CN114806973B - 一种提高crm197蛋白产量的生长因子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种提高crm197蛋白产量的生长因子及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种提高CRM197蛋白产量的生长因子及其制备方法和应用。本申请的生长因子，为一混合液，每升所述混合液包括以下重量的组分：酵母浸粉/酵母浸膏10‑200g，瓜氨酸0.1‑3g，2‑80g含三价铁离子的试剂。该生长因子能使CRM197菌高效表达，便于较好地应用于CRM197菌发酵培养中以获得高产量的CRM197蛋白。

Description

一种提高CRM197蛋白产量的生长因子及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及微生物培养技术领域，更具体地说，它涉及一种提高CRM197蛋白产量的生长因子及其制备方法和应用。
背景技术
白喉毒素是白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)产生的蛋白质外毒素。CRM197蛋白为白喉毒素的无毒形式，由不产毒噬菌体β197tox感染的白喉棒杆菌(CRM197菌)产生，其在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，是一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。
现有制备CRM197蛋白的方法，主要通过发酵培养CRM197菌，从CRM197菌的培养物纯化而得。然而，在实际发酵培养过程中，无论CRM197菌的繁殖量过多或过少，其生产收获的CRM197蛋白产量均处于一个较低的水平。因此，如何有效提高CRM197菌的蛋白产量，是目前急需解决的技术难题。
发明内容
为了有效提高CRM197菌的蛋白产量，本申请提供一种提高CRM197蛋白产量的生长因子及其制备方法和应用，该生长因子能使CRM197菌高效表达，便于较好地应用于CRM197菌发酵培养中以获得高产量的CRM197蛋白。
第一方面，本申请提供一种提高CRM197蛋白产量的生长因子，为一混合液，每升所述混合液包括以下重量的组分：酵母浸粉/酵母浸膏10-200g，瓜氨酸0.1-3g，2-80g含三价铁离子的试剂。
本申请的生长因子中，酵母浸粉/酵母浸膏是以高蛋白酵母或啤酒酵母为原料，经自溶、酶解、浓缩等工艺制成，富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸、维生素及微量元素等营养成分，有助于CRM197菌快速吸收利用以表达分泌CRM197蛋白。
瓜氨酸是精氨酸生物合成的前体物质，本申请使用瓜氨酸与酵母浸粉/酵母浸膏合用能有效提高CRM197蛋白的产量，这可能是由于瓜氨酸能清除CRM197菌吸收营养物质时产生的氨毒，保证该蛋白的稳定存在于培养物中，与此同时瓜氨酸还能帮助CRM197菌产生能量以大量表达分泌CRM197蛋白。
铁离子对大多数微生物的生长至关重要，其作用于微生物体内酶的活力中心，介导氧化还原反应中动力学上自身难以发生的电子传递反应。本申请的生长因子中添加含三价铁离子的试剂，其能为CRM197菌提供生长所需的铁离子，保证CRM197菌的生命力。此外，本申请中含三价铁离子的试剂与瓜氨酸配伍，能有效提高CRM197蛋白的产量，这可能是由于铁离子介导的电子传递反应能同步加快CRM197菌对瓜氨酸的利用。
因此，本申请的生长因子中，三种组分相辅相成，能有效大量表达分泌CRM197蛋白，并保证该CRM197蛋白稳定存在于对应培养物中，由此能较好地应用于CRM197菌发酵培养中以获得高产量的CRM197蛋白。另外，三种组分使用必须适量，添加量过低起不到高效表达CRM197蛋白的目的，添加量过多又会拟制CRM197菌的生长和CRM197蛋白的表达。
优选的，所述含三价铁离子的试剂为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁及其水合物中的一种或多种的混合物。
通过采用上述技术方案，氯化铁、硫酸铁和硝酸铁都能在水中电离出三价铁离子，并维持相对稳定，因此将其作为本申请的进一步优选。
优选的，所述含三价铁离子的试剂包括硫酸铁和硝酸铁，所述硫酸铁和硝酸铁的重量比为1:3。
通过采用上述技术方案，经过试验发现，本申请使用硫酸铁和硝酸铁按重量比为1:3配制的试剂，其收获的CRM197蛋白含量明显高于其他。这可能是由于氯化铁、硫酸铁和硝酸铁在电离出三价铁离子的同时还会对应电离出氯离子、硫酸根离子和硝酸根离子，而不同离子对CRM197菌生长活性的作用不同，进而导致不同含三价铁离子的试剂对提高CRM197蛋白产量的效果不同。
优选的，所述酵母浸粉/酵母浸膏与所述瓜氨酸的重量比为100:1。
通过采用上述技术方案，若瓜氨酸过多，容易使精氨酸合成过多，反而会促进CRM197菌进行繁殖，若瓜氨酸过少，则难以发挥其提高蛋白产量的功能，按照本申请的重量比配制酵母浸粉/酵母浸膏和瓜氨酸，能够获得产量更高的CRM197蛋白，因此将其作为进一步的优选。
第二方面，本申请提供一种生长因子的制备方法，包括以下步骤：取适量注射用水，加入酵母浸粉/酵母浸膏10-200g分散均匀后，再加入瓜氨酸0.1-3g和含三价铁离子的试剂2-80g充分溶解，继续加入注射用水至接近1L，调节pH至7.5±0.5，继续加入注射用水定容至1L，除菌过滤或高压湿热灭菌后即收获所述生长因子。
通过采用上述技术方案，酵母浸粉倒入水中后因其表面张力而会发生团聚，酵母浸膏的密度大于水，将其加入水中后会沉淀在水底，待酵母浸粉/酵母浸膏分散均匀后再加入瓜氨酸以及含三价铁离子的试剂，有助于各组分均匀分散，最后经pH调节和除菌过滤，由此获得的生物因子能直接用于CRM197菌的发酵培养。
第三方面，本申请提供一种生长因子在CRM197菌发酵培养中的应用，能获得高产量的CRM197蛋白。
优选的，所述生长因子适于CRM197菌在摇瓶培养和/或种子罐培养和/或生产罐培养时添加。
优选的，CRM197菌开始摇瓶培养和/或种子罐培养和/或生产罐培养时，按液体培养基体积的0.01-1％的添加量加入所述生长因子。
优选的，CRM197菌在摇瓶培养、种子罐培养以及生产罐培养时，所述生长因子的总添加量均≤5％。
通过采用上述技术方案，在摇瓶培养时，生长因子有助于促使菌种大量繁殖，在种子罐培养和生产罐培养时，菌种已经扩增到一定数量，此时加入本申请的生长因子可以实现蛋白的大量表达和分泌。但本申请的生长因子在实际使用过程中，添加量过多反而会降低CRM197蛋白的产量，这可能是过多的生长因子促使菌种趋于繁殖，减少蛋白的产量；此外，因菌种数量的增多其代谢产物也随之增多，进而使产量本就减少的蛋白进一步减产。若添加量过少，该生长因子则难以为菌种提供充足的养分，进而使蛋白产量提升有效。对此，发明人经过大量实验验证，生长因子在菌种开始培养时以0.01-1％的添加量为宜，总添加量控制在≤5％。
优选的，CRM197菌进行生产罐培养过程中，当OD600达到15.0-18.0时，按液体培养基体积的0.01-1％的添加量加入所述生长因子；当OD600≥30.0时，以每小时按液体培养基体积的0.01-0.02％的速率加入所述生长因子。
通过采用上述技术方案，当OD600达到15.0-18.0时，CRM197菌已经繁殖到一定数量，此时补充加入设定量的生长因子，有助于蛋白大量表达分泌；当OD600≥30.0时，菌种发酵效率放缓，产蛋白能力下降，只需补入少量的生长因子即可。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请的生长因子采用酵母浸粉/酵母浸膏、瓜氨酸和含三价铁离子的试剂，三者相辅相成能使CRM197菌高效表达，便于较好地应用于CRM197菌发酵培养中以获得高产量的CRM197蛋白。
2、本申请的生长因子中，酵母浸粉/酵母浸膏与瓜氨酸的重量比优选为100:1，含三价铁离子的试剂包括按重量比为1:3的硫酸铁和硝酸铁，能进一步提高CRM197蛋白的产量。
3、本申请的生长因子按设定添加量应用于CRM197菌发酵培养的种子罐培养和生产罐培养中，能够有效发挥其作用，由此获得高产量的CRM197蛋白。
具体实施方式
原料准备
1、CRM197菌种
本申请中CRM197菌种来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，菌株编号为ATCC39255。除此之外，本申请的CRM197菌种还可以选用菌株编号为ATCC39526、ATCC11049、ATCC51926、ATCC51280等其他菌种。在使用上述菌种之前，先将其使用液体培养基1mL进行复苏活化。
2、液体培养基
每升由以下配方的组分配置而成：250mL基础营养液、7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、0.5g酪氨酸、1.96g磷酸二氢钾、5.1g磷酸氢二钾、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b、8mL生长因子c和1.3g氯化钙，余量为水。
其中，每升基础营养液由以下配方的组分组成：2g精氨酸、2g天冬酰胺、0.5g门冬氨酸、0.5g谷氨酸、2gL-谷氨酰胺、0.5g甘氨酸、1.5g组氨酸、2gL-异亮氨酸、2g亮氨酸、2g赖氨酸盐酸盐、0.6g甲硫氨酸、1g苯丙氨酸、2g脯氨酸、2g丝氨酸、1g苏氨酸、0.6g色氨酸、1.5g缬氨酸和0.5gβ-丙氨酸，余量为水；
每升生长因子a由以下配方的组分组成：2g L-胱氨酸和2mL盐酸，余量为水；
每升生长因子b由以下配方的组分组成：6.5g烟酸、0.5g无水硫酸铜、0.15g庚二酸、30mL盐酸、200g七水硫酸镁、0.8g七水硫酸锌和0.393g四水氯化锰，余量为水；
每升生长因子c由以下配方的组分组成：0.1g维生素B1、0.75g维生素B5和0.075g维生素B6，余量为水。
上述液体培养基的制备方法，包括以下步骤：
①、将0.5g酪氨酸用浓度为20wt％的氢氧化钠溶解，比例为10％(W/V)，得到酪氨酸溶液；
②、在容器中加入适量55℃(允许在50℃-60℃之间波动)的注射用水，依次准确称取或量取7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、步骤①制得的全部酪氨酸溶液、1.96g磷酸二氢钾和5.1g磷酸氢二钾加入该注射用水中混匀，得到初混液；
③、待初混液降至室温，依次准备量取25L基础营养液、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b和8mL生长因子c加入其中，充分混匀后用注射用水定容，用浓度为20wt％的氢氧化钠调节pH至7.4，混合均匀，得到待分层液；
④、往待分层液中加入1.3g氯化钙，充分溶解后静置30min至分层，用硅胶管虹吸上清液，经除菌过滤后即得液体培养基。
以下结合实施例和对比例对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1
一种提高CRM197蛋白产量的生长因子,其制备方法包括以下步骤：
取适量注射用水，加入酵母浸粉(购自OXIOD)100g分散均匀后，再加入瓜氨酸1g、硫酸铁10g和硝酸铁30g充分溶解，继续加入注射用水至接近1L，调节pH至7.5(允许在±0.5范围内波动)，继续加入注射用水定容至1L，除菌过滤后即收获生长因子。
将上述生长因子应用于CRM197菌的发酵培养中，其发酵培养方法包括以下步骤：
(一)、摇瓶培养
1、一代液体摇瓶：
开启一支CRM197菌种，接种入50mL液体培养基中，按液体培养基体积的0.5％加入0.25mL生长因子，在36.5±0.5℃、200rpm(允许在100-300rpm之间波动)的条件下摇瓶培养，直至OD600在1.0以上，收获一代液体摇瓶菌液。
2、二代液体摇瓶：
接种一代液体摇瓶菌液1.5mL入500mL液体培养基中，按液体培养基体积的0.5％加入2.5mL生长因子，此为二代液体摇瓶菌液，在36.5±0.5℃、200rpm(允许在100-300rpm之间波动)的条件下摇瓶培养，直至OD600在2.0以上，收获二代液体摇瓶菌液。
(二)、生物反应器培养
3、种子罐培养：
接种全部二代液体摇瓶菌液入7000mL液体培养基中混合为菌种培养液，控制温度为36.5±0.5℃、搅拌速度为200-600rpm、溶氧＞20％的条件下培养，直至OD600值＞10.0，收获种子罐菌液；
种子罐开始培养时，按液体培养基体积的0.5％加入35mL生长因子混合均匀。
4、生产罐培养：
接种全部种子罐菌液入60000mL液体培养基中混合为菌种发酵液，控制温度为36.5±0.5℃、搅拌速度为200-600rpm、溶氧＞20％的条件下培养，培养至OD600值＞40.0时停止培养，收获生产罐菌液，即完成CRM197菌种的发酵培养；
生产罐开始培养时，按液体培养基体积的0.5％加入300mL生长因子混合均匀；
当OD600达到15.0-18.0时，按液体培养基体积的0.5％的添加量加入300mL生长因子混合均匀；
当OD600≥30.0时，以每小时按液体培养基体积的0.01％的速率加入生长因子混合均匀；
实施例2-5
实施例2-5在实施例1的基础上，对组分用量进行调整，具体调整情况参见下表一。
表一实施例1-5的生长因子(1L)的配料表(单位为g)
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
酵母浸粉 100 10 50 160 200
瓜氨酸 1.0 0.1 0.5 1.6 2.0
硫酸铁 10 0.5 5 16 20
硝酸铁 30 1.5 15 48 60
实施例6
本实施例在实施例1的基础上，将酵母浸粉替换为酵母浸膏。
对比例
对比例1
本对比例在实施例1的基础上，未使用生长因子。
对比例2
本对比例在实施例1的基础上，其使用的生长因子中未添加瓜氨酸。
对比例3
本对比例在实施例1的基础上，其使用的生长因子中，将瓜氨酸替换为精氨酸。
对比例4
本对比例在实施例1的基础上，其使用的生长因子中未添加硫酸铁和硝酸铁。
对比例5
本对比例在实施例1的基础上，其使用的生长因子中将含三价铁离子的试剂(硫酸铁和硝酸铁)均替换为硫酸亚铁。
性能检测试验
按实施例1-6以及对比例1-5的方法对应发酵11个批次的CRM197菌种，其批号对应为A202205001-A202205006以及D202205001-D202205005，其收获的生产罐菌液按2015版《中国药典》中记载的絮状单位(Lf)测定法对CRM197蛋白产量加以测定。
其中，絮状单位是评价蛋白表达水平的直接指标，表示发酵培养液中所含特定蛋白的浓度水平，且絮状蛋白水平越高，蛋白的表达量也越高。测定结果参见下表二。
表二实施例1-6、对比例1-4的CRM197蛋白产量的检测结果
参见表二，结合实施例1-6与对比例1的检测结果可以得到，添加本申请的生物因子能有效提高最终OD600值和絮状单位，可见本申请的生长因子能够促使CRM197菌体繁殖并表达分泌CRM197蛋白。
其中，随着生长因子浓度的增加，最终OD600值呈上升趋势，絮状单位呈先上升后下降的趋势，且絮状单位的下降趋势逐步加大。这可能是由于添加过多的生长因子使得菌体趋于繁殖扩增，进而导致菌体怠于表达分泌蛋白。此外，CRM197菌种大量繁殖产生CRM197蛋白的同时，还会产生降解CRM197蛋白的物质，进而使CRM197蛋白的收获量进一步降低。
结合实施例1与对比例2-6的检测结果可以得到，本申请的生长因子中，酵母浸粉/酵母浸膏、瓜氨酸和含三价铁离子的试剂需要同时使用才能有效大量表达分泌CRM197蛋白，并保证该CRM197蛋白稳定存在于对应培养物中，由此能较好地应用于CRM197菌发酵培养中以获得高产量的CRM197蛋白。
综合上述实施例1-6的检测结果，本申请将实施例1作为上述实施例的优选。
实施例7-11
实施例7-11是在实施例1的基础上，对含三价铁离子的试剂进行调整，具体调整情况参见下表三。
表三实施例1、7-11的含三价铁离子的试剂的配料表(单位：g)
实施例1 实施例7 实施例8 实施例9 实施例10 实施例11
硫酸铁 10 40 20 10 / 10
硝酸铁 30 / 20 20 30 /
氯化铁 / / / 10 10 30
性能检测试验
按实施例7-11方法对应发酵5个批次的CRM197菌种，其批号对应为A202205006-A202205010，其收获的生产罐菌液按2015版《中国药典》中记载的絮状单位(Lf)测定法对CRM197蛋白产量加以测定，检测结果参见下表四。
表四实施例1、6-10的CRM197蛋白产量的检测结果
参见表四，本申请使用不同的含三价铁离子的试剂，对CRM197菌的发酵培养效果有一定影响。其中，使用硫酸铁和硝酸铁按重量比为1:3配制的试剂(实施例1)，其最终OD600值和絮状单位均高于其他含三价铁离子配制的试剂(实施例7-11)，可见实施例1对于发酵的生产罐菌液中菌体繁殖量更高，蛋白产量更多。这可能是由于氯化铁、硫酸铁和硝酸铁在电离出三价铁离子的同时还会对应电离出氯离子、硫酸根离子和硝酸根离子，而不同离子对CRM197菌生长活性的作用不同。其中。铁离子浓度越高，硫酸根离子和氯离子越低，CRM197菌体能大量繁殖并有效分泌CRM197蛋白，由此获得高产量的CRM197蛋白。
实施例12-13
实施例12-13是在实施例1的基础上，对酵母浸粉/酵母浸膏和瓜氨酸的配比进行调整，具体调整情况参见下表五。
表五实施例1、12-13的生长因子(1L)的配料表(单位为g)
实施例1 实施例12 实施例13
酵母浸粉 100 100 100
瓜氨酸 1.0 2.0 0.5
硫酸铁 10 10 10
硝酸铁 30 30 30
性能检测试验
按实施例12-13方法对应发酵2个批次的CRM197菌种，其批号对应为A202205012-A202205013，其收获的生产罐菌液按2015版《中国药典》中记载的絮状单位(Lf)测定法对CRM197蛋白产量加以测定，检测结果参见下表六。
表六实施例1、12-13的CRM197蛋白产量的检测结果
试验方法 发酵批次 最终OD600 絮状单位Lf/mL
实施例1 A202205001 54.2 245
实施例12 A202205012 55.0 232
实施例13 A202205013 53.6 230
参见表六，实施例12相对于实施例1增加了瓜氨酸的添加量，虽然提高了其最终OD600值，但并未获得高产量的CRM197蛋白，这可能是由于过多的瓜氨酸使得精氨酸合成过多，进而促使CRM197菌趋于繁殖扩增。实施例13相对于实施例1减少了瓜氨酸的添加量，其最终OD600值和絮状单位值均低于实施例1。由此可见，按照本申请100:1的重量比配制酵母浸粉/酵母浸膏和瓜氨酸，能够获得产量更高的CRM197蛋白，因此将其作为进一步的优选。
实施例14-23
实施例14-23是在实施例1的基础上，对生长因子的添加量进行调整，具体调整情况参见下表七。
表七实施例1、14-23的生长因子的添加量
性能检测试验
按实施例14-23方法对应发酵10个批次的CRM197菌种，其批号对应为A202205014-A202205023，其收获的生产罐菌液按2015版《中国药典》中记载的絮状单位(Lf)测定法对CRM197蛋白产量加以测定，检测结果参见下表八。
表八实施例1、14-23的CRM197蛋白产量的检测结果
试验方法 发酵批次 最终OD600 絮状单位Lf/mL
实施例1 A202205001 54.2 245
实施例14 A202205014 53.5 235
实施例15 A202205015 54.0 238
实施例16 A202205016 53.8 232
实施例17 A202205017 56.4 236
实施例18 A202205018 50.3 220
实施例19 A202205019 51.0 224
实施例20 A202205020 51.5 228
实施例21 A202205021 52.0 230
实施例22 A202205022 52.8 225
实施例23 A202205023 53.0 231
参见表八，结合实施例1、14-23的检测结果可得，在摇瓶培养、种子罐开始培养和生产罐开始培养时均加入液体培养基体积的0.01-1.0％的生长因子，且保持每个培养环节中生长因子的总添加量≤5％，并在生产罐培养时根据OD值投入设定量的生长因子，其获得的最终OD600值和絮状单位相对较高(实施例1/14-17优于实施例18-23)。
这可能是由于，在种子罐培养时，CRM197菌株繁殖扩增的同时还会分泌一定量的蛋白，因此在其开始培养时便加入生长因子，不但能为菌株表达蛋白提供营养物质，还能使其产生的蛋白稳定存在于培养物中。在此基础上，本申请在生产罐开始培养时加入生长因子，能够进一步减缓菌体繁殖产生的代谢物对CRM197蛋白的降解作用。当OD600达到15.0-18.0时，菌种开始吸收生长因子大量表达CRM197蛋白，此时加入适量的生长因子能为菌种提供充足的营养物质。待OD600≥30.0，菌种生产蛋白的能力下降，此时以每小时按液体培养基体积的0.01-0.02％的速率加入生长因子，能够保持培养物中维持一定浓度的生长因子，保证CRM197蛋白的稳定性。
其中，实施例1的最终OD600值达54.2、蛋白产量达245Lf/mL，明显优于其他实施例，因此将其作为本申请的优选实施例。
综上，本申请的生长因子采用酵母浸粉/酵母浸膏、瓜氨酸和含三价铁离子的试剂，三者相辅相成能使CRM197菌大量繁殖并高效表达，将其应用于CRM197菌发酵培养中收获的生产罐菌液中，最终OD600值可达50.0以上，絮状单位可达220Lf/mL以上，由此具有提高CRM197蛋白产量的特点。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (7)

1.一种生长因子在白喉棒杆菌发酵培养生产CRM197蛋白中的应用，其特征在于，所述生长因子在白喉棒杆菌摇瓶培养和/或种子罐培养和/或生产罐培养时添加，所述生长因子为一混合液，每升所述混合液由以下重量的组分组成：酵母浸粉/酵母浸膏10-200g，瓜氨酸0.1-3g，2-80g含三价铁离子的试剂，余量为水；所述含三价铁离子的试剂为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁及其水合物中的一种或多种的混合物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述含三价铁离子的试剂为硫酸铁和硝酸铁的混合物，所述硫酸铁和硝酸铁的重量比为1:3。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述酵母浸粉/酵母浸膏与所述瓜氨酸的重量比为100:1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生长因子的制备方法包括以下步骤：
取适量注射用水，加入酵母浸粉/酵母浸膏10-200g分散均匀后，再加入瓜氨酸0.1-3g和含三价铁离子的试剂2-80g充分溶解，继续加入注射用水至接近1L，调节pH至7.5±0.5，继续加入注射用水定容至1L，除菌过滤或高压湿热灭菌后即收获所述生长因子。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：白喉棒杆菌开始摇瓶培养和/或种子罐培养和/或生产罐培养时，按液体培养基体积的0.01-1%的添加量加入所述生长因子。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：白喉棒杆菌在摇瓶培养、种子罐培养以及生产罐培养时，所述生长因子的总添加量均≤5%。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：白喉棒杆菌进行生产罐培养过程中，当OD600达到15.0-18.0时，按液体培养基体积的0.01-1%的添加量加入所述生长因子；当OD600≥30.0时，以每小时按液体培养基体积的0.01-0.02%的速率加入所述生长因子。
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