CN1271017A - 用于生产木糖醇的方法 - Google Patents

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Abstract

通过使微生物作用于D－木酮糖以生产木糖醇,并且收集生产的木糖醇,将D－木酮糖高效地转化成木糖醇,所说的微生物由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过并且具有还原能力。

Description

用于生产木糖醇的方法
本发明涉及一种用于生产木糖醇的方法。木糖醇在食品工业、药物等领域中是很有用的。
预计在将来对木糖醇这种天然存在的糖醇的需求将会增加。由于木糖醇具有较低的热量并且显示出可与蔗糖相比的甜度，因此它是一种很有前途的低热量的甜味剂。此外，由于其抗龋齿的特性，因此它被用作一种预防龋齿的甜味剂。再者，由于木糖醇并不增加血液中葡萄糖的水平，因此将其用于治疗糖尿病的流质疗法(fluid therapy)中。
正如在美国专利4,008,825中公开的那样，目前木糖醇的工业化生产主要依赖于D-木糖的氢化。用作原材料的D-木糖是通过诸如树木、稻草、玉米穗轴、燕麦壳这样的植物材料以及其它富含木聚糖的物质的水解获得的。
但是，通过植物材料的水解生产的这种D-木糖具有相当昂贵这样的缺点，并且这是由高的生产成本造成的。例如，水解处理植物材料的低产率导致生产的D-木糖的纯度很低。因此，在水解处理后必须通过离子交换处理除去用于水解的酸和染料，而得到的D-木糖必须进一步进行结晶以除去其它的半纤维素糖类。为了得到适合于食品的D-木糖，将需要进一步的纯化。这种离子交换处理和结晶处理导致了生产成本的增加。
因此，已经开发了几种用于生产木糖醇的方法，它们都采用了易于得到的原材料并且产生了极少的废物。例如，现已开发出了采用其它的戊糖醇作为起始材料来生产木糖醇的方法。一种这种易于得到的戊糖醇是D-阿拉伯糖醇，并且D-阿拉伯糖醇可以通过使用酵母来产生(《Can.J.Microbiol.》，31，1985，467-471；《遗传微生物学杂志》139，1993，1047-54)。
已开发了几种采用D-阿拉伯糖醇作为原材料来生产木糖醇的方法。《应用微生物学》18，1031-1035(1969)报道了一种方法，通过使用汉逊氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)ATCC20121进行发酵由葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇，随后使用弱氧化醋杆菌将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖，并且进一步在季也蒙氏假丝酵母soya变种的作用下将D-木酮糖转化成木糖醇。
但是，该方法使用5.3％的阿拉伯糖醇花费112个小时才得到木糖醇，产率为39％，因此仍然存在着改进其产率和生产能力的空间。
EP 403 392A(Roquette Freres)和EP421 882A(Roquette Freres)公开了一些方法，所述方法包括通过使用抗渗透作用的酵母进行发酵来生产D-阿拉伯糖醇，然后使用属于醋杆菌属、葡糖杆菌属或克雷白氏杆菌属的细菌将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖，通过葡萄糖(木糖)异构酶的作用由D-木酮糖生成木糖和D-木酮糖的混合物，以及通过氢化反应将得到的木糖和D-木酮糖的混合物转化成木糖醇。另外还公开了木糖醇的生产方法，包括初步浓缩木糖和D-木酮糖的混合物中的木糖，并且通过氢化反应将木糖转化成木糖醇。
但是，以上提及的那些用于生产木糖醇的方法采用了通过发酵生产的D-阿拉伯糖醇作为起始材料，并且通过多个工艺步骤将其转化。因此，这些方法非常复杂，并且考虑到方法的经济性是不太令人满意的。
为了解决上述问题，本发明的发明人已经发现了具有将D-阿拉伯糖醇直接转化成木糖醇的能力的微生物，并且开发了一种生产木糖醇的方法，该方法包括使这些微生物作用于D-阿拉伯糖醇，并且收获所生产的木糖醇(日本专利申请10-258962)。并且他们分析了这些微生物，指出D-阿拉伯糖醇脱氢酶的活性和D-木酮糖还原酶(木糖醇脱氢酶)的活性参与了这一转化反应。而且，他们发现通过加入碳源或NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为还原性物质来进行反应，可以以高产率稳定地生产木糖醇(日本专利申请10-258961)。
本发明的一个目的是提供一种利用上述发现高效地进行D-木酮糖至木糖醇的转化的方法。
作为致力于实现上述目的的本发明发明人的研究结果，发现通过使用具有增强的木糖醇脱氢酶活性的并具有还原能力(ability to supply reducing power)的微生物可以高效地由D-木酮糖生产木糖醇，并由此完成了本发明。
即，本发明提供了一种用于生产木糖醇的方法，该方法包括下列步骤：使由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并具有还原能力的微生物与D-木酮糖反应以生产木糖醇，以及收集生产的木糖醇。
根据本发明前述方法的一个优选的实施方案，具有还原能力的微生物为属于埃希氏杆菌属的细菌。作为属于埃希氏杆菌属的这类细菌，可以提到的有大肠杆菌。
根据本发明前述方法的另一优选的实施方案，所述方法包括下列步骤：使具有将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖能力的微生物与D-阿拉伯糖醇反应以生产D-木酮糖，以及使所生产的D-木酮糖与由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并且具有还原能力的微生物反应。
根据本发明前述方法的一个更为优选的实施方案，所述方法包括下列步骤：在合适的培养基中培养具有从葡萄糖生产D-木酮糖能力的微生物以生产D-木酮糖，以及在所述的培养基中使所生产的D-木酮糖与由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并且具有还原能力的微生物反应。
本发明还提供了一种用于生产木糖醇的方法，该方法包括下列步骤：在含有D-阿拉伯糖醇的培养基中培养由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并且具有还原能力的微生物和具有将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖能力的微生物以生产木糖醇，以及收集生产的木糖醇。
本发明进一步提供了一种用于生产木糖醇的方法，该方法包括下列步骤：在一种合适的培养基中培养由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并且具有还原能力的微生物和具有从葡萄糖生产D-木酮糖能力的微生物以生产木糖醇，以及收集生产的木糖醇。
此后将更为详细地解释本发明。
本发明所用的微生物为由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并且具有还原能力的微生物。具有所述能力的微生物可以称之为“本发明的微生物”。
本发明的微生物可以通过用编码木糖醇脱氢酶的基因转化具有还原能力的微生物来得到。本发明所用的术语“具有还原能力”指的是一种为了还原D-木酮糖使其转化成木糖醇，以足以使所述反应进行的量提供NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的能力，所述的反应是由木糖醇脱氢酶(D-木酮糖还原酶)催化的。如上所述，已经暗示着当通过使用具有将D-阿拉伯糖醇直接转化成木糖醇的能力的微生物以生产木糖醇时，所观察到的未反应的D-木酮糖剩余的原因是没有充分地提供该反应所需的NADH。并且本发明的发明人已经发现当把碳源或NADH加入由D-阿拉伯糖醇至木糖醇的转化反应中时，该反应高效地进行着。相反地，当用编码木糖醇脱氢酶的基因转化微生物时，在向反应体系中不加碳源或NADH的情况下D-木酮糖的还原反应仍充分进行时该反应借助的微生物为具有本发明所称的具有还原能力的微生物。更具体地讲，当在合适的反应条件下使所述的微生物作用于浓度为5％的D-木酮糖时，以85％的产率生产木糖醇的微生物为本发明的具有还原能力的微生物。这种微生物的实例例如包括属于埃希氏杆菌属的细菌。作为这样的一种属于埃希氏杆菌属的细菌，可以提到的有大肠杆菌。
具体地讲，为了用编码木糖醇脱氢酶的基因转化具有还原能力的微生物，可以通过把编码木糖醇脱氢酶的基因片段连接到在所述微生物中起作用的载体(优选多拷贝型载体)上来制备重组DNA，以及将所述重组DNA引入所述微生物中以便转化该微生物。
作为编码木糖醇脱氢酶的基因的来源，只要含有木糖醇脱氢酶，那么可以使用任何微生物。这类微生物的实例例如包括蜡状葡糖杆菌、氧化葡糖杆菌、醋化醋杆菌、液化醋杆菌、巴氏醋杆菌、金黄弗拉特氏菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、雷氏变形菌、粘质沙雷氏菌、美棒杆菌、产氨短杆菌、橙色黄杆菌、莱茵黄杆菌、Pseudomonas badiofaciens、绿针假单胞菌、懒惰假单胞菌、紫红红球菌、粘无色杆菌、根癌土壤杆菌、放射形土壤杆菌、石蜡节杆菌、Arthrobacterhydrocarboglutamicus、印度固氮菌、酮戊二酸短杆菌、Corynebacterium faciens、解淀粉欧文氏菌、外来黄杆菌、染色黄杆菌、Micrococcus sp.CCM825、不透明诺卡氏菌、Planococcus eucinatus、类黄假单胞菌、红串红球菌、摩氏摩根氏菌、马杜拉马杜拉放线菌、紫产色放线菌、天蓝色链霉菌、浅黄链霉菌、浅灰琏霉菌、浅青紫链霉菌、橄榄链霉菌、田无链霉菌、弗吉尼亚链霉菌、抗生链霉菌、可可链霉菌、淡紫灰链霉菌、具柄毕赤氏酵母等。
在前面提到的微生物中，已经报道了例如来源于具柄毕赤氏酵母(《FEBSLett.》324，9(1993))和摩氏摩根氏菌(DDBJ/GenBank/EMBL登记号L34345)的编码木糖醇脱氢酶的基因的核苷酸序列，因此通过在编码木糖醇脱氢酶的这些基因的核苷酸序列的基础上合成引物以及使用诸如摩氏摩根氏菌ATCC25829之类的微生物的染色体DNA作模板进行聚合酶链式反应(PCR：参见White，T.J.等人《遗传学趋势》5，185(1989))便可以得到所述的编码木糖醇脱氢酶的基因。所述引物的具体的例子包括用于扩增摩氏摩根氏菌的编码木糖醇脱氢酶的基因的寡核苷酸，它具有序列表中如SEQ ID NOD：1和2所示的核苷酸序列。
用于将编码木糖醇脱氢酶的基因引入宿主微生物的载体可以是任意的载体，而只要它能在所述的宿主微生物中繁殖就行。其具体的例子包括质粒载体，诸如pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19和pUC18。
为了通过把所述编码木糖醇脱氢酶的基因连接到在埃希氏杆菌属的细菌中起作用的载体上以制备出含有所述基因的重组DNA，可以用与编码木糖醇脱氢酶的基因的末端序列相匹配的限制酶消化该载体，这就可以连接所述的两个序列。通常通过使用诸如T4 DNA连接酶之类的连接酶来实现所述的连接。
通过针对大肠杆菌所报道的方法[诸如D.A.Morrison的方法(《酶学中的方法》68，326(1979))]或者通过其中用氯化钙处理受体细胞来增加DNA的通透性的方法(Mandel，M.与Higa，A.《分子生物学杂志》53，159(1970))，可以把如上所述制得的重组质粒引入宿主微生物中。另一方面，通过使用转导、转座子(Berg，D.E.与Berg，C.M.《生物/技术》1，417(1983))、Mu噬菌体(日本专利延迟公开[公开]2-109985)或同源重组(《分子遗传学中的实验》冷泉港实验室(1972))的方法，也可以将编码木糖醇脱氢酶的基因掺入到宿主的染色体中。
作为用于表达编码木糖醇脱氢酶的基因的启动子，当对编码木糖醇脱氢酶的基因具有特异性的启动子在宿主细胞中起作用时，便可以使用该启动子。另一方面，还可能把一个外源启动子连接到编码木糖醇脱氢酶的DNA上，以便在该启动子的控制下得到表达。当把埃希氏杆菌属的细菌用作宿主时，作为这样的一种启动子，可以使用lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子和PL启动子、tet启动子、amyE启动子、spac启动子等。而且，还可能使用含有类似于pUC19的启动子的表达载体，并将编码木糖醇脱氢酶的DNA片段插入所述载体中，从而可以在所述启动子的控制下表达所述的片段。
当微生物含有编码木糖醇脱氢酶的基因时，通过用一个诸如所述基因自身的启动子这样的更强的序列代替表达调节序列便可以增强木糖醇脱氢酶的活性(参见日本专利延迟公开1-215280)。例如，所有在前面提到的在埃希氏杆菌属的细菌中起作用的启动子被认为是强启动子。
用于制备染色体DNA、PCR、制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化、设计和合成用作引物的寡核苷酸等的方法可以是本领域普通技术人员众所周知的常用的方法。这类方法例如在Sambrook J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的《分子克隆：实验室手册，第二版》(冷泉港实验室出版社(1989))等文献中进行了描述。
通过使用如上所述得到的编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并且具有还原能力的微生物作用于D-木酮糖以及收集生产的木糖醇便可以生产木糖醇。
用于培养由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的微生物的培养基可以是常用的培养基，它含有适合于所述微生物的碳源、氮源、无机离子，并且如果需要的话还含有其它的有机成分。
作为碳源，可能使用糖，诸如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解产物；醇类，诸如甘油或山梨醇；或者有机酸，诸如富马酸、柠檬酸或琥珀酸。
作为氮源，可能使用无机铵盐，诸如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵；有机氮，诸如大豆水解产物；氨气；或氨水。
使以合适的量含有作为有机痕量营养物的所需物质，诸如维生素或酵母提取物，是合乎需要的。除上面的物质以外，如果需要的话，再加入少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
优选在需氧条件下进行培养16-120小时。在培养的过程中，培养温度优选控制在25℃至45℃，pH优选控制在5-8。可以使用无机的或有机的、酸性的或者碱性的物质以及氨气等物质来调节pH。
通过使含有如上所述培养过的细胞的培养物、从所述培养物中分离和收集的细胞、经历了丙酮处理或冷冻干燥的处理过的细胞、从上述细胞或处理过的细胞制得的无细胞提取物、诸如从上述无细胞提取物中分级分离出的膜组分之类的组分、或者通过将这些细胞、处理过的细胞、无细胞提取物以及组分固定化而生产的固定化物质与D-木酮糖接触并且使所述的反应进行，便可以在反应混合物中生产木糖醇。所述的微生物可以由一种微生物组成，或者使用任意的两种或多种微生物的混合物。
通过在含有D-木酮糖的培养基中培养本发明所述的微生物，也可以在该培养基中生产木糖醇。当通过任意的方法可以生产D-木酮糖时，例如通过使具有将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖能力的微生物作用于D-阿拉伯糖醇而生产的D-木酮糖优选可以用于本发明。而且，通过使用具有从葡萄糖生产D-木酮糖能力的微生物以生产的D-木酮糖也可以用于本发明。
如果向反应混合物或培养基中加入了葡萄糖或者甘油的话(其中葡萄糖或甘油是当使本发明的微生物或者由所述微生物得到的处理过的材料作用于D-木酮糖时使用的)，可以提高由D-木酮糖至木糖醇的转化率。
例如，通过在含有D-阿拉伯糖醇的培养基中培养具有将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖能力的微生物，然后使用相同的培养基培养本发明所述的微生物，也可以由D-阿拉伯糖醇生产木糖醇。而且，通过在合适的培养基中培养具有从葡萄糖生产D-木酮糖能力的微生物，然后使用相同的培养基培养本发明的微生物，也可以由葡萄糖生产木糖醇。此外，通过在合适的培养基中与具有将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖能力的微生物或者与具有从葡萄糖生产D-木酮糖能力的微生物一起培养本发明所述的微生物，也可以生产木糖醇。
具有将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖能力的微生物的实例例如包括属于葡糖杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、短杆菌属、棒杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、微球菌属、摩根氏菌属、诺卡氏菌属、动性球菌属、变形菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、红球菌属、芽孢八叠球菌属、葡萄球菌属、弧菌属、马杜拉放线菌属、放线菌属、北里孢菌属、链霉菌属、气单胞菌属、金杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、微杆菌属、沙雷氏菌属、沙门氏菌属或黄单胞菌属的微生物。
更具体地讲，上面提到的微生物的实例包括氧化葡糖杆菌、浅井氏葡糖杆菌、德尔马瓦无色杆菌、粘无色杆菌、乳无色杆菌、根癌土壤杆菌、放射形土壤杆菌、粪产碱杆菌、柠檬节杆菌、肿胀节杆菌、石蜡节杆菌、Arthrobacterhydrocarboglutamicus、氧化节杆菌、天牛金杆菌、印度固氮菌、产氨短杆菌、扩展短杆菌、乳发酵短杆菌、黄色短杆菌、Brevibacterium globosum、暗褐短杆菌、酮戊二酸短杆菌、微黄短杆菌、极小短杆菌、砖红色短杆菌、玫瑰色短杆菌、Brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌、原玻璃蝇短杆菌、嗜乙酰棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、美棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、产气肠杆菌、解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、草生欧文氏菌、菊欧文氏菌、奇异黄杆菌、染色黄杆菌、橙色黄杆菌、莱茵黄杆菌、塞沃尼黄杆菌、短黄杆菌、脑膜脓毒性黄杆菌、Micrococcus sp.CCM825、摩氏摩根氏菌、不透明诺卡氏菌、粗糙诺卡氏菌、Planococcus eucinatus、雷氏变形菌、谢氏丙酸杆菌、类黄假单胞菌、产氨假单胞菌、荧光假单胞菌、卵状假单胞菌、司徒茨氏假单胞菌、食酸假单胞菌、霉味假单胞菌、睾丸酮假单胞菌、铜绿假单胞菌、红串红球菌、紫红红球菌、Rhodococcussp.ATCC 15592、Rhodococcus sp.ATCC 19070、脲芽孢八叠球菌、金黄色葡萄球菌、梅氏弧菌、干酪弧菌、马杜拉马杜拉放线菌、紫产色放线菌、Kitasatosporiaparulosa、天蓝色链霉菌、浅黄链霉菌、浅灰链霉菌、变青链霉菌、橄榄链霉菌、田无链霉菌、弗吉尼亚链霉菌、抗生链霉菌、可司链霉菌、淡紫灰链霉菌、绿色产色链霉菌、杀鲑气单胞菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、大肠杆菌、弗氏埃希氏杆菌、嗜氨微杆菌、粘质沙雷氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、薛氏沙门氏菌、相橘黄单胞菌等。
此外，作为具体的细菌菌株提到了下列菌株：
氧化葡煻杆菌ATCC621
弱氧化葡糖杆菌NRRL B-755
氧化葡糖杆菌氧化亚种IFO14819
氧化葡糖杆菌IAM1842
浅井氏葡糖杆菌IFO3276
德尔马瓦无色杆菌AJ1983
粘无色杆菌ATCC12448
乳无色杆菌AJ2394
根癌土壤杆菌ATCC4720
粪产碱杆菌IAM1015
柠檬节杆菌ATCC11624
肿胀节杆菌ATCC6947
石蜡节杆菌ATCC15590
石蜡节杆菌ATCC15591
石蜡节杆菌ATCC19064
石蜡节杆菌ATCC19065
Arthrobacter hydrocarboglutamicus ATCC15583
氧化节杆菌ATCC14358
印度固氮菌ATCC9037
扩展短杆菌ATCC14020
乳发酵短杆菌ATCC13655
乳发酵短杆菌ATCC13869
黄色短杆菌ATCC13826
黄色短杆菌ATCC21406
Brevibacterium globosum AJ1563
暗褐短杆菌AJ3124
酮戊二酸短杆菌ATCC15587
酮戊二酸短杆菌ATCC15588
微黄短杆菌ATCC11822
极小短杆菌ATCC19096
砖红色短杆菌AJ1464
玫瑰色短杆菌ATCC13825
Brevibacterium immariophilium ATCC14068
扩展短杆菌ATCC8377
原玻璃蝇短杆菌AJ3125
嗜乙酰棒杆菌NRRLB3421
谷氨酸棒杆菌ATCC13059
美棒杆菌ATCC15991
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC21407
醋谷棒杆菌ATCC15806
产气肠杆菌ATCC13048
解淀粉欧文氏菌IFO12687
胡萝卜软腐欧文氏菌CCM969
胡萝卜软腐欧文氏菌AJ2992
草生欧文氏菌ATCC23822
菊欧文氏菌ATCC11662
奇异黄杆菌CCM1080-A
染色黄杆菌AJ2478
橙色黄杆菌AJ2466
莱茵黄杆菌AJ2468
塞沃尼黄杆菌AJ2476
短黄杆菌ATCC14234
脑膜脓毒性黄杆菌ATCC13253
Micrococcus sp.CCM825
不透明诺卡氏菌NCIB9409
粗糙诺卡氏菌NCIB8926
Planococcus eucinatus AJ1656
雷氏变形菌NRRL B-11344
雷氏变形菌AJ2769
雷氏变形菌AJ2770
摩氏摩根氏菌AJ2771
谢氏丙酸杆菌IAM1725
类黄假单胞菌ATCC796
产氨假单胞菌IFO12693
荧光假单胞菌IFO3757
荧光假单胞菌ATCC13525
卵状假单胞菌IAM1201
司徒茨氏假单胞菌IAM1504
食酸假单胞菌ATCC9355
霉味假单胞菌ATCC4685
睾丸酮假单胞菌ATCC17409
铜绿假单胞菌ATCC15528
红串红球菌ATCC11048
紫红红球菌ATCC4273
紫红红球菌ATCC21199
紫红红球菌ATCC21198
紫红红球菌ATCC19149
紫红红球菌ATCC21197
Rhodococcus sp.ATCC15592
Rhodococcus sp.ATCC19070
脲芽孢八叠球菌AJ1232
金黄色葡萄球菌IFO3761
梅氏弧菌ATCC7708
干酪弧菌AJ2807
马杜拉马杜拉放线菌ATCC19425
紫产色放线菌IFO13100
Kitasatosporia parulosa AJ9458
天蓝色链霉菌ATCC10147
浅黄链霉菌AJ9012
浅灰链霉菌NRRL B-1062
变青链霉菌IFO13385
橄榄链霉菌ATCC21379
田无链霉菌ATCC15238
弗吉尼亚链霉菌AJ9053
抗生链霉菌NRRL3238
可可链霉菌ATCC19093
淡紫灰链霉菌ATCC8664
绿色产色链霉菌IFO3113
杀鲑气单胞菌ATCC14174
天牛金杆菌ATCC19272
短小芽孢杆菌IAM1244
环状芽孢杆菌ATCC9966
解硫胺素芽孢杆菌IAM103
大肠杆菌ATCC10798
大肠杆菌IAM1204
大肠杆菌IAM1239
大肠杆菌IAM1518
大肠杆菌IAM1519
大肠杆菌IAM1137
弗氏埃希氏杆菌IFM S-36
嗜氨微杆菌ATCC15354
粘质沙雷氏菌CCM958
鼠伤寒沙门氏菌AJ2636
薛氏沙门氏菌ATCC8759
柑橘黄单胞菌IAM1648。
在1984年1月20日将乳无色杆菌AJ2394保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-7401。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6981。
在1987年7月11日将砖红色短杆菌AJ1464保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-9469。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6984。
在1995年2月23日将原玻璃蝇短杆菌AJ3125保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-14784。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6985。
在1987年1月19日将胡萝卜软腐欧文氏菌AJ2992保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-9135。在1987年10月27日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-1538。
在1984年1月20日将橙色黄杆菌AJ2466保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-7402。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6982。
在1985年9月30日将莱茵黄杆菌AJ2468保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-8459。在1988年4月21日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-1862。
在1983年4月25日将塞沃尼黄杆菌AJ2476保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-7052。在1984年2月2日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-476。
在1987年7月11日将鼠伤寒沙门氏菌AJ2636保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-9470。在1998年11月2日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6566。
在1978年7月13日将雷氏变形菌NRRL B-11344以国际保藏的形式保藏在农业研究服务培养物保藏中心中，保藏号为NRRL B-11344。
在1985年11月28日将雷氏变形菌AJ2770以国际保藏的形式保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM BP-941。
在1983年4月25日将脲芽孢八叠球菌AJ1232保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-7050。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6979。
在1983年4月25日将染色黄杆菌AJ2478保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-7053。在1998年9月9日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6492。
在1987年1月19日将Planococcus eucinatus AJ1656保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-9133。在1998年9月9日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6493。
在1983年4月25日将雷氏变形菌AJ2769保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-7057。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6980。
在1983年4月25日将干酪弧菌AJ2807保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-7060。在1997年3月4日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-5848。
在1998年1月16日将德尔马瓦无色杆菌AJ1983保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-16593。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6988。
在1998年1月16日将Brevibacterium globosum AJ1563保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-16590。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6987。
在1985年4月23日将暗褐短杆菌AJ3124保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-8194。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6983。
在1998年1月16日将摩氏摩根氏菌AJ2771保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-16594。在1998年9月9日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6496。
在1998年1月16日将Kitasatosporia parulosa AJ9458保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-16588。在2000年1月6日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6986。
在1998年1月16日将浅黄链霉菌AJ9012保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-16585。在1998年9月9日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6494。
在1998年1月16日将弗吉尼亚链霉菌AJ9053保藏在国际贸易与工业部工业科学与技术机构的发酵研究所(目前为国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究所)中，保藏号为FERM P-16587。在1998年9月9日将该菌株转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6495。
胡萝卜软腐欧文氏菌CCM969、奇异黄杆菌CCM1080-A、Micrococcus sp.CCM825和粘质沙雷氏菌CCM958可以从Czechoslovak微生物保藏中心得到(地址：Tvrdeho 14，Bmo CS-60200，Czechoslovakia)。
不透明诺卡氏菌NCIB9409和粗糙诺卡氏菌NCIB8926可以从国家工业与海洋细菌保藏中心得到(地址：NCIMB Lts.，Torry研究站，135 Abbey街，Aberdeen AB98DG，英国)。
氧化葡糖杆菌氧化亚种IFO14819、浅井氏葡糖杆菌IFO3276、金黄色葡萄球菌IFO3761、解淀粉欧文氏菌IFO12687、紫产色放线菌IFO13100、变青链霉菌IFO13385和绿色产色链霉菌IFO3113可以从大阪的发酵研究所得到(地址：17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，大阪532，日本)。
氧化葡糖杆菌IAM1842、谢氏丙酸杆菌IAM1725、粪产碱杆菌IAM1015、IAM1725、短小芽孢杆菌IAM1244、大肠杆菌IAM1204、大肠杆菌IAM1239、大肠杆菌IAM1518、大肠杆菌IAM1519、大肠杆菌IAM1137以及柑橘黄单胞菌IAM1648可以从分子与细胞生物科学研究所得到(之前为应用微生物学研究所，地址：东京大学，Yayoi 1-chome，Bunkyo-ku，东京，日本)。
弗氏埃希氏杆菌IFM S-36可以从千叶大学的致病真菌与微生物中毒研究中心得到(地址：8-1，Inohara 1-chome，Chuo-ku，Chiba-Shi，千叶，日本)。
其它的菌株可以从美国模式培养物保藏中心得到(地址：12301 Parklawn道，Rockville，马里兰州20852，美国)。
对用于培养这些微生物的培养基并没有具体限制，它可以是含有碳源、氮源和无机离子、并且如果需要的话还含有有机营养物的普通培养基。作为碳源，可以适当地使用比如葡萄糖这样的糖类、比如甘油这样的醇类以及有机酸等。作为氮源，可以使用氨气、氨水、铵盐等。作为无机离子，如果需要的话，可以适当地使用镁离子、磷酸根离子、钾离子、铁离子、锰离子等。作为有机营养物，可以适当地使用维生素、氨基酸、含有这些物质的物质(诸如肝提取物、酵母提取物、麦芽汁、胨、肉膏、玉米浆、酪蛋白分解产物)等。
而且，通过向培养基中加入糖和糖醇(诸如D-木糖、D-木酮糖、D-阿拉伯糖醇和木糖醇)作为所述酶的诱导物，可以提高由D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖的活性。
对培养条件也没有进行具体的限制，例如可以在需氧条件下通过对pH和温度进行适当的控制在pH5-8和在25-40℃的温度范围内进行培养12至72小时。
通过使含有如上所述得到的细胞的培养物、从所述培养物中分离和收集的细胞、经历了丙酮处理或冷冻干燥的处理过的细胞、从上述细胞或处理过的细胞制得的无细胞提取物、诸如从上述无细胞提取物中分级分离出的膜组分之类的组分、或者通过将这些细胞、处理过的细胞、无细胞提取物以及组分固定化而生产的固定化物质与D-阿拉伯糖醇接触并且使所述的反应进行，便可以在反应混合物中生产D-木酮糖。所用的微生物可以由一种微生物组或，或者可以以任意的两种或多种微生物的混合物用作所述的微生物。
一般说来，通过在20-60℃的温度下(可取的是30-40℃)以及pH 4.0-9.0(可取的是pH 6.5-8.0)下进行反应，可以得到好结果。可以以静态的反应或者在搅拌下的反应进行所述的反应。反应时间可以随着诸如所用微生物的活性和D-阿拉伯糖醇的浓度之类的各种条件进行变化，但理想的是1-100小时。而且，通过向反应中加入诸如葡萄糖和乙醇之类的碳源，可以提高D-木酮糖的产率。此外，通过向反应混合物中加入吡咯并喹啉醌，也可以提高D-木酮糖的产率。
再者，通过在含有D-阿拉伯糖醇的培养基中培养前面提到的微生物，便可以与所述的培养同时实现由D-阿拉伯糖醇生成D-木酮糖的反应。
当通过本发明的方法生产木糖醇时，可以以完成所述反应之后的反应混合物的形式使用如上所述生产的D-木酮糖，或者在从该混合物中收集和纯化后使用所述的D-木酮糖。为了从完成所述反应后的反应混合物中收集并分离出D-木酮糖，可以采用使用合成吸附树脂的方法、使用沉淀剂的方法以及其它常用的收集和分离方法。
具有从葡萄糖生产D-木酮糖能力的微生物的例子包括属于葡糖杆菌属、醋杆菌属或弗拉特氏菌属的微生物。
这类微生物的具体的例子包括：蜡状葡糖杆菌、氧化葡糖杆菌、浅井氏葡糖杆菌，醋化醋杆菌、液化醋杆菌、巴氏醋杆菌、金黄弗拉特氏菌等。
具体的细菌菌株包括：
蜡状葡糖杆菌IFO3262
氧化葡糖杆菌ATCC8147
氧化葡糖杆菌IFO3293
氧化葡糖杆菌IAM1839
氧化葡糖杆菌IFO3250
氧化葡糖杆菌IFO3292
氧化葡糖杆菌IFO3294
氧化葡糖杆菌氧化亚种IFO3189
氧化葡糖杆菌弱氧化亚种IFO3172
氧化葡糖杆菌弱氧化亚种IFO3130
醋化醋杆菌木质亚种ATCC14851
液化醋杆菌ATCC14835
巴氏醋杆菌IFO3222
巴氏醋杆菌IFO3223
金黄弗拉特氏菌IFO3245。
氧化葡糖杆菌ATCC621和氧化葡糖杆菌ATCC8147、醋化醋杆菌木质亚种ATCC14851以及液化醋杆菌ATCC14835可以从美国模式培养物保藏中心得到(地址：12301 Parklawn道，Rockville，马里兰州20852，美国)。
蜡状葡糖杆菌IFO3262、氧化葡糖杆菌IFO3293、氧化葡糖杆菌IFO3250、氧化葡糖杆菌IFO3292、氧化葡糖杆菌IFO3294、氧化葡糖杆菌氧化亚种IFO3189、氧化葡糖杆菌弱氧化亚种IFO3172、氧化葡糖杆菌弱氧化亚种IFO3130、巴氏醋杆菌IFO3222、巴氏醋杆菌IFO3223以及金黄弗拉特氏菌IFO3245可以从大阪的发酵研究所得到(地址：17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，大阪532，日本)。
氧化葡糖杆菌IAM1839可以从分子与细胞生物科学研究所得到(之前为东京大学的应用微生物学研究所，地址：Yayoi 1-chome，Bunkyo-ku，东京，日本)。
用于培养前面提到的微生物的培养基可以是含有普通的碳源、氮源、无机离子、并且如果需要的话还含有有机营养物的普通的培养基。
作为碳源，可以适当地使用诸如葡萄糖这样的糖类、诸如甘油这样的醇类、有机酸等。考虑到在用于生产木糖醇的已知方法中观察到的优选方案(例如由诸如D-木糖或D-阿拉伯糖醇之类的戊糖醇生产木糖醇的方法)，优选为诸如葡萄糖和果糖这样的己糖、诸如蔗糖和乳糖这样的二糖、以及诸如淀粉这样的多糖。在培养基中将这些物质以10-60％、优选20-50％的量用作主要的碳源。可以将这些碳源一次加入培养基中，或者分成几部分并在培养时间进程中分批添加。
作为氮源，使用氨气、氨水、铵盐等。作为无机离子，当需要时适当地使用镁离子、磷酸根离子、钾离子、铁离子、锰离子等。作为有机营养物，当需要时使用维生素、氨基酸、含有这些物质的物质(诸如肝提取物、酵母提取物、麦芽汁、胨、肉膏、玉米浆、酪蛋白分解产物)等。
对培养条件也不具体地加以限制。但是一般说来，可以通过对pH和温度进行适当的控制在5-8的pH范围以及25-40℃的温度范围内培养微生物。在通过例如搅拌或振荡通气得到的需氧条件下进行培养。至于培养时间，令人满意的是培养所述的微生物直至消耗了主要的碳源为止，即通常为3-8天。
当通过本发明的方法生产木糖醇时，如上所述在培养基中生产的D-木酮糖可以用作培养基，或者可以在从该培养基中收集和纯化后使用所述的D-木酮糖。为了从培养基中收集并分离出D-木酮糖，可以采用使用合成吸附树脂的方法、使用沉淀剂的方法以及其它常用的收集和分离方法。
可以以常规的方式从反应混合物中分离并收集如上所述生产的木糖醇。更具体地讲，例如通过离心、过滤等方法从反应混合物中除去固体物质后，通过使用活性炭、离子交换树脂等可以对剩余的溶液脱色和脱盐，并且从该溶液中可以结晶出木糖醇。
根据本发明，从葡萄糖、D-阿拉伯糖醇或D-木酮糖可以高效地生产木糖醇。
                      实现本发明的最佳方式
参照下列实施例将更加具体地解释本发明。但本发明却并不限于这些实施例。在所述实施例中，作为原材料的D-阿拉伯糖醇以及所生产的木糖醇和D-木酮糖是在下列条件下通过高效液相层析(HPLC)进行分析的：
柱：Shodex SC1211(Showa Denko，日本)
流动相：50％乙腈/50％ 50ppm的Ca-EDTA水溶液
流速：0.8ml/分钟
温度：60℃
检测：RI检测器实施例1：制备由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的大肠杆菌
在摩氏摩根氏菌ATCC25829菌株的编码木糖醇脱氢酶的已知基因的核苷酸序列(DDBJ/GenBank/EMBL登记号L34345)的基础上，合成出具有如序列表中SEQ ID NO：1和2所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
在常规的条件下使用这些合成的寡核苷酸作引物以及所述菌株的基因组DNA作模板来进行PCR。结果，扩增出含有编码木糖醇脱氢酶的基因的约1.2kb的DNA片段。通过琼脂糖凝胶电泳分离并收集该DNA片段。然后，用EcoRI和BamHI消化该片段的两个末端，并连接到pUC18(Takara Shuzo)的EcoRI和BamHI消化产物上。将这一片段用来转化大肠杆菌JM109，并选出含有编码木糖醇脱氢酶的基因的转化菌株。如果被克隆的片段含有编码木糖醇脱氢酶的基因的话，那么在lac启动子的控制下以与lac Z’基因形成的融合基因的形式进行表达。
如下测定出转化菌株的木糖醇脱氢酶的活性。将在L培养基(1％的胰化蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.5％的NaCl)中培养过夜的细胞进行超声处理，并将上清液用作粗酶溶液。在30℃下在1ml含有100mM甘氨酸缓冲液(pH9.5)、100mM木糖醇、2mM NAD和100μl所述粗酶溶液的反应混合物中进行反应1分钟。基于340nm处吸光值的增加来检测NADH或NADPH的生产。将在前面提到的反应条件下每分钟氧化1μmol木糖醇以生成1μmol NADH的酶活性定义为一个单位。
结果，在转化菌株中鉴定出木糖醇脱氢酶的活性为3.9U/mg，而在用作对照的大肠杆菌JM109(宿主菌株)中没有观察到所述的酶活性。因此，这就证实了所述的转化菌株具有编码木糖醇脱氢酶的基因。实施例2：使用氧化葡糖杆菌和由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的大肠杆菌从D-阿拉伯糖醇生产木糖醇(1)将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖
将氧化葡糖杆菌ATCC621菌株接种到一个含有3ml培养基(pH 6.0)的试管中，其中所述培养基含有2.4％的马铃薯葡萄糖、3％的酵母提取物、0.5％的甘油、3％的甘露糖醇和2％的碳酸钙，并在30℃下培养16小时。然后将上述培养基以5％的量接种到一个体积为500-ml的含有50ml培养基(pH6.0)的烧瓶中，其中所述培养基含有0.5％的酵母提取物(w/v)、0.5％的胨、0.5％的牛肉膏、0.5％的硫酸铵、0.1％的磷酸二氢钾、0.3％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁七水合物、0.001％的硫酸铁七水合物、0.001％的硫酸锰n-水合物、5％的D-阿拉伯糖醇和2％的碳酸钙，并在30℃下振荡培养。结果，在17个小时中得到了4.7％的D-木酮糖(产率：94％)。(2)由D-木酮糖生产木糖醇
通过离心从含有D-木酮糖的以上得到的培养基中除去细胞，然后通过使用实施例1中制得的由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的大肠杆菌将D-木酮糖转化为木糖醇。
首先，将前面提到的转化菌株接种到一个含有4ml培养基(pH6.0)的试管中，所述培养基含有0.5％的酵母提取物、0.5％的胨、0.5％的牛肉膏、0.5％的硫酸铵、0.1％的磷酸二氢钾、0.3％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁七水合物、0.001％的硫酸铁七水合物、0.001％的硫酸锰n-水合物、1％的甘油、5％的D-阿拉伯糖醇和2％的碳酸钙，并在30℃下振荡培养16小时。然后，将1ml所述的培养基接种到含有50ml相同培养基的体积为500-ml的烧瓶中并培养3小时。将IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)以1mM的最终浓度加入培养基中作为lac启动子的表达诱导物，并持续培养4小时。将如上所述得到的培养基以5％的最终浓度加入(1)中得到的含有D-木酮糖的氧化葡糖杆菌的培养上清液中，并在30℃下振荡培养。结果，在40个小时中得到了4.3％的木糖醇(产率：91％)。
综合上述(1)和(2)的方法，总共在57个小时里通过使用氧化葡糖杆菌和由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的大肠杆菌，由浓度为5％的D-阿拉伯糖醇可以高效地生产浓度为4.3％的木糖醇(产率：86％)。实施例3：使用氧化葡糖杆菌和由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的大肠杆菌同时从D-阿拉伯糖醇生产木糖醇
以与实施例2中相同的方式，将氧化葡糖杆菌ATCC621菌株接种到一个含有3ml培养基(pH6.0)的试管中，其中所述培养基含有2.4％的马铃薯葡萄糖、3％的酵母提取物、0.5％的甘油、3％的甘露糖醇和2％的碳酸钙，并在30℃下培养16小时。
另一方面，把实施例1中生产的由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的大肠杆菌类似地接种到一个含有4ml培养基(pH 6.0)的试管中，所述培养基含有0.5％的酵母提取物、0.5％的胨、0.5％的牛肉膏、0.5％的硫酸铵、0.1％的磷酸二氢钾、0.3％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁七水合物、0.001％的硫酸铁七水合物、0.001％的硫酸锰n-水合物、5％的D-阿拉伯糖醇和2％的碳酸钙，并在30℃下振荡培养16小时。然后，将1ml所述的培养基接种到含有50ml相同培养基的体积为500-ml的烧瓶中并培养3小时。将IPTG以1mM的最终浓度加入培养基中作为表达诱导物，并持续培养4小时。
将氧化葡糖杆菌和由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的大肠杆菌的共培养的培养基接种到一个含有50ml培养基(pH6.0)的体积为500-ml的烧瓶中，所述培养基含有0.5％的酵母提取物(w/v)、0.5％的胨、0.5％的牛肉膏、0.5％的硫酸铵、0.1％的磷酸二氢钾、0.3％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁七水合物、0.001％的硫酸铁七水合物、0.001％的硫酸锰n-水合物、5％的D-阿拉伯糖醇和2％的碳酸钙，并在30℃下振荡培养。
结果，在50个小时里由浓度为5％的D-阿拉伯糖醇得到了浓度为4.4％的木糖醇(产率：88％)。参考实施例1：从D-阿拉伯糖醇生产D-木酮糖
向每个试管中引入4ml含有1.8％(w/v)营养肉汤(由EIKEN化学制品有限公司生产)的培养基(pH 7.0)，并且通过在120℃下加热20分钟进行灭菌。将单独进行了灭菌的D-阿拉伯糖醇、木糖醇和D-木糖各以1％的浓度加入培养基中。将表1中所示的各种菌株的细胞接种到前面提到的培养基中，并且在30℃下振荡培养2天。通过离心从培养基中收集细胞，并用生理盐水洗涤一次。
把各种菌株的培养过的细胞以大约5％(w/v)的浓度悬浮在0.1M的磷酸缓冲液(pH 7.0)中，其中的浓度以湿重为单位。将玻璃珠(由Biospec Products生产，直径：0.1mm)以约为细胞悬浮液体积一半的体积加入该悬浮液中，并通过使用多珠振荡器(Multi-Beads Shocker)MB-200(Yasui Kikai)破碎细胞。在3000rpm下破碎3分钟，并将得到的破碎的细胞悬浮液用作下列转化反应中的粗酶制剂。
将D-阿拉伯糖醇和NAD各以5％(w/v)和10mM的最终浓度溶解在1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中，并以每个试管0.9ml的量将其引入试管中。将0.1ml的各种粗酶制剂加入该反应混合物中，并使在pH 8.0和30℃下反应22小时。在反应之后，通过离心除去沉淀，并通过HPLC测定所生产的D-木酮糖。结果示于表1中。如表1所示，通过每种菌株的细胞从D-阿拉伯糖醇高效地生产并且积累了D-木酮糖。
                             表1
菌    株                          生产的D-木酮糖(g/l)        反应产率(％)德尔马瓦无色杆菌AJ1983                        0.4                     0.8粘无色杆菌ATCC12448                           0.1                     0.2根癌土壤杆菌ATCC4720                          0.3                     0.6放射形土壤杆菌ATCC4718                        0.1                     0.2粪产碱杆菌IAM1015                             0.6                     1.2柠檬节杆菌ATCC11624                           0.3                     0.6肿胀节杆菌ATCC6947                            0.4                     0.8石蜡节杆菌ATCC15590                           0.7                     1.4石蜡节杆菌ATCC15591                           1.3                     2.6石蜡节杆菌ATCC19064                           0.8                     1.6石蜡节杆菌ATCC19065                           1.0                     2.0Arthrobacter hydrocarboglutamicus ATCC15583   0.9                     1.8印度固氮菌ATCC9037                            0.1                     0.2产氨短杆菌ATCC6871                            0.4                     0.8产氨短杆菌ATCC6872                            0.5                     1.0扩展短杆菌ATCC14020                           0.5                     1.0乳发酵短杆菌ATCC13655                         0.5                     1.0黄色短杆菌ATCC13826                           1.3                     2.6黄色短杆菌ATCC21406                           0.3                     0.6Brevibacterium globosum AJ1563                0.1                     0.2暗褐短杆菌FERM BP-6983                        0.5                     1.0酮戊二酸短杆菌ATCC15587                       0.4                     0.8酮戊二酸短杆菌ATCC15588                       0.9                     1.8嗜乙酰棒杆菌NRRLB3421                         0.3                     0.6产气肠杆菌ATCC13048                           0.1                     0.2解淀粉欧文氏菌IFO12687                        0.1                     0.2胡萝卜软腐欧文氏菌CCM969                      0.1                     0.2奇异黄杆菌CCM1080-A                           0.1                     0.2染色黄杆菌FERM BP-6492                        0.1                     0.2Micrococcus sp.CCM825                         0.3                     0.6不透明诺卡氏菌NCIB9409                        1.0                     2.0Planococcus eucinatus FERM BP-6493            0.4                     0.8雷氏变形菌NRRL 11344                          0.7                     1.4雷氏变形菌FERM BP-6980                        0.7                     1.4雷氏变形菌FERM BP-941                         0.6                     1.2摩氏摩根氏菌AJ2771                            0.5                     1.0谢氏丙酸杆菌IAM1725                           0.1                     0.2类黄假单胞菌ATCC796                           0.4                     0.8红串红球菌ATCC11048                           1.1                     2.2脲芽孢八叠球菌FERM BP-6979                    0.1                     0.2金黄色葡萄球菌IFO3761                         0.1                     0.2梅氏弧菌ATCC7708                              0.1                     0.2干酪弧菌FERM BP-5848                          0.6                     1.2参考实施例2：由D-阿拉伯糖醇生产D-木酮糖
向体积为500-ml的每个烧瓶中引入50ml含有0.2％的酵母提取物(w/v)、0.2％的肉膏、0.4％的胨、0.5％的NaCl和0.2％的硫酸镁七水合物的培养基(pH7.2)，并且通过在120℃下加热20分钟进行灭菌。将单独进行了灭菌的D-阿拉伯糖醇、木糖醇和D-木糖各以1％的浓度加入培养基中。将表1中所示的各种菌株的细胞接种到所述的培养基中，并且在30℃下振荡培养2天。通过离心从培养基中收集细胞，并用生理盐水洗涤一次。
把各种菌株的培养过的细胞以大约5％(w/v)的浓度溶解在0.1M的磷酸缓冲液(pH7.0)中，其中的浓度以湿重为单位。将玻璃珠(由Biospec Products Co.生产，直径：0.1mm)以约为细胞悬浮液体积一半的体积加入该悬浮液中，并通过多珠振荡器MB-200(Yasui Kikai)破碎细胞。在3000rpm下破碎3分钟，并将得到的破碎的细胞悬浮液用作下列转化反应中的粗酶制剂。
将D-阿拉伯糖醇和NAD各以5％(w/v)和10mM的最终浓度溶解在1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中，并以每个试管0.9ml的量将其引入试管中。将0.1ml的各种粗酶制剂加入该反应混合物中，并使在pH 8.0和30℃下反应22小时。在反应之后，通过离心除去沉淀，并通过HPLC测定所生产的D-木酮糖。结果示于表2中。如表2所示，通过每种菌株的细胞由D-阿拉伯糖醇高效地生产并且积累了D-木酮糖。
                               表2
菌  株                        生产的D-木酮糖(g/l)          反应产率(％)马杜拉马杜拉放线菌ATCC19425             0.1                        0.2紫产色放线菌IFO13100                    0.7                        1.4Kitasatosporia parulosa AJ9458          0.1                        0.2抗生链霉菌NRRL3238                      0.1                        0.2可可链霉菌ATCC19093                     0.1                        0.2天蓝色链霉菌ATCC10147                   0.1                        0.2浅黄链霉菌AJ9012                        0.1                        0.2浅灰链霉菌NRRL B-1062                   0.1                        0.2淡紫灰链霉菌ATCC8664                    0.1                        0.2变青链霉菌IFO13385                      0.1                        0.2橄榄链霉菌ATCC21379                     0.1                        0.2田无链霉菌ATCC15238                     0.1                        0.2弗吉尼亚链霉菌AJ9053                    0.1                        0.2绿色产色链霉菌IFO3113                   0.1                        0.2参考实施例3：由葡萄糖生产D-木酮糖
向每个试管中引入4ml含有0.2％的硫酸铵、0.1％的磷酸二氢钾、0.3％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁和0.5％的酵母提取物的培养基(pH 6.0)，并且通过在120℃下加热20分钟进行灭菌。将单独进行了灭菌的D-葡萄糖以5％的浓度加入培养基中。所述浓度(％)表示为重量/体积(w/v)百分数。
将表3中所示的各种菌株接种到前面提到的培养基中，并且在30℃下振荡培养1天。将该培养物用作种子培养物。向体积为500-ml的每个坂口烧瓶中引入50ml具有与上面提到的组成相同(除了D-葡萄糖以外)的培养基中，并且通过在120℃下加热20分钟进行灭菌。将单独进行了灭菌的D-葡萄糖和碳酸钙分别以5％和4％的浓度加入该培养基中。将前面提到的种子培养物以2％的浓度接种到培养基中，并在30℃下振荡培养4天。通过离心从培养基中除去细胞，并通过HPLC测定在培养基中生产的木糖醇和D-木酮糖。结果示于表3中。
                         表3
菌   株                               生产的D-木酮糖(g/l)蜡状葡糖杆菌IFO3262                                1.11氧化葡糖杆菌ATCC8147                               0.4氧化葡糖杆菌IFO3293                                1.0氧化葡糖杆菌IAM1839                                0.5氧化葡糖杆菌IFO3250                                0.5氧化葡糖杆菌IFO3292                                1.0氧化葡糖杆菌IFO3294                                1.0氧化葡糖杆菌氧化亚种IFO3189                        1.0氧化葡糖杆菌弱氧化亚种IFO3172                      0.5氧化葡糖杆菌弱氧化亚种IFO3130                      1.2醋化醋杆菌木质亚种ATCC14851                        1.6液化醋杆菌ATCC14835                                1.1巴氏醋杆菌IFO3222                                  1.0巴氏醋杆菌IFO3223                                  2.3金黄弗拉特氏菌IFO3245                              0.8
                        序列表<110>AJINOMOTO公司<120>用于生产木糖醇的方法<130>OP946<140><141>2000-02-<150>JP 11-031464<151>1999-02-09<150>JP 11-197621<151>1999-07-12<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>1cgggaattcg atatcatttt aatgaa<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>2ggcggatccg cagtcaatac cggcataga

Claims (9)

1.一种用于生产木糖醇的方法，该方法包括下列步骤：使微生物与D-木酮糖反应以生产木糖醇，并收集生产的木糖醇，所说的微生物由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过并且具有还原能力。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的具有还原能力的微生物为属于埃希氏杆菌属的细菌。
3.根据权利要求2的方法，其中所述的属于埃希氏杆菌属的细菌为大肠杆菌。
4.根据权利要求1的方法，该方法包括下列步骤：使具有将D-阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖能力的微生物与D-阿拉伯糖醇反应以生产D-木酮糖，并使所生产的D-木酮糖与由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并具有还原能力的微生物反应。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的具有将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖能力的微生物为属于葡糖杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、短杆菌属、棒杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、微球菌属、摩根氏菌属、诺卡氏菌属、动性球菌属、变形菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、红球菌属、芽孢八叠球菌属、葡萄球菌属、弧菌属、马杜拉放线菌属、放线菌属、北里孢菌属、链霉菌属、气单胞菌属、金杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、微杆菌属、沙雷氏菌属、沙门氏菌属或黄单胞菌属的微生物。
6.根据权利要求1的方法，该方法包括下列步骤：在合适的培养基中培养具有从葡萄糖生产D-木酮糖能力的微生物以生产D-木酮糖，并在培养基中使所生产的D-木酮糖与由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并具有还原能力的微生物反应。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的具有从葡萄糖生产D-木酮糖能力的微生物为属于葡糖杆菌属、醋杆菌属或者弗拉特氏菌属的微生物。
8.一种用于生产木糖醇的方法，该方法包括下列步骤：在含有D-阿拉伯糖醇的培养基中培养由编码木糖醇脱氢酶的基因转化过的并具有还原能力的微生物和具有将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖能力的微生物以生产木糖醇，并收集生产的木糖醇。
9.一种用于生产木糖醇的方法，该方法包括下列步骤：在合适的培养基中培养由木糖醇脱氢酶转化过的并具有还原能力的微生物和具有从葡萄糖生产D-木酮糖能力的微生物以生产木糖醇，并收集生产的木糖醇。
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