CN106661587A - Crm197和相关蛋白的表达和纯化 - Google Patents

Crm197和相关蛋白的表达和纯化 Download PDF

Info

Publication number
CN106661587A
CN106661587A CN201580018271.2A CN201580018271A CN106661587A CN 106661587 A CN106661587 A CN 106661587A CN 201580018271 A CN201580018271 A CN 201580018271A CN 106661587 A CN106661587 A CN 106661587A
Authority
CN
China
Prior art keywords
crm
albumen
resin
recombinant cell
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580018271.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106661587B (zh
Inventor
N.奥加内斯彦
A.李斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fina BioSolutions LLC
Original Assignee
Fina BioSolutions LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fina BioSolutions LLC filed Critical Fina BioSolutions LLC
Publication of CN106661587A publication Critical patent/CN106661587A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106661587B publication Critical patent/CN106661587B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/34—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Corynebacterium (G)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)

Abstract

本发明涉及用于生产重组蛋白的细胞、组合物和方法。具体而言，本发明涉及用于从大肠杆菌获得高水平的可溶性重组CRM197蛋白的生产方法。细胞优选地包含二硫化物还原酶基因的一个或多个突变，使得二硫化物还原酶活性降低。本发明还涉及CRM197的纯化方法以及正确折叠的CRM197蛋白的表征。

Description

CRM197和相关蛋白的表达和纯化
相关申请的引用
本申请要求2014年1月31日提交的相同标题的美国临时申请号61/934,377的优先权，其整体通过引用特别结合到本文中。
发明背景
1. 发明领域
本发明涉及在细菌宿主中生产重组蛋白的领域。具体而言，本发明涉及用于从大肠杆菌获得高水平的可溶性重组CRM197蛋白的生产方法。本发明还涉及CRM197的纯化和表征方法以及通过所述方法生产的CRM197的用途。
2.背景描述
白喉毒素(DT)是一种由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的致病菌株合成和分泌的蛋白质性外毒素。这些致病菌株包含携带毒素基因的噬菌体溶素原。白喉毒素是一种ADP-核糖基化的酶，其作为535个残基的酶原分泌和由胰蛋白酶-样蛋白酶加工，并释放两个片段(A和B)。片段A使用NAD作为底物，催化在烟酰胺环和N-核糖之间的N-糖苷键的裂解和介导ADP-核糖共价转移(ADPRT活性)至延伸因子EF-2的修饰的组氨酸715 (白喉酰胺)。该翻译后白喉酰胺修饰使EF-2失活，停止蛋白合成和导致细胞死亡。DT的A片段(亦称为C结构域)带有催化活性位点，并且是中毒的最后一步所需的唯一毒素片段。B片段上携带的R结构域介导与宿主细胞表面上的受体的结合，并且也在B片段上携带的T结构域促进片段A的pH-依赖性转移至细胞质。富含精氨酸的二硫键连接的环连接片段A与片段B (或者结构域C与结构域TR)。在该链在位置186上蛋白水解裂解后，该链间二硫键是在这两个片段之间唯一的共价连接。各种无毒性和部分毒性的免疫学交叉反应形式的白喉毒素(CRM或交叉反应材料)的分离导致发现CRM197 (Uchida等Journal of Biological Chemistry 248，3845-3850，1973；亦参见Giannini等Nucleic Acids Res. 1984年5月25日;12(10):4063-9)。优选地，CRM可具有包含整个DT或其一部分的任何大小和组成。
CRM197是一种主要酶失活和无毒性形式的白喉毒素，其包含单个氨基酸置换G52E。该突变导致NAD-结合位点之前的活性位点环的内在柔韧性，和降低CRM197结合NAD的能力并消除DT的有毒性质(Malito等Proc Natl Acad Sci USA 109(14):5229-342012)。如同DT一样，CRM197具有两个二硫键。一个二硫键连接Cys186与Cys201，其连接片段A与片段B。第二个二硫键在片段B内连接Cys461与Cys471。DT和CRM197两者均具有片段A-相关的核酸酶活性(Bruce等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、2995-8、1990)。
许多抗原具有差的免疫原性，尤其是在婴儿中，除非与蛋白化学连接(“缀合”)，从而形成缀合物或缀合物疫苗。这些缀合物疫苗的蛋白组分也称为“载体蛋白”。CRM197通常用作蛋白-糖和半抗原-蛋白缀合物的载体蛋白。作为载体蛋白，CRM197相对于白喉类毒素以及其它类毒素蛋白具有许多优点，其中许多已被证明(Shinefield Vaccine，28:4335，2010；Broker等Biologicals，39:195 2011)。例如，因为CRM197是遗传上去毒性的，它保留较大的赖氨酸(其用于缀合但被化学类毒素化封闭)补体。已经证明CRM197是肺炎链球菌荚膜多糖的有效的载体蛋白，如通过PREVNAR™ (Pfizer)(一种由与CRM197化学连接的至多13种荚膜多糖组成的疫苗)的成功所证明的。还有证据表明，与破伤风类毒素相比，存在较少的载体诱导的免疫反应抑制，尤其是当存在许多单独多糖与相同的载体蛋白连接时。
CRM197和天然DT对白喉毒素受体(DTR)具有类似的亲和力，所述受体与HB-EGF前体pro-HB-EGF具有相同的氨基酸序列(Mitamura等J. Biol. Chem. 272(43):27084-90、1997)。CRM197结合可溶形式的HB-EGF，以及膜形式pro-HB-EGF，和通过阻止其与EGF受体结合而抑制HB-EGF有丝分裂作用。因此CRM197也可能在癌症疗法中具有有前景的作用(Miyamoto等Anticancer Res. Nov-Dec 27(6A):3713-21，2007)。
CRM197已经在原始宿主棒状杆菌中生产，但收率低，通常<50mg/L，并且另外地，与例如大肠杆菌相比，棒状杆菌生长相对缓慢。存在专有的棒状杆菌菌株，其已被工程改造以较高水平生产CRM197 (美国专利号5,614,382)。CRM197还已经在专有的荧光假单胞菌(Psuedomonas fluorescens)菌株中表达和以高水平表达。在大肠杆菌中生产CRM197将是有利的，因为大肠杆菌是BL1水平的生物，其在培养和繁殖方面廉价。在大肠杆菌中生产CRM197主要产生不溶性包涵体(通常不溶)，其然后需要困难的再折叠过程，导致收率低(EP20100742260)或具有额外的肽序列(标签) (J Biotechnol. 2010 Dec 20;156(4):245-52, Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxinvariant CRM197 in Escherichia coli. Stefan A, Conti M, Rubboli D, Ravagli L,Presta E, Hochkoeppler A)。尚未报道适合于大量蛋白生产的用于在大肠杆菌中过量表达可溶性无标签CRM197的方法。因此，对以高效和成本有效方式生产CRM197的更好方法存在需要。
发明概述
本发明克服了与当前策略和设计有关的问题和缺点，提供了用于生产CRM的新的组合物和方法。
本发明的一个实施方案涉及生产整个CRM蛋白或其一部分的方法，包括：提供包含表达载体的重组细胞，所述表达载体包含与多顺反子基因序列功能连接的诱导型启动子，其中至少一个顺反子编码CRM蛋白；诱导表达载体生产CRM蛋白；和分离表达的CRM蛋白。优选地，重组细胞的一种或多种二硫化物还原酶的活性降低，和还优选地，各个顺反子包含核糖体结合位点和起始密码子。优选地，多顺反子基因序列在一个或多个核糖体结合位点和一个或多个起始密码子之间包含至少一个间隔基。优选地，由细胞表达的CRM蛋白是可溶性的，和还优选地，表达的CRM蛋白是细胞内的、周质的或分泌的。优选地，重组细胞在约15°C至约32°C的温度下增殖，和还优选地，CRM蛋白通过色谱法从细胞分离。优选的色谱介质包括例如硫酸葡聚糖树脂、凝胶树脂、活性硫酸化树脂、磷酸盐树脂、肝素树脂或肝素-样树脂。本发明的另一实施方案包括通过本发明的方法分离的CRM蛋白。
本发明的另一实施方案涉及生产整个CRM蛋白或其一部分(例如优选地CRM197)的方法，包括：提供包含表达载体的重组细胞，其中与未修饰的重组细胞相比，重组细胞已被修饰以改变细胞质的氧化还原状态至更加氧化的状态，和表达载体包含与CRM编码序列化学连接的诱导型启动子、在核糖体结合位点和ATG密码子之间的间隔基序列、CRM编码序列上游的表达增强子区；诱导表达载体生产CRM蛋白；和分离表达的CRM蛋白。重组细胞可以是真核细胞或原核细胞。优选地，重组细胞是原核细胞，例如大肠杆菌细胞或大肠杆菌的衍生菌或菌株。优选地，重组细胞修饰包括一种或多种二硫化物还原酶的活性降低，所述二硫化物还原酶例如氧化还原酶、二氢叶酸还原酶、硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶、蛋白还原酶或谷胱甘肽还原酶的一种或多种。优选地，与非-重组细胞相比，一种或多种二硫化物还原酶的活性降低改变重组细胞的细胞质的氧化还原状态至氧化状态。优选地，CRM编码序列编码一个或多个CRM表位、CRM肽序列、CRM结构域或其组合。优选地，间隔基包含多于9个核苷酸或少于9个核苷酸，例如5-20个核苷酸。优选地，表达增强子包含CRM编码序列上游的核糖体结合位点和ATG密码子。优选地，由细胞表达的CRM蛋白是可溶性的，和是细胞内的、周质的或分泌的。优选地，重组细胞在约15°C至约32°C的温度下增殖。
优选地，CRM蛋白通过色谱法从细胞分离，所述色谱法包括硫酸葡聚糖树脂、活性硫酸盐树脂、磷酸盐树脂、肝素树脂或肝素-样树脂作为优选的色谱介质。
本发明的另一实施方案涉及通过本发明的方法分离的CRM蛋白。优选地，分离的CRM蛋白是缀合的，和缀合的CRM蛋白作为疫苗配制。
本发明的另一实施方案涉及生产整个CRM蛋白或其一部分(例如从CRM编码序列生产的蛋白或肽，所述编码序列编码一个或多个CRM表位、CRM肽序列、CRM结构域或其组合，和优选地CRM197)的方法，包括提供包含表达载体的重组细胞，其中所述表达载体包含与EES编码序列(其前面有核糖体结合位点)功能连接的启动子；从CRM编码序列(其前面有核糖体结合位点)表达CRM蛋白；和分离表达的CRM蛋白。优选地，重组细胞是原核或真核细胞，和优选地，原核细胞是大肠杆菌细胞或大肠杆菌的衍生菌或菌株。优选地，启动子是组成型或诱导型的。优选地，与未修饰的重组细胞相比，重组细胞被修饰以改变细胞质的氧化还原状态至更加氧化的状态。优选地，修饰的重组细胞的一种或多种硫醇-二硫化物氧化还原酶和/或参与硫氧还蛋白和谷氧还蛋白系统的酶(例如，硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶)的活性降低。优选地，表达载体包含受核糖体结合位点控制的表达增强子序列(例如SEQ ID 15)或例如包括CRM编码序列上游的核糖体结合位点上游的T7标签序列。
本发明的另一实施方案涉及分离和/或纯化CRM蛋白的方法，包括用加样缓冲液加载CRM蛋白至包含树脂的色谱柱上，其中树脂优选地是硫酸葡聚糖树脂、活性硫酸盐树脂、磷酸盐树脂、肝素树脂或肝素-样树脂；用一种或多种洗涤缓冲液洗涤树脂；和用洗脱缓冲液从树脂洗脱CRM蛋白。优选地，加样缓冲液和洗涤缓冲液是或包含相同的组分，并且其量相同或类似。优选地，加样缓冲液和一种或多种洗涤缓冲液是低电导率缓冲液，例如Tris-HCl、HEPES、磷酸钠缓冲液，电导率为约10 mS/cm或更小(例如1 mS/cm、2 mS/cm、3 mS/cm、4mS/cm、5 mS/cm、6 mS/cm、7 mS/cm、8 mS/cm、9 mS/cm)。优选地，洗脱缓冲液是高电导率缓冲液，例如含有添加的盐例如NaCl或KCl的缓冲液，电导率为约10 mS/cm或更大(例如12mS/cm、14 mS/cm、15 mS/cm、20 mS/cm、25 mS/cm、30 mS/cm、40 mS/cm、50 mS/cm、60 mS/cm、70 mS/cm、80 mS/cm、90 mS/cm、100 mS/cm或更大)。
本发明的另一实施方案涉及表征白喉毒素或CRM蛋白的折叠的方法，包括：使白喉毒素或CRM蛋白接触HB-EGF；测定白喉毒素或CRM蛋白与HB-EGF结合的量；和通过测定的结合的量，测定白喉毒素或CRM蛋白的折叠，其中结合表示正确折叠。优选地，白喉毒素或CRM包含受体结合结构域。优选地，CRM蛋白包含CRM197。还优选地，白喉毒素或CRM蛋白和/或HB-EGF的至少一种结合到固体载体。优选地，白喉毒素或CRM蛋白与HB-EGF结合的量通过ELISA测定，和结合HB-EGF的CRM蛋白在PBS中是可溶性的。
本发明的另一实施方案包含表达载体，其包含启动子和两个或更多个顺反子(至少一个编码蛋白)，其中至少一个顺反子编码CRM蛋白和各个顺反子具有核糖体结合位点和起始密码子。优选地，表达载体在核糖体结合位点和起始密码子之间进一步包含间隔基，和还优选地，间隔基包含5-20个核苷酸。优选地，间隔基不包含9个核苷酸。
本发明的其它实施方案和优点在之后的详述中部分地描述，和部分地，可从该详述中显而易见，或者可从本发明的实施中获知。
附图简述
图1：载体构建体crm7 (SEQ ID NO 10)、crm7_2 (SEQ ID NO 11)、crm 8 (SEQ ID NO12)、crm 9 (SEQ ID NO 13)和crm 12 (SEQ ID NO 14)的示意图，其中核糖体结合位点(RBS)和起始密码子(ATG)两者均用粗体表示，间隔基序列用下划线表示。
图2：在用2 µg/ml的pn6B包被的immunotech板上小鼠抗-pn6B血清的滴定结果。
图3：在pn14包被的板上抗-pn14血清的滴定结果。
发明详述
可溶性的完整重组CRM最初在蛋白酶-缺陷的大肠杆菌中生产(Bishai等1987)。然而，蛋白生产量非常低。随后，CRM197在大肠杆菌细胞中作为包涵体(Stefan A等J Biotechnol.Dec 20;156(4):245-52，2010；国际申请公开号WO 2011/126811，中国专利申请号200610042194)或作为通过信号肽引导到周质的可溶性蛋白(国际申请公开号WO 2011/042516)生产。大肠杆菌的周质是一种氧化环境，其允许形成二硫键。CRM197具有两个二硫键，其对于正确折叠和功能以及对于蛋白可溶性而言可能是重要的。
已经令人惊讶地发现，可溶性重组CRM蛋白的单一未裂解链可从微生物在细胞内和以商业化的量快速生产，其后大量分离和/或纯化，并保持可溶。CRM在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.5)和其它类似的缓冲液中是可溶性的，并且在该缓冲液和其它缓冲液中可浓缩至大于5 mg/ml，同时保持可溶。尽管在Cornybacter中表达的CRM可在这些缓冲液中浓缩，但在假单胞菌中产生和在周质中表达的CRM不能容易地在这些相同的缓冲液中浓缩(Pfenex Inc.，San Diego，CA)。与周质表达相比，细胞内表达的其它优点是实现更高表达水平，这是因为与细胞内空间相比，周质空间有限。
优选生产的CRM蛋白是全长或部分区域，例如肽、单一或多个结构域或表位和从天然CRM编码序列表达的任何特定区域，其包括已被一个或多个缺失、取代和/或添加(例如保守或非保守的)修饰的CRM序列，和已被促进在宿主生物中的表达的另外序列(例如一个或多个启动子、起始密码子和翻译因子、核糖体或聚合酶结合位点)修饰的CRM序列。优选的CRM蛋白是CRM197。可溶性的和不作为细胞的不溶性包涵体另外结合的CRM蛋白的表达是优选的。用于表达和生产CRM蛋白的优选的表达系统包括具有细胞内氧化状态的微生物。优选的表达系统可以是重组或天然的真核或原核细胞，其中重组细胞包括包含非天然CRM编码序列的细胞。优选的原核细胞是大肠杆菌的菌株或包含一个或多个遗传改变(例如一个或多个缺失或突变)的另一细菌菌株。优选地，与野生型相比，一个或多个遗传改变将细胞的细胞质的氧化还原状态改变为更加氧化的状态，例如公开于美国专利号7,410,788 (通过引用结合到本文中)。改变优选地降低一种或多种二硫化物还原酶基因和/或其它基因的活性，所述其它基因降低细胞质的氧化状态。优选地，活性降低归因于一种、两种或多种二硫化物还原酶或其它基因的无表达或表达降低，或降低一种或多种表达的二硫化物还原酶蛋白或其它蛋白的活性的一种或多种突变。优选的微生物细胞(例如，重组、改造或天然的真核或原核细胞)菌株生产仍为功能蛋白的包含二硫键的天然折叠蛋白的能力增加。本发明的方法生产一定量的包含完全、截短或修饰的CRM氨基酸序列的CRM蛋白。根据本发明生产的CRM蛋白的量是令人惊讶的，例如600 mg或更多的CRM蛋白/升细菌细胞培养物。
本发明的一个实施方案涉及生产大量CRM蛋白和优选地CRM197的方法。生产量通常按mg/L的细菌细胞培养物量化。根据本发明方法的CRM蛋白生产是200mg/L或更多、300mg/L或更多、400mg/L或更多、500mg/L或更多、600 mg/L或更多、700 mg/L或更多、800 mg/L或更多、900 mg/L或更多、1,000 mg/L或更多、1,500mg/L或更多、或2,000mg/L或更多。本发明优选量的CRM197包括包含全长和截短的CRM蛋白以及修饰的CRM蛋白氨基酸序列的相关蛋白。修饰包括一个或多个保守氨基酸缺失、取代和/或添加。保守修饰是保持分子的功能活性和/或免疫原性的修饰，但可增加或降低活性和/或免疫原性。CRM的保守修饰的实例包括但不限于氨基酸修饰(例如，单个、两个和另外的短氨基酸添加、缺失和/或取代)、可容易用于缀合形成疫苗的39个赖氨酸残基的α-氨基(赖氨酸的伯胺基)之外的修饰、由于DT的血清型变化导致的修饰、增加免疫原性或增加缀合效率的修饰、基本上不改变与肝素的结合的修饰、保留正确折叠或三维结构的修饰、和/或不显著改变提供对DT的保护性免疫的蛋白或蛋白部分的免疫原性的修饰。
用于本发明方法的重组细胞优选地是大肠杆菌细菌，和优选地，经遗传改造以改变细胞质的氧化还原状态至更加氧化的状态的大肠杆菌(例如通过一种或多种二硫化物还原酶基因的突变，例如氧化还原酶、二氢叶酸还原酶、硫氧还蛋白还原酶、谷氨酸半胱氨酸裂解酶、二硫化物还原酶、蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶)。优选地，一种或多种二硫化物还原酶基因被突变，和赋予无功能性或少量功能性，使得与野生型相比，细胞的细胞质的氧化还原状态被改变至更加氧化的状态。氧化的蛋白折叠涉及二硫桥的形成和异构化，并在许多蛋白包括CRM197的稳定性和溶解性方面起关键作用。二硫桥的形成和断裂通常通过硫醇-二硫化物氧化还原酶催化。这些酶的特征为一个或多个Trx折叠，其由通过三个α-螺旋围绕的四链β−片组成，具有CXXC氧化还原活性位点基序。各种Trx组件的装配已经用于构建在原核和真核生物中存在的不同的硫醇氧化还原酶。在细菌周质中，通过DsbB-DsbA和DsbD- DsbC/DsbE/DsbG对的组合作用，蛋白保持在合适的氧化状态(Inaba 2009，Gruber等2006)。许多蛋白表达系统是本领域众所周知的，和市售可得的。
特别优选的微生物包括大肠杆菌表达菌株，例如化学感受态的大肠杆菌K12细胞，其经工程改造以在细胞质中形成二硫键键合的蛋白(例如，ORIGAMI™ (EMD Millipore)和SHUFFLE™ (New England Biolabs))。也可使用氧化型氧化还原状态提高的其它菌株和细胞类型和其它大肠杆菌菌株。例如，ORIGAMI™ 2宿主菌株是在硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)两个基因中具有突变的K-12衍生菌，其极大提高在大肠杆菌细胞质中的二硫键形成。这些菌株是卡那霉素敏感性的；像原始的Origami菌株一样，仍通过四环素选择gor突变。为了减少在分子之间形成二硫键的可能性，建议包含trxB和gor突变的菌株仅用于表达为了正确折叠而需要二硫键形成的蛋白。SHUFFLE ™ 细胞是化学感受态大肠杆菌K12细胞，其经工程改造以在细胞质中形成包含二硫键的蛋白。优选地，这些细胞包含trxB和gor突变和细胞质蛋白伴侣二硫键异构酶DsbC (fhuA2 [lon] ompT ahpC gal λatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacIq) ΔtrxB sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2[dcm] R(zgb-210::Tn10 --TetS) endA1 Δgor ∆(mcrC-mrr)114::IS10)。还优选地，细胞适合于T7启动子驱动的蛋白表达和具有基因型F´ lac, pro, lacIQ / Δ(ara-leu) 7697 araD139 fhuA2 lacZ::T7gene1 Δ(phoA)PvuII phoR ahpC* galE (or U) galK λ att::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR、lacI q ) ΔtrxB rpsL150(StrR) Δgor Δ(malF)3。SHUFFLE™菌株组成型表达二硫键异构酶DsbC的染色体拷贝。DsbC促进校正错误氧化的蛋白为它们的正确形式。细胞质DsbC还是可有助于不需要二硫键的蛋白折叠的蛋白伴侣。
细菌培养物优选地在使得与较高的温度(例如37°C)下的溶解性相比表达的蛋白的溶解性增加的温度下培养(例如CRM或CRM197)。优选的培养温度是30°C或更低、优选地25°C或更低、优选地20°C或更低、优选地18°C或更低和优选地在15°C和32°C之间。
本发明的另一实施方案涉及用于生产CRM的载体和生产整个CRM蛋白或其一部分(例如优选地CRM197)的方法，所述CRM蛋白在细胞和优选地原核细胞的细胞质中可溶。以前在大肠杆菌中在细胞内表达CRM的尝试基于仅编码CRM序列的单顺反子mRNA，和导致包涵体形成。在细胞的细胞质中生产可溶性CRM的方法使用提供在多顺反子mRNA中的CRM的转录的表达载体开发。多顺反子mRNA是指编码两种或更多种多肽的信使RNA。在原核细胞中，参与相同生物化学或生理学途径的基因往往归类为操纵子，其控制基因转录为单一的多顺反子mRNA。操纵子中的基因(顺反子)受核糖体结合位点序列的控制，和可通过多个核苷酸或甚至重叠序列分开。例如，第一个基因的终止密码子在第二个基因的起始密码子的下游，如在半乳糖操纵子中。已经表明在操纵子中的基因位置通过翻译和mRNA稳定性作用也强烈影响基因表达水平(Smolke，C. D.和Keasling，J. D. (2002) Effect of gene location，mRNAsecondary structures, and RNase sites on expression of two genes in anengineered operon. Biotechnol. Bioeng. 80，762−76)。发现下游基因表达水平经过翻译偶联，通过上游基因表达而提高(Schümperli，D.，McKenney，K.，Sobieski，D. a和Rosenberg，M. (1982) Translational coupling at an intercistronic boundary ofthe Escherichia coli galactose operon. Cell 30，865−71)。本发明的一个优选的实施方案是包含原核启动子和两个编码多肽(其中之一是CRM)的顺反子的载体。各个顺反子包含核糖体结合位点和起始密码子，例如ATG。本发明还包括诱导表达载体生产CRM蛋白和分离表达的CRM蛋白。在一个优选的实施方案中，CRM序列之前的第一个顺反子包含与CRM顺反子重叠的T7标签序列，使得第一个顺反子的终止密码子在CRM的起始密码子的下游(例如SEQ ID NO 15)。表达增强子按SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17进一步修饰。CRM编码序列之前的第一个顺反子被称为“表达增强子序列” (EES)。表达载体包含(1) 启动子，接着是核糖体结合位点和表达增强子序列，和(2) 核糖体结合位点和ATG密码子和CRM编码序列。重组细胞可以是原核或真核细胞。优选地，重组细胞是原核细胞，例如大肠杆菌细胞或大肠杆菌的衍生菌或菌株。优选地，重组细胞修饰包含降低活性的一种或多种二硫化物还原酶，例如氧化还原酶、二氢叶酸还原酶、硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶、蛋白还原酶或谷胱甘肽还原酶的一种或多种。优选地，与非-重组细胞相比，降低活性的一种或多种二硫化物还原酶改变重组细胞的细胞质的氧化还原状态至氧化状态。优选地，CRM编码序列编码一个或多个CRM表位、CRM肽序列、CRM结构域或其组合。优选地，由细胞表达的CRM蛋白是可溶性的，和是细胞内的、周质的或分泌的。优选地，重组细胞在约15°C至约32°C的温度下增殖。
本发明的另一实施方案包括包含可表达的CRM序列和优选地CRM197的序列的重组细胞，例如细菌、哺乳动物或昆虫细胞。优选的宿主细胞包括但不限于经遗传改造以改变细胞质的氧化还原状态至更加氧化的状态的细胞。优选的细胞包括原核或真核细胞，例如大肠杆菌细胞表达系统，杆状病毒表达系统和其它细菌和/或真核细胞表达系统。优选地，细胞包含用于表达外源或非天然序列例如CRM肽的蛋白表达系统。还优选的，待表达的序列由表达载体构成，其包含一个或多个诱导型启动子(例如，自动诱导型，优选地用特定培养基)、起始密码子(例如ATG)、核糖体结合位点、非特定的多肽序列和转录为多顺反子mRNA的CRM编码序列。还优选地，表达载体在核糖体结合位点和ATG起始密码子之间或在起始密码子和待表达的序列之间包含修饰的序列。优选的修饰序列或间隔基序列包括例如，多于9个或少于9个的多个核苷酸(例如7-12个核苷酸)，和优选地不是9个核苷酸。可用于表达系统的间隔基核苷酸的具体实例包括但不限于GATATAC (SEQ ID NO 3)、GATATACCA (SEQ IDNO 4)和GATATACCATAT (SEQ ID NO 5)。因此，本发明的另一实施方案包含CRM的表达构建体、核苷酸和氨基酸序列，含或不含定义的间隔基序列并且含和不含宿主细胞。
本发明的另一实施方案涉及重组CRM197蛋白以及重组CRM在大肠杆菌或另一宿主细胞中使用具有诱导型启动子和/或在核糖体结合位点和ATG起始密码子之间的修饰序列的表达载体的表达。优选地，表达载体包括乳糖/IPTG诱导型启动子，优选地tac启动子和在核糖体结合位点和ATG起始密码子之间的序列。优选地，表达系统在起始密码子和表达序列之间包含间隔基，其由多于9个或少于9个的多个核苷酸构成(例如7-12个核苷酸)，和优选地不是9个核苷酸。可用于表达系统的间隔基核苷酸的具体实例包括但不限于本文鉴定的那些。令人惊讶的发现，与9个核苷酸的间隔基相比，使用长度为7或12的间隔基导致显著增加CRM197表达水平。
本发明的另一实施方案包括CRM的表达构建体、核苷酸和氨基酸序列，含或不含本文所公开的定义的间隔基序列和含或不含增强子区。增强子区通过增强CRM的正确折叠的翻译偶联促进下游CRM序列的表达，导致蛋白可溶性。增强子区还通过添加促进核酸识别以增加表达的一个或多个序列，促进蛋白表达(例如，起始密码子、酶结合位点、翻译或转录因子结合位点)。优选地，本发明的增强子包含核糖体结合位点与编码序列上游的起始密码子和编码序列，所述编码序列不同于CRM蛋白的编码序列。
本发明的另一实施方案涉及根据本发明的方法纯化的重组CRM，和具体而言CRM197。纯化优选地包括肝素或肝素-样亲和色谱法。令人惊讶的发现，CRM197包含典型的肝素结合位点XBBXBX (SEQ ID NO 6)的基于序列的基序，其中B是赖氨酸或精氨酸和X是亲水残基(Cardin AD，Weintraub HJ.,1989: Molecular modeling of protein-glycosaminoglycan interactions. Arteriosclerosis 9: 21–32)。该基序位于CRM197 受体-结合结构域中并包含以下氨基酸：GRKIRMRCR (SEQ ID NO 7)，其中G (甘氨酸)、I (异亮氨酸)、M (甲硫氨酸)和C (半胱氨酸)是亲水残基。肝素结合位点的存在允许在纯化中使用肝素或肝素-样树脂。肝素-样树脂包括包含硫酸官能团的树脂，例如硫酸葡聚糖，例如硫酸葡聚糖(Sterogene)、Capto Devirs (GE)或硫酸酯，例如Cellufine Sulfate (AsahiKasei Bioprocess)。
在第一步中，粗大肠杆菌提取物可例如优选地通过离心或深过滤澄清。任选澄清的裂解物可优选地通过加入对蛋白溶解度有影响的盐和盐析CRM197进一步分级。在第二步中，澄清的裂解物或包含CRM197的再溶解的盐析部分可在当CRM197流动通过的条件下施加至例如阴离子交换树脂。在第三步中，包含CRM197的流动通过部分可施加至柱。优选的柱树脂包括但不限于硫酸葡聚糖树脂、CELLUFINE™ 树脂(Chisso Corporation; 色谱凝胶)、活性硫酸化树脂、磷酸盐树脂或肝素或肝素-样树脂。优选地，CRM与树脂结合在低盐缓冲液中进行和在较高盐缓冲液中洗脱，得到高度纯化的CRM197。优选的结合缓冲液包含例如一种或多种离液剂、NaCl、KCl、甘油、异丙醇、乙醇、精氨酸、乙酸盐、胍、尿素、ATP、一种或多种一-、二-、三-和/或多-磷酸盐、硫酸盐或焦磷酸盐，和其组合。优选的洗脱缓冲液包含例如，较高浓度的一种或多种结合缓冲液组分。
其它优选的纯化方法包括阴离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法和/或Cibacron-Blue树脂(CN 101265288A、美国专利号8,383,783)的任何一种或组合。本发明的纯化方法以如本文所述的高收率和大于80%、优选地大于85%、优选地大于90%、优选地大于95%、优选地大于99%纯度水平和优选地甚至更高的纯度生产重组CRM蛋白(例如CRM197)。
本发明的另一实施方案涉及表征包含受体结合结构域(见SEQ ID NO 2)的重组DT和CRM蛋白(例如结合活性)，和具体而言CRM197的方法。这些方法包括测定包含DT受体结合结构域的天然或修饰序列的蛋白的结合活性。这样的修饰优选地保留CRM结合HB-EGF (肝素结合表位生长因子)的能力。所述方法可适用于粗制和纯化的CRM197两者。结合活性代表了可溶形式的白喉毒素受体HB-EGF (DTR)的结合。这些方法优选地包括测定CRM197与DTR的结合和用对正确折叠的结构、复合物、结合和/或结合位点有特异性的分子(例如抗体、抗体片段、抗原)和优选地以ELISA形式检测。测定和定量结合的测定法允许快速检测CRM197是正确折叠的，因为仅正确折叠的CRM197结合受体。因此，所述方法监测在开发、生产和纯化过程中制备的CRM197和相关蛋白的正确折叠。此外，该表征方法可用于在与另一分子缀合后鉴定和跟踪CRM蛋白，例如在疫苗生产中。使用本发明的检测方法，在开发用于治疗和/或预防患者的疾病和病症的疫苗过程中可监测正确折叠和构造的缀合的CRM蛋白。
本发明的另一实施方案包括用于缀合CRM蛋白的方法，用于疫苗生产，例如通过与多糖缀合。还包括蛋白、肽、寡糖和半抗原的缀合。本发明的另一实施方案包括包含本发明的CRM蛋白的疫苗。本发明的另一实施方案涉及与另一分子例如另一蛋白或多糖经基因或化学融合的本发明的CRM蛋白。融合优选地通过在分子之间的一个或多个共价键进行。
以下实施例举例说明了本发明的实施方案，但不应视为限制本发明的范围。
实施例
实施例1. 自在RBS和起始ATG密码子之间包含7、8、9或12个核苷酸序列的表达载体检测的CRM197表达
将编码成熟CRM197的DNA以多顺反子形式克隆至表达载体，产生以下DNA调节和编码片段的序列：tac启动子-核糖体结合位点-ATG密码子-T7标签-核糖体结合位点-ATG密码子-CRM编码序列-终止密码子。不同的大肠杆菌菌株，包括ORIGAMI 2、C41，作为表达菌株进行测试(图1)。
实施例2. CRM197在允许在细胞质中形成二硫键的Origami 2大肠杆菌表达菌株中可溶性表达
CRM197在37°C不溶性表达。当表达温度下降至低于37℃时，在ORIGAMI™ 2细胞和SHUFFLE™ 细胞中而非在其它测试的大肠杆菌菌株中表达的蛋白的溶解度增加。当在ORIGAMI™ 2细胞中在18°C下表达时，CRM197大部分是可溶的。
实施例3. 在CRM197表达中的表达增强子序列(EES)
EES在包含CRM的载体中促进CRM序列的转录和产生多顺反子mRNA，其翻译成两种蛋白，短的EES肽和CRM肽。对于潜在的3D结构形成，分析天然CRM基因的编码序列，和发现包含多个潜在的发夹结构，其可抑制翻译。创建CRM序列，其将可能产生没有发夹结构但仍翻译相同的CRM氨基酸序列的mRNA。该基因序列称为最佳CRM序列和包含SEQ ID NO 8。
最佳CRM序列在大肠杆菌(例如BL21)和经改造包含氧化细胞质的大肠杆菌(例如Shuffle)中均良好表达。自多顺反子mRNA翻译的CRM肽产生全长蛋白，和认为其比天然CRM编码序列更稳定。不像天然CRM序列，最佳CRM序列作为全长和作为可溶性蛋白在Shuffle细胞中表达。此外，与天然CRM相比，以较低的细胞密度和以与色谱树脂的结合增加观察到最佳CRM序列的更高表达，使CRM蛋白的生产水平更高。
实施例4. 硫酸铵沉淀来自细胞裂解物的CRM197
表达CRM197的SHUFFLE™细胞使用微流化仪打开，向细胞裂解物中加入1M的氯化钠。向其中加入足够的硫酸铵至等于1M，接着以20,000x g离心30分钟，这除去错误折叠的CRM197和大部分的细菌蛋白。在澄清后，硫酸铵浓度进一步增加至2.2M。收集主要是CRM197的沉淀物和再溶于低电导率缓冲液。
实施例5. 在肝素柱上CRM197的纯化
将硫酸铵沉淀的CRM197再溶于20mM Tris-HCl pH 8.0，达到电导率5 mS/cm和上样到包含肝素琼脂糖CL-6B树脂(GE)的柱上。在以下条件下进行纯化：流速5ml/min，洗涤缓冲液A：20mM Tris-HCl pH8。用缓冲液B 0-100%梯度，缓冲液B: 缓冲液A + 1M NaCl以20个CV进行洗脱。洗脱的CRM197通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下分析。洗脱的CRM197的纯度大于95%。用DTT还原的蛋白作为单一多肽显示，证实了完整形式的CRM197在大肠杆菌中表达。
实施例6. 在Capto Devirs柱上的CRM197的纯化
表达CRM197的SHUFFLETM细胞使用微流化仪在1xPBS pH 7.4、1%焦磷酸钠中打开。裂解物使用深过滤澄清。将澄清的裂解物上样到包含Q Sepharose XL (GE)的柱上，和收集流动通过的部分(flow through fraction)。为减少体积和电导率，将流动通过部分使用10K盒(cassette)(Sartorius)进行切向流过滤。Capto Devirs树脂用25mM焦磷酸钠缓冲液pH8.0平衡。CRM197在以下条件下与柱结合：电导率低于10mS/cm，在包含离液剂(例如在该情况下为尿素)的结合缓冲液中，洗涤缓冲液为25mM焦磷酸钠pH8.0。用NaCl进行洗脱。洗脱的CRM197通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下分析。洗脱的CRM197的纯度大于95%。用DTT还原的蛋白作为单一多肽显示，证实了CRM197在纯化过程期间保持完整。
实施例7. 用于CRM197表征的结合测定
将重组可溶性白喉毒素受体HB-EGF (DTR) (Sigma)结合至ELISA板。5%脱脂奶粉的封闭液用于防止高背景。将在1xPBS pH7.4、0.1% Twin 20中稀释的重组CRM197在37°C在板上孵育1小时。与HB-EGF结合的CRM197通过兔多克隆抗-CRM197抗体和与大豆过氧化物酶缀合的山羊抗兔抗体(Fina BioSolutions; Rockville, MD)检测。变性的重组CRM197不与受体结合。
实施例8. 在大肠杆菌中生产的CRM197结合DTR，其类似于来自棒状杆菌和假单胞菌的CRM
ELISA板用可溶性HB-EGF (肝素-结合EGF-样生长因子)包被，和用5%脱脂奶粉封闭。CRM197与受体结合，和用兔抗-CRM197多克隆抗体和与SBP缀合的山羊抗-兔多克隆抗体检测。在大肠杆菌中表达的CRM197显示对HB-EGF的亲和力与在棒状杆菌和假单胞菌中生产的CRM相同。
实施例9 CRM197是载体蛋白
CRM197按照本发明的方法表达和纯化(实施例1)和使用CDAP化学，化学连接(缀合)至肺炎球菌荚膜多糖血清型14和6B (Lees，A. Producing immunogenic constructs usingsoluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents. 见美国专利号5,651,971; 5,693,326和5,849,301)。缀合物自未缀合的蛋白和多糖纯化。根据表1的时间表用缀合物皮下免疫BALB/c雌性小鼠。在完全弗氏佐剂中免疫小鼠和在不完全弗氏佐剂中加强两次，并在第57天采血。
表1
血清型 在CFA中初次* 加强IFA** 加强IFA** D57
6B 20 ug 10 ug，第28天 10 ug，第48天 采血
14 20 ug 5 ug，第21天 5 ug，第48天 采血
*60%完全弗氏佐剂；**60%不完全弗氏佐剂
通过ELISA在用2 µg/ml的Pn6B或Pn14 (来自ATCC)包被的Brandtech免疫级板上使用γ-特异性检测，测试血清的反应性。图2的结果表明与Pn6B的强反应性。小鼠5086用于杂交瘤生产，并且得到的杂交瘤中的三个用于制备高特异性小鼠抗-6B单克隆抗体。针对Pn14包被板的血清滴定的结果显示在图3中。小鼠1397随后用于生产与P14多糖有反应的四种高特异性小鼠单克隆抗体。未缀合的多糖不产生显著的ELISA吸光度。
考虑本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其它实施方案和用途对本领域技术人员而言将是显然的。本文引用的所有参考文献，包括所有出版物、美国和其它国家的专利和专利申请，明确和完整地通过引用结合到本文中。术语“包含”，在任何时候使用时，意图包括术语“由……组成”和“基本上由……组成”。此外，术语“包含”、“包括”、“含有”等不意图限制。预期说明书和实施例仅认为是示例性的，本发明的真实范围和精神由随附权利要求书表明。
序列
SEQ ID NO 1 　CRM197
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKYDAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFG DGASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFE TR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLSCINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLE EF HQTALEHPEL SELKTVTGTNPVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMVAQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLF QV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKT HI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTFCRPKSPVYVG NGVHANLH VA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLS LF FEIKS
SEQ ID NO 2 　CRM197的结构域
SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRT GF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGKLDVNKSKT HI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLH VA FHRSSSEKIHSNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLS LF FEIKS
SEQ ID NO 3 　GATATAC 　 间隔基
SEQ ID NO 4 　GATATACCA 　间隔基
SEQ ID NO 5 　GATATACCATAT 　间隔基
SEQ ID NO 6 　XBBXBX 　 推定的肝素结合位点
SEQ ID NO 7 　GRKIRMRCR 　 肝素结合位点
SEQ ID NO 8 　最佳CRM序列
ATGGGTGCTGATGATGTTGTTGATTCCTCTAAGTCTTTCGTGATGGAAAATTTCTCGTCCTATCACGGTACCAAGCCTGGCTATGTGGATAGCATTCAAAAGGGTATTCAAAAACCGAAGTCTGGTACCCAGGGCAACTACGATGACGATTGGAAAGAGTTTTACAGCACCGACAACAAATATGACGCGGCAGGCTACAGCGTTGATAATGAAAATCCGCTGAGCGGTAAGGCTGGCGGCGTCGTTAAGGTTACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTGCTGGCCCTGAAAGTTGACAATGCTGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGTCTGAGCTTGACCGAGCCGCTGATGGAACAGGTTGGTACTGAAGAATTCATTAAACGTTTTGGTGACGGCGCGAGCCGTGTTGTGCTGTCCCTGCCGTTTGCCGAGGGTTCTAGCTCCGTGGAGTATATCAACAATTGGGAACAGGCGAAAGCGTTGAGCGTCGAGCTGGAAATCAATTTCGAGACTCGTGGTAAGCGTGGCCAAGATGCGATGTACGAGTACATGGCCCAGGCATGTGCGGGTAACCGCGTCCGTCGCAGCGTCGGCAGCTCCCTGAGCTGCATTAACCTGGACTGGGACGTGATCCGCGACAAGACTAAGACCAAGATTGAGAGCCTGAAAGAGCACGGTCCGATTAAGAACAAAATGTCCGAGTCTCCGAACAAAACGGTGAGCGAAGAAAAAGCCAAACAGTATCTGGAAGAATTCCATCAGACCGCCCTGGAGCACCCAGAGCTGAGCGAGCTGAAAACCGTCACCGGCACGAATCCGGTTTTTGCGGGTGCGAACTACGCGGCATGGGCAGTCAATGTTGCGCAAGTCATCGACAGCGAAACGGCTGATAACTTGGAGAAAACCACCGCGGCACTGAGCATTCTGCCGGGCATCGGTAGCGTTATGGGCATTGCGGACGGTGCCGTGCATCACAATACCGAAGAAATTGTCGCGCAGAGCATCGCATTGTCTAGCCTGATGGTTGCACAGGCCATTCCGCTGGTAGGCGAATTGGTGGATATCGGTTTCGCGGCTTACAATTTCGTTGAGTCGATCATTAACCTGTTTCAAGTCGTTCACAATAGCTATAACCGTCCGGCATACAGCCCGGGTCATAAGACGCAACCGTTTCTGCATGATGGCTATGCCGTGAGCTGGAACACGGTCGAGGATTCGATTATCCGTACCGGTTTTCAGGGTGAGAGCGGTCACGACATCAAAATCACCGCGGAGAACACGCCGCTGCCTATTGCGGGCGTCCTGCTGCCGACGATCCCGGGCAAACTGGACGTTAACAAGAGCAAGACCCATATCAGCGTCAACGGTCGTAAGATTCGCATGCGTTGTCGTGCAATCGACGGTGACGTGACGTTCTGCCGCCCAAAAAGCCCGGTGTACGTGGGTAACGGCGTGCACGCGAATCTGCATGTCGCGTTCCACCGCTCCTCAAGCGAGAAAATCCACAGCAATGAAATTAGCAGCGACAGCATTGGTGTGTTGGGCTACCAAAAGACCGTGGATCACACCAAGGTTAATAGCAAGCTGAGCCTGTTCTTTGAGATCAAAAGC
SEQ ID NO 9 　非最佳CRM序列
ATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCTTCCAAAAGCTTCGTCATGGAAAACTTCAGCTCCTATCACGGCACTAAACCGGGTTATGTCGACAGCATCCAGAAAGGCATCCAGAAACCGAAATCTGGCACTCAGGGTAACTATGACGACGACTGGAAAGAGTTCTACTCTACCGACAACAAATACGACGCGGCTGGTTATTCTGTGGACAACGAAAACCCGCTGTCTGGTAAAGCTGGTGGTGTTGTTAAAGTGACCTACCCGGGTCTGACCAAAGTTCTGGCTCTGAAAGTGGACAACGCCGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGTCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAGGTAGGTACCGAGGAATTCATCAAACGTTTTGGTGATGGTGCGTCCCGTGTTGTACTGTCTCTGCCATTTGCCGAAGGTTCTAGCTCTGTCGAGTACATCAACAACTGGGAGCAGGCCAAAGCTCTGTCTGTGGAACTGGAAATCAACTTCGAGACCCGTGGTAAACGTGGTCAGGACGCAATGTATGAATACATGGCACAGGCTTGCGCGGGTAACCGTGTACGTCGTTCTGTAGGTTCTTCCCTGTCTTGCATCAACCTGGACTGGGATGTCATCCGTGACAAAACCAAAACCAAAATCGAGTCCCTGAAAGAGCACGGTCCGATCAAAAACAAAATGAGCGAATCTCCGAACAAAACGGTCTCTGAGGAAAAAGCGAAACAGTACCTGGAAGAATTCCATCAGACCGCCCTGGAACACCCGGAACTGTCTGAACTGAAAACCGTTACCGGTACTAACCCGGTTTTCGCAGGTGCTAACTACGCAGCGTGGGCGGTTAACGTAGCCCAGGTAATCGATTCCGAAACCGCAGACAACCTGGAAAAAACGACTGCGGCTCTGTCTATTCTGCCGGGTATTGGTAGCGTGATGGGTATTGCAGATGGTGCAGTTCACCACAACACGGAAGAAATCGTTGCGCAGTCTATCGCTCTGTCTTCTCTGATGGTAGCACAGGCGATCCCGCTGGTTGGTGAACTGGTTGACATTGGCTTCGCGGCCTACAACTTCGTTGAATCCATCATCAACCTGTTCCAGGTTGTGCACAACTCTTACAACCGTCCAGCTTACTCTCCGGGTCACAAAACCCAGCCGTTCCTGCACGACGGTTATGCGGTTTCTTGGAACACCGTTGAAGACAGCATCATCCGTACTGGTTTCCAGGGTGAATCTGGCCACGACATCAAAATCACTGCTGAAAACACCCCGCTGCCGATCGCAGGTGTTCTCCTGCCAACTATTCCGGGTAAACTGGACGTGAACAAATCCAAAACGCACATCTCCGTGAACGGTCGTAAAATCCGCATGCGTTGTCGTGCGATTGATGGTGACGTTACTTTCTGTCGTCCGAAATCTCCGGTCTACGTAGGTAACGGTGTACATGCTAACCTCCATGTAGCGTTCCACCGTTCTTCTTCCGAGAAAATCCACTCCAACGAGATCTCTAGCGACTCTATCGGTGTTCTGGGTTACCAGAAAACCGTTGACCACACCAAAGTGAACTCCAAACTCAGCCTGTTCTTCGAAATCAAATCT
SEQ ID NO 10　crm 7
GAGCTCTAAGAAGGAGATATACATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
SEQ ID NO 11　crm 7_2
GAGCTCTTAAGAAGGAGATATACATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
SEQ ID NO 12　crm 8
GAGCTCTAAGAAGGAGATATACAATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
SEQ ID NO 13　crm 9
GAGCTCTAAGAAGGAGATATACACATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
SEQ ID NO 14　crm 12
GAGCTCTAAGAAGGAGATATACCATATATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
SEQ ID NO 15
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCCGAATTCGAGCTCTAAGAAGGAGATATACC
SEQ ID NO 16
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTAAGGAGATATACC
SEQ ID NO 17
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTGCGMAYCCATTCAGTGAAGAAGRAGSTTYATTT

Claims (58)

1.生产整个CRM蛋白或其一部分的方法，包括：
提供包含表达载体的重组细胞，所述表达载体包含与多顺反子基因序列功能连接的诱导型启动子，其中至少一个顺反子编码所述CRM蛋白；
诱导所述表达载体以生产CRM蛋白；和
分离所表达的CRM蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述重组细胞的一种或多种二硫化物还原酶的活性降低。
3.权利要求1的方法，其中各个顺反子包含核糖体结合位点和起始密码子。
4.权利要求1的方法，其中所述多顺反子基因序列在一个或多个核糖体结合位点和一个或多个起始密码子之间包含至少一个间隔基。
5.权利要求1的方法，其中由所述细胞表达的CRM蛋白是可溶性的。
6.权利要求1的方法，其中表达的CRM蛋白是细胞内的、周质的或分泌的。
7.权利要求1的方法，其中所述重组细胞在约15°C至约32°C的温度下增殖。
8.权利要求1的方法，其中所述CRM蛋白通过色谱法从所述细胞分离。
9.权利要求8的方法，其中所述色谱法包括硫酸葡聚糖树脂、凝胶树脂、活性硫酸化树脂、磷酸盐树脂、肝素树脂或肝素-样树脂。
10.通过权利要求8的方法分离的CRM蛋白。
11.生产整个CRM蛋白或其一部分的方法，包括：
提供包含表达载体的重组细胞，其中与未修饰的重组细胞相比，所述重组细胞已被修饰以改变细胞质的氧化还原状态至更加氧化的状态，和所述表达载体包含与CRM编码序列功能连接的诱导型启动子、在核糖体结合位点和起始密码子(start codon)例如起始密码子(initiation codon)之间的间隔基、CRM编码序列上游的表达增强子区；
诱导所述表达载体以生产CRM蛋白；和
分离所表达的CRM蛋白。
12.权利要求11的方法，其中所述重组细胞是大肠杆菌细胞或大肠杆菌的衍生菌或菌株。
13.权利要求11的方法，其中所述重组细胞修饰包括一种或多种二硫化物还原酶的活性降低。
14.权利要求13的方法，其中所述一种或多种二硫化物还原酶包括氧化还原酶、二氢叶酸还原酶、硫氧还蛋白还原酶、蛋白还原酶或谷胱甘肽还原酶的一种或多种。
15.权利要求11的方法，其中与非-重组细胞相比，所述一种或多种二硫化物还原酶的活性降低改变重组细胞的细胞质的氧化还原状态至氧化状态。
16.权利要求11的方法，其中所述CRM编码序列编码一个或多个CRM表位、CRM肽序列、CRM结构域或其组合。
17.权利要求11的方法，其中所述CRM编码序列编码CRM197。
18.权利要求11的方法，其中所述间隔基包含多于9个核苷酸或少于9个核苷酸。
19.权利要求18的方法，其中所述间隔基包含5-20个核苷酸。
20.权利要求11的方法，其中表达增强子包含CRM编码序列上游的核糖体结合位点和ATG密码子。
21.权利要求11的方法，其中由所述细胞表达的CRM蛋白是可溶性的。
22.权利要求11的方法，其中所表达的CRM蛋白是细胞内的、周质的或分泌的。
23.权利要求11的方法，其中所述重组细胞在约15°C至约32°C的温度下增殖。
24.权利要求11的方法，其中所述CRM蛋白通过色谱法从所述细胞分离。
25.权利要求24的方法，其中所述色谱法包括硫酸葡聚糖树脂、凝胶树脂、活性硫酸化树脂、磷酸盐树脂、肝素树脂或肝素-样树脂。
26.通过权利要求24的方法分离的CRM蛋白。
27.权利要求11的方法，进一步包括缀合所述分离的CRM蛋白。
28.权利要求27的方法，其中所述缀合的CRM蛋白是疫苗。
29.通过权利要求28的方法生产的CRM蛋白疫苗。
30.生产整个CRM蛋白或其一部分的方法，包括：
提供包含表达载体的重组细胞，其中所述表达载体包含与CRM编码序列功能连接的启动子；
从CRM编码序列表达CRM蛋白；和
分离所表达的CRM蛋白。
31.权利要求30的方法，其中所述重组细胞是原核或真核细胞。
32.权利要求31的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌细胞或大肠杆菌的衍生菌或菌株。
33.权利要求30的方法，其中所述启动子是组成型或诱导型的。
34.权利要求30的方法，其中所述CRM编码序列编码一个或多个CRM表位、CRM肽序列、CRM结构域或其组合。
35.权利要求30的方法，其中所述CRM编码序列编码CRM197。
36.权利要求30的方法，其中与未修饰的重组细胞相比，所述重组细胞已被修饰以改变细胞质的氧化还原状态至更加氧化的状态。
37.权利要求36的方法，其中所述修饰的重组细胞的一种或多种二硫化物还原酶的活性降低。
38.权利要求37的方法，其中所述一种或多种二硫化物还原酶包括氧化还原酶、二氢叶酸还原酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、蛋白还原酶或谷胱甘肽还原酶的一种或多种。
39.权利要求30的方法，其中所述表达载体在核糖体结合位点和起始密码子之间包含间隔基。
40.权利要求39的方法，其中所述间隔基包含多于9个核苷酸或少于9个核苷酸。
41.权利要求39的方法，其中所述间隔基包含5-20个核苷酸。
42.权利要求30的方法，其中所述表达载体包含表达增强子。
43.权利要求30的方法，其中所述表达增强子包含CRM编码序列上游的核糖体结合位点和起始密码子。
44.权利要求30的方法，其中分离包括：
用加样缓冲液将CRM蛋白加载到包含树脂的色谱柱上；
用一种或多种洗涤缓冲液洗涤树脂；
用洗脱缓冲液从树脂洗脱CRM蛋白。
45.权利要求44的方法，其中所述加样缓冲液和所述洗涤缓冲液可以是相同的。
46. 权利要求44的方法，其中所述加样缓冲液和所述一种或多种洗涤缓冲液是低电导率缓冲液，其具有约10 mS/cm或更小的电导率。
47. 权利要求44的方法，其中所述洗脱缓冲液是电导率为约10 mS/cm或更大的高电导率缓冲液。
48.权利要求44的方法，其中所述树脂选自硫酸葡聚糖树脂、凝胶树脂、活性硫酸化树脂、磷酸盐树脂、肝素树脂或肝素-样树脂。
49.表征白喉毒素或CRM蛋白的折叠的方法，包括：
使白喉毒素或CRM蛋白接触HB-EGF；
测定白喉毒素或CRM蛋白与HB-EGF结合的量；和
通过所测定的结合的量，测定白喉毒素或CRM蛋白的折叠，其中结合表示正确的折叠。
50.权利要求49的方法，其中所述白喉毒素或CRM包含受体结合结构域。
51.根据权利要求49的表征CRM蛋白的折叠的方法，其中所述CRM蛋白包含CRM197。
52.权利要求49的方法，其中白喉毒素或CRM蛋白和HB-EGF的至少一个与固体载体结合。
53.权利要求49的方法，其中白喉毒素或CRM蛋白与HB-EGF的结合的量通过ELISA测定。
54. 权利要求49的方法，其中与HB-EGF结合的CRM蛋白在PBS中是可溶性的，和在约pH7.5的缓冲液中浓缩至5 mg/ml或更大。
55.表达载体，其包含启动子和各自编码蛋白的两个或更多个顺反子，其中至少一个顺反子编码CRM蛋白，和各个顺反子具有核糖体结合位点和起始密码子。
56.权利要求55的表达载体，其在核糖体结合位点和起始密码子之间进一步包含间隔基。
57.权利要求56的表达载体，其中所述间隔基包含5-20个核苷酸。
58.权利要求56的表达载体，其中所述间隔基不包含9个核苷酸。
CN201580018271.2A 2014-01-31 2015-02-02 Crm197和相关蛋白的表达和纯化 Active CN106661587B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461934377P 2014-01-31 2014-01-31
US61/934377 2014-01-31
PCT/US2015/014130 WO2015117093A1 (en) 2014-01-31 2015-02-02 Expression and purification of crm197 and related proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106661587A true CN106661587A (zh) 2017-05-10
CN106661587B CN106661587B (zh) 2020-01-24

Family

ID=53757814

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580018271.2A Active CN106661587B (zh) 2014-01-31 2015-02-02 Crm197和相关蛋白的表达和纯化

Country Status (10)

Country Link
US (1) US10093704B2 (zh)
EP (1) EP3099800B1 (zh)
JP (2) JP2017510290A (zh)
KR (1) KR102282930B1 (zh)
CN (1) CN106661587B (zh)
AU (1) AU2015210674B2 (zh)
CA (1) CA2938251C (zh)
DK (1) DK3099800T3 (zh)
NZ (1) NZ722504A (zh)
WO (1) WO2015117093A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107365782A (zh) * 2017-08-29 2017-11-21 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种基因工程菌及其应用
CN110452838A (zh) * 2019-07-18 2019-11-15 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种crm197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10597664B2 (en) * 2014-01-31 2020-03-24 Fina Biosolutions, Llc Expression and purification of CRM proteins and related proteins, and protein domains
WO2015117093A1 (en) * 2014-01-31 2015-08-06 Fina Biosolutions, Llc Expression and purification of crm197 and related proteins
CN106350527B (zh) * 2016-11-03 2019-05-07 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
KR101908590B1 (ko) 2017-02-01 2018-10-16 (주)포바이오코리아 Crm197의 용해성 단백질 발현 및 정제 방법
EP3444269A1 (en) 2017-08-17 2019-02-20 National Research Council of Canada Systems and methods for the production of diphtheria toxin polypeptides
JP7399934B2 (ja) 2018-07-04 2023-12-18 バックスサイト・インコーポレイテッド 免疫原性複合体の改良
WO2020010000A1 (en) 2018-07-04 2020-01-09 Sutrovax, Inc. Improved methods for the preparation of immunogenic conjugates
WO2020010016A1 (en) 2018-07-04 2020-01-09 Sutrovax, Inc. Self-adjuvanted immunogenic conjugates
FI3877552T3 (fi) 2018-11-08 2023-05-11 Sutro Biopharma Inc E coli -kantoja, joilla on oksidativinen sytoplasma
KR20220154221A (ko) * 2020-03-16 2022-11-21 피나 바이오솔루션스, 엘엘씨 용해성 재조합 단백질의 생산

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040043468A1 (en) * 2000-01-28 2004-03-04 Mauro Vincent P. Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
US20040063187A1 (en) * 1999-08-06 2004-04-01 Aventis Behring Gmbh Process for the preparation in pure form of the protease activating blood clotting factor VII, its proenzyme or a mixture of both proteins by means of chromatography
US20060030022A1 (en) * 1999-10-05 2006-02-09 Jonathan Beckwith Compositions and methods for production of disulfide bond containing proteins in host cells
WO2007063129A3 (en) * 2005-12-02 2007-07-12 Novozymes As Insolation of peptides , polypeptides and proteins
US20110287443A1 (en) * 2010-03-30 2011-11-24 Pfenex Inc. High level expression of recombinant toxin proteins

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69434079T2 (de) 1993-03-05 2005-02-24 Wyeth Holdings Corp. Plasmid zur Herstellung von CRM-Protein und Diphtherie-Toxin
ATE254475T1 (de) 1993-09-22 2003-12-15 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur aktivierung von löslichem kohlenhydraten durch verwendung von neuen cyanylierungsreagenzien, zur herstellung von immunogenischen konstrukten
US5849301A (en) 1993-09-22 1998-12-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Producing immunogenic constructs using soluable carbohydrates activated via organic cyanylating reagents
US7816117B2 (en) * 2006-04-26 2010-10-19 President And Fellows Of Harvard College Prokaryotic host cells for expressing proteins rich in disulfide bonds
CN101265288B (zh) 2007-03-13 2012-03-21 齐鲁制药有限公司 Crm197突变体的纯化方法
IT1398927B1 (it) * 2009-06-25 2013-03-28 Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati.
GB0917647D0 (en) 2009-10-08 2009-11-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Expression system
AU2010201410B2 (en) 2010-03-30 2015-04-30 Pelican Technology Holdings, Inc. High level expression of recombinant CRM197
US8383783B2 (en) 2010-04-23 2013-02-26 Serum Institute Of India, Ltd. Simple method for simultaneous removal of multiple impurities from culture supernatants to ultralow levels
FR2988393B1 (fr) * 2012-03-20 2014-05-09 Commissariat Energie Atomique Inhibiteur de l'hb-egf derive du domaine r de la toxine diphterique pour le traitement des maladies associees a l'activation de la voie hb-egf/egfr
GB201209896D0 (en) * 2012-06-01 2012-07-18 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Process
US20150184215A1 (en) * 2013-12-27 2015-07-02 Development Center For Biotechnology Development of the soluble recombinant crm197 production by e. coli
WO2015117093A1 (en) * 2014-01-31 2015-08-06 Fina Biosolutions, Llc Expression and purification of crm197 and related proteins

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040063187A1 (en) * 1999-08-06 2004-04-01 Aventis Behring Gmbh Process for the preparation in pure form of the protease activating blood clotting factor VII, its proenzyme or a mixture of both proteins by means of chromatography
US20060030022A1 (en) * 1999-10-05 2006-02-09 Jonathan Beckwith Compositions and methods for production of disulfide bond containing proteins in host cells
US20040043468A1 (en) * 2000-01-28 2004-03-04 Mauro Vincent P. Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
WO2007063129A3 (en) * 2005-12-02 2007-07-12 Novozymes As Insolation of peptides , polypeptides and proteins
US20110287443A1 (en) * 2010-03-30 2011-11-24 Pfenex Inc. High level expression of recombinant toxin proteins

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
付灿: "重组人成纤维细胞生长因子-8a在大肠杆菌中的可溶性表达", 《菏泽学院学报》 *
熊盛 等: "还原酶缺陷型大肠杆菌对重组蛋白溶解性的影响", 《生物工程学报》 *
王春娥 等: "白喉毒素无毒变异体CRM197的表达及其载体作用", 《中国生物制品学杂志》 *
肖钾钙镁: "白喉毒素突变体CRM197的表达纯化及性质研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
赵雪娜 等: "白喉毒素突变体CRM197在大肠杆菌中", 《生物技术通报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107365782A (zh) * 2017-08-29 2017-11-21 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种基因工程菌及其应用
CN110452838A (zh) * 2019-07-18 2019-11-15 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种crm197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法
CN110452838B (zh) * 2019-07-18 2020-12-29 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种crm197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10093704B2 (en) 2018-10-09
US20160333057A1 (en) 2016-11-17
CA2938251A1 (en) 2015-08-06
JP2017510290A (ja) 2017-04-13
AU2015210674A1 (en) 2016-08-18
JP7073312B2 (ja) 2022-05-23
AU2015210674B2 (en) 2017-08-24
KR102282930B1 (ko) 2021-07-27
DK3099800T3 (da) 2021-01-11
JP2019205446A (ja) 2019-12-05
EP3099800B1 (en) 2020-10-14
EP3099800A4 (en) 2017-11-08
WO2015117093A1 (en) 2015-08-06
KR20160113276A (ko) 2016-09-28
CN106661587B (zh) 2020-01-24
EP3099800A1 (en) 2016-12-07
NZ722504A (en) 2017-08-25
CA2938251C (en) 2021-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106661587A (zh) Crm197和相关蛋白的表达和纯化
Khushoo et al. Extracellular expression and single step purification of recombinant Escherichia coli L-asparaginase II
AU652124B2 (en) Stabilized protein or peptide conjugates
Yang et al. One hundred seventy-fold increase in excretion of an FV fragment-tumor necrosis factor alpha fusion protein (sFV/TNF-α) from Escherichia coli caused by the synergistic effects of glycine and Triton X-100
Choi et al. Cloning, expression, and characterization of single-chain variable fragment antibody against mycotoxin deoxynivalenol in recombinant Escherichia coli
Sánchez et al. High cytoplasmic expression in E. coli, purification, and in vitro refolding of a single chain Fv antibody fragment against the hepatitis B surface antigen
CN105263527A (zh) 与crm197有关的方法和组合物
JPH05268983A (ja) 原核宿主生物によるジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質の立体配座の形成を向上させる方法
Imani et al. Recombinant production and affinity purification of the FraC pore forming toxin using hexa-His tag and pET expression cassette
Sun et al. Co-expression of Dsb proteins enables soluble expression of a single-chain variable fragment (scFv) against human type 1 insulin-like growth factor receptor (IGF-1R) in E. coli
Piątek et al. Molecular aspects of biogenesis of Escherichia coli Dr Fimbriae: characterization of DraB-DraE complexes
US10597664B2 (en) Expression and purification of CRM proteins and related proteins, and protein domains
Charbonnier et al. Overexpression, refolding, and purification of the histidine-tagged outer membrane efflux protein OprM of Pseudomonas aeruginosa
TW202406930A (zh) 重組肉毒桿菌毒素及其製備方法
Jianhua et al. Probing the antigenicity of E. coli L-asparaginase by mutational analysis
Zhuo et al. Refolding and purification of non-fusion HPT protein expressed in Escherichia coli as inclusion bodies
US20210032284A1 (en) Method for efficiently recovering and purifying active crm197 from insoluble crm197 protein expressed in inclusion body
Burks et al. Rapid, High‐Yield Recovery of a Recombinant Digoxin Binding Single Chain Fv from Escherichia coli
US11060123B2 (en) Production of soluble recombinant protein without n-terminal methionine
US11124548B2 (en) Method for expressing and purifying soluble protein of CRM197
US20210348174A1 (en) Production of Soluble Recombinant Proteins without N-Terminal Methionine in E-Coli
Duarte et al. An improved method for purification and refolding of recombinant HIV Vif expressed in Escherichia coli
AU2001256032B2 (en) Co-expression of recombinant proteins
Reed et al. Expression of furin-linked Fab fragments against anthrax toxin in a single mammalian expression vector
Kim et al. Activation of a refolded, berberine-specific, single-chain Fv fragment by addition of free berberine

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant