CN114699521B

CN114699521B - 基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用

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Publication number: CN114699521B
Application number: CN202210631970.6A
Authority: CN
Inventors: 陈薇; 殷瑛; 徐俊杰; 宰晓东; 于蕊; 辜彦霏; 张军
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2042-06-07
Also published as: WO2023236726A1; CN114699521A

Abstract

本发明公开了金属硫蛋白作为免疫佐剂的应用。该金属硫蛋白与免疫原性抗原以融合蛋白或组合物的形式使用可以快速、高效、持久地激发抗原特异的免疫反应。

Description

基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用

技术领域

本发明公开了一种新型的佐剂，属于疫苗技术领域。

背景技术

疫苗是防控疾病经济有效的手段。佐剂是疫苗的重要组成部分，可以通过触发和调节先天与获得性免疫增强抗原特异的免疫反应。铝盐佐剂也称铝佐剂，是全球首个获批的人用疫苗佐剂。铝佐剂包括明矾、磷酸铝与氢氧化铝，其中氢氧化铝佐剂使用更为普遍（Vaccine 2019; 37(24): 3167-3178.）。铝佐剂以诱导Th2型体液免疫应答为主，因制备工艺成熟、价格低廉、安全性高，是目前商业应用最为广泛的佐剂，至今仍在百白破联合疫苗、乙型肝炎病毒疫苗等重组蛋白疫苗中使用。但铝佐剂也存在些不足，如可能引起注射部位红肿与疼痛、无法有效激发机体细胞免疫应答等（J Control Release 2019; 303: 130-150）。19世纪90年代后期，水包油乳剂佐剂 MF59 首次被纳入获批的流感疫苗 Fluad中。此后陆续有多种佐剂用于其他获批的疫苗产品，包括用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Mosquirix 的AS01，用于乙肝疫苗 Fendrix 和人乳头瘤疫苗 Cervarix的 AS04，用于大流行性流感疫苗 Pandemrix 和 Arepanrix的 AS03和用于乙型肝炎疫苗 Heplisav-B的胞嘧啶磷酸鸟苷 (CpG) 1018（Nat Rev Drug Discov 2021; 20(6):454-475）等。随着新发突发传染病的不断涌现，对新型佐剂的需求在不断增长。

金属硫蛋白(MTs)是一个富含半胱氨酸的低分子量的金属结合蛋白家族，几乎在所有生物体中都有表达，包括原核生物、低等真核生物、无脊椎动物和哺乳动物。这些蛋白可以调节体内铜、锌离子稳态，减轻重金属中毒和超氧化物胁迫。近年来，MTs被认为是免疫系统的重要组成部分，但尚未引起重视。MTs 蛋白家族在小鼠中包括四种亚型 (MT1-4)，在人类中包括多种亚型/变体及相应的同种型（MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G1、MT1G2、MT1H、MT1HL1、MT1M、MT1X、MT2A、MT3 和 MT4，以及假基因MT1DP、MT1JP、MT1L、MT2P1、MT1CP、MT1LP、MT1XP1、MT1P3、MT1P1和MTL3P）。不同亚型的人源MTs约含有20个保守的半胱氨酸残基和α、β两个结构域。Koh 等（Mol Brain 2020; 13(1): 116.）报道，MTs具有物种间的异质性，但是在结构上具有共同的特征。Zhu等（Small. 2019;15(2):e1803428）报道MTs中的MT3蛋白可作为一种化疗药物递送载体的组成部分，实现抗肿瘤药物的靶向递送。但目前尚无将MT3作为疫苗佐剂的报道。

理想的疫苗佐剂在兼顾安全性的同时可以增强抗原的免疫原性、缩短免疫反应起效的时间、诱导持续的免疫反应、减少接种次数、节省抗原用量并提高疫苗对反应不佳者的有效性等，现有新型佐剂的研发工作多以此为努力的方向。

本发明的目的就是提供一类新的佐剂，可以快速、高效地激发抗原特异的免疫反应，且具有较好的免疫持续性。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了金属硫蛋白、其活性片段或其衍生物作为免疫佐剂的应用。此处所述的金属硫蛋白是指一类广泛存在于生物中的低分子质量(2〜18kD)，富含半胱氨酸( Cys 10 %〜40 % )的独特生物学特性的金属结合蛋白，其几乎在所有生物体中都有表达，包括原核生物、低等真核生物、无脊椎动物和哺乳动物。此处所述的金属硫蛋白活性片段是指截取金属硫蛋白的片段，仍能保持金属硫蛋白生物活性，尤其是保持了作为佐剂使用的生物活性的金属硫蛋白活性片段。此处所述的金属硫蛋白衍生物是指通过对其修饰、串联、变异等手段仍保持金属硫蛋白功能域的金属硫蛋白其衍生物。

在一个优选的技术方案中，所述金属硫蛋白为人、动物、植物和微生物来源。

在一个更为优选的技术方案中，所述金属硫蛋白为哺乳动物来源。本发明例选的人源和鼠源的金属硫蛋白均可以实施本发明上述的应用，均取得了优异的技术效果。因此本领域技术人员根据本发明的应用以及本领域技术常识能够明白及合理地预期使用其它哺乳动物来源的金属硫蛋白家族蛋白也能够实施本发明。现有技术中能够用于本发明的其它哺乳动物来源的金属硫蛋白包括但不限于：MT3_HORSE（UniProt数据库编号：P37360，以下来源相同）、MT3_RAT （P37361）、MT3_MOUSE （P28184）、MT3_SHEEP （Q8MKE4）、MT3_BOVIN（P37359）、MT3_BOSMU （Q2MJS5）、MT3_RABIT （Q2PS21）、MT3_PIG （P55944）、MT3_MACFA（Q2PFZ0）。

在另一个优选的技术方案中，所述金属硫蛋白选自I型、II型、III型或IV型金属硫蛋白中的任一型别。

更为优选地，本发明的技术方案中所述金属硫蛋白选自人源金属硫蛋白I型、III型以及鼠源的金属硫蛋白III型，均可以实施本发明上述的应用，均取得了优异的技术效果。因此本领域技术人员根据本发明的应用以及本领域技术常识能够明白及合理地预期使用其它型别的金属硫蛋白，例如II型、IV型也能够实施本发明。现有技术中能够用于本发明的金属硫蛋白型别包括但不限于：MT4-HUMAN（UniProt数据库编号：P47944，以下来源相同）、MT3-HUMAN（P25713）、MT1H_HUMAN（P80294）、M1BL1_HUMAN （P0DM35）、MT1X_HUMAN（P80297）、MT1M_HUMAN （Q8N339）、MT1B_HUMAN （P07438）、MT2_HUMAN（P02795）、MT1G_HUMAN（P13640）、MT1F_HUMAN（P04733）、MT1E_HUMAN （P04732）、MT1A_HUMAN（P04731）、MT1L_HUMAN（Q93083）、 MT1DP_HUMAN （A1L3X4）。在本发明的一个具体实施方案中所述金属硫蛋白为SEQ ID NO.1所示的人源I型、SEQ ID NO.2所示的人源III型、SEQ ID NO.3所示的鼠源III型中的任一种。

又为优选地，所述金属硫蛋白为氨基酸序列经添加、缺失、替换1个或多个，例如1-5个，1-10个，1-15个，1-20个氨基酸残基所获得的仍能保持金属硫蛋白功能的金属硫蛋白突变体。本领域技术人员通过常规地突变手段获得所述金属硫蛋白的变异体，只要其保持了金属硫蛋白生物学功能，这些变异体均能实现本发明所述的作为佐剂使用的技术效果。

在以上技术方案中，所述金属硫蛋白与免疫原性抗原以融合蛋白或组合物的形式使用。

在以上技术方案中，所述融合蛋白和免疫佐剂以组合物的形式使用，含有金属硫蛋白的疫苗和传统佐剂例如Al(OH)₃组合使用时也具有优异的免疫诱导效果。

所述金属硫蛋白可以是人源的或者是鼠源的，可以是I型的，也可以是III型，上述金属硫蛋白作为佐剂的具体应用，本领域技术人员可以明白，应用其它来源和型别的金属硫蛋白将能够获得如本发明所公开的类似的技术效果。

又为优选地，所述免疫原性抗原为受试者自身抗原或来源于细菌、病毒、真菌或寄生虫。在本发明的上下文中，受试者指人或动物。在本发明的具体实施例中，所述免疫原性抗原为布鲁氏菌Omp19抗原、破伤风毒素Hc片段和新冠病毒RBD抗原时仅为例举，本领域技术人员能够明白，其它类别的免疫原性抗原，包括但不限于如乙型肝炎病毒表面抗原、人乳头瘤病毒抗原、肺炎球菌抗原、流感病毒抗原也可以用于本发明的具体实施。

免疫原性抗原的来源可以为蛋白、蛋白的消化物和／或其片段、多糖，可以为纯化的形式，或可以涵盖在天然成分中，优选为生物源，例如，细菌裂解物、寄生裂解物、酵母菌裂解物、病毒裂解物、真菌裂解物、超声产物(sonicate)或固定产物(fixate)。可选择地，抗原可以为化学合成的或在体外酶解产生的。

所述金属硫蛋白与免疫原性抗原融合或组合作为疫苗使用时，疫苗的形式可选自以下一种或几种：灭活疫苗、减毒疫苗、蛋白疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗、载体疫苗，其中核酸疫苗包括有编码上述免疫原性组合物的DNA序列或mRNA序列的重组载体；载体疫苗包括但不限于包含编码上述免疫原性组合物的核酸序列的重组病毒载体，可选地，病毒载体可选自以下一种或几种，腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体和腺相关病毒载体。

在本发明一个具体的技术方案中，所述金属硫蛋白可以为人源III型（SEQ IDNO.2），其作为佐剂与布鲁氏菌Omp19抗原互相连接形成融合蛋白（本发明简称：MO），布鲁氏菌Omp19抗原序列如SEQ ID NO.4所示，所述金属硫蛋白与布鲁氏菌Omp19抗原以连接肽（序列如SEQ ID NO.10所示）连接，所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明一个具体的技术方案中，所述金属硫蛋白可以为人源I型（SEQ IDNO.1），其作为佐剂与布鲁氏菌Omp19抗原互相连接形成融合蛋白（本发明简称M₁O），布鲁氏菌Omp19抗原序列如SEQ ID NO.4所示，所述金属硫蛋白与布鲁氏菌Omp19抗原以连接肽（序列如SEQ ID NO.10所示）连接，所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明一个具体的技术方案中，所述金属硫蛋白可以为鼠源III型（SEQ ID NO.3），其作为佐剂与布鲁氏菌Omp19抗原互相连接形成融合蛋白（本发明简称：M_mO），布鲁氏菌Omp19抗原序列如SEQ ID NO.4所示，所述金属硫蛋白与布鲁氏菌Omp19抗原以连接肽（序列如SEQ ID NO.10所示）连接，所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明一个具体的技术方案中，所述金属硫蛋白可以为人源III型（SEQ IDNO.2），其作为佐剂与破伤风毒素重链C片段（Hc）互相连接形成融合蛋白（本发明简称：MH），破伤风毒素Hc片段序列如SEQ ID NO.8所示，所述金属硫蛋白与破伤风毒素Hc片段以连接肽（序列如SEQ ID NO.13所示）连接，所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明的实施例还显示，与人源的MT3类似，人源的MT1和鼠源的MT3同样具有免疫增效的作用，人源MT1与Omp19的形成的融合蛋白M₁O，以及鼠源MT3与Omp19形成的融合蛋白M_mO均可以在首免后的4、7、14天显著增强抗原的免疫原性，缩短抗体的产生时间。该结果提示该佐剂能力是金属硫蛋白家族成员的共性。

在一个优选的技术方案中，本发明所述的金属硫蛋白可以作为佐剂和免疫原性抗原形成免疫组合物作为疫苗应用。在本发明一个具体的技术方案中，所述金属硫蛋白可以为人源III型（SEQ ID NO.2），其作为佐剂与破伤风毒素Hc片段形成免疫组合物作为疫苗应用。

在另一个优选的技术方案中，本发明所述的金属硫蛋白可以作为佐剂和免疫原性抗原融合表达作为疫苗应用，两者可通过直接相连或者以柔性连接肽相连。金属硫蛋白和免疫原性抗原在融合蛋白中位置并没有任何限定，金属硫蛋白可以位于融合蛋白的氨基端，也可以位于融合蛋白的羧基端。金属硫蛋白作为分子内佐剂与其他蛋白融合，不会影响其他蛋白自身构象，金属硫蛋白作为分子内佐剂是一种普适性的功能。在本发明一个具体的技术方案中，所述金属硫蛋白可以为人源III型（SEQ ID NO.2），其作为佐剂与新型冠状病毒受体结合域（RBD）抗原互相连接形成融合蛋白（本发明简称：MR），新型冠状病毒RBD抗原序列如SEQ ID NO.11所示，所述金属硫蛋白与新型冠状病毒RBD抗原直接连接，所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.12所示。

在金属硫蛋白作为佐剂与免疫性抗原直接互相连接为融合蛋白再与佐剂形成免疫原性组合物的研究中，金属硫蛋白与RBD直接相互连接后再与Al(OH)₃佐剂联合形成免疫原性组合物，在7天即可快速、高效的激发免疫反应，在14d抗体水平较RBD联合Al(OH)₃佐剂组高出约100倍。中和抗体水平呈现相同趋势，MT3-RBD联合Al(OH)₃佐剂显著优于RBD联合Al(OH)₃佐剂。在金属硫蛋白作为佐剂与免疫性抗原通过间隔链（连接肽）互相连接形成免疫原性组合物的研究中，金属硫蛋白与Omp19经间隔链互相连接可以显著增强Omp19特异的免疫反应。在金属硫蛋白与免疫性抗原形成免疫原性组合物的研究中，将金属硫蛋白作为佐剂与Hc直接组合作为疫苗使用，在免疫后的第14天其激发的抗体滴度显著高于Hc单独免疫组。

本发明所提供的技术方案显示出了优异的技术效果。其中，在研究人源的MT3作为疫苗佐剂的实施例中，将MT3经间隔链分别与布鲁氏菌外膜蛋白Omp19和破伤风杆菌Hc片段连接，获得融合蛋白MT3-Omp19 （MO）和MT3-Hc （MH）。在小鼠模型上开展了相应的免疫原性研究。MO的研究结果表明，在免疫后7天，MO免疫组即可诱导高滴度的Omp19特异性抗体产生，相较于Omp19联合Al(OH)₃ + CpG免疫组（双佐剂组），特异性抗体水平显著提高了约100倍。对抗体进行长期监测的结果表明，MO组小鼠的高滴度抗体维持至180天仍未见明显下降。剂量研究的结果表明，5 μg MO即可有效激发较4倍剂量的Omp19免疫更高的抗体水平。MH研究的结果表明，MH在免疫后7天即可快速激发高水平的特异性抗体滴度，显著高于Hc联合铝佐剂组。抗体持续性研究的结果表明，MH所激发的特异性抗体在初免后的90天依然维持在高位。剂量研究的结果表明，初免后7天，5μg 和1μg MH 所激发的特异性抗体即可显著高于5μg Hc联合铝佐剂免疫组及5μg Hc单独免疫组，5 μg MH和1 μg MH免疫组所诱导的Hc特异性抗体无显著性差异，提示MT3作为佐剂可有效减少抗原用量。MH保护效力研究的结果表明，1 μg MH 单针免疫14 或28 d后，均可以100 %保护免疫的小鼠对抗5LD50的破伤风毒素的攻击，相较于Hc单独免疫组， MH可以显著提高小鼠的存活率，提示MT3可以增强Hc的保护效力。该结果提示当人源的MT3作为佐剂与免疫原性抗原连接时，可以快速、高效、持久地激发抗原特异的免疫反应。

在研究金属硫蛋白作为佐剂与抗原组合及形成融合蛋白的实施例中，金属硫蛋白作为免疫佐剂与如乙型肝炎病毒表面抗原、人乳头瘤病毒抗原、肺炎球菌抗原、流感病毒抗原，按照如上所述所形成的组合物，直接或通过间隔链互相连接形成的融合蛋白也可以激发较好地抗原特异的免疫反应。

综上所述，本发明所提到的MTs家族作为免疫佐剂使用具有如下的优异技术效果：

1.可辅助抗原快速（缩短抗体产生的时间）、高效（提高抗体滴度）激发免疫反应。当MTs与免疫原性抗原（布鲁氏菌抗原、破伤风抗原和新型冠状病毒抗原）形成的融合蛋白(MO、MH和MR)及组合物单针免疫时可以将抗体产生的时间缩短到初免后的七天，同时使抗体滴度得到迅速提高。

2.具有较好的免疫持续性，针对布鲁氏菌抗原，融合蛋白MO于 0，14d免疫，在观察到的180天，抗体滴度依然维持在高位，针对破伤风杆菌抗原，融合蛋白MH单针免疫90天后依然可以观察到抗体维持高位。

3.可以节省抗原使用剂量，在以布鲁氏菌抗原为模型的工作中，0.1μg的融合蛋白(MO)单针免疫14天后激发的抗体水平显著高于单独布鲁氏菌抗原Omp19免疫20μg激发的抗体水平。在以破伤风抗原Hc为模型的工作中，1μg融合蛋白(MH)单针免疫7天后激发的抗体水平显著高于5μg的破伤风抗原Hc联合铝佐剂激发的抗体水平。

附图说明

图1.MO的表达与鉴定图谱；

图2.MH的表达与鉴定图谱；

图3. MO的蛋白纯化图图谱；

图4. MH的蛋白纯化图图谱；

图5. MR的蛋白纯化图图谱

图6. M₁O的蛋白纯化图图谱

图7. M_mO的蛋白纯化图图谱

图8.MO 免疫原性及起效速度分析图；

图9. MO免疫持续性分析图；

图10. MO免疫剂量分析图；

图11. MH免疫原性和起效速度分析图；

图12. MH的免疫剂量分析图；

图13. MH的免疫持续性分析图；

图14. MH免疫小鼠对抗破伤风毒素攻击的生存曲线；

图15. MT家族的佐剂效应分析图；

图16. MH的佐剂使用形式分析图；

图17. MR+ Al(OH)₃免疫抗体水平比较图；

图18. MR+ Al(OH)₃免疫血清活病毒中和抑制率曲线图；

图19. MO的佐剂使用形式分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实施例1. MT家族序列同源性分析

利用Geneious Prime 软件对MT家族的代表性序列进行比对。分别比较了人源MT蛋白的多个序列和多物种来源的MT3序列之间的同源性。人源的四种MT亚型中，MT1和MT2的同源性高达70-90%。MT3和MT4蛋白与MT1和MT2蛋白的同源性约为50-60%。常见的大鼠、小鼠、兔、食蟹猴、猪、马、牛、羊、人等物种来源的MT3蛋白的同源性，除了羊种与大鼠、小鼠的同源性分别为75%和76.4%外，其余物种间MT3蛋白的同源性均能达到80%以上。这些结果提示MT家族成员间有一定的序列一致性，提示其在功能上的相似性。

实施例2 构建与制备

2.1基于人源MT3与的免疫原性组合物的构建与制备

2.1. 1质粒构建

2.1.1 .1 MT3(human)-Omp19 (MO)质粒的构建

将人源MT3（序列如SEQ ID NO.2所示）通过GGGS连接子（序列如SEQ ID NO.10所示）连接于去除了信号肽的布鲁氏菌Omp19抗原序列（序列如SEQ ID NO.4所示）的N端，构成融合序列MT3-Omp19（MO），将序列按照原核表达载体大肠杆菌的偏嗜性密码子优化后开展全基因合成，优化序列如SEQ ID NO.5所示。将基因片段通过XhoI 和 NdeI 酶切位点连接于 pET28a 载体中获得表达质粒pET28a-MO。

2.1.1.2 MT3(human)-Hc（MH）质粒的构建

将人源MT3（序列如SEQ ID NO.2所示）通过GGGGS连接子（序列如SEQ ID NO.13所示）连接于破伤风毒素Hc片段序列（如SEQ ID NO.8所示）的N端，构成融合序列MT3-Hc（MH），将序列按照原核表达载体大肠杆菌的偏嗜性密码子优化后开展全基因合成，优化序列如SEQ ID NO.9所示。将基因片段通过XhoI 和 NdeI 酶切位点连接于 pET28a 载体中获得表达质粒pET28a-MH。

2.1.1.3 MT3(human)-RBD（MR）质粒的构建

将人源MT3（序列如SEQ ID NO.2所示）连接于新冠病毒RBD抗原氨基酸序列（如SEQID NO.11所示）的N端，构成融合序列MT3-RBD（MR），在N末端增加分泌性信号肽tPA，在C末端添加6-His纯化标签，将序列经哺乳动物细胞密码子人工优化，在3’端加上翻译终止密码子TGA，优化序列如SEQ ID NO. 12所示，开展全基因合成，通过EcoRI（GAATTC）和HindIII（AAGCTT）酶切位点将基因连接至pcDNA3.1真核表达载体中获得表达质粒pcDNA3.1 -MR。

2.1.2 诱导表达与鉴定

将pET28a-MO与pET28a-MH质粒转化E.coli BL21（DE）感受态细胞，用于蛋白的诱导表达，具体步骤如下:（1）挑取单克隆菌落接种到5mL LB 培养基（含100 μg/mL 卡那霉素）中，于37℃、220 r/min条件下过夜振荡培养；（2）次日以1∶100 的比例将过夜培养物转接至5 mL LB 液体培养基，37℃、220 r/min 振摇至菌液OD600 为0.6~0.8；（3）加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG 于37℃诱导表达5h；（4）8000×g离心10min收集1mL 菌液的菌体，加入1ml PBS（pH 7.4）重悬菌体，取50μL重悬液加入10μL 6×Loading buffer混匀，99℃煮沸5min，用于SDS-PAGE 分析。利用超声破碎分析了蛋白的亚细胞定位。利用WB鉴定了蛋白的表达。

图1为MO的表达与鉴定图谱。其中，M：蛋白质相对分子质量标志物；（A）MO的SDS-PAGE 分析。1:IPTG诱导菌体；2：未诱导菌体；（B）MO的Western-Blot分析。1：IPTG诱导菌体；2：未诱导菌体；（C）为MO可溶性表达的SDS-PAGE分析。其中，1：全菌菌体；2：上清；3：沉淀。箭头表示目的蛋白。

图2为MH的表达与鉴定图谱，其中，M：蛋白质相对分子质量标志物；（A）MH的SDS-PAGE 分析。1：未诱导菌体；2:IPTG诱导菌体；（B）MO的Western-Blot分析。1：未诱导菌体；2：IPTG诱导菌体；（C）为MO可溶性表达的SDS-PAGE分析。其中，1：全菌菌体；2：沉淀；3：上清。箭头表示目的蛋白。

2.1.3 蛋白的制备

挑取含有目的蛋白质粒的BL21 菌株单克隆，转接于10mL卡那霉素抗性的LB 培养基，220 r/min、37℃过夜培养；吸取过夜培养所得菌液10m L 转接于1 L 新的卡那抗性的LB 培养基中，220 r/min、37℃培养至菌液OD600 在0.6~0.8 之间；加入2mL 0.5mmol/L 的IPTG、220 r/min、37℃培养5h；诱导培养结束后， 8000×g 室温离心菌液10min，弃上清；冰浴状态下超声裂解菌体30min。超声后的样品于8000×g、4℃ 离心10min，上清液经0.45μm滤器过滤后用镍柱（Ni²⁺）亲和层析方法对蛋白进行纯化。利用Endotoxin Removing Gel柱或DEAE柱对Ni柱收集的样品进行二次处理以减少内毒素的影响。结果如图3（MO）和图4（MH）所示。

使用Expi293F哺乳动物细胞表达系统表达RBD与MR蛋白。首先对Expi293F悬浮细胞进行培养与扩展，使用Expi293表达培养基将细胞密度调整至3×10⁶个/mL。随后准备表达质粒，使用Expi293转染试剂盒转染细胞。将转染后的细胞置于摇床进行培养，培养条件为120 r/min，37℃，相对湿度≥80%，二氧化碳浓度为8%。转染72 h后，将细胞培养液离心（3000×g，15 min），使用0.45 μm针头过滤器对上清液进行过滤除去细胞碎片，过滤后的上清液用于后续蛋白纯化。将GE公司His-trap亲和层析柱层析柱安装在AKTA蛋白纯化仪上，利用His标签进行亲和层析纯化蛋白。利用SDS-PAGE鉴定了MR蛋白的表达，分子量约为40kDa，与理论分子量相符。图5为RBD与MR的鉴定图谱。其中，M：蛋白质相对分子质量标志物；2：RBD对照蛋白；3：MR目的蛋白。

2.2 基于人源MT1、鼠源MT3的免疫原性组合物的构建与制备

2.2.1 质粒构建

2.2.1 .1 MT1(human)-Omp19 (MO)质粒的构建

将人源MT1序列（SEQ ID NO.1）通过GGGS连接子（（SEQ ID NO.10））连接于去除了信号肽的布鲁氏菌Omp19抗原基因序列（SEQ ID NO.4）的N端，构成融合序列MT1-Omp19（M₁O），将序列按照原核表达载体大肠杆菌的偏嗜性密码子优化后开展全基因合成，优化序列如SEQ ID NO.6所示。将基因片段通过XhoI 和 NdeI 酶切位点连接于 pET28a 载体中获得表达质粒pET28a-M₁O。

2.2.1.2 MT3(mouse)- Omp19（MmO）质粒的构建

将鼠源MT3序列（SEQ ID NO.3）通过GGGS连接子（（SEQ ID NO.10））连接于去除了信号肽的布鲁氏菌Omp19抗原基因序列（SEQ ID NO.4）的N端，构成融合序列MT3-Omp19（MmO），将序列按照原核表达载体大肠杆菌的偏嗜性密码子优化后开展全基因合成，优化序列如SEQ ID NO.7所示。将基因片段通过XhoI 和 NdeI 酶切位点连接于 pET28a 载体中获得表达质粒pET28a-MmO。

2. 2.2 蛋白的制备

挑取含有目的蛋白质粒的BL21 菌株单克隆，转接于10mL卡那霉素抗性的LB 培养基，220 r/min、37℃过夜培养；吸取过夜培养所得菌液10m L 转接于1 L 新的卡那抗性的LB 培养基中，220 r/min、37℃培养至菌液OD600 在0.6~0.8 之间；加入2mL 0.5mmol/L 的IPTG、220 r/min、37℃培养5h；诱导培养结束后， 8000×g 室温离心菌液10min，弃上清；冰浴状态下超声裂解菌体30min。超声后的样品于8000×g、4℃ 离心10min，上清液经0.45μm滤器过滤后用镍柱（Ni²⁺）亲和层析方法对蛋白进行纯化。利用Endotoxin Removing Gel柱或DEAE柱对Ni柱收集的样品进行二次处理以减少内毒素的影响。结果如图6（M₁O）和图7（M_mO）所示。

实施例3 不同来源和种型MTs的佐剂作用

3.1 人源MT3作为疫苗佐剂效应研究

3.1.1 人源MT3在布鲁氏菌抗原Omp19上的佐剂效应

3.1.1.1 MT3增强Omp19的免疫原性、起效速度和持续性

将小鼠随机分为4组，每组8只。分别于第0、14 d对小鼠进行腿部肌肉免。免疫方案如表1所示， PBS组为阴性对照。免疫后7、14、28、35、60、180 d采用眼眶静脉丛采血法对小鼠进行血液采集及血清抗体测定。

表1. MO免疫原性、起效速度及免疫持久性研究方案

注：*表示用量为μL/只。

结果如图8所示，初免后7天，MO免疫组即可检测到较高的Omp19特异性抗体的产生，抗体滴度约为1.4×10⁵， Omp19 + Al(OH)₃+ CpG免疫组激发的抗体滴度约为4.1×10²。相较Omp19 + Al(OH)₃+ CpG（双佐剂）免疫组，MO将Omp19特异性抗体滴度显著提高约343倍（P < 0.0001）。初免后14天，MO所激发的Omp19特异性抗体滴度约为2.0×10⁵，相较于Omp19联合双佐剂免疫组（4.9×10³）显著提高约41倍（P < 0.0001）。二免后14天，MO所激发的抗体滴度约为1.7×10⁶，依然显著高于其他免疫组（P < 0.0001）。抗体持续性研究的结果如图9所示，融合蛋白MO具有较好的免疫持续性，在观测的180天内MO组所激发的Omp19特异的抗体滴度一直维持在高位，较Omp19单独抗原免疫组持续提高100-1000倍。

3.1.1.2 MT3可显著降低Omp19的使用剂量

将BALB/c小鼠随机分组，每组8只，设置20μg Omp19单独免疫组和MO蛋白不同免疫剂量组，通过肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠，PBS作为阴性对照。免疫方法如表2所示。

表2. 免疫剂量研究方案

注：*表示用量为μL/只。

结果如图10所示，初免后7天，5μg MO免疫激发的抗体滴度即显著高于4倍剂量的Omp19单独免疫组，抗体滴度提高约1000倍。初免后14天，0.1μg MO所激发的特异性抗体水平仍显著高于20μg Omp19单独免疫组约10倍, 提示MT3的加入可以显著降低抗原的使用剂量。

3.1.2 人源MT3在破伤风抗原Hc片段上的佐剂效应

3.1.2.1 MT3增强Hc的免疫原性和起效速度

将BALB/c小鼠随机分组，每组5只，分别免疫Hc、Hc+Al(OH)₃、MH。PBS组为阴性对照。免疫1针后7、14、28天采血，分离血清，通过ELISA法检测相应的特异性抗体的产生。免疫方案如表3所示。

表3. MH免疫原性和起效速度研究方案

注：*表示用量为μL/只。

结果如图11所示，与MO研究中观察到的结果类似，5μg MH单针免疫7天即可激发显著高于Hc和Hc联合铝佐剂免疫组的抗体反应，抗Hc特异性抗体相较于Hc单独免疫组显著提高约100倍，相较于Hc联合铝佐剂免疫组显著提高约10倍。提示MT3作为疫苗佐剂可以显著增强Hc特异的抗体反应并能快速诱导抗体的产生。

3.1.2.2 MT3节省了Hc的使用剂量

将小鼠随机分为8组，每组5只。PBS组为阴性对照。于第0 d对小鼠进行腿部肌肉免疫。于免疫后4、7、14、28天采用眼眶采血法对小鼠进行采血，分离血清。抗原剂量及免疫方案如表4所示。

表4 . MH免疫剂量研究方案

注：*表示用量为μL/只。

结果如图12所示，初免后7天，5μg和1μg的MH免疫均可诱导高水平的抗Hc特异性抗体的产生，此时Hc (5μg) + Al(OH)₃组和5μg Hc单独免疫组诱导的抗体滴度均显著低于5μg MH单独免疫组。5μg MH和1μg MH免疫组所诱导的Hc特异性抗体无显著性差异, 1μg MH免疫激发的特异性抗体水平约为5倍剂量Hc免疫激发的100倍。初免后14天，各组的抗体水平均有了一定程度的提高，Hc (5μg) + Al(OH)₃免疫组的抗体滴度与5μg 或1μg MH 免疫组没有显著性差异，但5μg MH免疫组和1μg MH免疫组所激发的抗体水平依然显著高于5μg Hc单独免疫组（P < 0.05）, 1μg MH免疫激发的特异性抗体水平约为5倍剂量Hc免疫激发的10倍。初免后28天，5 μg MH免疫组激发的抗体滴度依然显著高于5μg Hc单独免疫组（P <0.005）。本结果再次提示MT3作为疫苗佐剂可以显著降低抗原的使用剂量，缩短抗原的起效时间。

3.1.2.3 MT3增强了Hc的免疫持续性

将BALB/c小鼠随机分组，每组5只，分别免疫Hc、Hc+Al(OH)₃、MH。PBS组为阴性对照。免疫前和免疫1针后的4、7、14、60、90天采血，分离血清，通过ELISA法检测相应的特异性抗体的产生。免疫方案如表5所示。

表 5. MH免疫持续性研究方案

注：*表示用量为μL/只。

结果如图13所示，融合蛋白MH也具有较好的免疫持续性，在观测的90天内MH组所激发的Hc特异的抗体滴度一直维持在高位，较Hc单独抗原免疫组持续提高约100倍。

3.1.2.4 MT3增强了Hc的保护效力

将小鼠随机分为5组，每组16只。于第0 d对小鼠进行腿部肌肉免疫。免疫方案如表6示，以PBS组为阴性对照。该实验分2批完成，每批实验设置5组，每组8只小鼠。用于评价MH的保护效力。

表6. MH 保护效力研究方案

注：*表示用量为μL/只。

单针免疫14或28d后，用致死剂量的破伤风毒素对小鼠进行攻击。经腹腔途径对每只小鼠注射不同剂量的破伤风毒素，攻毒方案见表7。攻毒后每天观察两次，连续观察10 天（d），记录小鼠的发病及存活情况。

表7. 破伤风毒素攻毒方案

。

小鼠免疫后14 d用5 LD50破伤风毒素攻毒，结果如图14所示，MH免疫组提供了100%的保护作用，Hc单独免疫组提供的保护作用仅为25 %；免疫后28 d攻毒，MH免疫组小鼠100%存活，Hc单独免疫组小鼠生存率为12.5 %，而 MT3、PBS免疫组小鼠在攻毒后6天内全部死亡。MH免疫组的存活率显著高于Hc单独免疫组（P < 0.005），提示MT3作为疫苗佐剂可以有效地增强Hc抗原的保护效力。

3.2 型别及来源对金属硫蛋白佐剂效应的影响

将人源的MT1和鼠源的MT3序列与Omp19蛋白相连，得到融合蛋白M₁O（编码序列如SEQ ID NO. 6所示）和M_mO（编码序列如SEQ ID NO. 7所示）。将BALB/c小鼠随机分组，每组5只，分别免疫MO、M₁O、M_mO、Omp19+Al(OH)₃、Omp19+Al(OH)₃+CpG、Omp19。MT3和PBS免疫组为阴性对照。免疫1针后于4、7、14天采血，分离血清，通过ELISA法检测相应的特异性抗体的产生。免疫方案如表8所示。

表8. MT家族佐剂效应研究方案

注：*表示用量为μL/只。

结果如图15所示，与人源的MT3类似，人源的MT1和鼠源的MT3同样具有免疫增效的作用，均可以在首免后的4、7、14天显著增强抗原的免疫原性，缩短抗体的产生。该结果提示该佐剂能力是MT家族成员的共性。

实施例4. MT3作为佐剂的使用方式研究

4.1 MT3与免疫性抗原形成组合物

将小鼠随机分为4组，每组5只。PBS组为阴性对照。于第0 d对小鼠进行腿部肌肉免疫。于免疫后14 d采用眼眶采血法对小鼠进行采血，分离血清进行检测。免疫方案见表9。

表9. 佐剂使用形式研究方案

注：*表示用量为μL/只。

免疫后14天，MT3与Hc组合物及MH免疫所激发的抗体水平均显著高于Hc单独免疫组（参见图16），提示，MT3发挥佐剂作用的方式可以是通过与免疫原性抗原形成组合物起效。

4.2 MT3与免疫原性抗原直接相互连接

将BALB/c小鼠随机分组，每组8只，分别免疫RBD +Al(OH)₃、MR+ Al(OH)₃。PB组为阴性对照。免疫前和免疫1针后的7、14、28天采血，分离血清，通过ELISA法检测相应的特异性抗体的产生。使用小鼠免疫后28天的血清，进行SARS-CoV-2 活病毒（SARS-CoV-2/human/CHN/Beijing_IME-BJ01/2020 (Genbank No. MT291831)，该病毒株已于“Nat Commun 11,4081 (2020)”中公开）中和实验。将热灭活的小鼠血清梯度稀释后，与100 TCID50的SARS-CoV-2 IME-BJ01毒株在37°C孵育2小时。将血清-病毒复合物添加到预铺有Vero E6 细胞的96孔板中，孵育48〜72小时。用0.05％结晶紫将细胞染色30分钟。加入脱色溶液后，在570nm/ 630nm处测量OD，计算血清活病毒中和抑制率。免疫方案如表10所示。

表 10. MR+ Al(OH)₃免疫评价研究方案

注：*表示用量为μL/只。

结果如图17和图18请提供所示，MT3-RBD联合Al(OH)₃佐剂，在7天即可快速、高效地激发免疫反应，在14d抗体水平较RBD联合Al(OH)₃佐剂组高出约100倍（图17）。中和抗体水平呈现相同趋势（图18），MT3-RBD联合Al(OH)₃佐剂显著优于RBD联合Al(OH)₃佐剂。显示MT3可与Al(OH)₃联用发挥佐剂效力。

4.3 MT3与免疫原性抗原通过间隔序列（序列如SEQ ID NO.10所示的连接肽）相互连接

将BALB/c小鼠随机分组，每组3只。将Omp19、Omp19与MT3融合蛋白（MO）组及PBS对照组分别于第0、14d对小鼠进行腿部肌肉免疫。免疫方案如表11所示。

表11. 佐剂使用形式研究方案

注：*表示用量为μL/只。

结果如图19所示，在免疫后的7、14、28d，MT3与Omp19的融合蛋白MO免疫所激发的抗体滴度显著高于单独Omp19免疫组。提示MT3可以以融合蛋白的形式发挥佐剂效应。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 61

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys Thr

1 5 10 15

Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser

20 25 30

Cys Cys Ser Cys Cys Pro Met Ser Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys

35 40 45

Ile Cys Lys Gly Ala Ser Glu Lys Cys Ser Cys Cys Ala

50 55 60

<210> 2

<211> 68

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys

1 5 10 15

Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys

20 25 30

Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp

35 40 45

Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys

50 55 60

Ser Cys Cys Gln

65

<210> 3

<211> 68

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys

1 5 10 15

Ser Asp Lys Cys Lys Cys Lys Gly Cys Lys Cys Thr Asn Cys Lys Lys

20 25 30

Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Gly Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp

35 40 45

Cys Val Cys Lys Gly Glu Glu Gly Ala Lys Ala Glu Ala Glu Lys Cys

50 55 60

Ser Cys Cys Gln

65

<210> 4

<211> 158

<212> PRT

<213> Brucella

<400> 4

Met Cys Gln Ser Ser Arg Leu Gly Asn Leu Asp Asn Val Ser Pro Pro

1 5 10 15

Pro Pro Pro Ala Pro Val Asn Ala Val Pro Ala Gly Thr Val Gln Lys

20 25 30

Gly Asn Leu Asp Ser Pro Thr Gln Phe Pro Asn Ala Pro Ser Thr Asp

35 40 45

Met Ser Ala Gln Ser Gly Thr Gln Val Ala Ser Leu Pro Pro Ala Ser

50 55 60

Ala Pro Asp Leu Thr Pro Gly Ala Val Ala Gly Val Trp Asn Ala Ser

65 70 75 80

Leu Gly Gly Gln Ser Cys Lys Ile Ala Thr Pro Gln Thr Lys Tyr Gly

85 90 95

Gln Gly Tyr Arg Ala Gly Pro Leu Arg Cys Pro Gly Glu Leu Ala Asn

100 105 110

Leu Ala Ser Trp Ala Val Asn Gly Lys Gln Leu Val Leu Tyr Asp Ala

115 120 125

Asn Gly Gly Thr Val Ala Ser Leu Tyr Ser Ser Gly Gln Gly Arg Phe

130 135 140

Asp Gly Gln Thr Thr Gly Gly Gln Ala Val Thr Leu Ser Arg

145 150 155

<210> 5

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggatccgg aaacctgccc gtgcccgagc ggcggcagct gcacctgcgc ggattcctgc 60

aaatgcgaag gctgcaaatg cacctcttgc aaaaaatctt gctgcagctg ctgcccggcg 120

gaatgcgaaa aatgcgcgaa agattgcgtt tgcaaaggtg gtgaagcggc ggaagcggaa 180

gcggaaaaat gcagctgctg ccagggtggc ggctccatgt gccagagcag ccgtctgggc 240

aacctggata acgttagccc gccgccgccg ccggcgccgg tgaacgcggt tccggctggc 300

accgttcaga aaggtaacct ggattctccg acccagttcc cgaacgcgcc gagcaccgat 360

atgagcgcgc agtctggcac ccaggttgcg agcctgccgc cggcgtccgc gccggatctg 420

accccaggcg cggttgcggg tgtttggaac gcgagcctgg gcggtcagtc ttgcaaaatc 480

gcgaccccgc agaccaaata cggccagggc taccgtgcgg gcccgctgcg ttgtccgggc 540

gaactggcga acctggcgtc ttgggcggtg aacggcaaac agctggtgct gtacgacgcg 600

aacggcggca ccgttgcgag cctgtatagc tctggtcagg gccgtttcga cggccagacc 660

accggcggcc aggcggttac cctgtctcgt taa 693

<210> 6

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggatccga attgtagttg cgcaaccggc ggtagttgta cctgtaccgg tagctgtaaa 60

tgcaaagaat gcaaatgtac cagctgtaaa aaatcttgtt gtagctgctg tccgatgagc 120

tgcgccaaat gtgcccaggg ttgtatttgc aaaggcgcaa gtgaaaaatg cagctgctgc 180

gcaggtggtg gtagcatgtg tcagagtagc cgcctgggca atctggataa tgttagtccg 240

ccgccgccgc ctgcaccggt taatgcagtt ccggccggca ccgttcagaa aggcaatctg 300

gacagcccga cccagtttcc gaatgccccg agcaccgata tgagtgccca gagtggcacc 360

caggttgcca gtctgccgcc ggctagcgca ccggatctga cccctggtgc agttgcaggc 420

gtgtggaatg caagcctggg tggtcagagt tgtaaaattg caaccccgca gaccaaatat 480

ggccagggct atcgtgccgg cccgctgaga tgcccgggtg aactggccaa tctggcaagc 540

tgggcagtga atggtaaaca gctggttctg tatgatgcca atggtggcac cgttgccagt 600

ttatatagca gtggccaggg ccgttttgat ggtcagacca ccggtggtca ggccgtgacc 660

ctgagtcgct aa 672

<210> 7

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggatccgg aaacctgccc gtgtccgacc ggtggtagct gcacctgtag cgataaatgt 60

aaatgtaaag gttgtaagtg caccaattgt aaaaaatctt gttgcagctg ctgtccggca 120

ggttgtgaaa aatgcgcaaa agattgcgtg tgcaaaggtg aagaaggtgc aaaagcagaa 180

gcagaaaaat gtagttgttg ccagggtggc ggtagcatgt gccagagtag tcgtctgggt 240

aatctggata atgttagccc gccgccgccg cctgcccctg tgaacgcagt tccggcaggc 300

accgtgcaga aaggcaatct ggatagcccg acccagtttc cgaatgcacc gagcaccgat 360

atgagcgccc agagtggtac ccaggtggca agcctgccgc cggctagcgc tcctgatctg 420

accccgggcg cagtggccgg tgtgtggaat gcaagtctgg gcggtcagag ttgtaaaatt 480

gccaccccgc agaccaaata tggccagggc tatcgcgccg gcccgctgcg ttgtcctggt 540

gaactggcaa atctggcaag ctgggccgtt aatggtaaac agctggttct gtatgatgcc 600

aatggcggta ccgttgcaag cctgtatagt agcggccagg gccgctttga tggccagacc 660

accggcggtc aggccgtgac actgagccgc taa 693

<210> 8

<211> 453

<212> PRT

<213> Clostridium tetani

<400> 8

Met Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val

1 5 10 15

Ile Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile

20 25 30

Ile Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp

35 40 45

Ala Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn

50 55 60

Asn Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr

65 70 75 80

Asn Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro

85 90 95

Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Asp Thr Asn Glu Tyr Ser

100 105 110

Ile Ile Ser Ser Met Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp

115 120 125

Ser Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser

130 135 140

Ala Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Ser Asp Lys Phe

145 150 155 160

Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp

165 170 175

Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser

180 185 190

Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr

195 200 205

Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp

210 215 220

Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys

225 230 235 240

Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly

245 250 255

Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Tyr

260 265 270

Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu

275 280 285

Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg

290 295 300

Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn

305 310 315 320

Asn Glu Ile Asp Ser Phe Val Arg Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr

325 330 335

Val Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly

340 345 350

Asn Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Met Leu Arg Val Gly Tyr Asn

355 360 365

Ala Pro Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg

370 375 380

Asp Leu Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asp

385 390 395 400

Ala Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp

405 410 415

Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu

420 425 430

Lys Asp Lys Thr Leu Thr Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu

435 440 445

Gly Trp Thr Asn Asp

450

<210> 9

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggatccgg aaacctgtcc gtgtccgagt ggtggtagtt gtacctgcgc agatagctgt 60

aaatgtgaag gttgcaaatg taccagctgc aaaaaatctt gctgtagctg ttgtccggcc 120

gaatgcgaaa aatgtgcaaa agattgtgtg tgcaaaggtg gtgaagcagc cgaagcagaa 180

gccgaaaaat gtagctgttg ccagggtggc ggtggcagca tgaaaaatct ggattgttgg 240

gtggataatg aagaagatat tgatgttatc ctgaagaaaa gtaccattct gaatctggat 300

attaacaatg atatcatcag cgatatcagc ggttttaata gcagcgttat tacctatccg 360

gatgcccagc tggtgccggg cattaatggc aaagccattc atctggttaa taatgaaagt 420

agcgaagtta ttgtgcataa agccatggat attgaatata atgacatgtt taacaacttc 480

accgttagtt tttggctgcg cgttccgaaa gtgagcgcaa gtcatctgga acagtatgat 540

accaatgaat atagcattat cagcagcatg aaaaaataca gcctgagtat tggcagcggt 600

tggagtgtga gcctgaaagg taataatctg atttggaccc tgaaagatag cgcaggtgaa 660

gttcgccaga ttacctttcg tgatctgagt gataaattca atgcatatct ggcaaataag 720

tgggttttta ttaccattac caacgatcgt ctgagcagcg caaatctgta tattaatggt 780

gtgctgatgg gcagcgccga aattaccggc ctgggcgcca ttcgcgaaga taataatatt 840

accctgaaac tggatcgttg taataataat aaccagtatg tgagtatcga caaatttcgc 900

attttctgta aagccctgaa tccgaaagaa attgaaaaac tgtataccag ctacctgagc 960

attacctttc tgcgtgattt ttggggtaat ccgctgcgct atgataccga atattatctg 1020

attccggttg cctatagcag caaagatgtt cagctgaaaa atattaccga ttatatgtac 1080

ctgaccaatg caccgagcta taccaatggt aaactgaata tctattaccg ccgcctgtat 1140

agcggtctga aattcattat taagcgttat accccgaata atgaaattga tagtttcgtt 1200

cgcagtggtg actttattaa gctgtatgtg agctataata acaacgaaca tatcgttggc 1260

tatccgaaag atggcaatgc attcaataat ctggatcgta ttctgcgcgt tggctataat 1320

gcaccgggca ttccgctgta taaaaagatg gaagcagtga aactgcgtga tctgaaaacc 1380

tatagtgtgc agctgaaact gtatgatgat aaagatgcca gcctgggtct ggtgggtacc 1440

cataatggcc agattggtaa tgatccgaat cgcgatattc tgattgcaag caattggtat 1500

tttaaccatc tgaaagataa gaccctgacc tgtgattggt attttgttcc gaccgatgaa 1560

ggctggacca atgattaa 1578

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 11

<211> 223

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 11

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 12

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggacgcca tgaagagggg cctgtgttgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

agcaattccg atcctgagac ctgcccctgt ccctccggcg gaagctgcac atgtgccgat 120

tcctgcaagt gtgagggctg caagtgcaca tcctgtaaga agtcctgctg ttcctgctgt 180

cccgccgagt gcgagaagtg tgccaaggat tgtgtgtgta agggcggcga ggccgccgag 240

gctgaggctg agaagtgtag ctgttgccag agagtgcagc ccaccgagag catcgtgaga 300

ttccctaaca tcacaaatct gtgtcccttt ggcgaggtgt ttaatgccac aaggttcgcc 360

agcgtgtacg cctggaatag gaagaggatc tccaattgcg tggccgatta ctccgtgctg 420

tacaattccg cctccttcag cacctttaag tgttacggcg tgagccccac aaagctgaac 480

gacctgtgct ttaccaacgt gtacgccgac tcctttgtga tcagaggcga cgaggtgagg 540

cagatcgccc ccggacagac aggcaagatc gccgactaca actacaagct gcccgacgac 600

ttcacaggct gcgtgatcgc ctggaacagc aacaacctgg atagcaaggt gggcggcaac 660

tacaactacc tgtacaggct gttcagaaag tccaacctga agcctttcga gagagacatc 720

agcaccgaga tctaccaggc cggcagcaca ccctgcaacg gcgtggaggg ctttaactgc 780

tacttccctc tgcagtccta cggctttcag cctaccaatg gcgtgggcta ccagccctac 840

agagtggtgg tgctgtcctt tgagctgctg cacgcccccg ccaccgtgtg tggaccaaag 900

aagagcacca atctggtgaa gaacaagtgt gtgaactttc accaccacca ccatcactga 960

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims

1.金属硫蛋白在制备免疫佐剂中的应用，其特征在于，所述金属硫蛋白选自序列为SEQID NO.1所示的人源I型、SEQ ID NO.2所示的人源III型、SEQ ID NO.3所示的鼠源III型中的任一种，所述金属硫蛋白与免疫原性抗原通过直接相连或者以柔性连接肽相连重组为融合蛋白，所述免疫原性抗原为布鲁氏菌Omp19抗原、破伤风毒素重链C片段、新型冠状病毒受体结合域蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、人乳头瘤病毒抗原、肺炎球菌抗原或流感病毒抗原。