JP6048845B2 - ジフテリア毒素の無毒性突然変異体crm197又はその断片を含む融合タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明に関与する配列の情報を、以下の表に示す。
ATCCから得たジフテリア・バチルス(Diphtheria bacillus)C7(β197)菌株(NO53281)から抽出したゲノムDNAを、PCR反応のための鋳型として使用し、順方向プライマーが、CRM197F(配列番号19)であり、逆方向プライマーが、CRM197R(配列番号20)であった。PCR反応を、PCR装置(Biometra T3)中、以下の条件下で実施して、CRM197をコードする完全長の遺伝子を調製した。
実施例では、融合タンパク質を発現するベクターを、例として構築した。構築した種々の例示的な融合タンパク質のクローン設計を、図1に示し、図中、融合タンパク質はそれぞれ、CRM197又はその断片及びHEVキャプシドタンパク質の断片を、場合によりリンカーを使用して含む。
実施例1で得た増幅生成物(すなわち、CRM197の完全長の遺伝子)を、鋳型として使用した。順方向プライマーが、CRM197F(配列番号19)であり、当該プライマーの5’末端に、制限エンドヌクレアーゼNdeI部位CAT ATGを導入し、ATGは、イー・コライ系における開始コドンであった。逆方向プライマーは、CRM197−リンカーR(配列番号21)、389−リンカーR(配列番号22)、及びA−リンカーR(配列番号23)であり、それぞれ、当該プライマーの5’末端に、制限エンドヌクレアーゼBamHI部位GGA TCCを導入した。PCR反応を、PCRサーモサイクラー(Biometra T3)中、以下の条件下で実施した。使用したプライマーの配列を、表1に示した。
389−E2s及びA−E2sを発現するベクターを、3つのPCR反応により構築した。第1のPCR反応のために、CRM197の完全長の遺伝子を、鋳型として使用した。順方向プライマーが、CRM197Fであり、当該プライマーの5’末端に、制限エンドヌクレアーゼNdeI部位CAT ATGを導入し、ATGは、イー・コライ系における開始コドンであった。逆方向プライマーがそれぞれ、389−E2sR(配列番号27)及びA−E2sR(配列番号28)であった。増幅を実施して、融合タンパク質のN−末端断片を得た。第2のPCR反応のために、CRM197の完全長の遺伝子を、鋳型として使用した。順方向プライマーがそれぞれ、389−E2sF(配列番号29)及びA−E2sF(配列番号30)であった。逆方向プライマーが、DrP59Rであり、当該プライマーの5’末端に、制限エンドヌクレアーゼEcoRI部位GAA TTCを導入した。増幅を実施して、融合タンパク質のC−末端断片を得た。第1及び第2のPCR反応を、PCRサーモサイクラー(Biometra T3)中、以下の条件下で実施した。
融合タンパク質の発現及び封入体の精製
−70℃の極低温フリーザーから取った5μLの細菌溶液を、カナマイシンを含有する液体LB培地の5mLに播種し、次いで、OD600が約0.5に達するまで、180rpmで振とうしながら、37℃で培養した。得られた溶液を、カナマイシンを含有するLB培地の500mlに移動させ、次いで、180rpmで振とうしながら、37℃で4〜5時間培養した。OD600が約1.5に達したら、IPTGを添加して、0.4mMの最終濃度を得、細菌を、振とうしながら37℃で4時間誘発した。
試料:上記で得た、約80%の純度を有するA−L−E2タンパク質の溶液。
機器:GE Healthcare(すなわち、元々は、Amershan Pharmacia Co.)製のAKTA Explorer 100調製用液体クロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー用の媒体:Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Co.)
カラム体積:15mm×20cm
緩衝液:20mMリン酸緩衝液、pH7.7+4M尿素
20mMリン酸緩衝液、pH7.7+4M尿素+1M NaCl
流速:6mL/分
検出器の波長:280nm
溶出プロトコール:目的のタンパク質を、150mM NaClを用いて溶出し、望まれないタンパク質を、300mM NaClを用いて溶出し、150mM NaClを用いて溶出した画分を収集する。
機器:GE Healthcare(すなわち、元々は、Amershan Pharmacia Co.)製のAKTA Explorer 100調製用液体クロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー用の媒体:Phenyl Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Co.)
カラム体積:15mm×20cm
緩衝液:20mMリン酸緩衝液、pH7.7+4M尿素+0.5M(NH4)2SO4
20mMリン酸緩衝液、pH7.7+4M
流速:5mL/分
検出器の波長:280nm
試料:以前のステップにおいて得た、150mM NaClを用いて溶出した画分を、緩衝液(20mMリン酸緩衝液、pH7.7+4M尿素+0.5M(NH4)2SO4)に対して透析し、次いで、試料として使用した。
溶出プロトコール:望まれないタンパク質を、0.3M(NH4)2SO4を用いて溶出し、目的のタンパク質を、0.1M及び0Mの(NH4)2SO4を用いて溶出し、0.1M及び0Mの(NH4)2SO4を用いて溶出した画分を収集する。
融合タンパク質の抗体との反応性の、ウエスタンブロッティングによる決定
HEV中和モノクローナル抗体8C11(Zhangら、Vaccine、23(22):2881〜2892(2005)を参照されたい)及び抗CRM197ポリクローナル抗血清(当該血清は、当技術分野で周知の方法を通して、CRM197を用いてマウスを免疫化することによって調製し、血清の反応性を、商業的に入手可能なCRM197により確認した)との融合タンパク質の反応性を、ウエスタンブロッティングにより決定した。透析及び再生した試料を、SDS−PAGE分離の後に、ニトロセルロース膜に移動させて、ブロッティングを行った。5%脱脂粉乳を使用して、膜を2時間ブロックし、次いで、特定の比に希釈したモノクローナル抗体8C11を添加し(モノクローナル抗体を1:500に希釈し、ポリクローナル抗血清を1:1000に希釈した)、反応を1時間行った。膜を、TNT(50ミリモル/L Tris−Cl(pH7.5)、150ミリモル/L NaCl、0.05%Tween20)を用いて、各回10分3回にわたり洗浄した。次いで、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ(KPL製)を添加し、反応を1時間行い、次いで、膜を、TNTを用いて、各回10分3回にわたり洗浄した。NBT及びBCIP(PROTOS製)を使用して、可視化した。融合タンパク質及びHEV中和モノクローナル抗体8C11を使用してウエスタンブロッティングにより決定した結果を、図4に示した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、HEV中和モノクローナル抗体8C11との顕著な反応性を有することが示された。
融合タンパク質並びに対照タンパク質であるE2及びHEV−239の、種々のHEV特異的抗体(Gu Yingら、Chinese Journal of Virology、19(3):217〜223(2003))との反応性を、間接ELISAにより決定した。透析及び再生した試料を、1×PBS(1μg/ml)中に希釈し、次いで、96ウエルマイクロプレート(Beijing Wantai Co.)に100μl/ウエルで添加し、37℃で2時間インキュベートした。コーティング溶液を廃棄し、プレートを、PBST(PBS+0.05%Tween−20)を用いて1回洗浄し、次いで、ブロッキング溶液(PBS中の2%ゼラチン、5‰カゼイン、1‰プロクリン300)を、200μl/ウエルで添加し、37℃で2時間インキュベートした。ブロッキング溶液を廃棄して、検出を実施し、特定の比に希釈したHEVモノクローナル抗体(E2s及びE2sの融合タンパク質を検出する場合、それらを1:10000に希釈した。E2及びE2の融合タンパク質を検出する場合、それらを1:100000に希釈した。A−L−E2、239及びE2タンパク質の反応性を比較する場合、モノクローナル抗体は、10倍段階希釈に付し、1mg/mlを、最初の濃度として使用し、ポリクローナル抗体は、その最初の濃度から、同じように希釈に付した)を、100μl/ウエルで添加した。混合物を、37℃で1〜2時間インキュベートした。次いで、プレートを、PBSTを用いて5回にわたり洗浄し、次いで、HRP標識ヤギ抗マウス(KPL製)(1:5000)を、100μl/ウエルで添加し、37℃で30分間インキュベートした。次いで、プレートを、PBSTを用いて5回にわたり洗浄し、次いで、HRPの基質(Beijing Wantai Co.)を、100μl/ウエルで添加し、37℃で15分間インキュベートした。2M硫酸を50μl/ウエルで添加して、反応を止め、次いで、マイクロプレートリーダー(Sunrise Type、Tecan Co.製)を使用して、OD450/620の値を読み取った。融合タンパク質とモノクローナル抗体とを使用したELISAの結果を、図5に示す。結果から、E2sタンパク質のCRM197又はその断片との融合の後に、E2sタンパク質のモノクローナル抗体との反応性が顕著に増強され、A−L−E2s及びA−E2sの反応性が最も顕著に増強され、E2タンパク質のCRM197又はその断片との融合の後に、E2タンパク質のHEVに特異的なモノクローナル抗体との反応性は、保持されるか又は増強されることが示された。
二段階クロマトグラフィーにより精製した融合タンパク質A−L−E2の反応性を、間接ELISAにより解析した(以前のステップにおける具体的なプロセスを参照されたい)。ELISAの結果を、図6に示した。結果から、A−L−E2のHEVに特異的なモノクローナル抗体との反応性は、対照タンパク質のHEV−239及びE2の反応性に匹敵することが示された。
実験で使用する装置は、米国のBeckman XL−A解析用超遠心分離機であり、当該遠心分離機には、光学的検出システム、並びにAn−50Ti回転子及びAn−60Ti回転子が装備されていた。沈降速度(SV)法(c(s)アルゴリズム、P.Schuckら、Biophys J、78:1606〜1619(2000)を参照されたい)を使用して、融合タンパク質A−L−E2の沈降係数を解析した。解析の結果を、図7に示す。結果から、融合タンパク質A−L−E2は、主として二量体の形態で存在し、二量体の中には、さらに重合して、四量体を形成することができるものがあることが示された。
融合タンパク質が誘発する抗体価
実験で使用したマウスは、雌、6週齢のBALB/Cマウスであった。アルミニウムアジュバントを使用することによって、マウスを、実施例3の方法により調製し、PBSに再生した融合タンパク質並びに対照タンパク質のHEV−239、E2及びE2sそれぞれの腹腔内注射により免疫化した。注射体積は1mlであり、2つの投与群(5μg用量群又は0.5μg用量群)を使用した。一次免疫化を第0週に実施し、追加免疫化を、第2及び4週に実施した。
実験において、融合タンパク質の免疫原性を、有効用量の中央値(ED50)を決定することによって検討した。使用した実験動物は、3〜4週齢の雌BALB/Cマウスであった。A−L−E2は、アルミニウムアジュバントと混合し、初回用量は、1μg/マウスであり、1:3の段階希釈に付し、結果として、全部で8つの投与群を得た。さらに、HEV−239(HEV組換えワクチン)を、対照として使用し、初回用量は、1.6μg/マウスであり、1:4の段階希釈に付し、結果として、全部で4つの投与群も得た。6匹のマウスを、各群で使用した。免疫化を、単回の腹腔内注射により実施した。
実施例では、融合タンパク質を発現するベクターを、例として構築した。構築した例示的な融合タンパク質のクローン設計を、図9に示し、図中、融合タンパク質はそれぞれ、CRM197又はその断片及びインフルエンザウイルスM2eタンパク質を、場合によりリンカーを使用して含む。
CRM197又はその断片のC−末端に融合させたM2e
実施例1で得た増幅生成物(すなわち、CRM197の完全長の遺伝子)を、鋳型として使用した。順方向プライマーが、CRM197F1(配列番号45)であり、当該プライマーの5’末端に、制限エンドヌクレアーゼNdeI部位CAT ATGを導入し、ATGは、イー・コライ系における開始コドンであった。逆方向プライマーが、CRM197−リンカーR1(配列番号46)、389−リンカーR1(配列番号47)、及びA−リンカーR1(配列番号48)であり、それぞれ、当該プライマーの5’末端に、制限エンドヌクレアーゼBamHI部位GGA TCCを導入した。PCR反応を、PCRサーモサイクラー(Biometra T3)中、以下の条件下で実施した。使用したプライマーの配列を、表4に示した。
(我々の研究室に保存されている、M2の完全長の遺伝子を含有する)プラスミドPHW2000を、鋳型として使用した。順方向プライマーが、M2eF2(配列番号51)であり、当該プライマーの5’末端に、制限エンドヌクレアーゼNdeI部位CAT ATGを導入し、ATGは、イー・コライ系における開始コドンであった。逆方向プライマーが、M2e−リンカーR(配列番号52)であり、当該プライマーの5’末端に、制限エンドヌクレアーゼBamHI GGA TCCを導入した。PCR反応を、PCRサーモサイクラー(Biometra T3)中、以下の条件下で実施した。
−70℃の極低温フリーザーから取った5μLの細菌溶液を、カナマイシンを含有する液体LB培地の5mLに播種し、次いで、OD600が約0.5に達するまで、180rpmで振とうしながら、37℃で培養した。得られた溶液を、カナマイシンを含有するLB培地の500mlに移動させ、次いで、180rpmで振とうしながら、37℃で4〜5時間培養した。OD600が約1.5に達したら、IPTGを添加して、0.4mMの最終濃度を得、細菌を、振とうしながら37℃で4時間誘発した。
融合タンパク質の抗体との反応性の、ウエスタンブロッティングによる決定
融合タンパク質の、インフルエンザウイルスM2eモノクローナル抗体5D1及びCRM197モノクローナル抗体1E6(実験室で調製した)との反応性を、ウエスタンブロッティングにより決定した。透析及び再生した試料を、SDS−PAGE分離の後に、ニトロセルロース膜に移動させて、ブロッティングを行った。5%脱脂粉乳を使用して、膜を2時間ブロックし、次いで、1:500に希釈したモノクローナル抗体5D1を添加した。反応を1時間行った。次いで、膜を、TNT(50ミリモル/L Tris−Cl(pH7.5)、150ミリモル/L NaCl、0.05%Tween20)を用いて、各回10分3回にわたり洗浄した。次いで、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ(KPL製)を添加した。反応を1時間行い、次いで、膜を、TNTを用いて、各回10分3回にわたり洗浄した。NBT及びBCIP(PROTOS製)を使用して、可視化した。融合タンパク質及びインフルエンザウイルスM2eモノクローナル抗体5D1(図11A〜11D)又はCRM197モノクローナル抗体1E6(図11E〜11H)を使用してウエスタンブロッティングにより決定した結果を、図11に示した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、インフルエンザウイルスM2eに特異的なモノクローナル抗体5D1及びCRM197に特異的なモノクローナル抗体1E6との顕著な反応性を有することが示された。
融合タンパク質及び対照タンパク質GST−M2eの、種々のM2eに特異的な抗体、及びCRM197に特異的なモノクローナル抗体1E6(実験で使用する抗体は、先行技術で公知であり、若しくは商業的に入手可能であるか、又は実験室で調製した)との反応性を、間接ELISAにより決定した。例えば、O19抗体は、先行技術で公知のインフルエンザに対する防御抗体である(Fuら、Virology、2009、385:218〜226を参照されたい)。透析及び再生した試料を、1×PBS(1μg/ml)中に希釈し、次いで、96ウエルマイクロプレート(Beijing Wantai Co.)に100μl/ウエルで添加し、37℃で2時間インキュベートした。コーティング溶液を廃棄し、プレートを、PBST(PBS+0.05%Tween−20)を用いて1回洗浄し、次いで、ブロッキング溶液(PBS中の2%ゼラチン、5‰カゼイン、1‰プロクリン300)を、180μl/ウエルで添加し、37℃で2時間インキュベートした。ブロッキング溶液を廃棄して、検出を実施し、特定の比に希釈した(0.002mg/mlを最初の濃度として使用して、2倍勾配による希釈を行った)抗M2e抗体又はCRM197抗体を、100μl/ウエルで添加した。混合物を、37℃で1時間インキュベートした。プレートを、PBSTを用いて5回にわたり洗浄し、次いで、HRP標識ヤギ抗マウス(KPL製)(1:5000)を、100μl/ウエルで添加し、37℃で30分間インキュベートした。プレートを、PBSTを用いて5回にわたり洗浄し、次いで、HRPの基質(Beijing Wantai Co.)を、100μl/ウエルで添加し、37℃で15分間インキュベートした。2M硫酸を50μl/ウエルで添加して、反応を止め、次いで、マイクロプレートリーダー(Sunrise Type、Tecan Co.製)を使用して、OD450/620の値を読み取った。融合タンパク質と抗体とを使用したELISAの結果を、図12A及び12Bに示した。結果から、M2eタンパク質単独と比較して、M2eタンパク質のCRM197又はその断片との融合の後に、M2eタンパク質の種々の抗M2e特異的モノクローナル抗体との反応性は、保持されるか又は増強されることが示された。
実験で使用する装置は、米国のBeckman XL−A解析用超遠心分離機であり、当該遠心分離機には、光学的検出システム、並びにAn−50Ti回転子及びAn−60Ti回転子が装備されていた。沈降速度(SV)法(c(s)アルゴリズム、P.Schuckら、Biophys J、78:1606〜1619(2000)を参照されたい)を使用して、融合タンパク質の沈降係数を解析した。解析の結果を、図13A〜13Fに示した。結果から、実施例6において構築した融合タンパク質のうち、A−L−M2e及びM2e−L−Aは、主として単量体及び四量体の形態で存在し、389−L−M2eは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、M2e−L−389は、主として単量体及びポリマーの形態で存在し、CRM197−L−M2eは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、M2e−L−CRM197は、主として単量体及びポリマーの形態で存在することが示された。
実験で使用したマウスは、雌、6週齢のBALB/Cマウスであった。アルミニウムアジュバントを使用することによって、マウスを、実施例6において構築し、PBSに再生した融合タンパク質及び対照タンパク質GST−M2eそれぞれの腹腔内注射により免疫化した。注射体積は1mlであり、2つの投与群(5μg用量群又は0.5μg用量群)を使用した。一次免疫化を第0週に実施し、追加免疫化を、第2及び4週に実施した。
Claims (28)
- CRM197の断片及び標的タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記CRM197の断片が、標的タンパク質の免疫原性を増強し、前記CRM197の断片が、CRM197のaa1〜190、又はaa1〜389を含む、融合タンパク質。
- 前記標的タンパク質が、HEVキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記HEVキャプシドタンパク質の免疫原性断片が、HEV−239(HEVキャプシドタンパク質のaa368〜606)、E2(HEVキャプシドタンパク質のaa394〜606)若しくはE2s(HEVキャプシドタンパク質のaa455〜606)を含むか、又はHEV−239(HEVキャプシドタンパク質のaa368〜606)、E2(HEVキャプシドタンパク質のaa394〜606)若しくはE2s(HEVキャプシドタンパク質のaa455〜606)である、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記標的タンパク質が、インフルエンザウイルスM2タンパク質又はその免疫原性断片である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記M2タンパク質の免疫原性断片が、M2e(M2タンパク質のaa1〜24)を含むか、又はM2e(M2タンパク質のaa1〜24)である、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質において、前記CRM197の断片が、標的タンパク質のN−末端及び/又はC−末端に、リンカーを介して又は介さずに、連結されており、並びに/或いは、CRM197の断片が配列番号2のaa1〜190又はaa1〜389からなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、リンカーを介して又は介さずに、連結されている、前記CRM197の断片及びHEVキャプシドタンパク質若しくはその免疫原性断片を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、配列番号8、10、12、14、16又は18に記載するアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、リンカーを介して又は介さずに、連結されている、前記CRM197の断片及びインフルエンザウイルスM2タンパク質若しくはその免疫原性断片を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、配列番号36、38、42又は44に記載するアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドを含むコンストラクト。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチド又は請求項12に記載のコンストラクトを含むベクター。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチド、請求項12に記載のコンストラクト、又は請求項13に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質、並びに場合により、薬学的に許容できる担体及び/又は賦形剤を含む、医薬組成物又はワクチン。
- 標的タンパク質により予防又は治療することができる疾患を予防及び/又は治療するための医薬組成物の製造における、請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
- 前記融合タンパク質が、CRM197の断片及びHEVキャプシドタンパク質若しくはその免疫原性断片を含み、前記医薬組成物が、HEV感染及びHEV感染に伴う疾患の予防及び/又は治療に使用される、請求項16に記載の使用。
- 前記HEV感染に伴う疾患がE型肝炎である、請求項17に記載の使用。
- 前記融合タンパク質が、CRM197の断片及びインフルエンザウイルスM2タンパク質若しくはその免疫原性断片を含み、前記医薬組成物が、インフルエンザウイルス感染、及びインフルエンザウイルス感染に伴う疾患の予防及び/又は治療に使用される、請求項16に記載の使用。
- 前記インフルエンザウイルス感染に伴う疾患がインフルエンザである、請求項19に記載の使用。
- HEV感染、及び/又はHEV感染に伴う疾患を予防及び/又は治療するための融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、リンカーを介して又は介さずに、連結されている、CRM197の断片及びHEVキャプシドタンパク質若しくはその免疫原性断片を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- インフルエンザウイルス感染、及びインフルエンザウイルス感染に伴う疾患を予防及び/又は治療するための融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、リンカーを介して又は介さずに、連結されている、CRM197の断片及びインフルエンザウイルスM2タンパク質若しくはその免疫原性断片を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 標的タンパク質の免疫原性を増強するための方法であって、前記方法が、標的タンパク質の免疫原性を増強する融合タンパク質であり、請求項1に定義されたCRM197の断片、及び前記標的タンパク質を含む融合タンパク質を得るステップを含む、方法。
- 前記融合タンパク質が、CRM197の断片の、標的タンパク質との、リンカーを使用した又は使用しない、融合発現によって得られる、請求項23に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、HEVキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスM2タンパク質、又はそれらの免疫原性断片である、請求項23又は24に記載の方法。
- 標的タンパク質の免疫原性の増強における、請求項1に定義されたCRM197の断片の使用において、前記使用が、CRM197の断片及び前記標的タンパク質を含む融合タンパク質を得ることを特徴とする、使用。
- 前記融合タンパク質が、CRM197の断片の、標的タンパク質との、リンカーを使用した又は使用しない、融合発現によって得られる、請求項26に記載の使用。
- 前記標的タンパク質が、HEVキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスM2タンパク質、又はそれらの免疫原性断片である、請求項26又は27に記載の使用。
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