CN112126639A - 一种l-天门冬氨酸的制备方法 - Google Patents

一种l-天门冬氨酸的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112126639A
CN112126639A CN202011101738.9A CN202011101738A CN112126639A CN 112126639 A CN112126639 A CN 112126639A CN 202011101738 A CN202011101738 A CN 202011101738A CN 112126639 A CN112126639 A CN 112126639A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aspartic acid
escherichia coli
solution
valve
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011101738.9A
Other languages
English (en)
Inventor
陈沁�
张玉
武林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiyuan Huaibei Food Technology Co Ltd
Original Assignee
Jiyuan Huaibei Food Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiyuan Huaibei Food Technology Co Ltd filed Critical Jiyuan Huaibei Food Technology Co Ltd
Priority to CN202011101738.9A priority Critical patent/CN112126639A/zh
Publication of CN112126639A publication Critical patent/CN112126639A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本发明涉及制备L‑天门冬氨酸技术领域，具体涉及一种通过固定化含天门冬氨酸酶的大肠杆菌制备L‑天门冬氨酸的方法。本发明通过将大肠杆菌包埋于聚丙烯酰胺和角叉菜胶的复合载体中，以固定化含L‑天门冬氨酸酶的大肠杆菌细胞合成L‑天门冬氨酸，同时使用顺丁烯二酸调等电点，仅需要培养一批菌种就可以连续生产15‑20天，大幅提高了产品的稳定性，并且因顺丁烯二酸的酸性相对较弱，用顺丁烯二酸调等电点温和可控，不易造成因加酸失误导致溶液的pH值低于2.0的过等电点现象，减少对产品收率的影响，且即使出现过等电点现象，由于母液和冲洗液可以往复利用，不会造成物料损失，同时本发明方法还具有节约水资源和生产成本，废水处理压力小的特点。

Description

一种L-天门冬氨酸的制备方法
技术领域
本发明涉及制备L-天门冬氨酸技术领域，具体涉及一种通过固定化含天门冬氨酸酶的大肠杆菌制备L-天门冬氨酸的方法。
背景技术
天门冬氨酸(Aspartic acid)，化学名称为氨基丁二酸，是构成蛋白质的20 种基本氨基酸之一，在生化试剂和临床医学方面具有广泛的应用。
现有的L-天门冬氨酸采用游离法生产工艺，具体步骤如下：
1)在反应釜的纯净水中充入一定量的液氨；
2)将一定量的富马酸投入反应釜中完全溶解，调整pH值为7；
3)将培养好的具有高天门冬氨酸酶活力的大肠杆菌投入反应釜中；
4)维持反应温度35℃，直至富马酸完全转化为天门冬氨酸；
5)投入活性炭进行脱色和压滤，用时约4h；
6)注入硫酸，调节等电点，pH调节至2.2-2.5；
7)离心进行固液分离。
上述游离法中的等电点工艺使用硫酸调节，产生大量的硫酸铵废水，生产分离1吨L-天门冬氨酸一般产生4吨高浓度硫酸铵母液废水和8吨低浓度硫酸铵冲洗水，每吨L-天门冬氨酸共计产生各类废水约12吨，废水处理能耗大，成本高，这不仅对企业环保造成严重压力，也给自然环境造成严重危害。虽然许多企业采用三效浓缩的方法处理硫酸铵废水，制造硫酸铵肥料，但是由于废水存储量较大，设备能耗较高，大幅提高了企业的生产成本，加重企业运营负担。
此外，由于游离法的菌种培养采用种子罐与反应罐一对一培养法，菌种单罐培养不稳定，产酶活性不稳定，无法确保每一罐菌种产出的酶活性稳定，导致生产过程中经常出现反应不完全，需要另外补充菌种，造成生产延误并影响产品质量，严重影响企业生产进度和生产成本。该生产过程使用活性炭和压滤工艺，也导致生产时间和成本的增加。
以上菌种的培养和反应方式以及污水处理多年来一直困扰着L-天门冬氨酸的生产企业。
发明内容
本发明针对现有的L-天门冬氨酸的生产方法存在水消耗量大，废液处理压力大，及产品质量稳定性有待提高的问题，提供一种收率稳定、物料损失小、节约水资源、废水处理压力小的L-天门冬氨酸的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种L-天门冬氨酸的制备方法，包括以下步骤：
S1、以聚丙烯酰胺和角叉菜胶的混合物为载体，将含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌包埋于载体中，得到固定化细胞；以所述固定化细胞作为填料填充于交换柱中，得到固定化细胞柱。
优选的，载体中所述聚丙烯酰胺和角叉菜胶的质量比为3:1。
进一步地，大肠杆菌的包埋方法为：1g大肠杆菌细胞与1mL生理盐水混合制成菌悬浮，然后加入质量百分浓度为10-12％的载体溶液并搅拌混匀，制得大肠杆菌细胞质量百分浓度为2-2.5％的混合液，在持续搅拌下将混合液逐滴滴入100mL的0.2mol/L的CaCl2溶液中，得到包埋颗粒，包埋颗粒继续在0.2mol/L的CaCl2溶液中浸泡2h，然后过滤、洗涤、抽干，得到固定化细胞。
S2、使pH值为7的质量百分浓度为20％的富马酸铵水溶液经过所述固定化细胞柱，收集过柱液。
优选的，所述固定化细胞柱的柱温为49-51℃，pH为7，富马酸铵水溶液的通柱速度为2L/h。
进一步地，所述过柱液为L-天门冬氨酸铵水溶液。
S3、使用顺丁烯二酸调节过柱液的pH值至2.2-2.5，到达L-天门冬氨酸等电点时析出L-天门冬氨酸固体，固液分离，分别收集固体L-天门冬氨酸和母液。
进一步地，所述母液为顺丁烯二酸铵水溶液。
进一步地，步骤S3中，使用离心机进行固液分离，收集固体L-天门冬氨酸、母液和冲洗液，冲洗液合并至母液中。
S4、向母液中投入溴化铵和过硫酸铵，得到富马酸铵水溶液；然后再通过向富马酸铵水溶液中投入氨水和富马酸，将溶液调节为pH值为7的质量百分浓度为20％的富马酸铵水溶液。
以上所述的L-天门冬氨酸的制备方法，其中所述的含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌的培养方法为：
1、大肠杆菌的斜面培养
含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌用普通牛肉膏蛋白胨斜面培养。培养基由以下质量百分含量的各组分组成：牛肉膏0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl0.5％、琼脂2.0％、余量为H2O，将上述各组分完全溶解后，用1mol/L的NaOH调 pH7.0，分装于塑料帽试管中，1.05Kg/cm2灭菌30min后斜放成斜面，然后用大肠杆菌接种，于30℃培养箱中培养24h。得到斜面菌种。
进一步地，含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌为大肠杆菌AS1.881。
2、大肠杆菌的发酵培养
取斜面菌种接入发酵培养基中，接种量为5-10％(质量百分比)，培养温度为37℃，培养时间为24h。培养液经离心(10000r/min，10min)，生理盐水洗涤，得含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌湿细胞。
进一步地，所述发酵培养基的组成为泡敌溶液中含以下质量百分比的各组分：玉米浆1.8-2.2％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.145％，反丁烯二酸1％，并用氨水调节pH值至7.5。
进一步地，所述泡敌为Dowfax DF 104。
更进一步地，所述泡敌溶液中泡敌(消泡剂)的质量百分含量为0.1％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过将大肠杆菌包埋于聚丙烯酰胺和角叉菜胶的复合载体中，以固定化含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌细胞合成L-天门冬氨酸，同时使用顺丁烯二酸调等电点，仅需要培养一批菌种就可以连续生产15-20天，大幅提高了产品的稳定性，并且因顺丁烯二酸的酸性相对较弱，用顺丁烯二酸调等电点温和可控，不易造成因加酸失误导致溶液的pH值低于2.0的过等电点现象，减少对产品收率的影响，且即使出现过等电点现象，由于母液和冲洗液可以往复利用，不会造成物料损失，同时本发明方法还具有节约水资源和生产成本，废水处理压力小的特点。此外，用顺丁烯二酸调等电点，还可节约硫酸原料及预防硫酸作为危险品的高风险工序。
本发明方法制备L-天门冬氨酸，收率稳定，物料损失小，通过节约水、活性炭、菌种和酶的培养批次、硫酸、蒸汽、用电等方式，大幅降低产品的生产成本，可以实现同比每吨生产成本降低1000元以上。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
实施例1
本实施例提供一种L-天门冬氨酸的制备方法，包括大肠杆菌的培养、大肠杆菌固定化细胞的制备、酶催化反应、后处理步骤。具体如下：
一、含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌的培养
(一)大肠杆菌AS1.881的斜面培养
含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌AS1.881用普通牛肉膏蛋白胨斜面培养。培养基由以下质量百分含量的各组分组成：牛肉膏0.5％、蛋白胨1.0％、 NaCl0.5％、琼脂2.0％、余量为H2O，将上述各组分完全溶解后，用1mol/L 的NaOH调pH7.0，分装于塑料帽试管中，1.05Kg/cm2灭菌30min后斜放成斜面，然后用大肠杆菌接种，于30℃培养箱中培养24h。得到斜面菌种。
(二)大肠杆菌AS1.881的发酵培养
发酵培养基的组成为泡敌溶液(0.1％的Dowfax DF 104)中含以下质量百分比的各组分：玉米浆1.8-2.2％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.145％，反丁烯二酸1％，并用氨水调节pH值至7.5。
取斜面菌种接入发酵培养基中，接种量为5％(质量百分比)，培养温度为37℃，培养时间为24h。培养液经离心(10000r/min，10min)，生理盐水洗涤，得含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌湿细胞。
生产车间的具体操作如下：
1、配料准备工作
1.1检查配料罐，搅拌配料泵运转是否正常，减速机油位是否正常。
1.2检查配料罐、种子罐是否干净。
1.3检查所需原料、辅料是否齐全，并准备齐全。
1.4关闭配料罐的出料阀及排污阀。
2、配料
2.1配方：玉米浆1.8-2.2％，硫酸镁0.02产％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.145％，反丁烯二酸1％，泡敌溶液500mL。
2.2按定容1.2m3按配方称取玉米浆、硫酸镁、磷酸二氢钾、NaCl、反丁烯二酸、泡敌溶液等物料。
2.3打开配料罐进水阀加入0.9m3，把称好的玉米浆、硫酸镁产、磷酸二氢钾、氯化钠、反丁烯二酸，并用氨水调pH值为7.0-7.2，定容1.2m3(考虑蒸汽冷凝水100L)备用。
3、种子罐灭菌
3.1空消
检查种子罐是否清洁，阀门是否关闭，种子罐运转是否正常。
打开罐内两路蒸汽阀(罐内蒸汽阀取样口蒸汽阀)及罐内总阀使罐压升到0.15MPa。
与此同时，打开罐内排空阀少许，并打开罐内相通的所有排气阀，包括压力表小考克，保证排污阀成一直线。
此时，保持罐压0.12-0.15MPa30分钟。
关闭所有排污阀与小考克，并关闭蒸汽阀。
开大排污阀，开保压空气阀，利用罐压排尽罐内冷凝水。
关闭保压空气阀、排污阀，打开接种阀及小考克，打开进料阀及排空阀。
打开配料罐搅拌及配料罐出料阀及配料泵种子罐进料阀，进料完毕，停配料罐搅拌，关闭配料出料阀及种子罐进料阀，备用。
3.2实消
实消前提取检查PH值是否符合工艺要求。
检查夹套是否有冷却水，若有打开底部管道阀，排尽后，关旁通阀，打开疏水回前阀门。
打开进夹套蒸汽阀，进行加热，接种阀开少许。
与此同时，打开取样蒸汽阀，并打开取样阀(不进罐内)打开进罐蒸汽阀与保压进汽阀上小考克(蒸汽不进罐内)打开罐内排污阀(蒸汽不进罐内)进行这段管线杀菌。
待罐温升到90℃左右，关夹套蒸汽阀，并停搅拌。
打开罐内进罐内蒸汽阀，取样蒸汽阀，进行罐内实消，观察罐内翻腾情况，不得有冒顶现象。同时打开压力表旋塞三通。接种阀及小考蒸汽压力保持0.10-0.15MPa，使罐温升至115℃～120℃，打开罐顶所有排汽阀，充分排汽8-10分钟。
关闭罐内排污阀及进罐总阀，取松口阀及进罐阀门，然后关两路进罐内蒸汽阀。
待罐内压力≤0.05MPa后，关闭排空阀及压力表旋塞三通，打开罐顶空气保压阀，使罐内保压0.05MPa，接种阀不要关闭严，应开少许。
打开夹套进水阀及出水阀，并打开搅拌进行降温，使罐温降至37℃左右，并保持此温，关闭进水阀，保温，保压备用。
注意事项：实消结束后，罐内压力0.05MPa，防止细菌侵入；实消结束后，先关闭进罐内总阀，然后关闭蒸汽阀，严防跑料；冷却水降温37℃前，应注意提前关闭冷却水阀，防止温度下降，造成温度过后，一般降温至39℃左右时应关闭进水阀。
3.3接种操作(接种管0.5％)
关闭接种阀，打开活接并用火焰灭菌。与此同时，打开接种瓶橡胶管的保护套，对管道进行火焰保护，并迅速插在接种口上。
打开接种阀及空气保压阀，使罐压升至0.06MPa(严禁超过0.6MPa)，关闭保压阀，打开与流量计相连出气阀流量显示为6m3/h。
接完种子后，取样橡胶管，接种口用火焰灭菌后接上活接头，关闭接种阀。
打开与空气流量计阀门，打开进空气阀及总阀，调查适当空气流量，控制罐压0.05-0.06MPa。
打开取样口蒸汽阀及取样阀，让其排气2分钟。注意，不要让蒸汽进入罐内。
关闭蒸汽阀，打开取样出料阀及取样阀，取样测量OD值及PH值。
取样完毕，关闭取样出料阀，打开蒸汽阀排气2分钟，关闭蒸汽及取样阀。
3.4看罐操作
通置量7-8m3/h。
罐温在37±1℃，当温度升至37.5℃，打开夹套进水阀及出水阀，降温至37℃关闭进水阀及出水阀。
每2h取样测量PH值和OD值。
3.5取样具体操作
打开蒸汽阀取样口阀进行管道灭菌2分钟。
打开蒸汽阀，打开与取样阀相连罐壁出料阀，先放出取样管内液水约 40ml后，再放入取样管内。
关闭出料阀，打开蒸汽阀进行管道灭菌2分钟后，关闭蒸汽阀及取样阀。
3.6当OD值净增0.4以上，PH值8.0左右时，即可保压备用，一般情况种子罐培养周期10-12小时，OD值0.8左右，PH值8.0即可压入转化罐，并做摇床对照。
3.7种子液培养结束后，即可通知固定化岗位做好搅拌工作。
3.8接到固定化岗位回复后，打开蒸汽阀及出料阀，对种子罐至转化罐这段管线进行灭菌2分钟。
3.9管道灭菌后，关闭蒸汽阀5分钟后，打开罐内总阀及种子罐保压阀，让种子液压入转化罐。
3.10压料完毕后，关闭罐内总阀及进出料阀。
二、大肠杆菌固定化细胞的制备
以聚丙烯酰胺和角叉菜胶的混合物为载体，聚丙烯酰胺与角叉菜胶的质量比为3:1，将含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌包埋于载体中，得到固定化细胞。
具体的包埋方法为：1g大肠杆菌细胞与1mL生理盐水混合制成菌悬浮，然后加入质量百分浓度为10％的载体溶液并搅拌混匀，制得大肠杆菌细胞质量百分浓度为2.3％的混合液，在持续搅拌下将混合液逐滴滴入100mL的 0.2mol/L的CaCl2溶液中，得到包埋颗粒，包埋颗粒继续在0.2mol/L的CaCl2溶液中浸泡2h，然后过滤、洗涤、抽干，得到固定化细胞。
将固定化细胞作为填料填充于交换柱中，得到固定化细胞柱。
三、酶催化反应
使pH值为7的质量百分浓度为20％的富马酸铵水溶液以2L/h的通柱速度经过固定化细胞柱(柱温为49-51℃，pH为7)，收集过柱液，为L-天门冬氨酸铵水溶液。
使用顺丁烯二酸调节过柱液的pH值至2.2-2.5，到达L-天门冬氨酸等电点时析出L-天门冬氨酸固体，使用离心机进行固液分离，分别收集固体L- 天门冬氨酸、母液和冲洗液，母液和冲洗液一同收集到存储罐中，母液为顺丁烯二酸铵水溶液。
四、后处理
向盛装母液和冲洗水的存储罐中投入溴化铵和过硫酸铵，得到富马酸铵水溶液；然后再通过向富马酸铵水溶液中投入氨水和富马酸，将溶液调节为 pH值为7的质量百分浓度为20％的富马酸铵水溶液。后处理所得的富马酸铵水溶液回收利用，继续进行反应。
本实施例方法制备L-天门冬氨酸，连续运行20天，产品收率为96.3％，产品L-天门冬氨酸的纯度为99.6％。连续运行20天，酶活力保留35.7％(原细胞酶活力100387.5单位/克)。
实施例2
本实施例提供一种L-天门冬氨酸的制备方法，包括大肠杆菌AS1.881 的培养、大肠杆菌固定化细胞的制备、酶催化反应、后处理步骤。本实施例的制备方法与实施例1的不同之处在于酶催化反应步骤中的条件控制，其他步骤相同。本实施例的酶催化反应步骤中，使pH值为7的质量百分浓度为 20％的富马酸铵水溶液以2L/h的通柱速度经过固定化细胞柱(柱温为 52-54℃，pH为7)，收集过柱液，其他与实施例1的相同。
本实施例方法制备L-天门冬氨酸，连续运行15天，产品收率为88.3％，产品L-天门冬氨酸的纯度为98.9％。连续运行15天，酶活力保留24.8％。
实施例3
本实施例提供一种L-天门冬氨酸的制备方法，包括大肠杆菌AS1.881 的培养、大肠杆菌固定化细胞的制备、酶催化反应、后处理步骤。本实施例的制备方法与实施例1的不同之处在于大肠杆菌固定化细胞的制备，其他步骤相同。本实施例的大肠杆菌固定化细胞的制备步骤中，以聚丙烯酰胺为载体，其他与实施例1的相同。
本实施例方法制备L-天门冬氨酸，连续运行20天，产品收率为91.8％，产品L-天门冬氨酸的纯度为99.1％。连续运行20天，酶活力保留25.0％。
实施例4
本实施例提供一种L-天门冬氨酸的制备方法，包括大肠杆菌AS1.881 的培养、大肠杆菌固定化细胞的制备、酶催化反应、后处理步骤。本实施例的制备方法与实施例1的不同之处在于大肠杆菌固定化细胞的制备，其他步骤相同。本实施例的大肠杆菌固定化细胞的制备步骤中，以角叉菜胶为载体，其他与实施例1的相同。
本实施例方法制备L-天门冬氨酸，连续运行20天，产品收率为90.8％，产品L-天门冬氨酸的纯度为98.7％。连续运行20天，酶活力保留26.3％。
实施例5
本实施例提供一种L-天门冬氨酸的制备方法，包括大肠杆菌AS1.881 的培养、大肠杆菌固定化细胞的制备、酶催化反应、后处理步骤。本实施例的制备方法与实施例1的不同之处在于大肠杆菌固定化细胞的制备，其他步骤相同。本实施例的大肠杆菌固定化细胞的制备步骤中，以聚丙烯酰胺和角叉菜胶的混合物为载体，聚丙烯酰胺与角叉菜胶的质量比为4:1，其他与实施例1的相同。
本实施例方法制备L-天门冬氨酸，连续运行20天，产品收率为94.6％，产品L-天门冬氨酸的纯度为99.0％。连续运行20天，酶活力保留29.4％。
实施例6
本实施例提供一种L-天门冬氨酸的制备方法，包括大肠杆菌AS1.881 的培养、大肠杆菌固定化细胞的制备、酶催化反应、后处理步骤。本实施例的制备方法与实施例1的不同之处在于大肠杆菌固定化细胞的制备，其他步骤相同。本实施例的大肠杆菌固定化细胞的制备步骤中，以聚丙烯酰胺和角叉菜胶的混合物为载体，聚丙烯酰胺与角叉菜胶的质量比为2:1，其他与实施例1的相同。
本实施例方法制备L-天门冬氨酸，连续运行20天，产品收率为93.9％，产品L-天门冬氨酸的纯度为99.2％。连续运行20天，酶活力保留28.2％。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims (6)

1.一种L-天门冬氨酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以聚丙烯酰胺和角叉菜胶的混合物为载体，将含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌包埋于载体中，得到固定化细胞；所述固定化细胞作为填料填充于交换柱中，得到固定化细胞柱；
S2、使pH值为7的质量百分浓度为20％的富马酸铵水溶液经过所述固定化细胞柱，收集过柱液；
S3、使用顺丁烯二酸调节过柱液的pH值至2.2-2.5，到达L-天门冬氨酸等电点时析出L-天门冬氨酸固体，固液分离，分别收集固体L-天门冬氨酸和母液；
S4、向母液中投入溴化铵和过硫酸铵，得到富马酸铵水溶液；然后再通过向富马酸铵水溶液中投入氨水和富马酸，将溶液调节为pH值为7的质量百分浓度为20％的富马酸铵水溶液。
2.根据权利要求1所述的L-天门冬氨酸的制备方法，其特征在于，步骤S1中，载体中所述聚丙烯酰胺和角叉菜胶的质量比为3:1。
3.根据权利要求1所述的L-天门冬氨酸的制备方法，其特征在于，步骤S1中，大肠杆菌的包埋方法为：1g大肠杆菌细胞与1mL生理盐水混合制成菌悬浮，然后加入质量百分浓度为10-12％的载体溶液并搅拌混匀，制得大肠杆菌细胞质量百分浓度为2-2.5％的混合液，在持续搅拌下将混合液逐滴滴入100mL的0.2mol/L的CaCl2溶液中，得到包埋颗粒，包埋颗粒继续在0.2mol/L的CaCl2溶液中浸泡2h，然后过滤、洗涤、抽干，得到固定化细胞。
4.根据权利要求1所述的L-天门冬氨酸的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述固定化细胞柱的柱温为49-51℃，pH为7，富马酸铵水溶液的通柱速度为2L/h。
5.根据权利要求1所述的L-天门冬氨酸的制备方法，其特征在于，步骤S3中，使用离心机进行固液分离，收集固体L-天门冬氨酸、母液和冲洗液，冲洗液合并至母液中。
6.根据权利要求1-5任一项所述的L-天门冬氨酸的制备方法，其特征在于，培养步骤S1中所述的含L-天门冬氨酸酶的大肠杆菌时，使用的发酵培养基的组成为泡敌溶液中含以下质量百分比的各组分：玉米浆1.8-2.2％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.145％，反丁烯二酸1％，并用氨水调节pH值至7.5。
CN202011101738.9A 2020-10-15 2020-10-15 一种l-天门冬氨酸的制备方法 Pending CN112126639A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011101738.9A CN112126639A (zh) 2020-10-15 2020-10-15 一种l-天门冬氨酸的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011101738.9A CN112126639A (zh) 2020-10-15 2020-10-15 一种l-天门冬氨酸的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112126639A true CN112126639A (zh) 2020-12-25

Family

ID=73853846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011101738.9A Pending CN112126639A (zh) 2020-10-15 2020-10-15 一种l-天门冬氨酸的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112126639A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4518693A (en) * 1982-11-01 1985-05-21 Research Corporation Immobilized biocatalysts
CN1229143A (zh) * 1998-02-13 1999-09-22 株式会社日本触媒 生产l－天冬氨酸的方法
CN1229142A (zh) * 1998-02-13 1999-09-22 株式会社日本触媒 生产l－天冬氨酸的方法
CN104120101A (zh) * 2014-07-17 2014-10-29 杭州临安冰峰科技有限公司 一种大肠杆菌突变株及利用该菌生产手性天冬氨酸的方法
CN104593306A (zh) * 2015-02-04 2015-05-06 烟台恒源生物股份有限公司 一种大肠埃希氏菌株hy-05c高密度培养方法
CN106755157A (zh) * 2016-12-28 2017-05-31 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 利用顺酐制备l‑天冬氨酸和l‑丙氨酸的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4518693A (en) * 1982-11-01 1985-05-21 Research Corporation Immobilized biocatalysts
CN1229143A (zh) * 1998-02-13 1999-09-22 株式会社日本触媒 生产l－天冬氨酸的方法
CN1229142A (zh) * 1998-02-13 1999-09-22 株式会社日本触媒 生产l－天冬氨酸的方法
CN104120101A (zh) * 2014-07-17 2014-10-29 杭州临安冰峰科技有限公司 一种大肠杆菌突变株及利用该菌生产手性天冬氨酸的方法
CN104593306A (zh) * 2015-02-04 2015-05-06 烟台恒源生物股份有限公司 一种大肠埃希氏菌株hy-05c高密度培养方法
CN106755157A (zh) * 2016-12-28 2017-05-31 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 利用顺酐制备l‑天冬氨酸和l‑丙氨酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ICHIRO CHIBATA: "《Immobilized Microbial Cells》", 31 August 1979 *
W. Y. KUU等: "Improving Immobilized Biocatalysts by Gel Phase Polymerization", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107699557A (zh) 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法
CN103614428B (zh) 一种发酵生产l‑色氨酸的方法
CN101899479B (zh) 利用农林废弃物制备木糖醇的生产方法
CN103842512B (zh) 在发酵过程中防止细菌感染的方法
CN106635934A (zh) 一种嗜热型乳酸杆菌及人工添加该嗜热型乳酸杆菌的玉米浸泡方法
CN107746864A (zh) 一种微生物法丙烯酰胺发酵新工艺
CN108660178A (zh) 一种高絮凝率微生物絮凝剂的制备方法
CN109628080A (zh) 一种生物质泡沫排水剂的制备方法
CN112126639A (zh) 一种l-天门冬氨酸的制备方法
CN107805613A (zh) 一种纤维级甲醇蛋白的工业化提纯方法
CN101643411A (zh) 一种柠檬酸的中和方法
CN103789354A (zh) 一种采用含纤维素原料制备乙醇的方法
CN106434603B (zh) 一种利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法
CN214937353U (zh) 一种废水菌剂的扩培装置
CN113817614B (zh) 一种高效合成c21甾体苷的胶孢炭疽菌z-44及其应用
CN111172204B (zh) 一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法
CN107446813A (zh) 一种连续转化生产2‑pe的装置及其连续转化生产2‑pe的方法
CN107099555A (zh) 一种用中药药渣作为原料进行沼气生产的方法
CN113736843A (zh) 一种霉菌脱氢物精品的制备方法
CN208898904U (zh) 一种固定化单宁酶生产没食子酸的装置
CN104099311A (zh) 一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用
CN112088720A (zh) 杏鲍菇液体栽培培养液及杏鲍菇液体栽培生产工艺
CN214937352U (zh) 一种处理焦化废水微生物菌剂的扩培装置
CN107988085A (zh) 一种高产酸性果胶酶的棘孢曲霉菌株及其应用
CN102634463A (zh) 一株产木糖醇的酵母菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201225