CN111607605A

CN111607605A - 一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法

Info

Publication number: CN111607605A
Application number: CN202010482108.4A
Authority: CN
Inventors: 马永平
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2040-05-29
Also published as: CN111607605B

Abstract

本发明公开了一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法，属于疫苗领域。本发明将抗原蛋白通过融合表达连接到LTB26的两端，得到融合蛋白，再借助LTB26可自组装形成五聚体的特性，得到前述融合蛋白的五聚体。本发明的疫苗的活性成分正是前述融合蛋白的五聚体。本发明的疫苗不仅免疫原数量、种类丰富，且将LTB26免疫佐剂的活性与抗原肽的免疫原活性结合在一起，使疫苗能够刺激机体产生大量特异性抗体，激发有效的免疫反应，省去额外添加免疫佐剂的程序。融合到LTB26两端的还可以是抗原蛋白以外的其它蛋白，可应用于疫苗制备以外的领域，比如应用于抗体的大量制备，医学检测试剂盒研发等。

Description

一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法

技术领域

本发明属于疫苗领域。

背景技术

免疫接种(immunization)预防接种是把疫苗接种在健康人的体内使接种者在不发病的情况下产生针对特定病原体抗体，获得对特定疾病产生特异性免疫，达到防治某种传染病的目的。根据接种部位的不同，分为创伤性免疫接种(如注射、划痕等)和无创性接种(如滴鼻、喷雾等)。

目前，疫苗的研发主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗、重组基因工程疫苗、病毒载体疫苗和核酸疫苗5种技术路线【贾冰冰，李卫国.疫苗技术发展的历史与展望[J].生物学通报，2016，51(06)：1-3.】。传统的灭活疫苗和减毒活疫苗的研发因周期长，难以快速应对突发传染病防治的需求。灭活疫苗无法产生细胞免疫和粘膜免疫，对粘膜感染的病原体的保护性不高，而且灭活疫苗抗原的抗体滴度随时间而下降，需多次加强接种，需要抗原量比较大，成本比较高。只含有抗原的蛋白质亚单位疫苗和更优化精简的第四代表位(epitope)疫苗可以克服上述疫苗的某些缺点【贾冰冰，李卫国.疫苗技术发展的历史与展望[J].生物学通报，2016，51(06)：1-3.】，但是，蛋白质亚单位疫苗免疫原性较差，需要更加优良的免疫佐剂。

缺乏高效安全的人用佐剂是目前疫苗研究中遇到的最大问题，目前，98％以上的人用疫苗佐剂都是铝盐类佐剂(简称铝佐剂)，而含有铝佐剂疫苗的最大的缺点就是既不能冷冻干燥，又不能冰冻储存，必须贮存在2～8℃的恒温环境里，一旦接种了未经2℃-8℃存储和冷链运输的疫苗，首要风险是免疫无效。而且不能诱导Th1型细胞免疫应答，不能激活CTL对肿瘤细胞和胞内病原体感染细胞的清除；有诱导Ig E介导的I型超敏反应的副作用；接种点肿痛等，还可能出现发热、腹泻、头晕、呕吐等全身反应【贾冰冰，李卫国.疫苗技术发展的历史与展望[J].生物学通报，2016，51(06)：1-3.】。FDA批准的另3个人用佐剂是MF59(1％鲨烯，0.5％Tween 80和0.5％三油酸聚山梨脂的混合物)和AS03(维生素E、Tween 80和角鲨烯的混合物)和AS04(monophosphoryl lipid A(MPLA)与铝盐复配))，改善了铝佐剂的缺点，但使用范围有限。

在分析自2003年的SRAS、2005年人感染H5N1禽流感、2008年的手足口病、2009年甲型H1N1流感、2012年的MERS、2013年H7N9禽流感大范围流行，再到2019年底的新冠肺炎流行，我们发现三个规律：第一、不断有强致病性动物疫源性传染病感染人类；说明人类与已知和未知病毒引发的传染病的斗争将是长期性的。第二、以病毒性传染病为主，也面临无特效药(包括疫苗)可治的窘境。如2005年H5N1禽流感的死亡率为71.4％，2006年死亡率66.7％。第三、从感染部位和感染途径分析，近几年流行的病毒性烈性传染病大多数是通过飞沫感染呼吸道粘膜系统(手足口病病毒还可以通过消化道粘膜传播)发生病变。以COVID-19为例，除了感染呼吸道和肺部组织外，也感染肠粘膜组织出现腹泻症状【Shang W，etal.，The outbreak of SARS-CoV-2 pneumonia calls for viral vaccines.NPJVaccines.2020Mar 6；5：18.doi：10.1038/s41541-020-0170-0.】。而粘膜免疫系统是粘膜部位抵抗病原微生物的第一道防线，也是设计粘膜免疫疫苗的主要目标。因此，我们认为，通过开发粘膜免疫疫苗诱导粘膜免疫，是预防这类传染病的最佳方案。鉴于此，针对强致病性病原体(如病毒)的粘膜免疫疫苗研发的通用平台建设具有十分广阔的应用前景。而解决粘膜免疫佐剂又是基础中的基础。

LT蛋白属于A-B型细菌蛋白毒素家族，由一个毒性A亚单位(LTA)和五个聚集成环的B亚单位(LTB)组成，其中LTB可与细胞表面GM1和TLR2受体结合，具有粘膜免疫佐剂活性。LTB26是一种突变型LTB，有报道将LTB26与VP8联用，可大幅度提高机体对VP8的免疫反应强度(王秋娟.大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的突变型佐剂活性及其作用机制研究[D].2017.)。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种基于LTB26的多价表位和亚单位疫苗的构建方法。

本发明的技术方案如下：

一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法，所述方法包括：

将编码LTB26的基因的3’和5’两端都融合编码抗原表位或亚单位的基因，得到融合基因，表达的LTB26N、C两端都融合有编码抗原表位或亚单位的融合蛋白。

一种融合基因，它是在编码LTB26的基因的3’和5’两端都融合编码抗原表位或亚单位的基因，得到的融合基因；

优选的，所述编码抗原表位或亚单位的基因的长度为24-1500nt。

如前述的融合基因，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.5和6所示。

如前述的融合基因，所述编码抗原表位的基因的碱基序列如SEQ ID NO.3和4所示。

一种重组质粒，所述重组质粒是将前述的融合基因构建到基因表达载体上得到的质粒。

如前述的重组质粒，它是将前述的融合基因构建到pET32a载体上所得到的质粒。

一种融合蛋白，它是前述融合基因表达得到的蛋白。

一种蛋白五聚体，它是由前述的融合蛋白自组装形成的五聚体。

前述融合基因、前述质粒、前述融合蛋白或前述的蛋白五聚体在制备抗体或者疫苗中的用途。

一种基于LTB26的亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗以前述融合蛋白和/或前述的融合蛋白的五聚体为有效成分。

本发明中，“蛋白”是广义上的蛋白，指任何长度的氨基酸脱水缩合物，传统的“寡肽”、“多肽”也在本发明“蛋白”的定义范围内。

本发明的有益效果：

本发明在LTB26的基因上、下游都可以融合编码抗原蛋白的基因得到的融合蛋白，该融合蛋白可以自动组装成五聚体，放大了抗原分子的数量，直接增强了抗原剂量。

本发明的疫苗不仅免疫原数量大(每个五聚体最多可以有10个相同的抗原肽)、种类丰富(每个五聚体最多可以有10种不同抗原肽)，且将LTB26免疫佐剂的活性与抗原肽/抗原表位(例如新型冠状病毒的抗原表位)的免疫原活性结合在一起，使疫苗能够刺激机体产生大量特异性抗体，激发有效的免疫反应。

另外，在抗体生产领域，LTB26两端融合单价的抗原，可用于刺激免疫细胞生产更多的抗体，比单独使用抗原的效果明显更佳。这些抗体可用于科学研究或医学领域中的蛋白分离或检测。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：LTB26-重组亚单位二价疫苗模式。

图2：EP1-LTB26-EP2免疫效果(特异性IgG滴度)分析。

图3：LTB26-重组亚单位五价疫苗模式。

图4：LTB26-重组亚单位十价疫苗模式。

具体实施方式

实验材料和试剂：pET32a-LTB26-6×His、和pGEX-LTB26质粒由重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室构建和保存；原核表达载体pET32a，pGEX，E.coliTOP10、E.coliBL21(DE3)由重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室保存；雄性大鼠由重庆医科大学实验动物中心提供。T4连接酶，Taq普通酶，SalI，SacI，BamHI，Not I，蛋白质Marker，DNAMarker，Plasmid Mini kit I，Cycle-Pure Kit，胶回收试剂盒，IPTG，氨苄青霉素，BCA蛋白浓度测定试剂盒，PMSF等试剂。

实施例1 EP1-LTB26-EP2融合蛋白(二价疫苗)的制备：

1、重组表达

1.1 pET32-RBD EP1-LTB26-RBD EP2基因克隆与表达

a、合成重组目的基因：

将编码新型冠状病毒(SARS CoV-2)的受体结合结构域(RBD)的DNA序列(SEQ IDNO.1)的SacI(GAGCTC)和SalI(GTCGAC)酶切位点之间插入LTB26基因(SEQ ID NO.2)，相当于在LTB26两端连接新型冠状病毒的抗原表位EP1(SEQ ID NO.3)和EP2(SEQ ID NO.4)，形成EP1-LTB26-EP2融合基因。再将EP1-LTB26-EP2融合基因构建到普通大肠杆菌表达载体上(例如pET32a)。

涉及序列如下：

编码RBD的DNA序列(SEQ ID NO.1)：

SEQ ID NO.1中，划线部分表示酶切位点SacI(GAGCTC)和SalI(GTCGAC)。

LTB26基因(SEQ ID NO.2)：

编码EP1的DNA序列(SEQ ID NO.3，长度100bp)具体为：

编码EP2的DNA序列(SEQ ID NO.4，长度117bp)具体为：

EP1的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)为：FGEVFNATRFASVYAWNRKRI。

EP2的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)为：SNCVADYSV LYNSASFSTFKCYGVS。

b、转化大肠杆菌，制备重组菌

(1)将20ul上述pGEX-LTB26、pET32-EP1-LTB26-EP2、质粒DNA分别与50μlE.coli.BL21感受态细胞混合，冰上放置30分钟；

(2)42℃热休克90秒，立即冰浴1分钟；

(3)取50μl上述转化菌液混匀后均匀涂布于LA(含100ug/mL Amp的LB)培养板，在恒温培养箱中37℃倒置培养过夜。

(4)在LA培养板上挑选大小适中的菌落，通过菌落PCR初步筛选阳性克隆。

(5)鉴定正确的质粒公司测序。

1.2重组大肠杆菌的诱导表达

(1)接种上述重组菌的单克隆于LA培养基(100μg/ml Amp)，37℃250r/min摇床培养12h；

(2)将该菌液按1∶100的接种量转接至新鲜的LA培养基，在37℃摇床中继续培养，转速为200r/min，用分光光度计进行实时检测，当菌液OD₆₀₀值达到0.6-0.8(细菌对数生长期)时加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h。

(3)诱导表达的菌液在13000g下离心10min，弃掉上清，用细菌裂解液充分重悬菌体，在室温下裂解处理30min。

(4)通过离心分别收集菌液上清和沉淀，裂解处理后的标本通过12％SDS-PAGE进行分析。

1.3分离纯化

用磁珠纯化试剂盒(苏州海狸纳米科技公司)中的试剂裂解上述重组蛋白表达菌，2000rpm离心10min，上清液分别与1ml磁珠混合，室温下作用30min，置于磁性分离器分离，弃去上清液，用洗涤液洗磁珠10min，弃上清，用洗脱液洗涤磁珠5min，2000rpm离心10min，取上清，即为纯品EP1-LTB26-EP2融合蛋白，-20℃保存备用备用。

通常，LTB26在大肠杆菌表达过程中自动组装成五聚体；本实施例中，一个LTB26五聚体便携带5个相同的EP1和EP2抗原表位，使单一抗原肽的数量增加5倍而增强了抗原表位的免疫原性(图1)。

实验例2本发明EP1-LTB26-EP2二价疫苗多肽的安全性检测

1、实验方法

以雄性大鼠为动物模型，在大鼠腹腔注射本发明实施例1制备的EP1-LTB26-EP2，检测其安全性：

a)从重庆医科大学实验动物中心领取体重为3-4周龄的健康雄性大鼠6只。

b)将实施例1制备的具有免疫佐剂活性的EP1-LTB26-EP2用PBS缓冲液溶解。

c)将0.50ml浓度依次为1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml、50.0μg/ml、100.0μg/ml的EP1-LTB26-EP2(没有进行外源性内毒素检测和处理)经腹腔注射到上述a)所述的大鼠体内，3日内观察实验兔与对照之间的体征差异(如活动能力、取食能力、是否有震颤、竖毛、粪便拉稀等)，和存活情况，3日内共进行3次注射。

d)将第3次注射后的动物8小时后麻醉处死，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏进行病理学检测，同时以正常家兔的上述组织做对照。

2、实验结果

(1)注射后3小时内实验大鼠没有发现活动能力和取食能力的变化，也没有震颤、竖毛和粪便拉稀等其他体征差异和变化，更没有死亡个体。

(2)该EP1-LTB26-EP2进入动物体内后对心脏等主要的脏器无病理损害。

实验结果说明，本发明的EP1-LTB26-EP2用于体内使用是安全的。

实施例3本发明EP1-LTB26-EP2二价疫苗的有效性检测

1、实验方法

用实施例1制备的具有免疫佐剂活性的EP1-LTB26-EP2融合蛋白用PBS缓冲液溶解。按如下步骤进行有效性检测：

a)在重庆医科大学动物试验中心购买大鼠18只(雄性)，随机分为4组，每组6只。

b)将实施例1制备的EP1-LTB26-EP2融合蛋白(6.0μg/只)对4％水合氯醛麻醉的大鼠(1.0ml/100g)实施滴鼻免疫；PBS滴鼻作为对照。

c)初次免疫后的第7日进行上述b)相同的剂量第二次加强免疫，第14日进行第三次加强免疫，每次加强免疫前先要采集血液样本，-80℃保存备用。第21日采集第三次加强免疫后的血液标本，并将全部实验动物麻醉处死，-80℃保存备用。

d)用ELISA检测血液标本中抗EP1、EP2的特异性IgG抗体。

2、实验结果

与对照组相比，混合了本发明EP1-LTB26-EP2融合蛋白的动物的EP1和EP2检测到高水平特异性抗体(图2)。另外，单独用EP1和EP2作为抗原免疫动物，无法产生特异性IgG抗体。

实验结果说明，通过将EP1和EP2两种不同的抗原表位同时融合到LTB26的N端和C端，可以构建出重组亚单位二价疫苗。表明向LTB26两端连接抗原肽或抗原表位所得到的融合蛋白可形成五聚体，产生高水平特异性抗体，证明该方法可行高效。

实施例4 Pn-LTB26-Pn重组亚单位五价疫苗构建模式

将5个LTB26基因片段的上下游分别连接编码抗原肽P1、P2、P3、P4或P5的基因(每个LTB26片段连接一种抗原肽)，得到五个融合片段，分别连接启动子和终止子信号后，串联构建到pET32载体的Sac I与Sal I位点之间，得到pET32-Pn-LTB26-Pn(n＝1，2，3，4，5)表达载体，表达纯化后，可得到重组蛋白经自组装形成的重组亚单位五价疫苗模型(图3)。

实施例5 Pn-LTB-Px重组亚单位十价疫苗模式

将5个LTB26基因片段的上游分别连接编码抗原肽P1、P2、P3、P4或P5的基因，下游分别连接编码抗原肽P6、P7、P8、P9、P10的基因，得到五个融合片段，分别连接启动子和终止子信号后，串联构建到pET32载体的Sac I与Sal I位点之间，得到pET32-Pn-LTB26-Px(n＝1，2，3，4，5；x＝6，7，8，9，10)表达载体，可得到重组蛋白经自组装形成的重组亚单位十价疫苗模型(图4)。

通过将实施例3-5所示的串联融合表达改变为每个抗原单独与LTB26融合表达，然后分别混合再经变性-复性组装成双价或多价疫苗，仍然改变不了本发明的本质，属于本发明的常规替换形式。

通过将本发明所述的LTB26亚单位更换为其它细菌和植物等毒素AB5模式的B5五聚体的亚单位，仍然改变不了本发明的本质，属于本发明的常规替换形式。

综上，本发明通过LTB26可形成五聚体的原理，在LTB26两端融合抗原肽，构成单价或多价(二、三、四、五、六、七、八、九或十价)亚单位疫苗。该疫苗不仅免疫原数量、种类丰富，且将LTB26免疫佐剂的活性与抗原肽的免疫原活性结合在一起，使疫苗能够刺激机体产生大量特异性抗体，激发有效的免疫反应。在抗体生产领域，LTB26两端融合单价的抗原，可用于刺激免疫细胞生产更多的抗体，比单独使用抗原的效果明显更佳。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学

<120> 一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法

<130> GY363-2020P0110300CCZ

<150> 2020104652531

<151> 2020-05-27

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 219

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggatcctttg gcgaagtgtt taacgcgacc cgctttgcga gcgtgtatgc gtggaatcgc 60

aaacgcatta gcggcggcag cggtggtggt tcacctgagc tcgtcgaccc tggtggtggt 120

ggtagcggtt caggtagcaa ttgcgtggcg gattatagcg tgctgtataa cagcgcgagc 180

tttagcacct ttaaatgcta tggcgtgagc gcggccgcc 219

<210> 2

<211> 306

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 2

atgccccagt ctatgtcgaa ttccaccata aataacacac aaatatatac gataaatgac 60

aagatactat catatacgga atcgatggca ggcaaaagag aaatggttat cattacattt 120

aagagcggcg caacatttca ggtcgaagtc ccgggcagtc aacatataga ctcccaaaaa 180

aaagccattg aaaggatgaa ggacacatta agaatcacat atctgaccga gaccaaaatt 240

gataaattat gtgtatggaa taataaaacc cccaattcaa ttgcggcaat cagtatggaa 300

aactag 306

<210> 3

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatcctttg gcgaagtgtt taacgcgacc cgctttgcga gcgtgtatgc gtggaatcgc 60

aaacgcatta gcggcggcag cggtggtggt tcacct 96

<210> 4

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctggtggtg gtggtagcgg ttcaggtagc aattgcgtgg cggattatag cgtgctgtat 60

aacagcgcga gctttagcac ctttaaatgc tatggcgtga gcgcggccgc c 111

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp

1 5 10 15

Asn Arg Lys Arg Ile

20

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

1 5 10 15

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

20 25

Claims

1.一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法，其特征在于：所述方法包括：

将编码LTB26的基因的3’和5’两端都融合编码抗原表位或亚单位的基因，得到融合基因，表达的LTB26 N、C两端都融合有编码抗原表位或亚单位的融合蛋白。

2.一种融合基因，其特征在于：它是在编码LTB26的基因的3’和5’两端都融合编码抗原表位或亚单位的基因，得到的融合基因；

3.如权利要求2所述的融合基因，其特征在于：所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ IDNO.5和6所示。

4.如权利要求3所述的融合基因，其特征在于：所述编码抗原表位的基因的碱基序列如SEQ ID NO.3和4所示。

5.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒是将权利要求2～4任一所述的融合基因构建到基因表达载体上得到的质粒。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：它是将权利要求2～4任一所述的融合基因构建到pET32a载体上所得到的质粒。

7.一种融合蛋白，其特征在于：它是权利要求2～4任一所述融合基因表达得到的蛋白。

8.一种蛋白五聚体，其特征在于：它是由权利要求7所述的融合蛋白多肽自组装形成的五聚体。

9.权利要求2～4所述融合基因、权利要求5或6所述质粒、权利要求7所述融合蛋白或权利要求8所述的蛋白五聚体在制备抗体或者疫苗中的用途。

10.一种多价表位和亚单位疫苗疫苗，其特征在于：所述疫苗以权利要求7所述融合蛋白和/或权利要求8所述的融合蛋白的五聚体为有效成分。