CN110922456A

CN110922456A - 铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP-ExoU及制备方法和应用

Info

Publication number: CN110922456A
Application number: CN201911385097.1A
Authority: CN
Inventors: 郭刚; 冯强; 张欣; 熊蜂; 张娇娇; 卢文根; 杨念
Original assignee: Chongqing Alibei Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Alibei Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-28
Filing date: 2019-12-28
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-12-28
Also published as: CN110922456B

Abstract

本发明涉及细菌性抗原技术领域，公开了铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP‑ExoU及制备方法和应用，该疫苗重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的重组蛋白reSBP‑ExoU由部分SBP蛋白(Ala22‑Phe260)和部分无毒ExoU突变体(Ser100‑Asn360，S142A和Asp344Ala)通过柔性Linker—GSGGSG分子融合连接而成，该重组蛋白reSBP‑ExoU不仅解决了reSBP蛋白与人体适用的佐剂吸附差、reExoU不稳定的问题，还具有较好的免疫原性和免疫保护效果，这对下一步开发铜绿假单胞菌疫苗等免疫调控手段具有重要的意义。

Description

铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP-ExoU及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细菌性抗原技术领域，具体地，涉及一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白，编码所述疫苗重组蛋白的基因，插入有所述基因的表达载体，含有所述基因或载体的宿主细胞，所述疫苗重组蛋白或者所述基因或者所述表达载体或者所述宿主细胞在制备用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用，一种铜绿假单胞菌疫苗，所述疫苗重组蛋白或者所述基因或者所述表达载体或者所述宿主细胞在制备抗铜绿假单胞菌的抗体中的应用，一种生产权利要求1所述的疫苗重组蛋白的方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是烧伤、战创伤、机械通气患者等院内感染最常见的病原菌，可导致重症肺炎、肺功能衰竭、脓毒血症乃至死亡。WHO在2017年发布的《新抗生素研究、发现和全球抗生素耐药细菌优先性列表》中将PA列为第二，由此表明，PA感染流行导致的健康问题十分严重。由于PA对抗生素产生多重耐药或泛耐药性，临床治疗效果十分有限。数据显示，2016年PA总分离率为8.69％，特别是机械通气性肺炎中PA的分离率高达22.9％。PA对亚胺培南和美罗培南的年度耐药率已达到23.6％和20.9％。由于PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升，寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫。

由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。从免疫学角度入手，研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择，但目前还未见有上市的铜绿假单胞菌疫苗。综上所述，现有技术存在的问题是：研究疫苗的关键是寻找到免疫原性和免疫保护效果好的抗原。研发基因工程疫苗的关键是如何从成千上万的病原体蛋白质组中筛选到良好的保护性抗原分子。

PA的SBP蛋白全称为ABC transporter substrate-binding protein，已经有研究表明(国家发明专利申请201811382091.4)重组表达的SBP(reSBP)蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果，具体表现在reSBP免疫小鼠产生的抗体效价几何平均滴度为1:47200，抗体阳性率达到100％；此外，在致死性PA感染肺炎模型中SBP免疫表现出的保护率高达73.3％。但是，reSBP蛋白由于其特殊的物理特性，与人体适用的佐剂(如氢氧化铝、磷酸铝)吸附性较差，限制了其保护性效果以及与其它保护性抗原的联合应用。

PA外毒素U(ExoU)是PA的关键致病分子之一，因此，无毒的ExoU分子可作为良好的候选抗原，通过诱导针对ExoU的抗体等的免疫应答反应，发挥其保护效果。已经有研究表明(国家发明专利申请201811365156.4)重组表达突变的ExoU蛋白(rExoU)具有良好的免疫原性和免疫保护效果，亦是良好的PA基因工程疫苗候选抗原。但是rExoU还是存在稳定性差、易沉淀和降解的难题，限制了其作为疫苗抗原的应用。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的研究团体通过理性设计融合片段的选择，优化了蛋白单体的排序方式和连接的Linker，并且在充分分析蛋白的分子结构、表面电荷分布、结构易近性等的基础上，从成百个上千个设计的重组蛋白中筛选到了SBP和ExoU的可溶性融合方式，该蛋白reSBP-ExoU由部分SBP蛋白(Ala22-Phe260)和部分无毒ExoU突变体(Ser100-Asn360，S142A和Asp344Ala)通过柔性Linker—GSGGSG分子融合连接而成，具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。进一步发现该重组蛋白reSBP-ExoU不仅解决了reSBP蛋白与人体适用的佐剂吸附差、reExoU不稳定的问题，还具有较好的免疫原性和免疫保护效果，这对下一步开发铜绿假单胞菌疫苗等免疫调控手段具有重要的意义。

基于如上的研究成果，本发明第一方面提供了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白，该疫苗重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明第二方面提供了编码如上所述的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白的基因。

本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体插入有如上所述的基因。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有如上所述的基因或表达载体。

本发明第五方面提供了如上所述的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白、或者如上所述的基因、或者如上所述的表达载体、或者如上所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。

本发明第六方面提供了一种铜绿假单胞菌疫苗，该疫苗含有如上所述的疫苗重组蛋白。

本发明第七方面提供了如上所述的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白、或者如上所述的基因、或者如上所述的表达载体、或者如上所述的宿主细胞在制备抗铜绿假单胞菌的抗体中的应用。

本发明第八方面提供了一种生产如上所述的疫苗重组蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)培养如上所述的宿主细胞，诱导所述疫苗重组蛋白的编码基因进行表达；

(2)分离提纯所表达的疫苗重组蛋白。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

(1)本发明提供的重组蛋白reSBP-ExoU不仅解决了reSBP蛋白吸附差、reExoU不稳定的问题，还具有较好的免疫原性和免疫保护效果，这对下一步开发铜绿假单胞菌疫苗等免疫调控手段具有重要的意义；

(2)本发明采用基因工程技术克隆表达此重组蛋白，便于分离纯化，可直接与佐剂(如氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种；

(3)本发明提供的重组蛋白reSBP-ExoU，一个蛋白分子中就含有两个保护性抗原：SBP和ExoU。原生产方法需要分别制备抗原SBP和ExoU两个蛋白，而本发明只需要制备一个蛋白，就可以达到同样的效果。因此，本发明不仅大大简化了生产工艺，还降低了生产成本；

(4)本发明提供的重组蛋白reSBP-ExoU能够诱导动物产生特异性的抗体，从而具有免疫保护效果；利用本发明提供的重组蛋白reSBP-ExoU制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实，所述重组蛋白reSBP-ExoU诱导的免疫应答具有良好的抗PA感染的保护效果；

(5)本发明提供的重组蛋白reSBP-ExoU可在原核表达系统－大肠杆菌中表达，与从天然的铜绿假单胞菌的菌体中提取SBP和ExoU和其它重组表达系统相比，本发明成本低，产量高。

附图说明

图1：重组质粒pGex-6P-2-reSBP-ExoU的双酶切鉴定结果：

泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2：重组表达质粒pGEX-6p-2-reSBP-ExoU经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约5000bp和约1500bp。

图2：诱导表达的重组蛋白reSBP-ExoU的鉴定结果

泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道2：结合诱导表达的超声上清的GlutathioneSepharose 4B填料；泳道3和泳道4：经PP酶酶切后的上清；泳道5：经PP酶酶切后的Glutathione Sepharose 4B填料。

图3：纯化后的重组蛋白reSBP-ExoU的SDS-PAGE电泳结果；

泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道2：纯化的重组蛋白reSBP-ExoU。

图4：reSBP-ExoU与Al(OH)₃佐剂吸附后SDS-PAGE检测上清的电泳结果；

泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道2：reSBP-ExoU蛋白；泳道3：Al(OH)₃佐剂吸附reSBP-ExoU蛋白后的上清；泳道4：rExoU蛋白；泳道5：rExoU蛋白，Al(OH)₃佐剂吸附rExoU蛋白后的上清。

图5：4℃放置后reSBP-ExoU蛋白的SDS-PAGE电泳结果；

泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道2：reSBP-ExoU蛋白，4℃放置0天；泳道3：reSBP-ExoU蛋白，4℃放置3天；泳道4：rExoU蛋白，4℃放置0天；泳道5：rExoU蛋白，4℃放置3天。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白，该疫苗重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1：

AESLTVAATPVPHAEILNVVKPLLAKEGVDLKIKEFTDYVQPNVQVSEKRLDANFFQHQPYLDEFNKAKGTDLVAVTGVHIEPLGAYSSKYKKLDELPSGATVVIPNDATNGGRALLLLDKAGVIKLKDNKSITATPKDIVDNPKNIKIRELEAATLPRVLTQVDMALINTNYALEAKLNPTKDALAIEGSDSPYVNILVARPDNKDSDAMQKLAKALHSAEIKQFIQEKYKGAVVPAFGSGGSGSRPPLTSLVLSGGGAKGAAYPGAMLALEEKGMLDGIRSMSGSAAGGITAALLASGMSPAAFKTLSDKMDLISLLDSSNKKLKLFQHISSEIGASLKKGLGNKIGGFSELLLNVLPRIDSRAEPLERLLRDETRKAVLGQIATHPEVARQPTVAAIASRLQSGSGVTFGDLDRLSAYIPQIKTLNITGTAMFEGRPQLVVFNASHTPDLEVAQAAHISGSFPGVFQKVSLSDQPYQAGVEWTEFQAGGVMINVPVPEMIDKN

根据本发明，还可以对本发明提供的重组蛋白进行修饰，修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰形式还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。修饰形式还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能等。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对所述重组蛋白进行添加修饰，举例来说，可以通过在所述重组蛋白的氨基末端和/或羧基末端连接下表1所示的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明的重组蛋白的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

表1

根据本发明一种优选的实施方式，所述重组蛋白在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端连接有1个26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GTS)标签，该标签的使用使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

上述重组蛋白可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。

第二方面，本发明还提供了能够编码上述重组蛋白的基因。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的与所述重组蛋白功能相同的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述重组蛋白功能相同的氨基酸序列。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2。

SEQ ID NO：2：

GCAGAAAGCCTGACCGTTGCAGCAACACCGGTTCCGCATGCAGAAATTCTGAATGTTGTTAAACCGCTGCTGGCAAAAGAAGGTGTTGATCTGAAAATCAAAGAGTTTACCGATTACGTTCAGCCGAATGTTCAGGTTAGCGAAAAACGTCTGGATGCCAACTTTTTTCAGCATCAGCCGTATCTGGATGAGTTCAATAAAGCAAAAGGCACCGATCTGGTTGCAGTTACCGGTGTTCATATTGAACCGCTGGGTGCATATAGCAGCAAATACAAAAAACTGGATGAACTGCCGAGCGGTGCAACCGTTGTTATTCCGAATGATGCAACCAATGGTGGTCGTGCACTGCTGCTGCTGGATAAAGCCGGTGTTATTAAACTGAAAGACAACAAAAGCATTACCGCCACGCCGAAAGATATTGTTGATAATCCGAAAAACATCAAAATCCGCGAACTGGAAGCAGCAACCCTGCCTCGTGTTCTGACCCAGGTTGATATGGCACTGATTAATACCAATTATGCCCTGGAAGCAAAACTGAATCCGACCAAAGATGCACTGGCAATTGAAGGTAGCGATAGCCCGTATGTTAATATTCTGGTTGCCCGTCCGGATAATAAAGATAGTGATGCAATGCAGAAACTGGCCAAAGCACTGCATAGCGCAGAAATTAAACAGTTTATCCAAGAAAAGTACAAAGGTGCAGTTGTTCCGGCATTTGGTAGCGGTGGTAGTGGTAGCCGTCCGCCTCTGACCAGCCTGGTTCTGAGCGGTGGTGGTGCAAAAGGTGCCGCATATCCGGGTGCAATGCTGGCACTGGAAGAAAAAGGTATGCTGGATGGTATTCGTAGCATGAGCGGTAGCGCAGCAGGCGGTATTACCGCAGCACTGCTGGCGAGCGGTATGAGTCCGGCAGCATTTAAAACCCTGAGCGATAAAATGGATCTGATTAGCCTGCTGGATTCGAGCAATAAAAAGCTGAAACTGTTCCAGCATATTAGCAGTGAAATTGGTGCAAGCCTGAAGAAAGGTCTGGGTAACAAAATTGGTGGTTTTAGCGAACTGCTGTTAAATGTTCTGCCTCGTATTGATAGCCGTGCAGAACCTCTGGAACGTCTGCTGCGTGATGAAACCCGTAAAGCAGTTCTGGGCCAGATTGCAACCCATCCGGAAGTTGCACGTCAGCCGACCGTGGCAGCCATTGCAAGCCGTCTGCAGAGCGGTTCAGGTGTTACCTTTGGTGATCTGGATCGTCTGAGCGCATATATTCCGCAGATTAAAACACTGAATATTACCGGCACCGCAATGTTTGAAGGTCGTCCGCAGCTGGTTGTTTTTAATGCAAGCCATACACCGGATCTGGAAGTTGCCCAGGCAGCACATATTAGCGGTAGCTTTCCGGGTGTTTTTCAGAAAGTTAGCCTGAGTGATCAGCCTTATCAGGCAGGCGTTGAATGGACCGAATTTCAAGCCGGTGGTGTTATGATTAATGTTCCGGTTCCGGAAATGATCGACAAGAAT

如上所述，相应地，本发明提供的核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有上表1所示的标签的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的基因。

根据本发明，重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pGEX系列质粒。重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pGEX-6p-2质粒，可用BamHⅠ、XhoⅠ等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pGEX-6p-2质粒及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体。其中，在优选采用pGEX系列质粒(例如，pGEX-6p-2质粒)对所述重组蛋白进行表达时，所述重组蛋白以融合蛋白的形式进行表达，所表达的融合蛋白的氨基端连接有一个约26kDa的GST标签，该标签可作为蛋白纯化标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的重组载体。

可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为杆状菌(如大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))或酵母菌(如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(如大肠杆菌XL1-Blue)。

第五方面，本发明提供了如上所述的疫苗重组蛋白，或者如上的基因，或者如上所述的表达载体，或者如上所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。

第六方面，本发明提供了一种铜绿假单胞菌疫苗，该疫苗含有如上所述的疫苗重组蛋白。

根据本发明，所述疫苗还含有佐剂。所述佐剂可以为常规的适用于人体的佐剂，优选选自氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF5佐剂9、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂或分枝杆菌卡介苗佐剂。

如上所述的，本发明提供的重组蛋白reSBP-ExoU能够与适用于人体的佐剂具有很好的吸附性。因此，可以直接与佐剂配合适用，从而制备成各种预定剂型的疫苗。

第七方面，本发明提供了如上所述的疫苗重组蛋白，或者如上的基因，或者如上所述的表达载体，或者如上所述的宿主细胞在制备抗铜绿假单胞菌的抗体中的应用。

第八方面，本发明提供了一种制备如上所述的疫苗重组蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)培养如上所述的宿主细胞，诱导编码所述疫苗重组蛋白的基因进行表达；

(2)分离提纯所表达的所述疫苗重组蛋白。

根据本发明一种具体的实施方式，通过以本发明提供的基因作为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因片段；将所述目的基因片段克隆至表达载体中，构建重组载体；然后将重组载体转化至宿主细胞中，培养所述宿主细胞，诱导编码所述重组蛋白的基因的表达；最后分离提纯所表达的所述重组蛋白。

其中，重组载体的构建以及重组载体转化宿主细胞的方法已经在如上进行了详细的介绍，此处不再重复赘述。

其中，所述培养条件可以为常规的培养条件，如使用LB培养基(溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)，在35-38℃下培养至OD₆₀₀为0.6-1.0，之后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为150-250μM，并在25-35℃的条件下进行诱导表达。由于本发明提供的宿主细胞中含有编码重组蛋白的基因，其可以高效地表达所述重组蛋白。培养后经过分离提纯，即可得到高纯度的重组蛋白。可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离提纯，例如，用PBS缓冲液悬浮并超声破碎细胞，再经过纯化即可得到含有所述重组蛋白的融合蛋白，通过对所述融合蛋白进行酶切即可获得本发明的重组蛋白，在此不再赘述。

实施例

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

本实施例用于说明重组融合蛋白reSBP-ExoU在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定

(1)reSBP-ExoU的编码基因的合成和亚克隆

reSBP-ExoU的DNA序列(SEQ ID NO：2)的合成和reSBP-ExoU的DNA序列与pGEX-6p-2的连接由上海生工生物工程有限公司合成，从而获得重组质粒pGEX-6p-reSBP-ExoU。

(2)重组质粒的转化和双酶切鉴定

1)重组质粒的转化从-80℃冰箱取大肠杆菌XL1blue感受态细胞(上海超研生物科技有限公司)，加入1μl重组质粒pGEX-6p-reSBP-ExoU。冰浴10min，42℃金属浴中热击60s，迅速冰浴1min。加入600μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rpm振摇30min。

以5000rpm室温离心3min.，弃去100μl上清，再重悬菌体，取200μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养12h。挑取涂布有重组质粒转化的菌体的转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

2)双酶切鉴定

取37℃摇床培养过夜的阳性质粒，按照说明书的步骤，通过快速质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用BamH I(Takara公司)和Xho l(Takara公司)进行酶切，37℃水浴半小时。体系如下：

灌制1.0％琼脂糖凝胶，其中含EB 0.5μg/ml，在上述酶切反应体系中各加入1μl 6×Loading buffer，通过凝胶100V电泳15min后，UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约5000bp为表达载体pGEX-6P-2部分，小片段约1500bp，为插入的编码reSBP-ExoU的DNA片段，结果如图1所示。

(3)重组融合蛋白reSBP-ExoU的表达和纯化

1)reSBP-ExoU诱导表达

取过夜培养的pGEX-6P-2-reSBP-ExoU/XL-1blue菌液100μL加入10mL Amp+抗性的LB培养基中，180rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液200μL加入20mL Amp+抗性的LB培养基中，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG 4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃诱导表达5h。

将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL lysisbuffer(20mM PB,pH 7.2,250mM Nacl)混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃14000rpm离心15min，分离上清和沉淀。

2)处理上清

取Glutathione Sepharose 4B 40μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose 4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。取结合后目的蛋白的Glutathione Sepharose 4B填料20ul，加入20μL 2×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。

3)酶切样品的制备

向余下约20μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B填料中加入80μL PBS和20μLPreScission protease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清，加入20μL 6×蛋白质上样buffer进行制样；酶切后的填料使用200μL PBS洗涤3次，然后用20μLPBS重悬Glutathione Sepharose 4B酶切后填料，加入20μL 2×蛋白质上样buffer蛋白制样。

4)SDS-PAGE电泳

将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1～2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果：reSBP-ExoU与GST标签融合后在大肠杆菌中以可溶的形式表达，酶切去除GST标签后该蛋白仍然稳定存在(图2)。

实施例2

本实施例用于说明reSBP-ExoU抗原的制备

(1)放大培养获取蛋白

取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-reSBP-ExoU/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD 600为0.6-0.8时，加入80μL IPTG(终浓度为200μM)置于16℃摇床中诱导16h后，12000rpm离心15min收集菌体，再加20mL lysis buffer(同实施例1)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解15min，收集上清与800μL用于融合有GST标签的融合蛋白的Glutathione Sepharose4B(GE公司)填料(beads)结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳。

(2)使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取reSBP-ExoU目的蛋白

向余下约800μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800μL PBS和120μl PreScission protease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μL PBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切下来的重组蛋白reSBP-ExoU分子量在50-60kDa之间，与预期蛋白分子量大小相符合，见图3。

实施例3

本实施例用于说明重组蛋白reSBP-ExoU免疫动物后的抗体应答

(1)动物的分组与免疫

1)SPF级BALB/C 6～8周龄雌性小鼠15只，分成实验组、佐剂对照组和阴性对照组，每组5只，购于北京华阜康公司。

2)首次免疫，用PBS稀释reSBP-ExoU抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃；用5号半型针头，双侧大腿肌肉注射。实验组每只BALB/C小鼠注射量为100μL，含有reSBP-ExoU 50μg和Al(OH)₃ 100μg；佐剂对照组每只BALB/C小鼠注射量为100μL，含有Al(OH)₃ 100μg；阴性对照组每只BALB/C小鼠注射量为100μL PBS，不含有蛋白和Al(OH)₃佐剂。

3)第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上。

4)第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上。

5)第三次免疫后第7天，采集BALB/C小鼠的血。

(2)ELISA检测抗体所需液体的准备

1)包被液的配制：称取Na₂CO₃1.6g，NaHCO₃ 2.9g，溶于1L ddH₂O，用PH计将pH调至9.6；

2)封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500μL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；

4)洗涤液的制备：同抗体稀释液

5)显色液(TMB)，为天根公司产品；

6)终止液(2MH₂SO₄)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

(3)ELISA检测reSBP-ExoU重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

1)用包被液将纯化后的reSBP-ExoU重组蛋白稀释为4ug/mL。同时按照公开的方法分别制备纯化的reSBP蛋白(国家发明专利：201811382091.4)和reExoU蛋白(国家发明专利：201811365156.4)，并稀释至4ug/mL。

2)包被：含有重组蛋白reSBP-ExoU、reSBP和reExoU的稀释液分别加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

3)封闭：酶标板加封闭液200μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

4)将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等2倍倍比稀释；

5)取包备重组蛋白reSBP-ExoU、reSBP和reExoU的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤3遍，空干；

6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱30min，洗涤三遍，空干；

8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；

9)加入终止液(2M H₂SO₄)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

10)结果判断：A_样品/A_阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。

结果：检测重组蛋白reSBP-ExoU免疫小鼠产生的抗reSBP-ExoU抗体效价达到1:1024000；第三次免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，抗reSBP抗体效价达到1:256000；第三次免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，抗rExoU抗体效价达到1:512000；第三次免疫后第7天的抗体阳性率达到100％。而佐剂对照组和阴性对照组抗reSBP-ExoU抗体效价未见明显变化。这些说明本发明构建的重组蛋白reSBP-ExoU具有良好的免疫原性，免疫小鼠后可诱导其产生高效价的抗reSBP-ExoU、reSBP和reExoU抗体。

实施例4

本实施例用于说明重组蛋白reSBP-ExoU动物免疫的攻毒保护评价

(1)从北京华阜康公司SPF级BALB/C 4～6周龄雌性小鼠90只，随机分成实验组、佐剂对照组和阴性对照组，每组30只。小鼠免疫的蛋白组成、免疫时间点和部位同实施例3。

(2)免疫后小鼠的攻毒保护评价

reSBP-ExoU重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价按照参考文献：铜绿假单胞菌感染肺炎的动物模型的建立方法(国家发明专利201610117674.9)。简要地说，reSBP-ExoU末次免疫后10～14天，用生理盐水将准备PA XN-1菌液并调节浓度至1.5×10¹⁰CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO₂吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。

表2 reSBP-ExoU重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果

组别	小鼠(只)	免疫组分	7天后存活数	存活率(％)
					实验组	30	reSBP-ExoU+佐剂	26	86.7
阴性对照组	30	Al(OH)<sub>3</sub>佐剂	5	16.7
					空白对照组	30	PBS	4	13.3

表2显示：阴性对照组和空白对照组的存活率为分别为16.7％和13.3％，重组融合蛋白reSBP-ExoU加Al(OH)₃佐剂组的存活率为86.7％，通过公式：保护率＝(对照组死亡率-实验组死亡率)/对照组死亡率×100％，计算得到reSBP-ExoU的保护率为84.6％。因此，本发明的reSBP-ExoU重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对PA XN-1的感染起到保护作用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。

实施例5

本实施例用于说明重组蛋白reSBP-ExoU、reSBP的佐剂吸附能力

(1)使用PBS缓冲液将纯化的reSBP-ExoU稀释至0.2mg/ml；按照公开的方法制备reSBP蛋白(国家发明专利：201811382091.4)，并使用PBS缓冲液将蛋白稀释至0.2mg/ml。

(2)使用PBS缓冲液将Al(OH)₃佐剂使用PBS稀释至0.5mg/ml。

(3)分别取稀释的reSBP-ExoU蛋白和reSBP各250μL与0.5mg/ml的Al(OH)₃佐剂250μL混合，25℃条件下垂直混匀2h。

(4)取Al(OH)3佐剂与蛋白混合液，12000rpm离心5min。取上清，通过SDS-PAGE检测上清中游离的重组蛋白。

结果表明，reSBP经同样剂量的Al(OH)3佐剂吸附后，上清中还残留大量的蛋白；而reSBP-ExoU蛋白经Al(OH)3佐剂吸附后，混合物上清中未见明显的蛋白残留，表明reSBP-ExoU蛋白与Al(OH)₃的佐剂性优于reSBP(图4)。

实施例6

本实施例用于说明重组蛋白reSBP-ExoU、reExoU的稳定性。

(1)使用PBS缓冲液将纯化好的reSBP-ExoU使用PBS稀释至0.5mg/ml；

(2)按照文献方法制备rExoU蛋白(国家发明专利：201811365156.4)，并使用PBS缓冲液将蛋白稀释至0.3mg/ml。

(3)取稀释好的reSBP-ExoU、rExoU蛋白与4℃静置3天，通过SDS-PAGE分析重组蛋白的条带变化。

结果：由图5可见，纯化的rExoU蛋白4℃放置3天后，SDS-PAGE检测发现与0天的样本相比较，rExoU的条带明显变小，还出现了多个分子量低于rExoU的条带，表明rExoU出现明显了降解；而同样处理的reSBP-ExoU的蛋白条带却未见明显变化，表明其稳定性优于rExoU蛋白。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 重庆艾力彼生物科技有限公司

<120> 铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP-ExoU及制备方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 506

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP-ExoU(Recombinant reSBP-ExoU proteinof PSEUDOMONAS AERUGINOSA vaccine)

<400> 1

Ala Glu Ser Leu Thr Val Ala Ala Thr Pro Val Pro His Ala Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Val Val Lys Pro Leu Leu Ala Lys Glu Gly Val Asp Leu Lys

20 25 30

Ile Lys Glu Phe Thr Asp Tyr Val Gln Pro Asn Val Gln Val Ser Glu

35 40 45

Lys Arg Leu Asp Ala Asn Phe Phe Gln His Gln Pro Tyr Leu Asp Glu

50 55 60

Phe Asn Lys Ala Lys Gly Thr Asp Leu Val Ala Val Thr Gly Val His

65 70 75 80

Ile Glu Pro Leu Gly Ala Tyr Ser Ser Lys Tyr Lys Lys Leu Asp Glu

85 90 95

Leu Pro Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Pro Asn Asp Ala Thr Asn Gly

100 105 110

Gly Arg Ala Leu Leu Leu Leu Asp Lys Ala Gly Val Ile Lys Leu Lys

115 120 125

Asp Asn Lys Ser Ile Thr Ala Thr Pro Lys Asp Ile Val Asp Asn Pro

130 135 140

Lys Asn Ile Lys Ile Arg Glu Leu Glu Ala Ala Thr Leu Pro Arg Val

145 150 155 160

Leu Thr Gln Val Asp Met Ala Leu Ile Asn Thr Asn Tyr Ala Leu Glu

165 170 175

Ala Lys Leu Asn Pro Thr Lys Asp Ala Leu Ala Ile Glu Gly Ser Asp

180 185 190

Ser Pro Tyr Val Asn Ile Leu Val Ala Arg Pro Asp Asn Lys Asp Ser

195 200 205

Asp Ala Met Gln Lys Leu Ala Lys Ala Leu His Ser Ala Glu Ile Lys

210 215 220

Gln Phe Ile Gln Glu Lys Tyr Lys Gly Ala Val Val Pro Ala Phe Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Ser Gly Ser Arg Pro Pro Leu Thr Ser Leu Val Leu Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Ala Lys Gly Ala Ala Tyr Pro Gly Ala Met Leu Ala Leu

260 265 270

Glu Glu Lys Gly Met Leu Asp Gly Ile Arg Ser Met Ser Gly Ser Ala

275 280 285

Ala Gly Gly Ile Thr Ala Ala Leu Leu Ala Ser Gly Met Ser Pro Ala

290 295 300

Ala Phe Lys Thr Leu Ser Asp Lys Met Asp Leu Ile Ser Leu Leu Asp

305 310 315 320

Ser Ser Asn Lys Lys Leu Lys Leu Phe Gln His Ile Ser Ser Glu Ile

325 330 335

Gly Ala Ser Leu Lys Lys Gly Leu Gly Asn Lys Ile Gly Gly Phe Ser

340 345 350

Glu Leu Leu Leu Asn Val Leu Pro Arg Ile Asp Ser Arg Ala Glu Pro

355 360 365

Leu Glu Arg Leu Leu Arg Asp Glu Thr Arg Lys Ala Val Leu Gly Gln

370 375 380

Ile Ala Thr His Pro Glu Val Ala Arg Gln Pro Thr Val Ala Ala Ile

385 390 395 400

Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Ser Gly Val Thr Phe Gly Asp Leu Asp

405 410 415

Arg Leu Ser Ala Tyr Ile Pro Gln Ile Lys Thr Leu Asn Ile Thr Gly

420 425 430

Thr Ala Met Phe Glu Gly Arg Pro Gln Leu Val Val Phe Asn Ala Ser

435 440 445

His Thr Pro Asp Leu Glu Val Ala Gln Ala Ala His Ile Ser Gly Ser

450 455 460

Phe Pro Gly Val Phe Gln Lys Val Ser Leu Ser Asp Gln Pro Tyr Gln

465 470 475 480

Ala Gly Val Glu Trp Thr Glu Phe Gln Ala Gly Gly Val Met Ile Asn

485 490 495

Val Pro Val Pro Glu Met Ile Asp Lys Asn

500 505

<210> 2

<211> 1518

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reSBP-ExoU编码基因(Recombinant ProteinreSBP-ExoU encoding gene of PSEUDOMONAS AERUGINOSA vaccine)

<400> 2

gcagaaagcc tgaccgttgc agcaacaccg gttccgcatg cagaaattct gaatgttgtt 60

aaaccgctgc tggcaaaaga aggtgttgat ctgaaaatca aagagtttac cgattacgtt 120

cagccgaatg ttcaggttag cgaaaaacgt ctggatgcca acttttttca gcatcagccg 180

tatctggatg agttcaataa agcaaaaggc accgatctgg ttgcagttac cggtgttcat 240

attgaaccgc tgggtgcata tagcagcaaa tacaaaaaac tggatgaact gccgagcggt 300

gcaaccgttg ttattccgaa tgatgcaacc aatggtggtc gtgcactgct gctgctggat 360

aaagccggtg ttattaaact gaaagacaac aaaagcatta ccgccacgcc gaaagatatt 420

gttgataatc cgaaaaacat caaaatccgc gaactggaag cagcaaccct gcctcgtgtt 480

ctgacccagg ttgatatggc actgattaat accaattatg ccctggaagc aaaactgaat 540

ccgaccaaag atgcactggc aattgaaggt agcgatagcc cgtatgttaa tattctggtt 600

gcccgtccgg ataataaaga tagtgatgca atgcagaaac tggccaaagc actgcatagc 660

gcagaaatta aacagtttat ccaagaaaag tacaaaggtg cagttgttcc ggcatttggt 720

agcggtggta gtggtagccg tccgcctctg accagcctgg ttctgagcgg tggtggtgca 780

aaaggtgccg catatccggg tgcaatgctg gcactggaag aaaaaggtat gctggatggt 840

attcgtagca tgagcggtag cgcagcaggc ggtattaccg cagcactgct ggcgagcggt 900

atgagtccgg cagcatttaa aaccctgagc gataaaatgg atctgattag cctgctggat 960

tcgagcaata aaaagctgaa actgttccag catattagca gtgaaattgg tgcaagcctg 1020

aagaaaggtc tgggtaacaa aattggtggt tttagcgaac tgctgttaaa tgttctgcct 1080

cgtattgata gccgtgcaga acctctggaa cgtctgctgc gtgatgaaac ccgtaaagca 1140

gttctgggcc agattgcaac ccatccggaa gttgcacgtc agccgaccgt ggcagccatt 1200

gcaagccgtc tgcagagcgg ttcaggtgtt acctttggtg atctggatcg tctgagcgca 1260

tatattccgc agattaaaac actgaatatt accggcaccg caatgtttga aggtcgtccg 1320

cagctggttg tttttaatgc aagccataca ccggatctgg aagttgccca ggcagcacat 1380

attagcggta gctttccggg tgtttttcag aaagttagcc tgagtgatca gccttatcag 1440

gcaggcgttg aatggaccga atttcaagcc ggtggtgtta tgattaatgt tccggttccg 1500

gaaatgatcg acaagaat 1518

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 聚精氨酸(Poly-Arg)

<400> 3

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Poly-His(Poly-His)

<400> 4

His His His His His His

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> FLAG(FLAG)

<400> 5

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Strep-tagⅡ(Strep-tagⅡ)

<400> 6

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> c-myc(c-myc)

<400> 7

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 8

<211> 243

<212> PRT

<213> 谷胱甘肽转移酶(GST)

<400> 8

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

210 215 220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Arg Ala

225 230 235 240

Ala Ala Ser

Claims

1.一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白，其特征在于，该疫苗重组蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述的疫苗重组蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种表达载体，其特征在于，该表达载体插入有权利要求2或3所述的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求2或3所述的基因，或者含有权利要求4所述的表达载体。

6.权利要求1所述的疫苗重组蛋白，或者权利要求2或3所述的基因，或者权利要求4所述的表达载体，或者权利要求5所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。

7.一种铜绿假单胞菌疫苗，其特征在于，该疫苗含有权利要求1所述的疫苗重组蛋白。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其中，所述疫苗还含有佐剂，所述佐剂优选自氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59佐剂、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂或分枝杆菌卡介苗佐剂。

9.权利要求1所述的疫苗重组蛋白，或者权利要求2或3所述的基因，或者权利要求4所述的表达载体，或者权利要求5所述的宿主细胞在制备抗铜绿假单胞菌的抗体中的应用。

10.一种生产权利要求1所述的疫苗重组蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)培养权利要求5所述的宿主细胞，诱导所述疫苗重组蛋白的编码基因进行表达；

(2)分离提纯所表达的疫苗重组蛋白。