CN110452838B - 一种crm197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药和微生物培养技术领域，特别涉及一种CRM197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法。CRM197菌种培养基为液体培养基，每升培养基中包括以下配方的组分：250mL基础营养液、7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、0.5g酪氨酸、1.96g磷酸二氢钾、5.1g磷酸氢二钾、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b、8mL生长因子c和1.3g氯化钙。该培养基在制备时能使得各组分快速溶解，保证培养基的均一性。本申请中CRM197菌种的发酵培养方法采用逐级放大的发酵培养扩增模式，具有快速、便捷、成本低、高效的特点，便于CRM197菌种的大规模扩增，从而获得高表达量的发酵菌液。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药和微生物培养技术领域，特别涉及一种CRM197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法。
背景技术
白喉毒素(DT)是由白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的产毒菌株合成和分泌的蛋白质性毒素，其以单一多肽的形式产生，且该多肽易于被剪接，在190、192或193残基处裂解，结果形成由二硫键连接的两个亚基A片段和B片段(Moskaug等Biol.Chem.264：15709-15713，1989)。A片段为催化活性部分，是依赖NAD的ADP-核糖基转移酶，其特异性靶向蛋白质合成因子EF-2，从而使EF-2失活，细胞中的蛋白质则合成停止。
CRM197为白喉毒素的无毒形式，但其在免疫上与白喉毒素没有区别。CRM197由不产毒噬菌体β197tox感染的白喉棒杆菌产生，而β197tox是通过对产毒棒状噬菌体进行亚硝基胍诱突创造的(Uchida等Nature New Biology(1971)233；8-11)。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但其结构基因不同，其中有单碱基变化。这导致52位的氨基酸从甘氨酸变为谷胺酰胺，使A片段不能结合NAD，因此无毒(Pappenheimer 1977，AnnRev，Biochem.46；69-94，RappuoliApplied and Environmental Microbiology Sept 1983p560-564)。
由于没有毒性的CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合，即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，因此是一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。
目前，我国公布的有关生产CRM197的方法专利有：
2006年03月21日，国家知识产权局公布了葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司P·M·H·德霍泰等用于生产白喉类毒素的方法专利，专利申请号为200680017793.1，此专利涉及CRM197的发酵方法，包括在发酵罐中的培养白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的发酵方式以及培养基的配方，该培养方式足以维持均质培养物的搅动和限量通气以便培养物中的pO2在大部分发酵过程中能够降低到4％以下，直至完成发酵。
2007年07月18日，国家知识产权局公布了海南天源康泽医药科技有限公司李模孝等白喉毒素突变体CRM197及其制备方法专利，专利申请号为200610042194.7，此专利以大肠杆菌为出发菌，以包涵体形式表达白喉毒素突变体CRM197，目标产物序列为长度536个氨基酸，具有白喉毒素的免疫原性而不具有白喉毒素的毒性。该发明克隆了编码CRM197的基因，构建表达CRM197的重组表达质粒并转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达。目的蛋白在蛋白总含量中占24％以上，CRM197更易于纯化，纯度易于达到95％以上，目的蛋白回收率高。
然而，无论是天然的CRM197菌种还是重组构建的CRM197工程菌，在实际的菌种发酵过程中，培养方式是制约其高量产的重要一环。因此，研发出一种恰当的培养方式，使CRM197菌种得以大规模扩增而获得高表达量的发酵菌液是本发明所要解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种CRM197菌种培养基，其为CRM197菌种的发酵提供充足的养分，有助于CRM197菌种的大规模扩增，获得高表达量的发酵菌液。
本发明的第二个目的在于提供一种CRM197菌种培养基的配制方法，具有操作简单便捷、配制效率高、成本低廉的特点，且配制过程采取除菌过滤，无需高压灭菌，最大程度的保留了培养基的有效成分。
本发明的第三个目的在于提供一种CRM197菌种发酵培养方法，其采用逐级放大的发酵培养扩增模式，具有快速、便捷、高效的特点，便于CRM197菌种的大规模扩增，从而获得高表达量的发酵菌液。
为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：
一种CRM197菌种培养基，为液体培养基，且每升培养基中包括以下配方的组分：250mL基础营养液、7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、0.5g酪氨酸、1.96g磷酸二氢钾、5.1g磷酸氢二钾、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b、8mL生长因子c和1.3g氯化钙。
通过采用上述技术方案，本申请的培养基中，基础营养液为CRM197菌种的主要营养来源，为其生长提供充足的营养成分；乙酸和一水麦芽糖作为碳源，为CRM197菌种提供细胞的碳架以及细胞生命活动所需的能量。
乳酸钠可作为pH调节剂而使得培养基的pH较为稳定，虽然乳酸钠具有一定的抗微生物作用，但对CRM197菌种较为友好，因此其能保证CRM197菌种正常生长的同时，对其他微生物加以抑制，减少其他微生物发生营养掠夺的可能性，再培养基不使用时还能有效减少杂菌的感染。
酪氨酸是构成蛋白质的氨基酸，具有电离的芳香环侧链，呈嗜水性，酪氨酸在人及动物体内由苯丙氨酸羟化而产生，既是生糖又是生酮氨基酸，其自身被吸收利用的同时还能够促进CRM197菌种对乙酸以及一水麦芽糖的吸收利用。
磷酸二氢钾和磷酸氢二钾两者复合使用，作为磷钾调节剂，为CRM197菌种提供充足的磷钾元素。
生长因子是一类调节微生物正常生长代谢所需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的有机物，其通过与特异性、高亲和性的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能。本申请中的生长因子a、生长因子b和生长因子c相互协调作用，进而为CRM197菌种提供良好的生长环境，有助于其大量扩增。
氯化钙能够改变CRM197菌种细胞壁的通透性，其与上述其他培养基组分形成一个优良的生长环境体系，便于CRM197蛋白能顺利从细胞中分泌至细胞外，有效提高了CRM197蛋白的产量。
综上，本申请的CRM197菌种培养基能够为CRM197菌种的发酵提供充足的养分，有助于CRM197菌种的大规模扩增，获得高表达量的发酵菌液。另外，本申请上述培养基的组分除酵母提取物外均可采用国产试剂，从而可以有效降低该培养基的生产成本，便于被推广使用。
进一步地，每升所述基础营养液中包括有：2g精氨酸、2g天冬酰胺、0.5g门冬氨酸、0.5g谷氨酸、2g L-谷氨酰胺、0.5g甘氨酸、1.5g组氨酸、2g L-异亮氨酸、2g亮氨酸、2g赖氨酸盐酸盐、0.6g甲硫氨酸、1g苯丙氨酸、2g脯氨酸、2g丝氨酸、1g苏氨酸、0.6g色氨酸、1.5g缬氨酸和0.5gβ-丙氨酸。
通过采用上述技术方案，上述组分均为CRM197菌种生长所需的氨基酸，其按上述配方加以配制，为CRM197菌种提供了一个优异的生长环境，进而促进CEM197菌种的快速扩增。
进一步地，每升所述生长因子a中包括有：2g L-胱氨酸和2mL盐酸。
通过采用上述技术方案，L-胱氨酸可以作为营养强化剂，有利于CRM197菌种的成长，使得CRM197菌种具有优异的生命活性；盐酸则能够促使L-胱氨酸的溶解，便于L-胱氨酸较好分散于培养基中，同时为L-胱氨酸提供稳定的存在环境。
进一步地，每升所述生长因子b中包括有：6.5g烟酸、0.5g无水硫酸铜、0.15g庚二酸、30mL盐酸、200g七水硫酸镁、0.8g七水硫酸锌和0.393g四水氯化锰。
通过采用上述技术方案，生长因子b按上述配方的组分配制，主要为CRM197菌种提供充足的无机盐，是构成CRM197菌体细胞成分的要素，其可以作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂，调节培养基的渗透压、pH和氧化还原电位，进而促使CRM197蛋白得以大量分泌，从而有助于获得高表达量的发酵菌液。
进一步地，每升所述生长因子c中包括有：0.1g维生素B1、0.75g维生素B5和0.075g维生素B6。
通过采用上述技术方案，生长因子c按上述配方的组分配制，主要为CRM197菌种提供的相应的维生素B，其中的维生素B1和B6能促进CRM197菌种的快速生长，保证其优异的生命活力，而维生素B5能够提高CRM197菌种的环境耐受性，以此复配形成的生长因子促使CRM197菌种大量扩增。
进一步地，所述CRM197菌种培养基、基础营养液、生长因子a、生长因子b和生长因子c均使用50℃-60℃的注射用水加以配制。
通过采用上述技术方案，注射用水为经过灭菌后的双蒸水，有效减少培养基被杂菌感染的风险；另外，50℃-60℃的注射用水一方面能够有效促进各组分的快速溶解，另一方面保证了各组分的有效性，以此使其处于一个平衡状态，因此将其作为优选。
为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：
一种CRM197菌种培养基的配制方法，包括以下步骤：
①、将酪氨酸用浓度为20wt％的氢氧化钠溶解，比例为10％(W/V)，得到酪氨酸溶液；
②、在容器中加入适量50℃-60℃的注射用水，按设定配方依次准确称取或量取乙酸、一水麦芽糖、乳酸钠、步骤①制得的酪氨酸溶液、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾加入该注射用水中混匀，得到初混液；
③、待初混液降至室温，按设定配方依次准备量取基础营养液、生长因子a、生长因子b和生长因子c加入其中，充分混匀后用注射用水定容，调节pH至7.4±0.2，混合均匀，得到待分层液；
④、往待分层液中加入氯化钙，充分溶解后静置30min至分层，用硅胶管虹吸上清液，经除菌过滤后即得CRM197菌种培养基。
通过采用上述技术方案，酪氨酸在水中的溶解度较小，使用浓度为20wt％的氢氧化钠先行溶解，有助于其均匀分散于培养基中。乙酸、一水麦芽糖、乳酸钠、酪氨酸、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾这几种组分溶解较为缓慢，先用50℃-60℃的注射用水对加以溶解，再在室温时加入基础营养液、生长因子a、生长因子b和和生长因子c，使得各组分均能快速溶解分散，最后加入氯化钙后进行静置，采用硅胶管虹吸上清液，保证培养基的均一性，便于CRM197菌种的有效利用。该制备方法操作简单便捷，具有较高的配制效率，培养基成本低廉，配制过程采取除菌过滤，无需高压灭菌，最大程度的保留了培养基的有效成分。
为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：
一种CRM197菌种发酵培养方法，包括以下步骤：
(一)、培养基配制
按设定配方配制一定量的生长因子d以及CRM197菌种培养基；
(二)、摇瓶培养
一代液体摇瓶：开启一支CRM197菌种，接种入50mL CRM197菌种培养基中，加入2.5mL生长因子d，在36.5±0.5℃、100-300rpm的条件下摇瓶培养，直至OD600在1.0以上，收获一代液体摇瓶菌液；
二代液体摇瓶：接种一代液体摇瓶菌液1.5mL入500mL CRM197液体培养基中，加入25mL生长因子d，此为二代液体摇瓶菌液，在36.5±0.5℃、100-300rpm的条件下摇瓶培养，直至OD600在2.0以上，收获二代液体摇瓶菌液；
(三)、生物反应器培养
种子罐培养：接种全部二代液体摇瓶菌液入7000mL CRM197液体培养基中，在36.5±0.5℃、200-600rpm、溶氧20％以上的条件下培养，直至OD600在10.0以上，收获种子罐菌液；
生产罐培养：接种全部种子罐菌液入60000mL CRM197液体培养基中，在36.5±0.5℃、100-300rpm、溶氧20％以上的条件下培养，直至OD600在40.0以上，收获生产罐菌液，即完成CRM197菌种的发酵培养。
通过采用上述技术方案，本申请依次经一代液体摇瓶、二代液体摇瓶、种子罐和生产罐的逐级放大培养，使得CRM197菌种的生长呈指数型生长，有助于其大规模扩增，获得高产量的CRM197蛋白。其步骤简单、操作方便，具有快速、便捷、高效的特点，便于实现CRM197菌种的大批量生产，从而获得高表达量的发酵菌液，培养的发酵液中蛋白絮状单位可达到120Lf/mL以上。
进一步地，所述生长因子d为10g/L的酵母提取物溶液。
通过采用上述技术方案，酵母提取物中含有丰富的蛋白质、游离氨基酸、多肽、维生素、核苷酸及微量元素等，能为CRM197菌种提供全面的营养，其能与本申请的CRM197菌种培养基相辅相成，更好促进CRM197菌种的大规模扩增。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本申请的CRM197菌种培养基能够为CRM197菌种的发酵提供充足的养分，有助于CRM197菌种的大规模扩增，获得高表达量的发酵菌液，除酵母提取物外其可采用国产试剂而有效降低生产成本，便于被推广使用；
2、本申请中CRM197菌种培养基的配制方法使得培养基中的各组分快速溶解，保证培养基的均一性，具有操作简单便捷、配制效率高的特点；
3、本申请中CRM197菌种培养基的配制方法，采取除菌过滤，无需高压灭菌，最大程度的保留了培养基的有效成分。
4、本申请中CRM197菌种的发酵培养方法采用逐级放大的发酵培养扩增模式，具有快速、便捷、高效的特点，便于CRM197菌种的大规模扩增，从而获得高表达量的发酵菌液。
附图说明
图1为制备CRM197菌种培养基的工艺图；
图2为发酵培养CRM197菌种的工艺图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
1、原料准备
1.1、CRM197菌种：本申请中CRM197菌种来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，菌株编号为ATCC39255。除此之外，本申请的CRM197菌种还可以选用菌株编号为ATCC39526、ATCC11049、ATCC51926、ATCC51280等其他菌种。
在使用上述菌种之前，先将其使用CRM197液体培养基1mL进行复苏活化。
1.2、基础营养液的配方及其配制方法：
表一 基础营养液的配方表
| 试剂 | 物料名称 | 厂家 | 配方g/L |
| 1 | 精氨酸 | 上海协和氨基酸有限公司 | 2 |
| 2 | 天冬酰胺 | 上海凌峰化学试剂有限公司 | 2 |
| 3 | 门冬氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 0.5 |
| 4 | 谷氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 0.5 |
| 5 | L-谷氨酰胺 | 上海凌峰化学试剂有限公司 | 2 |
| 6 | 甘氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 0.5 |
| 7 | 组氨酸 | 上海麦克林生化科技有限公司 | 1.5 |
| 8 | L-异亮氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 2 |
| 9 | 亮氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 2 |
| 10 | 赖氨酸盐酸盐 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 2 |
| 11 | 甲硫氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 0.6 |
| 12 | 苯丙氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 1 |
| 13 | 脯氨酸 | 上海凌峰化学试剂有限公司 | 2 |
| 14 | 丝氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 2 |
| 15 | 苏氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 1 |
| 16 | 色氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 0.6 |
| 17 | 缬氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 1.5 |
| 18 | β-丙氨酸 | 上海凌峰化学试剂有限公司 | 0.5 |
配制方法：量取适量55℃注射用水，按上述配方表依次加入试剂1-18，溶解后用同样的注射用水定容后混匀，于室温下备用。
其中的注射用水可以在50℃-60℃之间波动，此时收获的CRM197蛋白的絮状单位的差异可以忽略不计，但超过该温度范围则会导致其絮状单位差异增大，因此将50℃-60℃的注射用水作为优选。
1.3、生长因子a的配方及其配制方法：
表二 生长因子a的配方表
| 试剂 | 物料名称 | 厂家 | 配方 |
| 19 | L-胱氨酸 | 上海麦克林生化科技有限公司 | 2g/L |
| 20 | 盐酸 | 上海凌峰化学试剂有限公司 | 2ml/L |
配制方法：量取适量55℃注射用水，按上述配方表依次加入试剂19-20，溶解后用同样的注射用水定容后混匀，于室温下备用。其中的注射用水可以在50℃-60℃之间波动，此时收获的CRM197蛋白的絮状单位的差异可以忽略不计。
1.4、生长因子b的配方及其配制方法
表三 生长因子b的配方表
| 试剂 | 物料名称 | 厂家 | 配方 |
| 21 | 烟酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 6.5g/L |
| 22 | 五水硫酸铜 | 国药集团化学试剂有限公司 | 0.5g/L |
| 23 | 庚二酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 0.15g/L |
| 24 | 盐酸 | 上海凌峰化学试剂有限公司 | 30ml/L |
| 25 | 七水硫酸镁 | 国药集团化学试剂有限公司 | 200g/L |
| 26 | 七水硫酸锌 | 国药集团化学试剂有限公司 | 0.8g/L |
| 27 | 四水氯化锰 | 国药集团化学试剂有限公司 | 0.393g/L |
配制方法：量取适量55℃注射用水，按上述配方表依次加入试剂21-27，溶解后用同样的注射用水定容后混匀，于室温下备用。其中的注射用水可以在50℃-60℃之间波动，此时收获的CRM197蛋白的絮状单位的差异可以忽略不计。
1.5、生长因子c的配方及其配制方法
表四 生长因子c的配方表
| 试剂 | 物料名称 | 厂家 | 配方g/L |
| 28 | 维生素B1 | 国药集团化学试剂有限公司 | 0.1 |
| 29 | 维生素B5 | 国药集团化学试剂有限公司 | 0.75 |
| 30 | 维生素B6 | 国药集团化学试剂有限公司 | 0.075 |
配制方法：量取适量55℃注射用水，按上述配方表依次加入试剂28-30，溶解后用同样的注射用水定容后混匀，于室温下备用。其中的注射用水可以在50℃-60℃之间波动，此时收获的CRM197蛋白的絮状单位的差异可以忽略不计。
1.6、生长因子d的配方及其配制方法
表五 生长因子d的配方表
| 试剂 | 物料名称 | 厂家 | 配方g/L |
| 31 | 酵母提取物 | OXIOD | 10 |
配制方法：量取适量55℃注射用水，按上述配方表加入试剂31，溶解后用同样的注射用水定容后混匀，于室温下备用。其中的注射用水可以在50℃-60℃之间波动，此时收获的CRM197蛋白的絮状单位的差异可以忽略不计。
1.7、20wt％氢氧化钠的配方及其配制方法
表六 20wt％氢氧化钠的配方表
配制方法：量取适量常温的注射用水，按上述配方表加入试剂32，溶解后用同样的注射用水定容后混匀，于室温下备用。
2、实施例
2.1、一种CRM197菌种培养基，为液体培养基，其配方表参见下表七：
表七 CRM197液体培养基的配方表
| 试剂 | 物料名称 | 厂家 | 配方 |
| / | 基础营养液 | 自制(参见表一) | 250ml/L |
| 33 | 乙酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 7.2ml/L |
| 34 | 一水麦芽糖 | 国药集团化学试剂有限公司 | 30g/L |
| 35 | 乳酸钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 2ml/L |
| 36 | 酪氨酸 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 0.5g/L |
| 37 | 磷酸二氢钾 | 国药集团化学试剂有限公司 | 1.96g/L |
| 38 | 磷酸氢二钾 | 国药集团化学试剂有限公司 | 5.1g/L |
| / | 生长因子a | 自制(参见表二) | 6.13ml/L |
| / | 生长因子b | 自制(参见表三) | 8ml/L |
| / | 生长因子c | 自制(参见表四) | 8ml/L |
| 39 | 氯化钙 | 河北华晨药业有限公司 | 1.3g/L |
2.2、上述CRM197菌种培养基的制备方法，参见图1，包括以下步骤：
①、将酪氨酸用浓度为20wt％的氢氧化钠溶解，比例为10％(W/V)，得到酪氨酸溶液；
②、在容器中加入适量55℃的注射用水，按表七的配方表依次准确称取或量取乙酸、一水麦芽糖、乳酸钠、步骤①制得的全部酪氨酸溶液、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾加入该注射用水中混匀，得到初混液；
③、待初混液降至室温，按表七的配方表依次准备量取25L基础营养液、生长因子a、生长因子b和生长因子c加入其中，充分混匀后用注射用水定容，用浓度为20wt％的氢氧化钠调节pH至7.4，混合均匀，得到待分层液；
④、往待分层液中加入氯化钙，充分溶解后静置30min至分层，用硅胶管虹吸上清液，经除菌过滤后即得CRM197菌种培养基；
其中的注射用水可以在50℃-60℃之间波动，此时收获的CRM197蛋白的絮状单位的差异可以忽略不计。
2.3一种CRM197菌种发酵培养方法，参见图1，包括以下步骤：
(一)、培养基配制
按1.6的配制方法配制50mL生长因子d，按2.1的配制方法配制100L的CRM197菌种培养基。
(二)、摇瓶培养
一代液体摇瓶：开启一支CRM197菌种，接种入50mL CRM197菌种培养基中，加入2.5mL生长因子d，在36.5±0.5℃、100-300rpm的条件下摇瓶培养，直至OD600在1.0以上，收获一代液体摇瓶菌液；
二代液体摇瓶：接种一代液体摇瓶菌液1.5mL入500mL CRM197液体培养基中，加入25mL生长因子d，此为二代液体摇瓶菌液，在36.5±0.5℃、100-300rpm的条件下摇瓶培养，直至OD600在2.0以上，收获二代液体摇瓶菌液。
(三)、生物反应器培养
种子罐培养：接种全部二代液体摇瓶菌液入7000mL CRM197液体培养基中，在36.5±0.5℃、200-600rpm、溶氧20％以上的条件下培养，直至OD600在10.0以上，收获种子罐菌液；
生产罐培养：接种全部种子罐菌液入60000mL CRM197液体培养基中，在36.5±0.5℃、100-300rpm、溶氧20％以上的条件下培养，直至OD600在40.0以上，收获生产罐菌液，即完成CRM197菌种的发酵培养。
3、对比例
本对比例采用授权公告号为CN 101180313 B的发明专利所公开的发酵方法发酵CRM197菌种(菌种编号ATCC39255)，收获对比发酵液。
4、检测结果
本申请按2.3中记载的CRM197菌种发酵培养方法平行发酵了三个批次的CRM菌种，其批号对应记为201903001、201903002和201903003，其收获的生产罐菌液以及对比例收获的对比发酵液均按2015版《中国药典》中记载的絮状单位(Lf)测定法对CRM197蛋白产量加以测定。
其中，絮状单位是评价蛋白表达水平的直接指标，表示发酵培养液中所含特定蛋白的浓度水平，且絮状蛋白水平越高，蛋白的表达量也越高。测定结果参见下表八。
表八 生产罐菌液以及对比发酵液中CRM197蛋白产量的检测结果
| 批号 | 最终OD600 | 絮状单位Lf/mL |
| 201903001 | 42.7 | 133 |
| 201903002 | 43.6 | 120 |
| 201906003 | 41.8 | 155 |
| 对比发酵液 | 42.5 | 86 |
从表八的检测结果可以得到，三个批次收获的生产罐菌液的蛋白絮状单位均能达到120Lf/mL以上，相对于对比发酵液的86Lf/mL，具有较高的蛋白表达水平。因此，采用本申请的CRM197菌种培养基及其制备方法以及CRM197菌种发酵培养方法，不但能够快速、便携、高效的大规模扩增CRM197菌种，还能获得高表达量的发酵菌液。其中，本申请中培养基的组分除酵母提取物外均采用国产试剂，从而可以有效降低该培养基的生产成本。本申请中CRM197菌种培养基的配制方法，采取除菌过滤，无需高压灭菌，最大程度的保留了培养基的有效成分。
另外，其获得的生产罐菌液可以用于培养扩增白喉毒素无毒突变体CRM197菌株、用于制备提纯白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白、用于使用白喉毒素无毒突变体CRM197作为载体蛋白的结合疫苗或联合疫苗的制备、用于白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的其他用途，因此值得被推广使用。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (4)
1.一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基，其特征在于，为液体培养基，且每升培养基由以下配方的组分组成：250mL基础营养液、7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、0.5g酪氨酸、1.96g磷酸二氢钾、5.1g磷酸氢二钾、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b、8mL生长因子c和1.3g氯化钙；每升所述基础营养液由以下配方的组分组成：2g精氨酸、2g天冬酰胺、0.5g门冬氨酸、0.5g谷氨酸、2g L-谷氨酰胺、0.5g甘氨酸、1.5g组氨酸、2g L-异亮氨酸、2g亮氨酸、2g赖氨酸盐酸盐、0.6g甲硫氨酸、1g苯丙氨酸、2g脯氨酸、2g丝氨酸、1g苏氨酸、0.6g色氨酸、1.5g缬氨酸和0.5gβ-丙氨酸；每升所述生长因子a由以下配方的组分组成：2g L-胱氨酸和2mL盐酸；每升所述生长因子b由以下配方的组分组成：6.5g烟酸、0.5g无水硫酸铜、0.15g庚二酸、30mL盐酸、200g七水硫酸镁、0.8g七水硫酸锌和0.393g四水氯化锰；每升所述生长因子c由以下配方的组分组成：0.1g维生素B1、0.75g维生素B5和0.075g维生素B6。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基，其特征在于，所述发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基、基础营养液、生长因子a、生长因子b和生长因子c均使用50℃-60℃的注射用水加以配制。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：①、将酪氨酸用浓度为20wt％的氢氧化钠溶解，重量体积比为10％，得到酪氨酸溶液；
②、在容器中加入适量50℃-60℃的注射用水，按设定配方依次准确称取或量取乙酸、一水麦芽糖、乳酸钠、步骤①制得的酪氨酸溶液、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾加入该注射用水中混匀，得到初混液；
③、待初混液降至室温，按设定配方依次准备量取基础营养液、生长因子a、生长因子b和生长因子c加入其中，充分混匀后用注射用水定容，调节pH至7.4±0.2，混合均匀，得到待分层液；
④、往待分层液中加入氯化钙，充分溶解后静置30min至分层，用硅胶管虹吸上清液，经除菌过滤后即得发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基。
4.一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)、培养基配制
配制一定量的生长因子d以及权利要求1至2中任意一项所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基；所述生长因子d为10g/L的酵母提取物溶液；生长因子d的配制方法：量取适量55℃-60℃注射用水，按酵母提取物溶液为10g/L的配方加入酵母提取物，溶解后用同样的注射用水定容后混匀；
(二)、摇瓶培养
一代液体摇瓶：开启一支发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种，菌种来自美国典型培养物保藏中心，菌株编号为ATCC39255或ATCC39526或ATCC11049或ATCC51926或ATCC51280，接种入50mL 发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基中，加入2.5mL生长因子d，在36.5±0.5℃、100-300rpm的条件下摇瓶培养，直至OD600在1.0以上，收获一代液体摇瓶菌液；
二代液体摇瓶：接种一代液体摇瓶菌液1.5mL入500mL 发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种的液体培养基中，加入25mL生长因子d；此为二代液体摇瓶菌液，在36.5±0.5℃、100-300rpm的条件下摇瓶培养，直至OD600在2.0以上，收获二代液体摇瓶菌液；
(三)、生物反应器培养
种子罐培养：接种全部二代液体摇瓶菌液入7000mL 发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基中，在36.5±0.5℃、200-600rpm、溶氧20％以上的条件下培养，直至OD600在10.0以上，收获种子罐菌液；
生产罐培养：接种全部种子罐菌液入60000mL 发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基中，在36.5±0.5℃、100-300rpm、溶氧20％以上的条件下培养，直至OD600在40.0以上，收获生产罐菌液，即完成发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种的发酵培养。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1894399A (zh) * | 2003-12-12 | 2007-01-10 | 圣诺菲·帕斯图尔有限公司 | 白喉毒素的制备 |
| CN101180313A (zh) * | 2005-03-23 | 2008-05-14 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 用于生产白喉毒素的发酵方法 |
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| CN106661587A (zh) * | 2014-01-31 | 2017-05-10 | 法纳生物解决办法有限责任公司 | Crm197和相关蛋白的表达和纯化 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN101180313A (zh) * | 2005-03-23 | 2008-05-14 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 用于生产白喉毒素的发酵方法 |
| CN106661587A (zh) * | 2014-01-31 | 2017-05-10 | 法纳生物解决办法有限责任公司 | Crm197和相关蛋白的表达和纯化 |
| CN104027797A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-09-10 | 山东亦度生物技术有限公司 | 一种白喉疫苗的制备方法 |
| CN104263678A (zh) * | 2014-09-02 | 2015-01-07 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种白喉杆菌培养基及应用其制备白喉类毒素的方法 |
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Non-Patent Citations (2)
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| Optimization of casein-based semisynthetic medium for growing of toxigenic Corinebacterium diphtheriae in a fermenter;Andrey I Tchorbanov等;《Can J Microbiol》;20041031;第50卷(第10期);全文 * |
| 白喉杆菌发酵产毒过程中影响因素的分析;姚雷等;《中国生物制品学杂志》;20190420;全文 * |
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