CN104593306A - 一种大肠埃希氏菌株hy-05c高密度培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养方法，通过对菌种培养培养基和培养工艺的优化，使单位体积培养液中菌体细胞浓度提高40-50％，天冬氨酸酶酶活提高70-80％，从而提高单位体积细胞培养液转化富马酸生产天冬氨酸转化效率。与原工艺相比，本发明大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养工艺，采用三级培养，二级种子液采用5-10％的大接种量接入最终转化用培养液，使获得的转化用培养液菌体更加整齐，酶活持续时间延长，有利于提高后续转化效率。

Description

一种大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养方法。

背景技术

天冬氨酸又称氨基丁二酸，是构成机体蛋白质的主要氨基酸之一。天冬氨酸是生命体中合成赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的前体。L-天冬氨酸参与鸟氨酸循环，促进氨和二氧化碳生成尿素，降低血液中氨和二氧化碳的含量，增强肝功能，可用做氨解毒剂、肝机能促进剂、疲劳恢复剂等医药用品和各种清凉饮料的添加剂。天冬氨酸与L-苯丙氨酸合成的二肽甜味剂阿斯巴甜，甜度高、热量低，适于糖尿病、高血压等患者，安全可靠；以L-天冬氨酸为原料合成的新型强力甜味剂纽甜，不仅适用于包括儿童、孕妇、哺乳期妇女以及肥胖、心血管病和糖尿病患者内的所有人群，还适用于不能食用阿斯巴甜的苯酮尿症患者。

目前L-天冬氨酸主要是由产L-天冬氨酸的游离整体细胞一步转化富马酸生产。生产过程大体如下：首先培养产L-天冬氨酸酶的菌体细胞，然后再将菌体培养液加入到含有富马酸铵的转化体系中，富马酸铵在L-天冬氨酸酶的作用下转化生成L-天冬氨酸铵，转化完成后再通过酸解、等电点结晶等得工序得到成品L-天冬氨酸。提高单位体积菌体培养液的酶活力是提高转化效率的关键。提高单位体积培养液中的酶活性主要有两种方法，一是通过菌种诱变提高菌体的产酶能力。另外，就是通过培养基和培养条件的优化，提高单位体积培养液中产酶菌体细胞个数，即增加培养液中菌体细胞浓度。

申请人拥有游离整体细胞转化生产L-天冬氨酸的专利菌株(大肠埃希氏菌株HY-05C，保藏编号为CGMCC No.5450)和技术(专利号：201110382584.X)，本发明在原有技术的基础上，提供一种提高大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度(高细胞浓度)的培养方法，提高单位体积培养液中产酶菌体细胞的浓度(数量)，进而提高单位体积培养液中的L-天冬氨酸酶活力。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种高密度培养大肠埃希氏菌株HY-05C的培养基和培养方法，通过提高单位体积培养液中菌体细胞浓度来提高培养液天冬氨酸酶酶活量，从而提高单位体积细胞培养液转化富马酸生产天冬氨酸转化效率。

所述的大肠埃希氏菌株HY-05C来自烟台恒源生物股份有限公司前期选育的L-天冬氨酸游离细胞转化法生产菌(记载在申请号为CN201110382584.X，申请日为：2011年11月25日，发明名称为：“高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌株及其应用”。大肠埃希氏菌株HY-05C保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5450，保藏日期为2011年11月8日。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，将大肠埃希氏菌株HY-05C进行液体培养，包括如下步骤：

1)菌株HY-05C斜面菌种活化：将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到装有活化培养基试管斜面中，35-37℃培养24-36小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化用试管斜面中，35-37℃培养24-36小时，再转接另一斜面，35-37℃培养24-36小时即得活化斜面菌种。

2)制备菌株HY-05C一级种子液：取步骤1)得到的大肠埃希氏菌株HY-05C活化斜面菌种，接种到装有高密度培养培养基的三角瓶中进行培养，200rpm、35～37℃、摇床培养6-8小时，得到一级种子液。

3)制备菌株HY-05C二级种子液：取步骤2)得到的一级种子液以体积比1-2‰接种量转接到装有高密度培养培养基发酵罐中进行扩大培养，控制通风比0.3-0.6vvm，相对溶解氧浓度20-40％，搅拌转速根据溶解氧需求适当调节，罐压0.05-0.08MPa，35～37℃培养7-9小时，得到大肠埃希氏菌株HY-05C二级种子液。

4)制备菌株HY-05C转化用培养液：将步骤3)培养好的大肠埃希氏菌株HY-05C二级种子液以体积比5-10％接种量转接到高密度培养培养基中进行扩大培养，控制通风比0.15-0.25vvm，相对溶解氧浓度20-40％，搅拌转速根据溶解氧需求适当调节，罐压0.05-0.08MPa，35～37℃培养8-10小时，制得大肠埃希氏菌株HY-05C转化用培养液。

上述的活化斜面培养基所必需的营养物质包括(g/L)：富马酸铵10；牛肉膏10；蛋白胨7；氯化钠5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2，琼脂15～20，pH7.0～7.2。

上述的高密度培养培养基所必需的营养物质包括(g/L)：富马酸铵7～12；玉米干粉6～8；酵母粉1～4；蛋白胨6～8；氯化钠5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2，pH 6.0～7.5。

更优选地：富马酸铵10；玉米干粉8；酵母粉2；蛋白胨7；氯化钠5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2，pH 6.0。

上述高密度培养培养基是通过单因素和正交设计试验优化得到的，考察指标为单位体积培养液中的菌体量和天冬氨酸酶活力，优化过程见实施例4。

上述菌株HY-05C高密度培养的工艺控制参数(接种量、培养时间、通风量、相对溶解氧浓度)是通过培养试验优化确定的，考察指标为最终用于转化的培养液中单位体积的菌体量和天冬氨酸酶活力。具体优化过程见实施例4。

本发明的有益效果：

1.本发明通过对大肠埃希氏菌株HY-05C培养基和培养条件的优化，显著提高了大肠埃希氏菌株HY-05C转化用培养液中的菌体浓度和天冬氨酸酶酶活力，进而提高后续转化效率和设备利用率。

2.与原工艺相比，本发明大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养工艺，通过对培养基和培养条件的优化，单位体积培养液中菌体量较之前提高了40％-50％、天冬氨酸酶活力提高了70-80％，效果显著。

3.与原工艺相比，本发明大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养工艺，采用三级培养，增加二级种子液，采用10％大接种量接入最终培养大罐，不仅缩短了大罐培养时间，同时使得获得的培养液中的菌体生长更加整齐，相对酶活力明显增加，转化试验证明，相同体积的转化用培养液转化效率明显提高。

附图说明

图1菌株HY-05C培养基优化正交实验效应曲线图

图2菌株HY-05C一级种子液菌体浓度和天冬氨酸酶活变化曲线

图3菌株HY-05C二级种子液菌体浓度和天冬氨酸酶活变化曲线

图4菌株HY-05C转化用培养液菌体浓度和天冬氨酸酶活变化曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

本发明实施例中所涉及的菌种：大肠埃希氏菌株HY-05C，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5450，保藏日期为2011年11月8日。

实施例1

一种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，包括以下步骤：

1、菌种活化

将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到装有活化培养基(培养基配方(g/L)：富马酸铵10；牛肉膏10；蛋白胨7；氯化钠5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2，琼脂15～20，pH7.0～7.2)试管斜面中，35℃培养24小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化培养基试管斜面中，35℃培养24小时，再转接另一斜面，35℃培养24小时即得活化斜面菌种。

2、高密度培养培养基配制

按以下配方配制细胞培养培养基：富马酸10g/L，玉米干粉8g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨7g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氨水调节pH至6.0，定容，121℃下灭菌20分钟。

3、一级种子液的制备

取2支上述新鲜活化斜面菌种分别接入5L的摇瓶中，培养基装液量1200ml，200rpm，35℃，摇床培养8小时，培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0.468，得到一级种子液。

4、二级种子液的制备

将经上述培养获得的一级种子液(2×1000mL)转接到装有1.5m³高密度培养培养基的2m³培养罐中，调整罐压0.06MPa，通风比0.25vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧20％，35℃培养8小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0.498，得到二级种子液。

5、转化用培养液制备

将培养好的二级种子液(1.5m³)，转接到装有15m³高密度培养培养基的20m³培养罐中，调整罐压0.06MPa，通风比0.15，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧20％，35℃培养8小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0.468，菌体计数为2.68×10⁸Cfu/mL，测定培养液的天冬氨酸酶活达到8084U/mL。将该培养液用于富马酸/天冬氨酸转化生产。

实施例2

一种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，包括以下步骤：

1、菌种活化

将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到装有活化培养基斜面中，37℃培养36小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一个活化斜面中，重复上面操作，连续转接三次，即得活化斜面菌种。

2、高密度培养培养基配制

培养基按以下配方配制：富马酸8g/L；玉米干粉7g/L；酵母粉3g/L；蛋白胨6g/L；氯化钠5g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸镁0.2g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氨水调节pH至6.5。

3、一级种子液的制备

取2支新鲜活化斜面(180mm×18mm)分别接入5L的摇瓶中，培养基装液量800mL，200rpm，37℃，摇床培养8小时，培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0.517，得到一级种子液。

4、二级种子液的制备

将经上述培养获得的一级种子液(2×800mL)转接到装有1.5m³高密度培养培养基的2m³培养罐中，调整罐压0.07MPa，通风比0.25vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧40％，37℃培养9小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0.531，得到二级种子液。

5、转化用培养液的制备：

将培养好的二级种子液(1.5m³)，转接到装有15m³高密度培养培养基的20m³培养罐中，调整罐压0.07MPa，通风比0.2，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧40％，37℃培养10小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0.512，菌体计数为2.85×10⁸Cfu/mL，测定培养液的天冬氨酸酶活达到8513U/mL。将该培养液用于富马酸/天冬氨酸转化生产。

实施例3

一种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，包括以下步骤：

1、菌种活化

将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到活化斜面上，37℃培养32小时，连续转接三次，即得活化斜面菌种。

2、高密度培养培养基配制

培养基按以下配方配制：富马酸9g/L；玉米干粉8g/L；酵母粉2.5g/L；蛋白胨8g/L；氯化钠5g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸镁0.2g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氨水调节pH至7.0。

3、一级种子液的制备

取2支新鲜活化斜面分别接入5L的摇瓶中，培养基装液量1000mL，200rpm，37℃，摇床培养6小时，培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0.465，得到一级种子液。

4、二级种子液的制备

将经上述培养获得的一级种子液(2×1000mL)转接到装有1.5m³高密度培养培养基的2m³培养罐中，调整罐压0.08MPa，通风比0.3vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧30％，37℃培养9小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0.513，得到二级种子液。

5、转化用培养液的制备：

将培养好的二级种子液(1.5m³)，转接到装有15m³高密度培养培养基的20m³培养罐中，调整罐压0.08MPa，通风比0.25，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧30％，37℃培养10小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0.506，菌体计数为2.73×10⁸Cfu/mL，测定培养液的天冬氨酸酶活达到8352U/mL。将该培养液用于富马酸/天冬氨酸转化生产。

实施例4大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养基和培养条件优化

1、L-天冬氨酸酶的酶活测定方法

酶活定义：在45℃，pH值7.5条件下，每小时转化1微摩尔富马酸底物的酶量定义为一个酶活力单位U。

底物溶液配制：称取富马酸80g，硫酸镁0.1g，加入300mL蒸馏水搅拌均匀，缓慢加入浓氨水，搅拌，使溶液最终pH为7.0，全部转移至500ml容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度，既得16％的富马酸溶液。

酶活测定：取16％的富马酸溶液250mL于洁净的三角瓶中，三角瓶放入45℃水浴锅中预热10min，加入菌体培养液20mL，摇匀，再放入45℃水浴锅中，立即计时，取0时和1小时时转化液样品，按下面的方法分别测定反应液中富马酸含量。

取1:10硫酸溶液35mL于250mL三角瓶中，加入0.2mL转化液样品，加热至75～80℃，用0.02M高锰酸钾溶液滴定至微红，半分钟内不褪色，即为终点。读取消耗的高锰酸钾体积数，0时样品消耗体积记为V_空，反应1小时消耗体积记为V_样，按以下公式计算生物转化酶活力：

注：116-富马酸分子量；

2-每消耗1mL 0.02M高锰酸钾相当于2mg富马酸；

270-反应液总体积270mL；

1-反应时间1小时；

20-加入20mL培养液；

0.2-取0.2mL反应液进行测定。

2、培养液液OD值测定方法

将培养液稀释10倍，以蒸馏水作为空白对照，于640nm处测定吸光度(OD)。

3、大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养培养基优化

在原有培养基配方的基础上，对大肠埃希氏菌株HY-05C培养基进行进一步优化，提高单位培养液体积中的细胞数。通过单因素试验的结果选取富马酸铵、玉米干粉、酵母粉和蛋白胨四个对菌体生长和产酶影响较大的通过正交实验进行优化。正交实验设计及结果见表1，表2和图1。

表1 大肠埃希氏菌株HY-05C碳氮源正交实验水平表

表2 大肠埃希氏菌株HY-05C碳氮源正交实验直观分析表

从图1和表2可以看出，影响大肠埃希氏菌株HY-05C生长的无机盐主次顺序为：玉米干粉＞蛋白胨＞酵母粉＞富马酸铵，最佳配方和添加量为(g/L)：富马酸铵1，玉米干粉8，酵母粉2，蛋白胨7，氯化钠5，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.2。

4、培养基最佳pH的确定

在上述最佳培养基配方的基础上，调节培养基的初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0，杀菌后接种培养，测定培养液的菌体浓度(OD)和天冬氨酸酶酶活力。试验结果表明，培养基的初始pH在6.0～7.0之间时，对应的培养液OD值和酶活力最高。

5、菌株HY-05C一级种子培养时间确定

在确定了最佳培养基和初始pH后对大肠埃希氏菌株HY-05C一级种子液的生长曲线进行测定，以确定种子最佳转种时间，结果见图2。可以看出，菌体生长延滞期较短，2小时即进入对数生长期，8小时几乎达到最高点，酶活与菌体量同步增加。经转接试验确定一级种子培养6-8小时转种时间最佳。

6、二级种子最佳培养时间的确定

将培养好的一级种子按1‰～2‰的接种量接种到二级高密度培养基中培养，观察二级种子的菌体生长及天冬氨酸酶活变化情况，结果见图3。可以看出，因为接种量较低，二级种子延滞期比一级种子略长，但进入对数期后菌体量增加较快，培养10-12小时基本达到稳定期。通过转接试验，结果表明，二级种子培养6-8小时转接转化液培养时机最佳。

7、大肠埃希氏菌株HY-05C转化液用培养液制备

通过接种量试验发现，二级种子液转接转化用培养液，接种量控制5-10％，培养效果区别不大。图4为10％的接种量转化用培养液培养进程曲线。从图中可以看出，控制较大接种量菌体生长几乎没有延滞期，直接进入对数期，约10小时酶活达到高峰，转化试验表明采用8-10小时的培养液进行转化，转化效率最高。

上述结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (4)

1.一种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，其特征在于，将大肠埃希氏菌株HY-05C进行液体培养，包括如下步骤：

1)菌株HY-05C斜面菌种活化：将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到装有活化培养基试管斜面中，35-37℃培养24-36小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化用试管斜面中，35-37℃培养24-36小时，再转接另一活化斜面，35-37℃培养24-36小时即得活化斜面菌种；

2)制备菌株HY-05C一级种子液：取步骤1)得到的大肠埃希氏菌株HY-05C活化斜面菌种，接种到装有高密度培养培养基的三角瓶中进行培养，200rpm、35～37℃、摇床培养6-8小时，得到一级种子液；

3)制备菌株HY-05C二级种子液：取步骤2)得到的一级种子液以体积比1-2‰接种量转接到装有高密度培养培养基发酵罐中进行扩大培养，控制通风比0.3-0.6vvm，相对溶解氧浓度20-40％，搅拌，罐压0.05-0.07MPa，35～37℃培养7-9小时，得到大肠埃希氏菌株HY-05C二级种子液；

4)制备菌株HY-05C转化用培养液：将步骤3)培养好的大肠埃希氏菌株HY-05C二级种子液以体积比5-10％接种量转接到高密度培养培养基中进行扩大培养，控制通风比0.15-0.25vvm，相对溶解氧浓度20-40％，搅拌，罐压0.05-0.08MPa，35～37℃培养8-10小时，制得大肠埃希氏菌株HY-05C转化用培养液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述活化斜面培养基所必需的营养物质包括：富马酸铵10；牛肉膏10；蛋白胨7；氯化钠5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2，琼脂15～20，pH7.0～7.2，单位为g/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的高密度培养培养基所必需的营养物质包括：富马酸铵7～12；玉米干粉6～8；酵母粉1～4；蛋白胨6～8；氯化钠5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2，单位为g/L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的高密度培养培养基的优选方案为：富马酸铵10；玉米干粉8；酵母粉2；蛋白胨7；氯化钠5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2，pH 6.5,单位为g/L。