CN1229143A - 生产l－天冬氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了生产晶体L－天冬氨酸的方法,该方法主要由下列步骤组成:制备含富马酸、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液,将混合溶液与天冬氨酸酶反应以得到含L－天冬氨酸盐的反应溶液并使L－天冬氨酸从反应溶液中结晶出,其中将额外量的氨加至含L－天冬氨酸盐的反应溶液中,然后将富马酸加至其中以结晶L－天冬氨酸。所述方法可以良好的加工性提供高纯度晶体L－天冬氨酸而无需任何复杂步骤。
Description
本发明涉及用天冬氨酸酶从富马酸生产晶体L-天冬氨酸的方法。本发明还涉及通过加至随后反应的起始溶液中，从分离出晶体L-天冬氨酸的母液中再循环未结晶的L-天冬氨酸的方法。
结晶并收集DL-天冬氨酸的方法已公开于日本专利申请特许公开48-56618中，其中富马酸被加至DL-天冬氨酸二钠溶液中。该方法包括将富马酸二钠与过量氨反应以形成DL-天冬氨酸，从反应溶液中除去过量的氨，然后将富马酸加至反应溶液中以结晶并分离DL-天冬氨酸。
在该方法中，加入富马酸前的溶液是DL-天冬氨酸钠溶液，向其中加入富马酸以沉淀DL-天冬氨酸。分离晶体DL-天冬氨酸后的母液(即滤液)是富马酸二钠溶液。随后，将比富马酸过量很多的氨加至富马酸二钠溶液中，将所得的溶液再作为下步反应的起始溶液再循环。
总之，在用酶从富马酸铵生产L-天冬氨酸的反应中，需要加入与起始物质(即富马酸)等摩尔量或过量的氨。为了使反应的平衡向L-天冬氨酸侧移动，通常使用的氨量是常规所用富马酸摩尔量的2至2.3倍。另一方面，催化所述反应的天冬氨酸酶的最佳pH为约8.3。在比该pH值高很多的pH范围内，可能会降低酶活性。
在日本专利申请特许公开48-56618公开的方法中，为了进行再循环，大大过量的氨被加至富马酸二钠溶液中。
所述富马酸二钠溶液的pH为8.4。在30℃，以与富马酸等摩尔的量向该溶液中加入氨时，溶液的pH升至12.1，在此pH天冬氨酸酶会变性。因此，对于用天冬氨酸酶进行的酶促反应来说，加入所述量的氨是不适宜的。
日本专利2524306公开了通过将富马酸加至L-天冬氨酸单铵溶液中而结晶并分离L-天冬氨酸的方法。在该方法中，用天冬氨酸酶将富马酸二铵溶液转变成L-天冬氨酸单铵溶液，将富马酸加至所得的溶液中以结晶L-天冬氨酸，然后过滤分离，然后将氨加至滤液中以进行随后的反应。
在该方法中，由于富马酸被加至L-天冬氨酸单铵溶液中，所以是在存在富马酸或L-天冬氨酸或两者同时存在的多相条件下进行L-天冬氨酸和富马酸之间盐的交换反应。
此外，在该方法中，首次加入的富马酸量是反应溶液中L-天冬氨酸盐摩尔量的0.5倍。但是，为了在分离晶体L-天冬氨酸后，将反应溶液作为随后反应的起始溶液进行再循环，必须向反应溶液中补充额外量的富马酸以便再调整减少的底物浓度，使其达到起始浓度。即，需加入两次固体组分(即富马酸)。在该方法中，处理固体组分的复杂步骤的次数增加可导致所产生的L-天冬氨酸的可加工性差和纯度低。
因此，本发明的目的是解决上述问题并提供通过天冬氨酸酶的作用，生产高纯度晶体L-天冬氨酸的方法。
我们进行了深入的研究以解决上述问题。结果，我们发现了下列事实：当用于结晶L-天冬氨酸而加入的富马酸量与L-天冬氨酸铵溶液中的的L-天冬氨酸盐的量基本上等摩尔时，加入富马酸后形成的富马酸盐是富马酸单铵，所述富马酸单铵的溶解度较小；部分富马酸单铵作为晶体出现在溶液中并被包含在L-天冬氨酸晶体中，成为其中的杂质；因此，降低了晶体L-天冬氨酸的纯度。
为了改进这种缺陷，我们发现了用于生产晶体L-天冬氨酸的方法，其中将氨加至通过天冬氨酸酶的酶促反应而得到的L-天冬氨酸铵溶液中以便使反应溶液达到氨溶解过量的状态，然后将富马酸以反应溶液中富马酸盐和L-天冬氨酸盐总摩尔量0.6-1.2倍的量加至反应溶液中以便将富马酸溶解于溶液并使L-天冬氨酸从溶液中结晶出。
我们还发现了另一种生产晶体L-天冬氨酸的方法，其中将氨加至通过天冬氨酸酶的酶促反应而得到的L-天冬氨酸铵溶液中，将反应溶液加热，将富马酸加至加热的反应溶液中以加速富马酸在溶液中的溶解，然后将所得的不含晶体的均匀溶液结晶，只有L-天冬氨酸从溶液中结晶出。
用这些方法，通过将氨加至反应溶液中，在加入富马酸后，可产生不仅仅是富马酸单铵，而是富马酸单铵和富马酸二铵的混合物。富马酸二铵由于其高溶解度而不会被包含在L-天冬氨酸晶体中。就作为反应产物的一部分而生产出的富马酸单铵而言，随富马酸二铵的形成其在溶液中的浓度降低，它以完全溶解的状态存在于反应溶液中。结果，由于可以避免将富马酸单铵晶体包含在晶体L-天冬氨酸中，因此可得到高纯度的L-天冬氨酸晶体。
此外，我们还发现利用氨和碱金属氢氧化物(如氢氧化钠)组合中和天冬氨酸酶的底物溶液(即起始富马酸溶液)，可提高晶体L-天冬氨酸的产率，而且加入的碱金属氢氧化物的量对于用天冬氨酸酶的酶促反应有最佳范围。
基于上述发现，我们完成了本发明。
因此，本发明的一个方面，提供生产晶体L-天冬氨酸的方法，该方法包括制备含富马酸、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液，将混合溶液与天冬氨酸酶反应以得到含L-天冬氨酸盐的反应溶液，然后将L-天冬氨酸从反应溶液中结晶出来，其中再将额外量的氨加至含L-天冬氨酸盐的反应溶液中，随后将富马酸加至反应溶液中以结晶L-天冬氨酸。
在此，在L-天冬氨酸结晶后，可分离仍留在反应溶液中的未结晶的天冬氨酸，可将氨加至该溶液中，将所得反应溶液作为生产晶体L-天冬氨酸方法的部分起始反应溶液，用于再循环。
根据本发明的另一方面，提供了生产晶体L-天冬氨酸的方法，该方法包括制备含富马酸、L-天冬氨酸铵、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液，将混合溶液与天冬氨酸酶反应以得到含L-天冬氨酸盐的反应溶液，然后将L-天冬氨酸从反应溶液中结晶出，其中再将额外量的氨加至含L-天冬氨酸盐的反应溶液中，随后将富马酸加入以结晶L-天冬氨酸。
根据本发明的另一方面，提供了生产晶体L-天冬氨酸的方法，该方法包括制备含富马酸、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液，将混合溶液与天冬氨酸酶反应以得到含L-天冬氨酸盐的反应溶液，然后将L-天冬氨酸从反应溶液中结晶出，其中再将额外量的氨加至含L-天冬氨酸盐的反应溶液中，随后将所述反应溶液冷却以结晶L-天冬氨酸。
在此，在L-天冬氨酸结晶后，可分离仍留在反应溶液中的未结晶的天冬氨酸，可将氨加至该溶液中，将所得反应溶液作为生产晶体L-天冬氨酸方法的部分起始反应溶液，用于再循环。
根据本发明的另一方面，提供了生产晶体L-天冬氨酸的方法，该方法包括制备含富马酸、L-天冬氨酸铵、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液，将混合溶液与天冬氨酸酶反应以得到含L-天冬氨酸盐的反应溶液，然后将L-天冬氨酸从反应溶液中结晶出，其中再将额外量的氨加至含L-天冬氨酸盐的反应溶液中，将反应溶液加热，将富马酸加至反应溶液中，将所述反应溶液冷却以结晶L-天冬氨酸。
在此，混合溶液中碱金属氢氧化物的量为溶液中所含富马酸盐和L-天冬氨酸盐总摩尔量的0.1-1倍。
用于结晶L-天冬氨酸所加入的富马酸量可以是含L-天冬氨酸的反应溶液中所含富马酸盐和L-天冬氨酸盐总摩尔量的0.6-1.2倍。
天冬氨酸酶可以是通过将携带天冬氨酸酶基因的转化体或从所述转化体生产的产物固定于载体上而制备出的固定化天冬氨酸酶。
含富马酸、L-天冬氨酸、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液以富马酸计，含有浓度为8-20％的富马酸和L-天冬氨酸，将该混合溶液以2-20的液体时空速流过含固定化天冬氨酸酶的反应器，所述固定化天冬氨酸酶的活性为250U或更高。本文所用“1U”指每分钟每毫升固定化天冬氨酸酶产生1μmol L-天冬氨酸，“LHSV”表示“液体时空速”并表示每体积填充的催化剂(以毫升计)每小时流过溶液的体积(以毫升计)。
通过将有天冬氨酸酶活性的微生物细胞或所述微生物细胞的产物吸附到离子交换树脂上或通过将含微生物细胞或所述微生物细胞之产物的聚合物包被到离子交换树脂上可制备固定化天冬氨酸酶。
通过将有天冬氨酸酶活性的微生物细胞或所述微生物细胞的产物与式(Ⅰ)聚合物混合，然后将混合物包被到球形苯乙烯/二乙烯基苯共聚物离子交换树脂颗粒的表面上，可制备固定化天冬氨酸酶：其中Y是直接键或由下列分子式代表的双功能基团：或
R1和R2各自独立地是氢原子或有机残基，X是阴离子，n是100-5000的整数。
本说明书包括日本专利申请10-31857和10-31858说明书和/或附图所公开的部分或全部内容，这两个申请是本申请的优先权文件。
下文将详细地描述本发明。
在本发明中，天冬氨酸酶可以是具有天冬氨酸酶活性的含天冬氨酸酶物质。含天冬氨酸酶物质的实例包括已知具有高天冬氨酸酶活性的微生物，如大肠杆菌和属于短杆菌和假单胞菌科的微生物，以及通过例如超声、摩擦、冻融、用酶或表面活性剂处理细胞而产生的其产物。也可以从细胞产物中通过常规技术如硫酸铵分离和丙酮沉淀部分纯化天冬氨酸酶，或通过常规技术如色谱从细胞产物中完全纯化。可以使用任何类型的天冬氨酸酶，只要它有天冬氨酸酶活性。
但是，在本发明中，特别优选使用已用携带天冬氨酸酶基因的质粒转化过的重组大肠杆菌细胞，以便所述细胞可产生增加量的天冬氨酸酶。这是因为当用碱金属氢氧化物(如氢氧化钠)中和部分富马酸时，相对于反应溶液中的碱金属氢氧化物量，氨在反应溶液中的数量减少，从而会导致富马酸向L-天冬氨酸的转化率降低。
可用于本发明的天冬氨酸酶基因可衍生于任已知其基因与大肠杆菌基因天然杂交(cross)并具有天冬氨酸酶活性的微生物，所述微生物包括大肠杆菌，荧光假单胞菌和属于肠杆菌科和柠檬酸杆菌科的微生物。天冬氨酸酶基因可得自例如大肠杆菌菌株K-12(IFO3301)或荧光假单胞菌(IFO3081)的染色体DNA，并用基于已知天冬氨酸酶基因序列制备的引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增。
对用于整合天冬氨酸酶基因的质粒没有限制，可以使用任何质粒，只要该质粒可以在属于大肠杆菌的微生物中复制。所述质粒的实例包括pUC18和pKK223-3。用于导入携带天冬氨酸酶基因之质粒的宿主微生物优选大肠杆菌菌株K-12。
在本发明中，可以用常规方法将具有天冬氨酸酶活性的微生物细胞、其产物或天冬氨酸酶本身固定在载体上。所述载体的实例包括天然聚合物如纤维素、藻酸、角叉菜胶和甘露聚糖凝胶；和合成聚合物如离子交换树脂，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺。其中，优选由苯乙烯/二乙烯基苯共聚物制备的球形离子交换树脂颗粒，该颗粒用上述式(Ⅰ)聚合物与上述微生物细胞或其产物的混合物包被。例如，优选通过将微生物细胞与水溶性聚合物(例如PAS-880)的混合物包被在载体上，然后干燥包被层从而将所述细胞固定在水不溶性载体上，所述水溶性聚合物可在聚合物分子间或聚合物与细胞表面间形成交联键。
用该方法制备的固定化天冬氨酸酶由于其扩散层薄而具有低压力损失和低扩散障碍，因此适用于具有高液体时空速(LHSV)的反应。
用于本发明的起始底物溶液是富马酸和富马酸-中和的盐的水溶液。所用的碱是氨和碱金属氢氧化物的组合。碱金属氢氧化物的量为底物溶液中所含L-天冬氨酸盐和富马酸盐总摩尔量的0.1-1.2倍，优选0.3-1.0倍，最佳为0.4-0.8倍。在此，本领域技术人员很容易理解表达方式“底物溶液中所含L-天冬氨酸盐和富马酸盐的总摩尔量”指在底物溶液中不含有L-天冬氨酸盐时“在底物溶液中所含的富马酸盐摩尔量”，实际上是加至底物溶液中的“富马酸”本身的摩尔量。在考虑底物溶液的再循环的情况下，从本发明的性质看，在本发明说明书中使用该表达方式是为了方便。这同样适用于下述表示氨量的表达方式。如果碱金属氢氧化物的量在范围以下，晶体L-天冬氨酸的回收率将降低。但如果碱金属氢氧化物的量在所述范围之上，则底物溶液的pH就会很高，而且所加的氨量减少，从而导致富马酸向L-天冬氨酸的转化率降低，并可导致天冬氨酸酶失活。
就工业实用性而言，优选本发明所用的氨是水溶液的形式。但是液体氨和氨气均可使用。起始底物溶液中的氨量是底物溶液中L-天冬氨酸盐和富马酸盐总摩尔量的1～2倍，优选1.1-1.8倍，更优选1.2-1.5倍。在本发明中，优选在加入碱金属氢氧化物后，将氨以一定的量加至底物溶液中以便将所得溶液的pH调至至6-9.5，优选7-9.3，最佳为8-9。富马酸在底物溶液中的浓度优选为5-20％重。但是就所产生的晶体L-天冬氨酸的生产率和纯度而言，特别有效的是使用浓度为8-15％重的富马酸。
底物溶液还可含有二价金属盐，例如锰，例如氯化锰，硫酸锰；镁盐，例如氯化镁，硫酸镁；和钴盐，所述二价金属盐的浓度为0.1-50mM，优选1-10mM。
在本发明中，可使用任何类型的反应器，包括常规的间歇式或柱型反应器。所述反应器可单个或两个或多个组合使用。
为了在工业上大规模生产晶体L-天冬氨酸，柱型反应器是特别优选的。在用柱型反应器完成的反应中，当使用固定化天冬氨酸酶时，可将底物溶液以2-20LHSV的流速流过所述柱以便使溶液与天冬氨酸酶反应，所述固定化天冬氨酸酶是通过将式(Ⅰ)聚合物与大肠杆菌细胞的混合物包被到球形苯乙烯/二乙烯基苯共聚物离子交换树脂上而制备的，所述大肠杆菌细胞已用携带天冬氨酸酶基因的质粒转化以便产生增加量的天冬氨酸酶。
当使用其中天然大肠杆菌被固定的固定化天冬氨酸酶时，需要延长反应时间或降低底物溶液的流速(LHSV)，因为天然大肠杆菌的天冬氨酸酶活性不是很高。相反，当使用其中大肠杆菌已用天冬氨酸酶基因转化的固定化天冬氨酸酶时，甚至以上述流速也可得到令人满意的转化率，因为所述固定化天冬氨酸酶有极高的天冬氨酸酶活性。
反应温度优选为约10℃-约50℃，更优选15℃-40℃。如果反应温度低于所述范围，则反应速率可能降低。而反应温度高于所述范围，则天冬氨酸酶可能被失活。
富马酸与氨的反应在上述条件下完成。尽管优选以较高的转化率进行反应，但对于随后L-天冬氨酸的结晶来说，转化率约90％是令人满意的，即使反应不能达到平衡。
然后，将氨加至反应溶液中以便将溶液的pH调至9或更高，优选pH9.1或更高，最佳为pH9.3或更高。所加氨量的上限与反应溶液中所含富马酸盐和L-天冬氨酸盐的总量是等摩尔的，具体为反应溶液中所含富马酸盐和L-天冬氨酸盐的总摩尔量的0.1-0.9倍，优选0.3-0.7倍。氨量低于上述范围，在晶体L-天冬氨酸中会出现富马酸单铵的污染。氨量高于上述范围，晶体L-天冬氨酸的产率将降低。
在本发明一方面，加入氨后，再将富马酸加至反应溶液中。富马酸的量为反应溶液中所含富马酸盐和L-天冬氨酸盐总摩尔量的0.6-1.2倍，优选0.7-1.1倍，最佳0.8-1.0倍。当加入的富马酸量低于上述范围时，晶体L-天冬氨酸的产率降低。当加入的富马酸量高于上述范围时，在晶体L-天冬氨酸中会出现富马酸盐的污染。
加入富马酸后，在45℃或低于45℃的温度搅拌反应溶液。如果温度太低，低溶解度的富马酸单铵晶体就可能被包含在晶体L-天冬氨酸中。因此，反应溶液的温度优选为10-40℃，最佳为25-35℃。加入富马酸后，再将反应溶液搅拌1秒至1小时，优选1-15分钟，以便使L-天冬氨酸从溶液中结晶出。用常规方法如抽滤和离心过滤可从溶液中分离出结晶的L-天冬氨酸。离心过滤是优选的，因为这样可得到液体含量低的晶体L-天冬氨酸饼。
在本发明的另一方面，加入氨后，将反应溶液加热至45℃或45℃以上，优选50℃或更高。尽管加热温度没有具体上限，但是通常，将反应溶液加热至其在常压下的沸点温度。随后，将富马酸加至反应溶液中。加入的富马酸量为反应溶液中所含富马酸盐和L-天冬氨酸盐总摩尔量的0.6-1.2倍，优选0.65-1.1倍，最佳0.7-1.0倍。当加入的富马酸量低于上述范围时，晶体L-天冬氨酸的产率降低。当加入的富马酸量高于上述范围时，在晶体L-天冬氨酸中会出现富马酸盐。加入富马酸后，再将反应溶液在45℃或45℃以上搅拌1秒至1小时，优选1-15分钟，以完全溶解富马酸。该溶液是不含富马酸或L-天冬氨酸晶体的均匀溶液。然后将该反应溶液冷却以便从溶液中结晶出L-天冬氨酸。继续冷却直到悬浮液(即，含晶体L-天冬氨酸的溶液)的温度达到10-45℃。当温度高于该范围时，晶体L-天冬氨酸的产率降低。当温度低于该范围时，晶体L-天冬氨酸中含富马酸盐。
冷却后，将溶液继续搅拌1秒至1小时，优选5-15分钟以便使L-天冬氨酸从溶液中结晶。用常规方法如抽滤和离心过滤可从溶液中分离出产生的晶体L-天冬氨酸。离心过滤是优选的，因为这样可得到液体含量低的晶体L-天冬氨酸饼。
如果需要，将由此分离的L-天冬氨酸晶体(即饼)用水洗涤。通过洗涤，可降低在L-天冬氨酸晶体中所含的富马酸盐的量，从而得到高纯度晶体L-天冬氨酸。但是，就从溶液中分离L-天冬氨酸晶体后的母液的再循环而言，最好不用大量水洗涤晶体。用于洗涤晶体的水量，以L-天冬氨酸晶体计，为5-500％重，优选10-200％。用这种方法，可得到含痕量例如0.1-3％重，优选0.2-2％重富马酸盐的L-天冬氨酸。即使制成细粉，由此得到的含富马酸盐的晶体L-天冬氨酸也很难在空中传播，因此易于处理并对于作为L-天冬氨酸用于工业用途是极有用的。
通过进一步的重复纯化，可将L-天冬氨酸用作食品、药物添加剂等。
可将分离L-天冬氨酸晶体后的母液再循环，通过与饼洗涤溶液混合并向其中加入氨作为随后反应的起始底物溶液。如果需要，可对母液和洗涤溶液进行适当的处理如浓缩。例如，底物溶液的体积由于洗涤溶液和氨水溶液中水的体积而增加。因此，加入氨后，通过浓缩母液和洗涤溶液，可将底物溶液的总体积调整至预定的起始体积。通过从作为晶体分离出的L-天冬氨酸摩尔量中减去加入富马酸前加入的氨的摩尔量，可确定补充的氨摩尔量。因此，将底物溶液中的氨量调整至溶液中所含富马酸盐和L-天冬氨酸盐总摩尔量的1-2倍。该溶液的pH为6-11。用该方法，可将母液制成用于随后反应的起始底物溶液。即，在本发明一方面，重复一系列过程，该过程包括将底物溶液与具有天冬氨酸酶活性的含天冬氨酸酶物质反应，将氨加至反应溶液中，将富马酸加至反应溶液中以便从溶液中结晶出L-天冬氨酸，分离L-天冬氨酸晶体，从母液制备下步起始底物溶液。在本发明的另一方面，重复一系列过程，该过程包括将底物溶液与具有天冬氨酸酶活性的含天冬氨酸酶物质反应，将氨加至反应溶液中，将反应溶液加热，将富马酸加至热反应溶液中，冷却反应溶液以便从溶液中结晶出L-天冬氨酸，分离L-天冬氨酸晶体，从母液制备下步起始底物溶液。根据本发明，可将母液再循环10次或更多。
以下描述通过遗传工程技术制备衍生于大肠杆菌的天冬氨酸酶的方法。
(ⅰ)用重组天冬氨酸酶基因生产大肠杆菌转化体
将从发酵研究所(Institute for Fermentation,Osaka,Japan(IFO))购买的大肠杆菌菌株IFO3301接种至表1所示的LB培养基中，在37℃培养8小时。从1毫升培养物中，收集大肠杆菌细胞并悬浮在1毫升蒸馏水中。用1微升细胞悬浮液作为模板DNA用于扩增天冬氨酸酶基因。
表1
LB培养基的组成
聚胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl 10g
蒸馏水 1升
(用高压消毒锅在121℃灭菌15分钟)
(ⅱ)用PCR扩增天冬氨酸酶基因并制备插入片段
为了扩增大肠杆菌的天冬氨酸酶基因，以已知大肠杆菌菌株K-12的天冬氨酸酶基因(SEQ ID NO:1)(Biochem.J.237(2),547-557)为基础，制备下列两个引物：
引物F:GGATAATCGTCGGTCGAAAA
引物R:CGTCATCTGACGTGCCTTT
用KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)制备含有下列组成的反应溶液以便在下列条件下通过PCR扩增天冬氨酸酶基因：
组成：
10x缓冲液 5μl
dNTPs混合物 5μl
MgCl2 2μl
模板DNA 1μl
KOD DNA聚合酶 1μl
引物F(25pmol) 1μl
引物R(25pmol) 1μl
无菌水 34μl
总量 50μl
PCR条件：
(1)98℃,5分钟
(2)98℃,30秒
(3)53℃,30秒
(4)68℃,1分钟
(其中将(2)至(4)重复30个循环)
在PCR反应结束后，在1％琼脂糖凝胶上电泳扩增的DNA片段并用溴化乙锭染色。结果，证实扩增了预期的约1600bp片段。
从琼脂糖凝胶上切下含DNA片段的部分以用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(ⅲ)将插入片段与载体连接
存在限制酶Srf和DNA连接酶的条件下，将以上得到的DNA片段连接至pCR-Script Amp SK(+)克隆载体中。
将携带含插入的DNA片段之载体的转化体命名为PUaspE1菌株。将菌株PUaspE1接种至3毫升含100ppm氨苄青霉素的LB培养基中并在37℃振荡培养过夜。从1.5ml培养物收集细胞，再用碱SDS方法从细胞中回收质粒。将得到的质粒命名为pUaspE1。
对插入片段的核苷酸序列分析该质粒。结果表明以与载体启动子相反的方向插入了天冬氨酸酶基因。
为了相对于启动子，以向前的方向，再连接天冬氨酸酶基因，用限制酶SacⅠ和BamHⅠ从质粒pUaspE1中裂解出插入片段以导入质粒pUC19。即，用BamHⅠ消化质粒pUaspE1，然后，通过乙醇沉淀收集DNA片段。再用SacⅠ消化DNA片段，将所得片段在1％琼脂糖凝胶上电泳以分离DNA片段，然后从凝胶上切下含DNA片段的部分并用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(ⅳ)制备载体
将1μg质粒pUC19(Nippon Gene Co.,Ltd.)用BamHⅠ消化，然后通过乙醇沉淀回收所得的DNA片段，再用SacⅠ消化DNA片段。在1％琼脂糖凝胶上电泳分离所得的DNA片段，然后从凝胶上切下含DNA片段的部分并用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)收集DNA。将收集的DNA作为载体。
(ⅴ)将插入片段与载体相连
在16℃，经30分钟，用Ligation High(Toyobo Co.,Ltd.)已用限制酶裂解过的插入片段和载体相连。
(ⅵ)转化大肠杆菌
为了转化大肠杆菌，将2μl反应混合物加至2009l感受态大肠杆菌细胞(由Stratagene生产的XL2-Blue MRF’超感受态细胞)中，所述反应混合物含有与载体连接的插入片段。将大肠杆菌转化体铺在含100ppm氨苄青霉素的LB琼脂培养基上并在37℃培养过夜。
捡出出现的20个菌落，接种至含100ppm氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃振荡培养8小时。将IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)加至培养基中达到1mM的浓度，然后在30℃振荡培养过夜。从1毫升培养物中回收细胞。
作为对照，按照与上述相同的方法，将用不含插入片段的质粒pUC18转化的大肠杆菌铺在含100ppm氨苄青霉素的LB琼脂培养基上并在37℃培养过夜。捡出在培养基上出现的一个对照转化体菌落并培养，用与上述相同的方法收集细胞。
将收集的细胞加至1毫升表2所示的20％富马酸铵底物溶液，悬浮于其中，然后使其在30℃反应1小时。
表2:20％富马酸铵底物溶液的组成
富马酸 200g
25％氨水 200g
七水硫酸镁 2.5g
离子交换水 500g
(在用25％氨水将反应混合物的pH调整至8.3后，加入离子交换水达到l升的总体积。)
反应完成后，分析各反应溶液。结果发现在含携带插入片段的大肠杆菌转化体的反应液中，富马酸转变成L-天冬氨酸的转化率为99.5％，而含有不带插入片段的大肠杆菌转化体的反应液转化率为5％。
将含插入片段的一个转化体命名为PUaspE2。
将PUaspE2转化体接种至3毫升含100ppm氨苄青霉素的LB培养基中，然后在37℃培养8小时。从1.5ml培养物中，用碱SDS方法回收质粒，将其命名为pUaspE2。用SmaⅠ消化质粒pUaspE2，然后用HindⅢ消化，接着用1％琼脂糖凝胶电泳以确定所得片段的大小。结果发现了大小分别为约2960bp和约1600bp的两个片段。
用PUaspE2菌株接种3毫升含100ppm氨苄青霉素的LB培养基，然后在37℃振荡培养8小时。将IPTG加至培养基中达到1mM的浓度，然后在30℃继续振荡培养。从1毫升培养物中回收细胞。培养物在OD660nm的细胞密度为8.0。
将收集的细胞悬浮在10毫升20％富马酸铵底物溶液中，然后在30℃反应1小时。用HPLC(高效液相色谱)分析反应混合物。以L-天冬氨酸产量和细胞密度为基础计算反应液天冬氨酸酶活性，其活性为2,000,0009M L-天冬氨酸/小时/OD 660nm细胞密度。
用同样的方法，培养不含插入片段的一个对照转化体菌落并从培养物中收集细胞。确定在OD 660nm的细胞密度。结果，发现培养物的细胞密度为8.5。
将收集的对照转化体细胞悬浮在10毫升20％富马酸铵底物溶液中，然后在30℃反应1小时，用HPLC分析反应。按上述确定反应溶液的天冬氨酸酶活性为10,0009M L-天冬氨酸/小时/OD 660nm细胞密度。
因此，转化体PUaspE2的天冬氨酸酶活性是不含天冬氨酸酶基因插入片段之菌株的200倍。
(ⅶ)培养转化体大肠杆菌
用经大肠杆菌天冬氨酸酶基因转染的重组体大肠杆菌菌株PUaspE2接种10个试验试管，每个试管含有3毫升用100ppm氨苄青霉素补充的表1所示培养基，然后在37℃培养8小时。用试验试管中的培养物分别接种10个Sakaguchi烧瓶，每个烧瓶含100毫升用1mMIPTG补充的上述表1培养基，然后在30℃培养过夜。将烧瓶离心以从中收集细胞。测量各烧瓶中细胞的天冬氨酸酶活性，发现为1.05mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。
用经天冬氨酸酶基因转染的重组大肠杆菌制备固定化天冬氨酸酶
将用碱将pH调至7.0左右的70g PAS-880(Nitto Boseki Co.,Ltd.)和230g去离子水彻底混合，在其中将在上步收集的重组大肠杆菌细胞分散均匀。将300毫升离子交换树脂(由Organo,Japan生产的AmberliteIRA-94SBC1型，平均颗粒直径为0.5mm)和200 Teflon球(粒径0.5英寸)放在6L茄形烧瓶中。向烧瓶中加入1/6上述细胞分散液，在30℃用蒸发器经1小时蒸发至干同时旋转烧瓶。用这种方法，用细胞包被离子交换树脂。该步骤重复6次。除去Teflon球以得到珠形的固定化天冬氨酸酶。该固定化天冬氨酸酶珠的酶活性为3500U(1U=1μmol L-天冬氨酸酶/分钟/ml固定化酶)。下文为了方便，将所述固定化天冬氨酸酶珠称为“重组固定化天冬氨酸酶珠”或“重组固定化天冬氨酸酶”。
培养大肠杆菌IFO3301
除不向培养基中加入氨苄青霉素和IPTG外，按照与上述相同的方法，培养未用天冬氨酸酶基因转染的大肠杆菌菌株IFO3301，从培养物中收集细胞。
制备非重组固定化天冬氨酸酶
除使用上述得到的大肠杆菌菌株IFO3301外，按照与上述相同的方法制备非固定化天冬氨酸酶。该非重组固定化天冬氨酸酶的活性为180U(1U=1μmol L-天冬氨酸酶/分钟/ml固定化酶)。
将用下列实施例进一步描述本发明，所述实施例对本发明不构成限制。实施例实施例1
将按上述用重组天冬氨酸酶基因制备的重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将70g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量61.3g；纯度98.4％)。
表3
富马酸 100g
NaOH 20g(富马酸摩尔量的0.58倍)
25％氨水溶液 87.9g(富马酸摩尔量的1.5倍)
硫酸镁 0.25g
(用去离子水加至1升)实施例2
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(LHSV=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将80g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量72.5g；纯度98.6％)。实施例3
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将90g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量84.1g；纯度98.7％)。实施例4
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入34.6g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.8。将100g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量94.1g；纯度98.5％)。
上述实施例1-4的结果表明，优选以70g或更多的量加入富马酸，这样可使回收率达60％或更高。实施例5
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表4的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入17.6g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.1。将70g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量88.3g；纯度98.6％)。
表4
富马酸 100g
NaOH 30g(富马酸摩尔量的0.87倍)
25％氨水溶液 70.0g(富马酸摩尔量的1.2倍)
硫酸镁 0.25g
(用去离子水加至1升)实施例6
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表4的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入17.6g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.1。将90g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量97.2g；纯度98.1％)。实施例7
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为10毫升/小时(液体时空速(LHSV)=0.2)。由此，完成连续反应。
反应开始后10小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.0％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将90g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量83.1g；纯度98.7％)。实施例8
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向3升该反应溶液中加入87.9g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将270g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用300毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量252.4g；纯度98.7％)。将除去晶体后所得的滤液和用于洗涤所述饼的溶液合并并减压浓缩。用70.0g25％氨水溶液补充该溶液并用去离子水制成3升。
将该溶液用作随后反应的起始底物溶液。即通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将该溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后30分钟，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向2升该反应溶液中加入58.6g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将180g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用200毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量189.3g；纯度98.7％)。将除去晶体后所得的滤液和用于洗涤所述饼的溶液合并并减压浓缩。用46.7g 25％氨水溶液补充该溶液并用去离子水制成2升。
将该溶液用作随后反应的起始底物溶液。即通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将该溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后30分钟，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将90g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用200毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量95.9g；纯度98.7％)。实施例9
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液和50g(0.5mol)富马酸。将反应溶液搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量51.6g；纯度98.8％)。实施例10
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表5的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为100毫升/小时(液体时空速(LHSV)=2.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为10.8％。
表5
富马酸 100g
NaOH 69.0g(富马酸摩尔量的2.0倍)
25％氨水溶液 58.4g(富马酸摩尔量的1.0倍)
硫酸镁 0.25g
(用去离子水加至1升)实施例11
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表6的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为100毫升/小时(液体时空速(LHSV)=2.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为80.2％。
表6
富马酸 100g
NaOH 60g(富马酸摩尔量的1.74倍)
25％氨水溶液 58.4g(富马酸摩尔量的1.0倍)
硫酸镁 0.25g
(用去离子水加至1升)比较实施例1
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表7的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.7％。
向1升该反应溶液中加入58.6g的25％氨水溶液和100g富马酸。将反应溶液搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量56.1g；纯度98.7％)。
表7
富马酸 100g
25％氨水溶液 129.0g(富马酸摩尔量的2.2倍)
硫酸镁 0.25g
(用去离子水加至1升)。
以上结果表明，不用NaOH的反应导致以低产率产生晶体L-天冬氨酸。实施例12
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表8的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.4％。
向1升该反应溶液中加入14.7g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.1。将70g富马酸加至反应溶液中并搅拌1小时以得到含晶体L-天冬氨酸的悬浮液。此时，悬浮液的温度为30℃。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量30.1g；纯度98.8％)。
表8
富马酸 100g
NaOH 10g(富马酸摩尔量的0.29倍)
25％氨水溶液 102.6g(富马酸摩尔量的1.75倍)
硫酸镁 0.25g
(用去离子水加至1升)。实施例13
将按上述制备的非重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为100毫升/小时(液体时空速(LHSV)=2.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为80.2％。实施例14
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将反应溶液加热至60℃，然后将70g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量59.7g；纯度99.1％)。实施例15
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将反应溶液加热至60℃，然后将80g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量71.2g；纯度99.1％)。实施例16
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将反应溶液加热至60℃，然后将90g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。向悬浮液中加入90g富马酸并搅拌1小时。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量83.2g；纯度99.1％)。实施例17
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入34.6g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.8。将反应溶液加热至60℃，然后将100g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量93.6g；纯度99.1％)。
从上述实施例14-17的结果看出，优选加入70g或更多的富马酸，这样可使L-天冬氨酸的回收率为60％或更高。实施例18
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表4的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入17.6g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.1。将反应溶液加热至60℃，然后将70g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量87.1g；纯度99.0％)。实施例19
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表4的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入17.6g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.1。将反应溶液加热至60℃，然后将90g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量96.7g；纯度98.5％)。实施例20
将按上述制备的非重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为10毫升/小时(液体时空速(LHSV)=0.2)。由此，完成连续反应。
反应开始后10小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.0％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将反应溶液加热至60℃，然后将90g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量82.8g；纯度99.2％)。实施例21
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向3升该反应溶液中加入87.9g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将反应溶液加热至60℃，然后将270g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用300毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量251.1g；纯度99.2％)。将除去晶体后所得的滤液和用于洗涤所述饼的溶液合并并减压浓缩。用70.0g 25％氨水溶液补充该溶液并用去离子水制成3升。
将该溶液用作随后反应的起始底物溶液。即通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将该溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后30分钟，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向2升该反应溶液中加入58.6g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将反应溶液加热至60℃，然后将180g富马酸加至反应溶液。搅拌反应混合物以得到富马酸晶体完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用200毫升水洗涤饼并干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量188.6g；纯度99.2％)。将除去晶体后所得的滤液和用于洗涤所述饼的溶液合并并减压浓缩。用46.7g25％氨水溶液补充该溶液并用去离子水制成2升。
将该溶液用作随后反应的起始底物溶液。即通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将该溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后30分钟，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.5。将反应溶液加热至60℃，然后将90g富马酸加至反应溶液。搅拌反应混合物以得到富马酸晶体完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用200毫升水洗涤饼并干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量95.6g；纯度99.2％)。实施例22
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表3的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.2％。
向1升该反应溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。将反应溶液加热至60℃，然后将50g(0.5mol)富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量50.3g；纯度99.3％)。比较实施例2
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表7的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.7％。
向1升该反应溶液中加入58.6g的25％氨水溶液。将反应溶液加热至60℃，然后将100g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量55.5g；纯度99.2％)。
该结果表明，不用NaOH的反应导致以低产率生产晶体L-天冬氨酸。实施例23
将上述重组固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜。将其中的50毫升装到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的热绝缘材料覆盖柱外层以保持柱内部温度的恒定。通过用热绝缘材料缠绕的Teflon管，将表8的底物溶液(已用恒温水浴保持在20℃)加至柱中，底物通过柱的流速为500毫升/小时(液体时空速(LHSV)=10.0)。由此，完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应溶液。结果发现L-天冬氨酸作为反应产物与消耗的富马酸约等摩尔，其中富马酸向L-天冬氨酸的转化率为99.4％。
向1升该反应溶液中加入14.7g的25％氨水溶液。反应溶液的pH为9.1。将反应溶液加热至60℃，然后将70g富马酸加至反应溶液中。搅拌反应混合物以得到富马酸完全溶解的均匀溶液。将该溶液逐渐冷却并同时搅拌。在温度为45℃左右时，在溶液中开始出现L-天冬氨酸晶体。将该悬浮液进一步冷却至30℃并在此温度再搅拌30分钟。将悬浮液过滤，彻底压紧所得的饼以从中除去液体成分。用100毫升水洗涤饼然后干燥得到晶体L-天冬氨酸(产量29.3g；纯度99.4％)。
如上所述，根据本发明，可以以良好的加工性生产高纯度的晶体L-天冬氨酸而无需任何复杂步骤。
已参考许多实施方案详细描述了本发明，在本发明较宽的方面，可进行改变和修饰而不偏离本发明，这对于本领域技术人员是显而易见的，因此，本发明权利要求覆盖落在本发明真正精神内的所有所述改变和修饰。
本文所引用的所有文献、专利和专利申请均全文引入本文作为参考。
以下是本文所述序列的资料：
序列表
SEQ ID NO:1的资料：
(Ⅰ)序列特征：
(A)序列长度：1573
(B)序列类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA到mRNA
(ⅵ)来源：大肠杆菌
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1ggggataatc gtcggtcgaa aaacattcga aaccacatat attctgtgtg tttaaagcaa 60atcattggca gcttgaaaaa gaaggttcac atg tca aac aac att cgt atc gaa 114
Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu
1 5gaa gat ctg ttg ggt acc agg gaa gtt cca gct gat gcc tac tat ggt 162Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly
10 15 20gtt cac act ctg aga gcg att gta aac ttc tat atc agc aac aac aaa 210Val His Thr Leu Arg Ala Ile Val Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys25 30 35 40atc agt gat att cct gaa ttt gtt cgc ggt atg gta atg gtt aaa aaa 258Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys
45 50 55gcc gca gct atg gca aac aaa gag ctg caa acc att cct aaa agt gta 306Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val
60 65 70gcg aat gcc atc att gcc gca tgt gat gaa gtc ctg aac aac gga aaa 354Ala Ash Ala Ile Ile Ala Ala Cys Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys
75 80 85tgc atg gat cag ttc ccg gta gac gtc tac cag ggc ggc gca ggt act 402Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr
90 95 100tcc gta aac atg aac acc aac gaa gtg ctg gcc aat atc ggt ctg gaa 450Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu105 110 115 120ctg atg ggt cac caa aaa ggt gaa tat cag tac ctg aac ccg aac gac 498Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp
125 130 135cat gtt aac aaa tgt cag tcc act aac gac gcc tac ccg acc ggt ttc 546His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe
140 145 150cgt atc gca gtt tac tct tcc ctg att aag ctg gta gat gcg att aac 594Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn
155 160 165caa ctg cgt gaa ggc ttt gaa cgt aaa gct gtc gaa ttc cag gac atc 642Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile
170 175 180ctg aaa atg ggt cgt acc cag ctg cag gac gca gta ccg atg acc ctc 690Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu185 190 195 200ggt cag gaa ttc cgc gct ttc agc atc ctg ctg aaa gaa gaa gtg aaa 738Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys
205 210 215aac atc caa cgt acc gct gaa ctg ctg ctg gaa gtt aac ctt ggt gca 786Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala
220 225 230aca gca atc ggt act ggt ctg aac acg ccg aaa gag tac tct ccg ctg 834Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu
235 240 245gca gtg aaa aaa ctg gct gaa gtt act ggc ttc cca tgc gta ccg gct 882Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala
250 255 260gaa gac ctg atc gaa gcg acc tct gac tgc ggc gct tat gtt atg gtt 930Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val265 270 275 280cac ggc gcg ctg aaa cgc ctg gct gtg aag atg tcc aaa atc tgt aac 978His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn
285 290 295gac ctg cgc ttg ctc tct tca ggc cca cgt gcc ggc ctg aac gag atc 1026Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile
300 305 310aac ctg ccg gaa ctg cag gcg ggc tct tcc atc atg cca gct aaa gta 1074Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val
315 320 325aac ccg gtt gtt ccg gaa gtg gtt aac cag gta tgc ttc aaa gtc atc 1122Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val Ash Gln Val Cys Phe Lys Val Ile
330 335 340ggt aac gac acc act gtt acc atg gca gca gaa gca ggt cag ctg cag 1170Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln345 350 355 360ttg aac gtt atg gag ccg gtc att ggc cag gcc atg ttc gaa tcc gtt 1218Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val
365 370 375cac att ctg acc aac gct tgc tac aac ctg ctg gaa aaa tgc att aac 1266His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn
380 385 390ggc atc act gct aac aaa gaa gtg tgc gaa ggt tac gtt tac aac tct 1314Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser
395 400 405atc ggt atc gtt act tac ctg aac ccg ttc atc ggt cac cac aac ggt 1362Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly
410 415 420gac atc gtg ggt aaa atc tgt gcc gaa acc ggt aag agt gta cgt gaa 1410Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu425 430 435 440gtc gtt ctg gaa cgc ggt ctg ttg act gaa gcg gaa ctt gac gat att 1458Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile
445 450 455ttc tcc gta cag aat ctg atg cac ccg gct tac aaa gca aaa cgc tat 1506Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr
460 465 470act gat gaa agc gaa cag taatcgtaca gggtagtaca aataaaaaag 1554Thr Asp Glu Ser Glu Gln
475gcacgtcaga tgacgtgcc 1573SEQ ID NO:2的资料：(Ⅰ)序列特征：
(A)序列长度：20
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ IDNO:2
ggataatcgt cggtcgaaaaSEQ ID NO:3:(Ⅰ)序列特征：
(A)序列长度：19
(B)序列类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3
cgtcatctga cgtgccttt
Claims (12)
1．生产晶体L-天冬氨酸的方法，该方法包括下列步骤：制备含富马酸、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液，将混合溶液与天冬氨酸酶反应以得到含L-天冬氨酸盐的反应溶液并使L-天冬氨酸从反应溶液中结晶出，其中再将额外量的氨加至含L-天冬氨酸盐的反应溶液中，然后将富马酸加至其中以结晶L-天冬氨酸。
2．权利要求1的方法，其中将L-天冬氨酸结晶后仍留在反应溶液中的未结晶的天冬氨酸分离出来，将氨加至溶液中，将所得溶液作为生产晶体L-天冬氨酸过程中的部分起始反应溶液再循环。
3．生产晶体L-天冬氨酸的方法，该方法包括下列步骤：制备含富马酸、L-天冬氨酸铵、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液，将混合溶液与天冬氨酸酶反应以得到含L-天冬氨酸盐的反应溶液并使L-天冬氨酸从反应溶液中结晶出，其中再将额外量的氨加至含L-天冬氨酸盐的反应溶液中，然后将富马酸加至其中以结晶L-天冬氨酸。
4．生产晶体L-天冬氨酸的方法，该方法包括下列步骤：制备含富马酸、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液，将混合溶液与天冬氨酸酶反应以得到含L-天冬氨酸盐的反应溶液并使L-天冬氨酸从反应溶液中结晶出，其中再将额外量的氨加至含L-天冬氨酸盐的反应溶液中，将反应溶液加热，将富马酸加至反应溶液中，将反应溶液冷却以结晶L-天冬氨酸。
5．权利要求4的方法，其中将L-天冬氨酸结晶后仍留在反应溶液中的未结晶的天冬氨酸分离出来，将氨加至溶液中，将所得溶液作为生产晶体L-天冬氨酸过程中的部分起始反应溶液再循环。
6．生产晶体L-天冬氨酸的方法，该方法包括下列步骤：制备含富马酸、L-天冬氨酸铵、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液，将混合溶液与天冬氨酸酶反应以得到含L-天冬氨酸盐的反应溶液并使L-天冬氨酸从反应溶液中结晶出，其中将额外量的氨加至含L-天冬氨酸盐的反应溶液中，将反应溶液加热，将富马酸加至反应溶液中，将反应溶液冷却以结晶L-天冬氨酸。
7．权利要求1-6的任一方法，其中混合溶液中碱金属氢氧化物的量是溶液中所含富马酸盐和L-天冬氨酸盐总摩尔量的0.1-1倍。
8．权利要求1-7的任一方法，其中用于结晶L-天冬氨酸所加的富马酸量是含有L-天冬氨酸的反应溶液中所含富马酸盐和L-天冬氨酸盐总摩尔量的0.6-1.2倍。
9．权利要求1-8的任一方法，其中的天冬氨酸酶是通过将携带天冬氨酸酶基因的转化体或所述转化体的产物固定到载体上而制得的固定化天冬氨酸酶。
10．权利要求1-9的任一方法，其中使含富马酸、L-天冬氨酸、氨和碱金属氢氧化物的混合溶液以2-20的液体时空速流过反应器，所述混合溶液含有以富马酸计浓度为8-20％的富马酸和L-天冬氨酸，所述反应器含具有250U或更高天冬氨酸酶活力的固定化天冬氨酸酶。
11．权利要求1-10的任一方法，其中通过将具有天冬氨酸酶活性的微生物细胞或所述微生物细胞的产物吸附到离子交换树脂上或通过将含微生物细胞或所述微生物细胞之产物的聚合物包被到离子交换树脂上，来制备固定化天冬氨酸酶。
12．权利要求1-11的任一方法，其中通过将具有天冬氨酸酶活性的微生物细胞或所述微生物细胞的产物与式(Ⅰ)聚合物混合，然后将所述混合物包被到球形苯乙烯/二乙烯基苯共聚物离子交换树脂颗粒的表面来制备所述固定化天冬氨酸酶L：
其中Y表示直接键或选自下列分子式的双功能基团：
或
R1和R2各自独立地是氢原子或有机残基，X是阴离子，n是100-5000的整数。
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