CN118027189A - 一种抗白喉毒素突变体抗体及crm197的纯化制备方法和应用 - Google Patents
一种抗白喉毒素突变体抗体及crm197的纯化制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出一种抗白喉毒素突变体抗体及CRM197的纯化制备方法和应用。本发明在研发并制备出CRM197抗原的基础上，进一步将白喉毒素突变体免疫接种小鼠后，将鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选产生抗白喉毒素突变体的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,经测序后得到抗白喉毒素突变体抗体序列。杂交瘤细胞于小鼠体内培养后，在体外通过层析纯化等方法可制得抗CRM197抗体。该抗体与CRM197具有较高的亲和力，可用于CRM197蛋白的纯化制备，也可用于以CRM197为载体的偶联疫苗的纯化制备，更进一步，可用于酶联免疫法检测以CRM197为载体的偶联疫苗中CRM197的含量。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种抗白喉毒素突变体抗体及CRM197的纯化制备方法和应用。
背景技术
白喉毒素（Diphtheria toxin，DT）是β噬菌体将白喉杆菌溶源化后，其tox基因编码表达的外毒素。DT可以灭活真核细胞的肽链延伸因子（Elongation factor，EP），阻断其细胞蛋白合成，从而导致细胞凋亡。
CRM197（cross-reacting materials197）是白喉毒素突变体中的一种，早期从白喉杆菌毒性基因突变株的菌株中获得。由于错义突变，白喉毒素抗原结合片段中第52位点上的甘氨酸（Gly）突变为谷氨酸（Glu），致使白喉毒素酶活性位点发生改变，CRM197的A片段不能与EF2结合，从而不能对细胞起到毒性作用，但免疫原性与白喉毒素没有显著差异，CRM197和DT均可以与细胞膜上的白喉毒素受体（Diphtheria toxin receptor,DTR）结合。因此，CRM197常作为一种理想的免疫蛋白载体而广泛应用于疫苗开发领域。
王春娥等对制备的CRM197分离纯化，将其作为蛋白载体，成功制备了A群脑膜炎球菌结合物，增加了我国结合疫苗的载体类型。赵雪娜等将G17与CRM197交联制备抗癌疫苗，通过体外药效试验证明其抑制肿瘤效果显著。Sticking P等在透皮免疫研究中发现，以CRM197作为交联反应物的DT疫苗可以提高小鼠体内功能性抗体水平。Broke M等系统研究了CRM197的生物化学和生物学特性，指出其作为疫苗结合蛋白的重要用途和潜在的临床应用。十多年来，几种广泛使用的抗严重疾病（如B型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等引起的疾病）的常规儿童复合糖疫苗，都利用CRM197作为蛋白载体。
本发明人在此前研发并且申报了专利（白喉毒素突变体CRM197的制备方法，专利号：CN104140972B），提供了一种廉价、高效的CRM197表达体系，在此基础上，本发明人进一步提出了针对CRM197的一种抗白喉毒素突变体CRM197的单克隆抗体。
发明内容
本发明提供一种抗白喉毒素突变体（CRM197）抗体，该抗体可与CRM197高亲和力结合，可应用于CRM197的纯化制备、也可进一步应用于以CRM197为载体的偶联疫苗的纯化和偶联疫苗中CRM197含量的检测。
为达到上述目的，本发明提出一种抗白喉毒素突变体抗体，所述抗体的重链可变区具有如下的互补决定区CDR：
SEQ ID NO: 2的VH-CDR1、SEQ ID NO: 3的VH-CDR2，和SEQ ID NO: 4的VH-CDR3；
所述抗体的轻链可变区具有如下互补决定区CDR：
SEQ ID NO: 10的VL-CDR1、SEQ ID NO: 11的VL-CDR2和SEQ ID NO: 12的VL-CDR3；
进一步的，所述抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。
进一步的，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 9。
进一步的，所述抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
本发明还提出一种抗白喉毒素突变体抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将白喉毒素突变体免疫接种小鼠；
步骤2：将鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合；
步骤3：筛选产生抗白喉毒素突变体的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株；
步骤4：杂交瘤细胞于小鼠体内培养，收获腹水，通过层析纯化制备抗白喉毒素突变体抗体。
本发明还提出一种CRM197的纯化制备方法，通过所述抗白喉毒素突变体抗体与CRM197之间的亲和力实现所述CRM197的纯化，包括以下步骤：
步骤1：将抗白喉毒素突变体抗体偶联至琼脂糖凝胶，得到富含抗体的亲和填料；
步骤2：利用大肠杆菌重组表达CRM197蛋白，得到含有CRM1967蛋白的包涵体；
步骤3：包涵体复性液上样至装填有步骤1中亲和填料的层析柱，经酸洗脱可得到纯度＞95%的CRM197蛋白。
本发明还提出一种以CRM197为载体的偶联疫苗的纯化制备方法，通过所述抗白喉毒素突变体抗体与偶联疫苗中的CRM197之间的亲和力实现所述偶联疫苗的纯化，包括以下步骤：
步骤1：将抗白喉毒素突变体抗体偶联至琼脂糖凝胶，得到富含抗体的亲和填料；
步骤2：偶联后的混合物上样至装填有步骤1中亲和填料的层析柱，经酸洗脱可得仅含有CRM197的偶联混合物；
其中，所述偶联疫苗为重组hEGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗或其他蛋白和CRM197交联后的结合疫苗。
本发明还提出一种检测以CRM197为载体的偶联疫苗中CRM197含量的方法，利用抗白喉毒素突变体的抗体与偶联疫苗中的CRM197之间的亲和力实现抗原检测；包括以下步骤：
步骤1：将偶联疫苗和CRM197分别倍比稀释后包被在酶标板上；
步骤2：封闭液封闭处理酶标板；
步骤3：HRP标记的CRM197抗体加入每个反应孔中，37℃孵育1个小时；
步骤4：加入显色液显色，后加入终止液终止反应；在450nm处测定吸光度；
其中，所述偶联疫苗为重组hEGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗或其他蛋白和CRM197交联后的结合疫苗。
与现有技术相比，本发明的优势之处在于：本发明的抗白喉毒素突变体抗体的提出，利用其特征可以应用于多种领域，包括CRM197蛋白的纯化制备、以CRM197为载体的偶联疫苗的纯化制备以及酶联免疫法检测以CRM197为载体的偶联疫苗中CRM197的含量等等，进一步的拓展了抗白喉毒素突变体抗体的应用，并且本发明的白喉毒素突变体抗体制备方法经济且高效，市场的应用性高。
本发明的抗体具有特异性和高亲和力，抗体能与CRM197蛋白特异性结合，可以高效的纯化分离CRM197蛋白，可特异的识别偶联疫苗中的CRM197组分，从而便于纯化和分离偶联疫苗并检测偶联疫苗中CRM197含量。本发明提供的抗白喉毒素突变体抗体与CRM197蛋白的亲和力要显著高于市售白喉毒素抗体、其他多克隆抗体。在CRM197蛋白相关的结合疫苗生产中，可以强特异性、高亲和力的捕获含有CRM197的疫苗组分，纯化得到疫苗的有效组分，解决了结合疫苗的纯化难题；同时，该抗体可以用于灵敏度更高的酶联免疫法检测偶联疫苗中CRM197的含量，更好的用来评估疫苗的有效组分和批间一致性。
附图说明
图1是通过ELISA法对表达CRM197抗体的不同杂交瘤细胞筛选检测结果，数字为不同细胞株的编号。
图2显示了不同细胞株CRM197抗体亲和力比较图，数字为不同细胞株的编号。
图3显示了在本发明具体实施方案中，按照本发明所述方法制备的抗CRM197抗体SDS-PAGE电泳图。
图4为本发明所述抗CRM197抗体与CRM197结合研究。
图5显示了在本发明具体实施方案中，按照本发明提供的亲和填料和所述的纯化方法纯化制备的CRM197蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图6为按照本发明提供的亲和填料和所述的纯化方法纯化重组hEGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗的层析图谱。
图7显示了在本发明具体实施方案中，使用发明提供的亲和填料和所述的纯化方法纯化重组hEGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗的SDS-PAGE电泳图。
图8显示了在本发明具体实施方案中，按照本发明提供的亲和填料和所述的纯化方法纯化重组hEGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗的Western blot鉴定结果。
图9为ELISA法测定重组hEGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗中CRM197含量结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，开发了一种针对白喉毒素突变体(CRM197)的抗体、提供了抗体的制备方法和抗体序列，并进一步地验证了使用其纯化制备CRM197蛋白、含CRM197载体的偶联疫苗以及检测偶联疫苗中CRM197含量的效果。实验结果表明，本发明提供的抗CRM197抗体与CRM197有着高的亲和力，可以一步纯化制备高纯度的CRM197蛋白，进一步，可有效的分离出混合物中含CRM197部分的偶联物并检测偶联物中CRM197的含量。在此基础上完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85%、90%或95%，优选至少为95%。非限制性实施例包括85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。
如本文所用，术语“白喉毒素突变体”和“CRM197蛋白”或“CRM197”可互换使用，均是指本发明抗体所特异性结合的CRM197蛋白。
优选地，本发明白喉毒素突变体CRM197的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示；
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS(SEQ ID NO: 19)
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈b-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等, NIH Publ. No. 91-3242, 卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接 参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为k和l)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为a、d、e、g、和m。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明中，“VH-CDR1”与“CDR-H1”可互换使用，均指重链可变区的CDR1；“VH-CDR2”与“CDR-H2”可互换使用，均指重链可变区的CDR2；“VH-CDR3”与“CDR-H3”可互换使用，均指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”与“CDR-L1”可互换使用，均指轻链可变区的CDR1；“VL-CDR2”与“CDR-L2”可互换使用，均指轻链可变区的CDR2；“VL-CDR3”与“CDR-L3”可互换使用，均指轻链可变区的CDR3。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M、10-9M或l0-10M或更小的亲和力(KD)结合。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
在本发明中，所述抗体能够特异性地识别CRM197蛋白，且亲和力明显高于市售抗体。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397，在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala (A) | Val; Leu; Ile | Val |
| Arg I | Lys; Gln; Asn | Lys |
| Asn (N) | Gln; His; Lys; Arg | Gln |
| Asp (D) | Glu | Glu |
| Cys I | Ser | Ser |
| Gln (Q) | Asn | Asn |
| Glu (E) | Asp | Asp |
| Gly (G) | Pro; Ala | Ala |
| His (H) | Asn; Gln; Lys; Arg | Arg |
| Ile (I) | Leu ; Val ; Met ; Ala ; Phe | Leu |
| Leu (L) | Ile ; Val ; Met ; Ala ; Phe | Ile |
| Lys (K) | Arg; Gln; Asn | Arg |
| Met (M) | Leu; Phe; Ile | Leu |
| Phe (F) | Leu; Val; Ile; Ala; Tyr | Leu |
| Pro (P) | Ala | Ala |
| Ser (S) | Thr | Thr |
| Thr (T) | Ser | Ser |
| Trp (W) | Tyr; Phe | Tyr |
| Tyr (Y) | Trp; Phe; Thr; Ser | Phe |
| Val (V) | Ile ; Leu ; Met ; Phe ; Ala | Leu |
本发明中，所述抗体为特异性结合CRM197的抗体。本发明提供一种针对CRM197的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO: 2所示的VH-CDR1，SEQ ID NO: 3所示的VH-CDR2，和SEQ ID NO: 4所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR1，SEQ ID NO: 11所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO: 12所示的VL-CDR3；其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留与CRM197的结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80%，较佳地至少85%，更佳地至少为90%，最佳地至少95%的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J. Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包 (Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序 (BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(singledomain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；更佳地为IgG1。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向CRM197的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40%，更优选为不超过35%，更优选为1-33%，更优选为5-30%，更优选为10-25%，更优选为15-20%。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列。
在一个更加优选的实施方式中，本发明各抗体或重组蛋白具体地包括以下各VL和VH序列，以及CDR和FR序列。
表B 本发明抗体序列总结
| 名称 | 序列 | SEQ ID NO: |
| 重链可变区(VH) | QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGINWIRQPPGKDLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARGNYFDFWGQGTTLTVSS | 1 |
| VH-CDR1 | GFSLTGYG | 2 |
| VH-CDR2 | IWGDGST | 3 |
| VH-CDR3 | ARGNYFDF | 4 |
| VH-FR1 | QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVS | 5 |
| VH-FR2 | INWIRQPPGKDLEWLGM | 6 |
| VH-FR3 | DYNSALKSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYC | 7 |
| VH-FR4 | WGQGTTLTVSS | 8 |
| 轻链可变区(VL) | DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVNNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEFPRTFGGGTKVEIK | 9 |
| VL-CDR1 | ESVNNYGISF | 10 |
| VL-CDR2 | AAS | 11 |
| VL-CDR3 | QQSKEFPRT | 12 |
| VL-FR1 | DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS | 13 |
| VL-FR2 | MNWFQQKPGQPPKLLIY | 14 |
| VL-FR3 | NQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC | 15 |
| VL-FR4 | FGGGTKVEIK | 16 |
| VH的编码序列 | CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGGCTATGGTATAAACTGGATTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGATCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGATGGCAGCACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACGACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGGGAACTACTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA | 17 |
| VL的编码序列 | GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTAATAATTATGGCATTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGTTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA | 18 |
编码的多核苷酸
本发明还提供一种多核苷酸，其编码上述的抗体或其重链可变区或轻链可变区。
较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 17所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 18所示。
更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 17所示；且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 18所示。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO细胞、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等, Anal. Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化抗体。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
应用
本发明还提供了本发明抗体的用途，例如用于分离纯化CRM197蛋白和纯化分离偶联疫苗，更进步一地，可用于检测偶联疫苗中CRM197的含量。
较佳地，所述的偶联疫苗是重组hEGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗；和/或，其他以CRM197作为交联反应物的结合疫苗。
本发明的主要优点包括：
1) 特异性。抗体能与CRM197蛋白特异性结合，可以高效的纯化分离CRM197蛋白，可特异的识别偶联疫苗中的CRM197组分，从而便于纯化和分离偶联疫苗并检测偶联疫苗中CRM197含量。
2）高亲和力。本发明提供的抗白喉毒素突变体抗体与CRM197蛋白的亲和力要显著高于市售白喉毒素抗体、其他多克隆抗体。在CRM197蛋白相关的结合疫苗生产中，可以强特异性、高亲和力的捕获含有CRM197的疫苗组分，纯化得到疫苗的有效组分，解决了结合疫苗的纯化难题；同时，该抗体可以用于灵敏度更高的酶联免疫法检测偶联疫苗中CRM197的含量，更好的用来评估疫苗的有效组分和批间一致性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：抗CRM197抗体单克隆细胞株的制备和筛选
将CRM197蛋白(制备方法参照本发明人申请专利：白喉毒素突变体CRM197的制备方法，专利授权公告号：CN 104140972 B)多次免疫BALB/c小鼠，得到高表达抗体的小鼠脾细胞。将免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞，用ELISA法和单克隆化等方法，最后筛选到5株单克隆细胞株，并测定了其ELISA结合曲线和ED50值。
(一)材料和仪器
1.小鼠：BALB/c
2.骨髓瘤细胞：SP2/0(ATCC)
3.免疫原：CRM197蛋白(1mg/ml)
4.细胞生长培养基：1640+10%FBS(Gibco)+OPI Media Supplement(Sigma)
5.检测抗体：M-HRP-anti-mouse IgG
6.细胞融合仪：BTX公司ECM 2001多功能细胞融合仪
(二)动物免疫方法
1.小鼠淋巴结免疫：采用腹股沟淋巴结注射方式，将CRM197蛋白按50μg/只进行淋巴结注射，每二周一次，共免疫三次，最后一次取尾静脉血，测定滴度，滴度在1:10万以上进行杂交瘤制备。
2.杂交瘤细胞制备：用ECM2001多功能细胞融合仪制备杂交瘤细胞。
(三)ELISA检测方法(间接法)
1.CRM197蛋白以PBS稀释至1μg/ml，100μl/孔包被，4℃，过夜；
2.PBST洗板1次，200μl/孔3%BSA-PBS，封闭，37℃，1小时；
3.PBST洗板1次；
4.以1%BSA-PBS稀释各个抗体至1μg/ml，2倍比稀释,共12个梯度，100μl/孔加入，37℃，1小时；
5.PBST洗板3次；
6.以1%BSA-PBS稀释抗小鼠IgG二抗，100μl/孔加入，37℃，1小时；
7.PBST洗板5次；
8.TMB显色，在酶标仪上读取OD450值。
(四)结果
筛选到生长状态最佳和滴度最高的杂交瘤细胞株5株，其ELISA结合曲线见图1。
进一步地，将上述杂交瘤细胞与CRM197亲和力进行比较，结果如图2，可以看出细胞株1号亲和力最佳。同时，我们选取市售白喉毒素单克隆抗体进行同行对比检测，发现细胞株1号产生的抗体与CRM197的结合能力约是市售抗体的30倍，效果远远好于已有白喉毒素抗体。
实施例2：本发明所述CRM197抗体制备
实验方法：使用有限稀释法将实施例1中的1号杂交瘤细胞株单克隆化，得到抗CRM197单克隆抗体细胞。将该细胞培养扩大后腹腔接种Balb/c小鼠，于注射后7-14天内观察小鼠产生腹水的情况并收集腹水。
收集的腹水先用硫酸铵沉淀处理，后使用缓冲液A(20mM PBS，pH 7.0)重悬沉淀，上样至已经用缓冲液A平衡的Protein A抗体纯化柱上。上样结束后使用缓冲液A冲洗层析柱至A280值及电导回到基线，采用100%缓冲液B(20mM柠檬酸，pH 2.7)一步洗脱，监测洗脱液A280值，收集洗脱组分即为抗CRM197抗体初步纯化产物。
使用缓冲液C(10mM柠檬酸，pH 5.5)将初步纯化产物的pH调至5.0-6.0，上样至已经平衡的阳离子交换层析柱上，之后线性增加NaCl浓度直至40%洗脱，收集最大的洗脱组分即为抗CRM197抗体。
实验结果：
硫酸铵处理可以快速有效的去除腹水中的杂质。处理后的粗提取物经ProteinA抗体柱，可一步捕获抗CRM197抗体，再经阳离子交换柱精细纯化，即可制备高纯度的抗CRM197抗体。SDS-PAGE电泳分析纯化得到的抗CRM197抗体，结果如图3，显示两条蛋白条带，分子量约为50kD和25kD，含有典型的重链及轻链结构。
实施例3：本发明CRM197抗体可以特异性识别CRM197蛋白
本发明发明的抗体和市售白喉毒素抗体作为一抗分别进行Western-blot实验，验证CRM197抗体的有效性。
实验方法：
取CRM197蛋白进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜上，使用10%脱脂奶粉进行封闭。取实施例2中制备的CRM197抗体（Anti-CRM197，0.1mg/ml，1：5000稀释）和市售白喉毒素抗体（Anti-Diphtheria Toxin，abcam公司，0.1mg/ml，1：1000）作为一抗分别孵育硝酸纤维素膜；使用TTBS洗去膜上未结合的一抗后，加入抗小鼠IgG二抗(1mg/ml，1：10000稀释)孵育。孵育结束后，再次用TTBS洗去未结合抗体，加入底物缓冲液显色。
实验结果：
结果如图4所示，两块膜上均可见清晰的CRM197蛋白条带。说明，抗CRM197抗体和白喉毒素抗体均可特异性的识别CRM197蛋白。另外，本发明发明的抗体在相同的实验条件下，使用的工作浓度要远低于市售白喉毒素抗体，说明本发明制备的CRM197抗体与CRM197蛋白具有更好的亲和力。
实施例4：采用本发明提供的抗体纯化CRM197蛋白
目前重组CRM197蛋白的制备往往采用大肠杆菌表达体系，需要经过包涵体变、复性，复性液需经阴离子交换柱纯化、分子筛柱纯化或其组合。纯化工艺相对较为繁琐，而使用本发明发明的抗CRM197抗体可以利用“抗原-抗体”结合的特异性来有效的捕获复性后混合物中的CRM197蛋白，再经一步酸洗脱即可得到高纯度的CRM197蛋白。
实验方法：
将实施例2中纯化制备得到的抗CRM197抗体交联至NHS-activated Sepharose 4Fast Flow或CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow或CNBr-activated Bestarose4FastFlow或Epoxy-activatedBestarose 6B。
成功表达CRM197蛋白的大肠杆菌，经菌体破碎后得到包涵体，包涵体变性、复性后用缓冲液D(20mM Tris/HCl，pH 8.0)调节pH，上样至已经用缓冲液D平衡的CRM197抗体亲和层析柱上。上样结束后使用缓冲液D冲洗柱子至A280值及电导回到基线，采用100%缓冲液E(20mM 柠檬酸，pH 3.0)一步洗脱，监测洗脱液A280值，收集洗脱组分即为CRM197蛋白。
实验结果：
从图5可以看出，经CRM197抗体亲和柱一步纯化得到的CRM197蛋白纯度可达100%，明显的提高了目的蛋白的纯度和制备效率，有效的缩短了CRM197蛋白的制备时间。
实施例5：采用本发明提供的抗体纯化偶联疫苗
以CRM197为载体的偶联疫苗在结合后（蛋白A-CRM197，蛋白A为任意可偶联蛋白），由于其具有较为复杂的组成（蛋白A,CRM197，蛋白A-蛋白A,蛋白A-CRM197，CRM197-CRM197），且各组分性质不均一，无法有效区分含有CRM197蛋白的偶联物，纯化制备中存在一定的难度，而使用本发明发明的抗CRM197抗体可以利用“抗原-抗体”结合的特异性来有效的识别结合疫苗中的CRM197组分，从而分离出含有CRM197成分的疫苗组分，进而达到纯化的目的。
实验方法：
将实施例2中纯化制备得到的抗CRM197抗体交联至NHS-activated Sepharose 4Fast Flow或CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow或CNBr-activated Bestarose4FastFlow或Epoxy-activatedBestarose 6B。
hEGF蛋白和CRM197蛋白偶联反应结束后的反应液，使用缓冲液D(20mM Tris/HCl，pH 8.0)调节pH，上样至已经用缓冲液D平衡的CRM197抗体亲和层析柱上。上样结束后使用缓冲液D冲洗柱子至A280值及电导回到基线，采用100%缓冲液E(20mM 柠檬酸，pH 3.0)一步洗脱，监测洗脱液A280值，收集洗脱组分即为有效含有CRM197成分的偶联疫苗。
实验结果：
从图6可以看出，偶联疫苗混合物上样至CRM197抗体的亲和层析柱，使用酸洗脱可见明显的紫外吸收峰，说明混合物中含有CRM197的组分可被CRM197抗体特异性识别并得到有效的分离纯化。如图7中SDS-PAGE显示，纯化后样品已经有效的去除未成功交联CRM197的小分子组分，如图8所示，且进一步使用western-blot分析，可以看出纯化后样品主要为交联成功的偶联物。 因此，使用本方法可以有效的纯化分离出偶联疫苗。
讨论：
免疫亲和层析主要是利用抗原、抗体之间高特异的亲和力特点。将抗体固定于固定相上，当将含有抗原的混合物通过色谱柱时即可被特异性捕获，而其他的物质因不会被捕获而流穿，从而有效的分离出目的蛋白。抗原与抗体结合具有可逆性，即抗原抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离。解离后的抗原和抗体仍可保持原来的理化特性和生物学活性。复性液中的CRM197蛋白或CRM197偶联疫苗中的CRM197蛋白与CRM197抗体在中性条件下特异性结合，之后在酸性条件下可发生解离。因此，本发明使用的缓冲液E为酸性缓冲液。
实施例6：采用本发明提供的抗体检测偶联疫苗中CRM197含量
酶联免疫吸附测定（ELISA）是基于抗原抗体特异性结合的特性，常用于检测抗原/抗体含量，即将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。拟使用本发明提供的CRM197抗体偶联辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）后制备成酶标抗体，直接检测包被于酶标板中的CRM197，以已知蛋白含量的CRM197蛋白作为参比，可以定量检测偶联疫苗中CRM197的含量。
实验方法：
1.hEGF-CRM197偶联疫苗（800ng/ml）和CRM197（800ng/ml）分别倍比稀释后按100μl/孔包被酶标板，封板后4℃静置过夜，之后弃去酶标板孔内液体。用洗液洗板3次。
2.用封闭液按200μl/孔加入酶标板中，封板后37℃±1℃孵育2小时，弃去封闭液。用洗液洗板3次。
3.每孔再加入100μl HRP标记的CRM197单克隆抗体（1：1000）。37℃震荡混匀10分钟后，封板后37℃±1℃孵育1小时。之后洗板5次。
4.将显色液按100μl/孔加入酶标板中，室温避光15min显色后，将终止液按50μl/孔加入酶标板终止反应。用酶标仪在450nm处测定吸光度（OD450）。
实验结果：
如图9所示，不同浓度的CRM197蛋白与抗体间可呈现明显的“S”型曲线，经软件计算得出CRM197标准品的EC50值为10.29ng/ml，hEGF-CRM197偶联物的EC50值为13.62ng/ml，折算可得每1μg/ml hEGF-CRM197偶联物中含有CRM197约0.75μg/ml。上述仅为本发明专利的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种抗白喉毒素突变体抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有如下的互补决定区CDR：
SEQ ID NO: 2的VH-CDR1、SEQ ID NO: 3的VH-CDR2，和SEQ ID NO: 4的VH-CDR3；
所述抗体的轻链可变区具有如下互补决定区CDR：
SEQ ID NO: 10的VL-CDR1、SEQ ID NO: 11的VL-CDR2和SEQ ID NO: 12的VL-CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO: 1。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO: 9。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
5.一种CRM197的纯化制备方法，使用如权利要求1-4中任意一项所述的抗白喉毒素突变体抗体，其特征在于，通过所述抗白喉毒素突变体抗体与CRM197之间的亲和力实现所述CRM197的纯化，包括以下步骤：
步骤1：将抗白喉毒素突变体抗体偶联至琼脂糖凝胶，得到富含抗体的亲和填料；
步骤2：利用大肠杆菌重组表达CRM197蛋白，得到含有CRM1967蛋白的包涵体；
步骤3：包涵体复性液上样至装填有步骤1中亲和填料的层析柱，经酸洗脱可得到纯度＞95%的CRM197蛋白。
6.一种以CRM197为载体的偶联疫苗的纯化制备方法，使用如权利要求1-4中任意一项所述的抗白喉毒素突变体抗体；特征在于，通过所述抗白喉毒素突变体抗体与偶联疫苗中的CRM197之间的亲和力实现所述偶联疫苗的纯化，包括以下步骤：
步骤1：将抗白喉毒素突变体抗体偶联至琼脂糖凝胶，得到富含抗体的亲和填料；
步骤2：偶联后的混合物上样至装填有步骤1中亲和填料的层析柱，经酸洗脱可得仅含有CRM197的偶联混合物；
其中，所述偶联疫苗为重组hEGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗或其他蛋白和CRM197交联后的结合疫苗。
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