kg左右，随机分为3组，每组5头。
实验组(联合免疫组)：ΔrAdv5-p72、ΔrAdv5-F317L、ΔrAdv5-B438L、ΔrAdv5-M1249L、ΔrAdv-p10、ΔrAdv5-CP530R、ΔrAdv5-A104R重组腺病毒和SRV9-F317L、SRV9-p72、SRV9-A104R、SRV9-M1249L、SRV9-B438L、SRV9-CP530R、SRV9-p10重组狂犬病病毒两组重组病毒组合；两组疫苗组合先(重组腺病毒)后(重组狂犬病病毒)肌肉注射猪颈部肌肉，间隔14日。每种重组腺病毒的滴度为108.0TCID50/ml，每种各取0.3ml等比例混合，混合后(总体积2.1ml，溶剂为生理盐水)直接进行免疫；每种重组狂犬病病毒的滴度为108.0TCID50/ml，每种各取0.3ml，等比例混合(总体积2.1ml，溶剂为生理盐水)，混合后直接使用进行免疫。共免疫5头猪，每头猪每次注射2.1ml。
单次免疫对照(重组腺病毒单次免疫)：采用重组腺病毒肌肉注射猪颈部肌肉，只免疫一次，每种重组腺病毒的滴度为108.0TCID50/ml，每种各取0.3ml等比例混合(总体积2.1ml，溶剂为生理盐水)，混合后直接进行免疫。共免疫5头猪，每头猪每次注射2.1ml。
不免疫攻毒对照组(对照组)：以不注射任何病毒、只注射等体积生理盐水的5头猪作为攻毒对照。按照日常饲养。
2、攻毒
联合免疫第二次免疫后14日、单次免疫后28日攻毒，免疫猪连同不免疫攻毒对照猪每头口服103.0TCID50/2ml ASFV强毒SY18株，观察28日，记录临床表现和最终结局。
结果如图22所示，攻毒结果通过28日内观察，不免疫对照猪全部发病、死亡。联合免疫组5头猪全部健活，单次免疫组5头猪2头死亡，3头获得攻毒保护，但在攻毒后出现了明显的发热和轻度精神沉郁。
实施例8、表达非洲猪瘟病毒目标基因重组腺病毒不同组合的免疫和攻毒试验
5种蛋白重组病毒(ΔrAdv5-p72、ΔrAdv5-B438L、ΔrAdv5-M1249L、ΔrAdv5-CP530R、ΔrAdv5-A104R)每种病毒均使用108.0TCID50，得到组合的疫苗(重组腺病毒疫苗1)，总体积2ml，溶剂为生理盐水，且在每头份疫苗中加入100微克茯苓多糖。
8种蛋白重组病毒(ΔrAdv5-p72、ΔrAdv5-F317L、ΔrAdv5-B438L、ΔrAdv5-M1249L、ΔrAdv-p10、ΔrAdv5-CP530R、ΔrAdv5-A104R、ΔrAdv5-p54)每种病毒均使用108.0TCID50，得到组合的疫苗(重组腺病毒疫苗2)，总体积2ml，溶剂为生理盐水，且在每头份疫苗中加入100微克茯苓多糖。
2种组合形式的重组腺病毒组合的免疫和攻毒试验具体如下：
20头长白猪，体重为15kg左右，随机分为4组，每组5头。
实验组1(5个病毒蛋白重组腺病毒疫苗免疫组)：将上述添加了茯苓多糖的组合形式的疫苗1注射猪颈部肌肉(每种病毒均使用108.0TCID50，每种病毒混合后每头份(总体积2ml)再加100微克茯苓多糖)，每组5头。
实验组2(8个病毒蛋白重组腺病毒疫苗免疫组)：将上述添加了茯苓多糖的组合形式的疫苗2分别注射猪颈部肌肉(每种病毒均使用108.0TCID50，每种病毒混合后每头份(总体积2ml)再加100微克茯苓多糖)，每组5头。
对照免疫组(其他病毒蛋白重组腺病毒疫苗免疫对照组)：利用分别表达p30、p54、p72和pCD2v基因的重组腺病毒的混合物作为对照(每种病毒均使用108.0TCID50，混合后每头份(2ml)再加100微克茯苓多糖)，每组5头。
上述三组(实验组1、实验组2、对照免疫组)分别免疫2次，间隔14日，每次免疫剂量一致。
攻毒对照组(空白对照组)：以不注射任何病毒、只注射等体积生理盐水的5头猪作为攻毒对照，按照日常饲养。
2、攻毒
第二次免疫后的第14日(以第二次免疫第一天记作第1日)采用非洲猪瘟病毒SY18株对上述各个实验组、对照免疫组和攻毒对照组进行强毒攻毒：每头口服103.0TCID50/2mlASFV强毒SY18株。观察猪的存活情况。
3、结果
组合的重组腺病毒的免疫攻毒结果如图23所示，可以看出，组合的5种蛋白的重组腺病毒1和组合的8种蛋白的重组腺病毒2均具有显著的攻毒保护效果，表明在本发明所选7个基因的基础上减少2个基因或增加1个基因的组合仍具有明显的攻毒保护效果。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.用于预防非洲猪瘟的蛋白质组合物，其特征在于，所述蛋白质组合物由pF317L、p72、pA104R、pM1249L、pB438L、pCP530R和p10组成；或由p72、pA104R、pM1249L、pB438L和pCP530R组成；或由pF317L、p72、pA104R、pM1249L、pB438L、pCP530R、p10和p54组成；
所述pF317L为下述任一种蛋白质：
H1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
H2）在H1）所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述p72为下述任一种蛋白质：
H3）氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
H4）在H3）所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述pA104R为下述任一种蛋白质：
H5）氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
H6）在H5）所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述pM1249L为下述任一种蛋白质：
H7）氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
H8）在H7）所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述pB438L为下述任一种蛋白质：
H9）氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
H10）在H9）所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述pCP530R为下述任一种蛋白质：
H11）氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；
H12）在H11）所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述p10为下述任一种蛋白质：
H13）氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质；
H14）在H13）所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
编码所述p54核酸分子的核苷酸序列如GenBank Accession No. 59226978所示，Update Date 2020.10.13。
2.用于预防非洲猪瘟的核酸分子组合物，其特征在于，所述核酸分子组合物由编码权利要求1中所述pF317L的核酸分子、编码权利要求1中所述p72的核酸分子、编码权利要求1中所述pA104R的核酸分子、编码权利要求1中所述pM1249L的核酸分子、编码权利要求1中所述pB438L的核酸分子、编码权利要求1中所述pCP530R的核酸分子和编码权利要求1中所述p10的核酸分子组成；或由编码权利要求1中所述p72的核酸分子、编码权利要求1中所述pA104R的核酸分子、编码权利要求1中所述pM1249L的核酸分子、编码权利要求1中所述pB438L的核酸分子和编码权利要求1中所述pCP530R的核酸分子组成。
3.根据权利要求2所述的核酸分子组合物，其特征在于，所述核酸分子组合物为下述任一种：
A1）所述核酸分子组合物由核苷酸序列分别是SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的DNA分子组成；或由核苷酸序列分别是SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQID No.13所示的DNA分子组成；
A2）所述核酸分子组合物由核苷酸序列分别是SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的mRNA分子组成；或由核苷酸序列分别是SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQID No.20所示的mRNA分子组成。
4.用于预防非洲猪瘟的生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
B1）表达权利要求1所述蛋白质组合物的重组载体组合物或重组载体；
B2）表达权利要求1所述蛋白质组合物的重组微生物组合物或重组微生物；
B3）表达权利要求1所述蛋白质组合物的重组细胞组合物或重组细胞。
5.权利要求1所述蛋白质组合物的下述任一种应用：
C1）在制备用于预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；
C2）在制备用于诱导非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂中的应用。
6.权利要求2或3所述核酸分子组合物的下述任一种应用：
D1）在制备用于预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；
D2）在制备用于诱导非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂中的应用。
7.权利要求4所述生物材料的下述任一种应用：
E1）在制备用于预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；
E2）在制备用于诱导非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂中的应用。
8.根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于，所述产品为疫苗。
9.非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述非洲猪瘟疫苗为下述任一种：
F1）所述非洲猪瘟疫苗包括权利要求1所述的蛋白质组合物；
F2）所述非洲猪瘟疫苗包括权利要求2或3所述的核酸分子组合物；
F3）所述非洲猪瘟疫苗包括权利要求4中所述的生物材料。
10.根据权利要求9所述的非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述非洲猪瘟疫苗为亚单位疫苗、核酸疫苗或重组微生物疫苗。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102967703A (zh) * | 2012-09-06 | 2013-03-13 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种用于elisa诊断的生物安全性非洲猪瘟抗原多因子血清 |
| CN112472801A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-03-12 | 华南农业大学 | 非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用 |
| CN112876570A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-06-01 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 非洲猪瘟病毒疫苗及其制备方法 |
| CN113365656A (zh) * | 2018-11-15 | 2021-09-07 | 堪萨斯州立大学研究基金会 | 用于非洲猪瘟病毒的免疫原性组合物 |
| CN113543801A (zh) * | 2019-03-27 | 2021-10-22 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 含有非洲猪瘟病毒肽及蛋白的免疫原性组合物及疫苗以及其用途 |
| CN113831394A (zh) * | 2021-11-29 | 2021-12-24 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种非洲猪瘟病毒asfv基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗 |
| CN114375199A (zh) * | 2019-07-29 | 2022-04-19 | 皮尔布莱特研究所 | 非洲猪瘟疫苗 |
| CN115772528A (zh) * | 2022-12-01 | 2023-03-10 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 用于预防非洲猪瘟的腺病毒载体疫苗及其应用 |
-
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- 2023-04-04 CN CN202310351751.7A patent/CN116284261B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102967703A (zh) * | 2012-09-06 | 2013-03-13 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种用于elisa诊断的生物安全性非洲猪瘟抗原多因子血清 |
| CN113365656A (zh) * | 2018-11-15 | 2021-09-07 | 堪萨斯州立大学研究基金会 | 用于非洲猪瘟病毒的免疫原性组合物 |
| CN113543801A (zh) * | 2019-03-27 | 2021-10-22 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 含有非洲猪瘟病毒肽及蛋白的免疫原性组合物及疫苗以及其用途 |
| CN114375199A (zh) * | 2019-07-29 | 2022-04-19 | 皮尔布莱特研究所 | 非洲猪瘟疫苗 |
| CN112472801A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-03-12 | 华南农业大学 | 非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用 |
| CN112876570A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-06-01 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 非洲猪瘟病毒疫苗及其制备方法 |
| CN113831394A (zh) * | 2021-11-29 | 2021-12-24 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种非洲猪瘟病毒asfv基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗 |
| CN115772528A (zh) * | 2022-12-01 | 2023-03-10 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 用于预防非洲猪瘟的腺病毒载体疫苗及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Subunit Vaccine Approaches for African Swine Fever Virus;Natasha N. Gaudreault等;《vaccines》;第7卷(第56期);第1-20页 * |
| 周小双等.《猪海拾贝 猪场复养操作流程》.湘潭大学出版社,2020,第122-123页. * |
| 基于疫苗研究的非洲猪瘟防控现状;王蒙蒙等;《延边大学农学学报》;第45卷(第01期);第31-41+61页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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