CN1849398A - 从碳底物生产终产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以生物质为基础的原料底物的体外和/或体内生物转化而生产目的终产物的方法，这些底物包括(但不限于)淀粉和纤维素之类的材料。在特别优选的实施方案中，本发明的方法无需底物的胶凝化和/或液化。

Description

从碳底物生产终产物的方法
发明领域
本发明提供通过以生物质为基础的原料底物的体外和/或体内生物转化而生产目的终产物的方法，这些底物包括(但不限于)淀粉和纤维素之类的材料。在特别优选的实施方案中，本发明的方法无需底物的胶凝化和/或液化。
发明背景
工业发酵主要使用葡萄糖作为生产蛋白质、酶和化学物质的原料。这些发酵通常采用分批式、分批补料式、或连续式，并在限制底物和产生最少副产物的条件下进行。这些是在发酵过程中必须加以控制的关键操作条件，以便获得优化的发酵时间、产量和效率。目前使用的方法和原料具有降低发酵过程的效率的缺点。
葡萄糖是一种天然的基于碳的化合物，它作为起始底物被大量用于化学和生物的合成。然而，纯度高于90％的含有葡萄糖的糖浆相对昂贵。另外，高葡萄糖浓度的存在增加了发酵系统对微生物污染的敏感性，因此为生产效率带来了反作用。另一个不利条件则是，即使当发酵缸里的葡萄糖浓度处于较低到中等时，也会产生不利于葡萄糖转化为目的终产物的作用，例如通过酶的抑制和/或代谢物的抑制，和/或微生物的生长。结果，已经进行了各种各样的尝试来降低工业发酵的成本，特别是利用比葡萄糖更廉价的底物。然而，尽管发展了许多方法，仍然需要既经济又有效利用底物发酵的技术。事实上，本领域大大需要有能够利用比葡萄糖更廉价的起始底物进行更为有效生产目的终产物的方法。
发明概述
本发明提供通过以生物质为基础的原料底物的体外和/或体内生物转化而生产目的终产物的方法，这些底物包括(但不限于)淀粉和纤维素之类的材料。在特别优选的实施方案中，本发明的方法无需底物的胶凝化和/或液化。
在一些优选的实施方案中，本发明提供生产终产物的方法，该方法特征在于保持转化的中间物处于低浓度，最好是低于引发代谢物阻遏和/或酶抑制的阈值，因此能够通过避免酶将底物转化成终产物过程中的中间物的代谢物阻遏和/或酶抑制效果，而提高方法的效率。
在特别优选的实施方案中，本发明提供生产终产物的方法，包括有机酸，包括(但不限于)葡糖酸、抗坏血酸中间物、琥珀酸、柠檬酸、醋酸、乳酸、氨基酸和抗菌剂，还有酶和有机溶剂，包括(但不限于)1，3-丙二醇、丁醇、丙酮、甘油和乙醇。在一些实施方案中，该方法包括步骤：将碳底物与至少一种底物转化酶相接触以产生中间物；接着中间物与产生中间物的至少一种酶接触，其中该中间物被生产终产物的微生物基本完全生物转化。在另一些实施方案中，转化底物和/或转化中间物的酶以无细胞的抽提物形式提供。
在一些优选的实施方案中，通过保持转化培养基中中间物的低浓度而使终产物的生成有效的完成，因此与中间物的形成相联系的代谢物阻遏和/或酶抑制效果被降低了。本发明提供用各种水平的中间物浓度、底物、中间物进行的方法和将中间物转化为乙醇的步骤。
本发明提供生产终产物的方法，包括这些步骤：将碳底物与至少一种底物转化酶相接触以产生中间物；将中间物与至少一种中间物转化酶相接触，其中中间物被中间物转化酶基本完全转化为终产物。在一些优选的实施方案中，中间物转化酶是微生物酶。在替代的实施方案中，微生物酶的产生是通过微生物与中间物的接触。在另一些实施方案中，底物转化酶是微生物酶。在进一步的实施方案中，微生物酶的产生是通过微生物与底物的接触。还在进一步的实施方案中，底物转化酶和中间物转化酶都是通过微生物与中间物和/或底物的接触产生。在有些实施方案中，这两种酶都是由同种微生物提供，而在另一些实施方案中，酶由不同的微生物产生。在一些特别优选的实施方案中，在将中间物转化为终产物的过程中，中间物的浓度保持在低于引发代谢物阻遏效果的水平。在进一步优选的实施方案中，在将中间物转化为终产物的过程中，中间物的浓度水平保持在低于引发酶抑制效果的水平。还在另一些的实施方案中，中间物转化为终产物的速率足以保持其浓度低于混合物的0.25％。在一些特别优选的实施方案中，底物选自生物质和淀粉。还在进一步的实施方案中，中间物选自己糖和戊糖。在一些优选的实施方案中，己糖是葡萄糖。在各种优选的实施方案中，终产物选自1，3-丙二醇、葡糖酸、甘油、琥珀酸、乳酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、葡糖酸盐、葡萄糖、醇和抗坏血酸中间物。在另一些实施方案中产生不只一种终产物。还在进一步的实施方案中，将底物与至少一种底物转化酶相接触的步骤进一步包括生物转化底物以产生中间物。在一些实施方案中，产生不只一种中间物。在这种情况下，在一些实施方案中，中间物转化酶作用于所有的中间物，而在另一些实施方案中，中间物转化酶作用于部分中间物，而在进一步的实施方案中，中间物转化酶只作用于一种中间物，产生至少一种终产物。在附加的一些实施方案中，底物转化和中间物转化酶以无细胞抽提物的形式提供。
本发明还提供一种生产终产物的方法，包括步骤：将碳底物与至少一种底物转化酶相接触，产生中间物；将此中间物与至少一种中间物转化酶相接触，其中中间物被中间物转化酶基本完全转化为终产物，并且其中终产物的出现并不抑制终产物的进一步产生。在一些实施方案中，不只一种中间物被产生。在这种情况下，在一些实施方案中，中间物转化酶作用于所有的中间物，而在另一些实施方案中，中间物转化酶作用于部分中间物，而在进一步的实施方案中，中间物转化酶只作用于一种中间物以产生至少一种终产物。在一些实施方案中，中间物转化酶是微生物酶。在另一些实施方案中，底物转化酶是微生物酶。在一些优选的实施方案中，底物转化酶和中间物转化酶是通过微生物与中间物和/或底物的接触产生。在有些实施方案中，两种酶都是由同种微生物提供，而在另一些实施方案中，酶由不同种微生物产生。在附加的一些实施方案中，底物转化和中间物转化酶以无细胞抽提物的形式提供。
本发明还提供生产终产物的方法，包括步骤：将碳底物与至少一种底物转化酶相接触以产生中间物；将此中间物与至少一种中间物转化酶相接触，其中中间物被中间物转化酶基本完全转化为终产物，并且其中底物的存在并不抑制终产物的进一步产生。在一些实施方案中，中间物转化酶是微生物酶。在另一些实施方案中，底物转化酶是微生物酶。在一些优选的实施方案中，底物转化酶和中间物转化酶是通过微生物与中间物和/或底物的接触产生。在有些实施方案中，两种酶都是由同种微生物提供，而在另一些实施方案中，酶由不同种微生物产生。在一些实施方案中，不只一种中间物被产生。在这种情况下，在一些实施方案中，中间物转化酶作用于所有的中间物，而在另一些实施方案中，中间物转化酶作用于部分中间物，而在进一步的实施方案中，中间物转化酶只作用于一种中间物以产生至少一种终产物。在附加的实施方案中，底物转化和中间物转化酶以无细胞抽提物的形式提供。
在一些优选的实施方案中，接触步骤发生在反应容器内，包括(但不限于)缸、瓶、烧瓶、袋子、生物反应器、以及任何其它适合操作本发明方法的容器。
附图描述
图1提供图表表示在分批式生物反应器中通过OXYGO®和FERMCOLASE®酶进行的从葡萄糖到葡糖酸的生物转化。
图2提供图表表示在分批式生物反应器中通过CU CONC RSH葡萄糖淀粉酶(Shin Nihon Chemicals，日本)进行的从玉米淀粉原料到D-葡萄糖的生物转化。
图3提供图表表示在分批式生物反应器中在CU CONC、OXYGO®和FERMCOLASE®酶存在的条件下进行的从玉米淀粉原料到D-葡糖酸盐的生物转化。
图4.提供图表表示在分批式生物反应器中CU CONC、OXYGO®、FERMCOLASE®和DISTILLASE®酶在改良的条件下进行的从淀粉到葡糖酸的生物转化。
图5提供图表表示在分批式生物反应器中通过OPTIMAX®4060进行的麦芽糖糊精到葡萄糖的生物转化。
图6提供图表表示确定从葡萄糖到葡糖酸盐的最有效生物转化的适当酶浓度的酶剂量分析结果。
图7提供图表表示在改良酶剂量条件下的从麦芽糖糊精到葡糖酸的生物转化。
图8提供图表表示优化酶剂量以提高从麦芽糖糊精到葡糖酸的总体转化率。
图9提供图表表示从淀粉到2，5-二酮葡糖酸(DKG)的生物转化。
图10提供图表表示从颗粒淀粉到葡萄糖和乳酸的生物转化。
图11提供图表表示从颗粒淀粉到葡萄糖的生物催化转化及其到琥珀酸的转化。
图12提供图表表示从颗粒淀粉到葡萄糖的生物转化，及其转化为甘油，并随后转化为1，3-丙二醇。
图13提供图表表示从颗粒淀粉到葡萄糖形成的生物转化，及其转化为甘油，并随后转化为1，3-丙二醇。
图14提供图表表示从颗粒淀粉到甘油的生物转化。
图15提供图表表示从玉米淀粉到葡萄糖的生物转化，及其到2，5-二酮-D-葡糖酸的转化。
图16(A)提供图表表示通过SPEZYME®酶进行的从纤维素(AVICEL®)到葡萄糖的生物转化。
图16(B)提供图表表示通过SPEZYME®(″SPE″)，OXYGO®和FERMCOLASE®酶进行的从纤维素(AVICEL®)到葡糖酸的生物催化转化。
图16(C)提供图表表示通过SPEZYME®(″SPE″)，OXYGO®和FERMCOLASE®酶进行的从玉米秸秆到葡糖酸的生物催化转化。
图16(D)提供图表表示通过SPEZYME®(“SPE”)、OXYGO®和FERMCOLASE®酶进行的从纤维素(AVICEL®)到葡糖酶的生物催化转化。
图17提供图表表示从纤维素到甘油和1，3-丙二醇的生物转化。
图18提供图表表示从纤维素到乳酸的生物转化。
图19提供图表表示从纤维素到琥珀酸的生物转化。
发明简述
本发明提供通过体外和/或体内生物转化以生物质为基础的原料底物而生产目的终产物的方法，这些底物包括(但不限于)淀粉和纤维素之类的材料。在特别优选的实施方案中，本发明的方法无需底物的胶凝化和/或液化。
在本发明提供的方法中，淀粉或生物质和水解酶被用来将淀粉或纤维素转变为葡萄糖。另外，在本发明提供的方法中，以这样的速率提供底物，即淀粉转化为葡萄糖的速率与各种发酵产物形成所需的葡萄糖的供给速率相匹配。因此，本发明提供了关键的葡萄糖限制的发酵条件，并避免了许多代谢调节和抑制。
在一些优选的实施方案中，本发明提供制造目的终产物的方法，这种方法在控制速率的条件下连续提供葡萄糖，并具有降低原料成本，降低粘度，提供用于代谢效率的氧的传递，提高生物转化效率，提高产量，改变代谢抑制和酶抑制的水平，降低整个制造成本的好处。
如上所指出的，本领域非常需要有能够利用比葡萄糖更廉价的起始底物进行有效生产目的终产物的方法。如在此所更为详细的描述，本发明所提供的方法涉及这些底物，包括淀粉(例如玉米和小麦淀粉)和生物质。
淀粉是以植物为基础的发酵碳源。玉米淀粉和小麦淀粉是比用于发酵的葡萄糖碳原料更为便宜的碳源。在本领域中已知液化淀粉向葡萄糖的转化，通常是使用酶来进行，如α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶。将液化淀粉转变为单糖即葡萄糖的大量过程已经被描述。葡萄糖有自身的价值，也可以作为其它糖的前体，如果糖。另外，葡萄糖可以被发酵成乙醇和其它发酵产品。然而，酶将第一碳源转变为中间物(特别是葡萄糖)的能力，将会由于中间物的存在而受损。
例如，日本米酒酿造和酒精生产的典型方法使用未经烹饪的淀粉。然而，这些技术需要某些专门的操作，如麦芽浆的酸化(pH 3.5)，以阻止有害微生物的污染。此外，这些方法需要比本发明更长的糖化和发酵时间。另外，这些方法需要复杂的操作步骤，例如透析发酵液，太为麻烦，以至于在通常的经由发酵的产品生产中难以利用。
使用糊精和葡萄糖作为发酵的原料有各种各样的缺点，包括加工成本高，以及与粘度和氧的传递相关的难题。另外，与本发明相比，这些方法产生较低的目的产物产量，具有更多的与副产物形成相关的难题。事实上，将淀粉或生物质转变为糊精的成本是显著的，涉及高能量的投入、分离的反应罐、更多的时间、详细的生物工艺操作、不完全的糖化、逆反应以及与典型的预发酵糖化步骤相关的酶。这些难题导致了许多提供在一个反应容器或器皿内并在较低的温度下直接转化为淀粉的方法的尝试。在US Pat.No.5,599,689(Haynie，等人)中描述了在混合培养基中将碳水化合物资源变为1，3-丙二醇的生物转化。Haynie等人描述的方法涉及：产生甘油(即中间物)的生物与产生二醇的生物(即终产物)混合，向混合的培养基中加入碳底物，孵育混合的培养基，以产生目的终产物1，3-丙二醇。在U.S.Patent No.4,514,496中，Yoshizuma描述了涉及相对于淀粉糖化液体在浆状物中保持原料的浓度，通过发酵生产酒精的方法(未经烹饪，即在糖化之前未经高温液化)。但是这些方法与本发明相比，缺乏效率和经济优势。
本发明提供了生产终产物的方法，包括有机酸(例如葡糖酸、抗坏血酸中间物、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、葡糖酸和乳酸)、氨基酸、抗生素、酶和有机溶剂(例如1，3-丙二醇、丁醇和丙酮)、甘油和乙醇。在一些优选的实施方案中，该方法包括：使至少一种碳底物与至少一种底物转化酶相接触以产生至少一种中间物；并使所述至少一种中间物与产生中间物的酶接触(通常在任何合适类型的反应容器内)，其中所述至少一种中间物基本完全生物转化为终产物。在一些优选的实施方案中，由微生物来实现该生物转化。通过将转化培养基中的中间物浓度保持在低水平上，从而改变了(例如降低)中间物的代谢物阻遇和/或酶抑制作用。本发明也提供了各种水平的中间物浓度、底物、中间物以及将中间物转化为目的产物的步骤。
定义
除非另有说明，否则这里所使用的所有技术和科学术语与在本发明所属领域具有普通技能的人的通常理解具有相同意义。各种参考文献(见，例如Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York[1994]；和Hale和Marham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，HarperPerennial，NY[1991])提供许多这里所使用术语的一般定义。除此以外，这里所涉及的所有专利和出版物，包括这些专利和出版物所公开的所有序列，都明确在此引用作为参考。
虽然与这里所描述相似或相同的任何方法和材料都可应用于本发明的实践中，这里描述了优选的方法和材料。数字范围包含定义此范围的数字。除非另有说明，否则核酸从左到右以5′到3′的方向写出，氨基酸序列从左到右以氨基到羧基的方向写出。应该理解，本发明并不限于所描述的特定的方法、流程和试剂，这些是可以变动的。这里提供的标题并不限制本发明的各个方面或实施方案，它们可以参考说明书整体而得到。
此外，以下定义的术语通过参考说明书整体而得到更充分地定义。
这里使用的术语“碳底物”指的是一种物质，其含有至少一个碳原子，能够被酶转化成中间物，并随后被转化成目的碳终产物。典型的碳底物包括(但不限于)：生物质、淀粉、糊精和糖。
这里使用的“生物质”是指含有纤维素和/或淀粉的原料，包括(但不限于)：碎木片、玉米秸秆、大米、草、草料、perrie-grass、马铃薯、茎、根、whole ground corn、玉米穗、谷物(grain)、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、糠、谷类(cereal)、含糖原料(例如糖蜜、水果材料、甘蔗或糖用甜菜)、木头、植物残渣。事实上，本发明无意限制于任何一种用作生物质的特定材料。在本发明优选的实施方案中，原料是含淀粉的原料，(如玉米穗、whole ground corn、玉米、谷物、买罗高梁和/或谷类和它们的混合物)。在特别优选的实施方案中，此术语指的是最初来自于任何植物来源的任何含淀粉的材料。
这里使用的“淀粉”是指任何含淀粉的材料。特别的是，此术语指的是各种以植物为基础的材料，包括但不限于小麦、大麦、马铃薯、甘薯、木薯粉、玉米、黄玉米(maize)、木薯、买罗高梁、黑麦和糠。事实上，本发明无意限制于任何淀粉的特定类型和/或来源。一般而言，此术语指的是任何含有植物的多糖碳水化合物复合物的任何材料，含有直链淀粉和支链淀粉，具有公式(C6H10O5)x，其中的“X”可以为任何数字。
这里使用的“纤维素”是指任何含纤维素的材料。特别的是，此术语指的是葡萄糖(或“纤维二糖”)的聚合物，具有公式(C6H10O5)x，其中的“X”可以为任何数字。纤维素是植物细胞壁的主要成分，是自然界最丰富的有机物。但是，纤维素中是β-糖苷连接，淀粉中是α-糖苷连接。与木质素相结合，纤维素成为“木质素纤维素”。
这里使用的“中间物”是指至少含有一个碳原子的化合物，其由碳底物酶转化而来。中间物的例子包括但不限于：戊糖(如木糖、阿拉伯糖、来苏糖、核糖、核酮糖、木酮糖)；己糖(如葡萄糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖)；和其有机酸。
这里使用的术语“酶转化”是指通过将底物或中间物与酶接触而将底物修改为中间物或将中间物修改为终产物。在一些实施方案中接触是直接将底物或中间物暴露于适当的酶。在另一些实施方案中，接触包含将底物或中间物暴露于表达和/或分泌所述酶的生物体，和/或分别将目的底物和/或中间物代谢为目的中间物和/或终产物。
这里使用的术语“淀粉水解酶”是指任何一种能将淀粉转变为中间物糖(如己糖或戊糖)的酶。
这里使用的“单糖”是指任何具有经验式(CH2O)n的化合物，其中n是3-7，优选为5-7。在一些实施方案中，该术语指由单一的多羟基醛或酮单元所组成的“单体糖”。此术语包括但不限于葡萄糖、半乳糖和果糖之类的化合物。
这里使用的“二糖”是指任何包含两个共价连接的单糖单元的化合物。此术语包括但不限于蔗糖、乳糖和麦芽糖之类的化合物。
这里使用的“寡糖”是指任何具有2-10个以糖苷键连接起来的单糖单元的化合物。在一些优选的实施方案中，此术语是指以共价键连接起来的单糖单元的短链。
这里使用的“多糖”是指任何具有许多单糖单元连接成直链或支链的化合物。在一些优选的实施方案中，此术语是指具有上百或上千个单糖单元的长链。一些多糖，如纤维素具有直链，而另一些(如糖原)具有支链。最丰富的多糖是淀粉和纤维素，由重复的葡萄糖单元所组成(虽然这些化合物的不同在于葡萄糖单元如何连接)。
这里使用的“培养”是指由碳底物到目的终产物的发酵生物转化(典型的是在反应容器内)。在特别优选的实施方案中，培养涉及微生物在适宜产生目的终产物的条件下生长。
这里使用的“糖化”是指将不能直接使用的多糖转变为用于生物转化或发酵生物转化的有用的糖原料。
这里使用的术语“发酵”是指有机物质被微生物酶解和厌氧降解成更简单的有机产物。在优选的实施方案中，发酵是指通过微生物(如细菌)对碳水化合物的利用，涉及发生在厌氧条件下的氧化-还原代谢过程，在这一过程中有机底物作为最终的氢受体(而不是氧)。虽然发酵发生在厌氧条件下，但是此术语并无意被仅仅限制于严格的厌氧条件下，因为发酵也发生在氧存在的条件下。
这里使用的术语“基本被完全消耗”和“基本被完全生物转化”是指在转化培养基中保持中间物的低水平，以抵消中间物(如己糖)对酶的抑制、氧的传递、产量、副产物最小化和/或代谢物阻遏效果的影响，提高中间物转化酶将中间物转变为终产物或别的中间物的能力和/或底物转化酶将底物转变为中间物的能力。
这里使用的术语“生物转化”是指在将碳底物或中间物分别转变为中间物或终产物的条件下，将碳底物或中间物与微生物接触。在一些实施方案中，此术语用于描述另一种介入中间物(interveningintermediate)的体外生产方法，其中只使用了生物催化。在一些优选的实施方案中，此术语包括通过微生物代谢和/或表达或分泌完成目的转化。
这里使用的术语“转化培养基”指的是酶和碳底物、中间物和终产物在其中彼此发生接触的培养基。这些术语包括但不限于：发酵培养基、溶解或悬浮酶和碳底物、中间物和终产物的有机和/或水培养基。在一些实施方案中，培养基是完全培养基，而在另一些优选的实施方案中，培养基是合成培养基。
这里使用的术语“终产物”是指任何来自碳源的分子产物，它是从中间物的酶转变而来。在特别优选的实施方案中，本发明使用的方法是为了产生“目的终产物”(即通过使用这些方法意图生成的产物)。
这里使用的“低浓度”是指化合物的这样一种浓度水平，即其低于该化合物可能导致有害作用的浓度。在特别优选的实施方案中，此术语用于指某一特定中间物的浓度，在低于该浓度时观测到了代谢物阻遏和/或酶抑制的有害效果。在一些实施方案中，此术语指某一特定中间物的浓度水平，高于此浓度即由底物和/或产物引发代谢物阻遏和/或酶抑制。
这里使用的短语“保持低于引发代谢物阻遏效果的水平”是指保持一中间物的浓度低于引发代谢物阻遏的水平。
这里使用的术语“减小代谢物阻遏”是会产生代谢物抑制效果的条件。在优选的实施方案中，此术语指中间物浓度低于引发代谢物阻遏效果的阈值的条件。
这里使用的术语“减小酶抑制”是指与通常标准的条件下酶的抑制相比，能减小对此酶抑制的条件。在本发明优选的实施方案中，此术语是指酶反应的中间物、底物和/或产物的浓度低于引发酶抑制的阈值的条件。
这里使用的术语“底物转化酶”是指任何将底物(如颗粒淀粉)转变为中间物(如葡萄糖)的酶。底物转化酶包括但不限于：α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、支链淀粉酶、淀粉水解酶和它们的各种组合。
这里使用的术语“中间物转化酶”是指任何将中间物(如D-葡萄糖、D-果糖等)转变为目的终产物的酶。在优选的实施方案中，这一转化通过水解来完成，而在另一些实施方案中，此转化涉及通过微生物的由中间物到终产物的代谢。然而，本发明无意限制于任何特定的酶或转化方式。事实上，在本发明的各种实施方案中可以使用任何恰当的酶。
这里使用的“产量”是指使用本发明的方法产生的中间物或终产物的数量。在一些优选的实施方案中，使用本发明的方法产生的产量高于用本领域已知的方法得到的产量。在一些实施方案中，产量是指终产物或中间物的体积，而在另一些实施方案中，此术语用来指终产物或中间物在组合物中的浓度。
这里使用的术语“氧的传递”是指在生物转化和/或发酵生物转化培养基中具有充足的溶解氧从气相传递到液体培养基，以至于其不是限速步骤。
这里使用的“副产物形成”指的是产生不需要的产物。在一些优选的实施方案中，本发明提供与本领域已知的方法相比能避免或减少副产物产生的方法。
这里使用的术语“酶抑制”指的是通过对酶物理或生化的作用而使酶的活力丧失。在一些实施方案中，抑制来自于酶活力形成的产物的影响。而在另一些实施方案中，抑制来自于底物或中间物对酶的作用。
这里使用的“酶活力”指的是酶对其底物的作用。在一些实施方案中，酶的活力通过测定底物向中间物的转化来定量，而在另一些实施方案中，测定的是底物向终产物的转化，而还在进一步的实施方案中，测定的是中间物向终产物的转化。
这里使用的“酶单位”指的是在最佳分析条件下每分钟转变一微摩尔底物成为底物产物的酶量(除非另有说明)。在一些实施方案中，可以通过商业获得的酶(如SPEZYME®、DISTALLASE®、OPTIMAX®；Genencor International)被用于本发明的方法中。
这里使用的术语“葡萄糖淀粉酶单位”(GAU)的定义是在40℃和pH5.0的分析条件下每分钟产生一微摩尔葡萄糖所需要的酶量。
这里使用的术语“葡萄糖氧化酶单位”(GOU)的定义是在25℃和pH7.0的分析条件下每分钟氧化一微摩尔葡萄糖成为葡糖酸所需要的酶量。
这里使用的术语“过氧化氢酶单位”(CU)的定义是在25℃和pH7.0的分析条件下每分钟分解一微摩尔过氧化氢所需要的酶量。
这里使用的一AG单位(GAU)是在25℃和pH4.3时每分钟分解一微摩尔麦芽糖所需要的酶量。在本发明的一些实施方案中，使用了可通过商业获得的每毫升具有400GAU活力的葡萄糖淀粉酶液体(OPTIDEX®L-400；Genencor International)。
这里使用的“碳终产物”意指产生于碳中间物的任何碳产物，其中底物至少含有一个碳原子(即碳底物)。
这里使用的“碳中间物”是指在含碳底物向碳终产物转化的过程中产生的含碳化合物。
这里使用的“酶控制”意指通过改变用于反应的酶量或活力来调节产自碳底物的碳中间物的数量。
这里使用的“微生物”是指具有典型微观结构的细胞的生物，包括细菌、真菌(酵母和霉菌)、立克次氏体和原生动物之类的生物。本发明并无意被限于任何特定的微生物或微生物种类，因为各种微生物和微生物酶适合用于本发明。本发明也无意被限于野生型微生物，因为使用重组DNA技术生产的微生物和微生物酶也可用于本发明。
这里使用的“微生物酶”是指由微生物产生的任何酶。这里使用的“微生物中间物转化酶”是将中间物转变为终产物的酶，而“微生物底物转化酶”是将底物转变为中间物或直接将底物转变为终产物(即不存在中间化合物)的酶。
这里使用的“葡糖酸”是指葡萄糖的氧化产物，其中葡萄糖的C6羟基被氧化成羧酸基团。
这里使用的术语“葡糖酸生产者”和“葡糖酸生产生物体”是指任何能够通过利用己糖或戊糖来生产葡糖酸的生物体或细胞。在一些实施方案中，生产葡糖酸的细胞含有纤维素酶作为底物转化酶，而葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶被用来将中间物转化为葡糖酸。
这里使用的“甘油生产者”和“甘油生产生物体”是指任何能够生产甘油的生物体或细胞。在一些实施方案中，生产甘油的生物体是好氧细菌，而另一些实施方案中，他们是厌氧细菌。还在进一步的实施方案中，生产甘油的生物体包括微生物，例如真菌(即霉菌和酵母)、藻类和其它合适的生物体。
这里使用的术语“二醇生产者”、“丙二醇生产者”、“二醇生产生物体”和“丙二醇生产生物体”是指任何能够利用甘油生产1，3-丙二醇的生物体。通常生产二醇的细胞含有二醇脱水酶或甘油脱水酶。
这里使用的术语“乳酸生产者”、“乳酸生产生物体”和“乳酸生产微生物”是指能够利用己糖或戊糖来生产乳酸的生物体或细胞。在一些实施方案中，乳酸生产者是乳杆菌属或发酵单胞菌属的成员，而在另一些实施方案中，这些生物体是真菌。
这里使用的术语“乙醇生产者”和“乙醇生产生物体”是指任何能从己糖或戊糖生产乙醇的生物体或细胞。一般而言，生产乙醇的细胞含有醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。
这里使用的术语“抗坏血酸中间物生产者”和“抗坏血酸中间物生产生物体”是指任何能从己糖或戊糖生产抗坏血酸中间物的生物体或细胞。一般而言，根据所需的特定抗坏血酸中间物，生产乙醇的细胞含有葡萄糖脱氢酶、葡糖酸脱氢酶、2，5-二酮-D-葡糖酸还原酶、2-酮-D-葡糖酸还原酶、2-酮-还原酶、5-酮还原酶、葡糖激酶、葡糖酸激、核酮糖-5-磷酸差相异构酶、转酮酶、转醛酶、己糖激酶、2，5-DKG还原酶和/或艾杜糖酸脱氢酶。
这里使用的术语“抗坏血酸中间物”是指任何以下化合物：D-葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸(2KDG)、2，5-二酮-D-葡糖酸(2，5-DKG或5 DKG)、2-酮-L-古洛糖酸(2KLG or KLG)，L-艾杜糖酸(IA)、异抗坏血酸(EA)和抗坏血酸(ASA)。
这里使用的“柠檬酸”是指具有公式C6H8O7，通常发现于柑橘类水果、甜菜、酸果蔓和其它酸水果。此术语涉及来自任何来源的柠檬酸，不管是天然的或合成的，以及它的盐和这种酸的任何其它形式。
这里使用的“琥珀酸”是指具有公式C6H6O4并且通常发现于琥珀、藻类、苔藓、甘蔗、甜菜和其它植物的酸。在通过各种霉菌、酵母和细菌进行糖、酒石酸、苹果酸和其它物质的发酵过程中也会形成此酸。此术语涉及来自任何来源的琥珀酸，不管是天然的或合成的，以及其酸性和中性盐和酯，和这种酸的任何其它形式。
这里使用的“氨基酸”是指任何自然产生的氨基酸，还有任何合成的氨基酸，包括氨基酸衍生物。
这里使用的“抗菌剂”是指任何能杀死或抑制微生物生长的化合物(包括但不限于抗菌化合物)。
这里使用的术语“耦合培养”(linked culture)是指使用至少两种细胞培养物的发酵系统，其中培养物被依次加入。在大多数的耦合系统的实施方案中，初级培养物或最初的一套培养物是在最佳的发酵条件下生长，以生产目的中间物(即中间物被释放到培养基中，产生“条件培养基”)。在初级培养物的发酵之后，条件培养基被暴露于次级培养物。次级培养物再将条件培养基中的中间物转变为目的终产物。在本发明的一些实施方案中，典型的初级培养物是甘油生产者，次级培养物是1，3-丙二醇生产者。
这里使用的“混合培养”是指在同一培养物中不同种微生物的各类混合的存在。在一些优选的实施方案中，混合培养物生长在反应容器内，其培养条件使得混合生物体各自的代谢过程的相互作用能产生单个的生物体所不能产生的产物。本发明无意被限制于包含特定数目的微生物种类的混合培养。
这里使用的“条件培养基”是指已经被补充了微生物生长的有机副产物的任何适合微生物生长的发酵培养基。在本发明优选的实施方案中，条件培养基产生于耦合培养的发酵过程中，其中生产甘油的细胞将甘油分泌到发酵培养基中，用于随后转化成1，3-丙二醇。
这里使用的“氧吸收率”(″OUR″)是指在一反应容器内，氧特定消耗的度量。氧的消耗可以通过本领域已知的各种即时测量法来测定。在一实施方案中，OUR(mmol/(升*小时))通过以下公式测定：((气流(升/每分钟)/发酵重量(发酵液的重量(kg)))×O2供给×发酵液密度×(校正常数，在21.1C而不是标准的20.0C处校正气流))减去([气流/发酵重量]×[废气O2/废气N2]×N2供给×发酵液密度×常数)。
这里使用的“碳演化率”(″CER″)是指在发酵过程中，反应容器内产生的CO2量的度量。通常，因为在最初或后来都没有向反应容器内加入CO2，容器内的任何CO2都被假定为是在发酵过程中产生的。“废气CO2”是指反应容器内测得的CO2的数量，通常使用本领域已知的质谱法。
这里使用的“增加的”是指目的蛋白质产量的提高。在优选的的实施方案中，本发明提供增加的(即提高到)目的蛋白质的产生和分泌。在这些实施方案中，当与宿主(如野生型细胞)正常的生产水平相比，“增加的”生产被提高了。因此，对于异源蛋白质而言，基本上任何表达都是增加的，因为细胞正常情况下并不产生这种蛋白质。
这里使用的术语“分离的”和“纯化的”是指去除掉至少一种与其天然结合的组分的核酸或氨基酸。
这里使用的术语“异源蛋白质”是指在宿主细胞中并不会天然产生的蛋白质或多肽。在替换的实施方案中，该蛋白质是商业上重要的工业蛋白质或多肽。该术语意图包括天然产生的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。
发明详述
本发明提供通过以生物质为基础的原料底物的体外和/或体内生物转化而生产目的终产物的方法，这些底物包括(但不限于)淀粉和纤维素之类的材料。在特别优选的实施方案中，本发明的方法无需底物的胶凝化和/或液化。
本发明提供明显改善将通常利用的碳底物(例如生物质和/或淀粉)直接转变为中间物之过程的方法，其中所述中间物优选是易于被转变成多种目的终产物的中间物，如初级代谢物(例如抗坏血酸中间物、乳酸、琥珀酸或氨基酸)，醇(如乙醇、丙醇和/或1，3-丙二醇)，和酶或次级代谢物(如抗菌剂)。
在一些特别优选的实施方案中，本发明强烈改进将颗粒淀粉直接转变为葡萄糖之方法，葡萄糖是一种易于被转变成多种目的终产物的中间物，如初级代谢物(例如抗坏血酸中间物、乳酸、琥珀酸或氨基酸)，醇(如乙醇、丙醇和/或1，3-丙二醇)，和酶或次级代谢物(如抗菌剂)。
在另外的实施方案中，本发明强烈改进了将淀粉或纤维素转变为葡萄糖之方法，其中葡萄糖接着被转变为目的终产物。通过保持中间物在转化培养基中以低浓度存在，整个生产效率被提高了。在一些实施方案中，酶的抑制和/或代谢物阻遏，氧的需求和/或副产物的形成被降低了。
在一些优选的实施方案中，最小中间物浓度的保持是通过将中间物浓度保持在低的浓度而实现的。在一个实施方案中，中间物浓度低于或等于培养基重量体积比的25％(例如0.25％到0.00001％的重量体积比)。在另一些实施方案中，中间物浓度低于或等于0.20％，0.10％，0.05％或0.01％的重量体积比(例如分别为0.20％到0.00001％，0.10％到0.00001％，0.05％到0.00001％，0.01％到0.00001％)。或者中间物在转化培养基中的浓度保持在低于或等于2.0μmolar。在另一个实施方案中，浓度保持在低于或等于1.0umolar。还在另一个实施方案中，中间物浓度保持在低于或等于0.75umolar。在任何情况下，保持低浓度意味着保持中间物的浓度低于导致酶抑制(即酶抑制效应)、代谢物阻遏(即代谢物阻遏效应)的阈值。
在进一步的实施方案中，最小浓度的保持是通过保持底物向中间物的转化速率低于或等于中间物向终产物的转化速率来实现的。虽然，已知底物向中间物的转化速率必然会限制中间物向终产物的转化速率，但是通过提供充足的中间物转化酶将第一个酶转化碳底物形成的中间物基本完全转化，从而基本上所有中间物被转变为终产物的速度与起始底物被转变的速度一样快，以最小化中间物在转化培养基中的存在。提供这种多余中间物转化的方法的例子包括提供过量的中间物转化酶，增加中间物转化酶的酶活力和/或降低底物转化酶的活力，从而使中间物到终产物的转变与其来自底物的转变一样快。因为预期实际上的转化速率会因产生的特定目的终产物而变化，因而也预期在量和测定这些量的实验上会有一些变化。然而，这里提供了进行这些测定的指导。
在一些实施方案中，中间物转化或消耗的速率通过计算混合培养基中生物体的量来测定，同时还要考虑混合培养基中的其它物理参数并用通常已知的转化速率乘以该数量。由此得出中间物(如葡萄糖)向终产物的转化速率。在一些实施方案中，中间物向目的产物的转化是通过天然产生的生物体或一种能提供这种生物转化的突变体来完成这种由中间物向终产物的转化或生物转化。另一个由中间物向终产物转化的实施方案涉及利用已知的获得目的终产物的酶并使用已知的酶转化方法来进行酶转化。例如，在一些实施方案中，葡萄糖向目的终产物(如丙二醇、琥珀酸、葡糖酸、乳酸、氨基酸、抗菌剂、乙醇、抗坏血酸中间物和/或抗坏血酸)的转化是通过加入一定量的已知将葡萄糖转变为特定目的终产物的酶来完成的。
一旦中间物向目的终产物的转化速率被确定，则碳底物向中间物的转化限制可以以同样的方式来确定。通过计算中间物到终产物转化的上限，碳底物向中间物转化的转化速率就能被确定，主要考虑的是在转化培养基中中间物的浓度水平保持在足够低的水平以抵消通常中间物的代谢物阻遏/酶抑制效应。在一个实施方案中这是通过保持中间物向终产物的转化速率超过或等于碳底物向中间物的转化速率来完成。因此，本发明提供提高向终产物的转化速率和限制碳底物向中间物转化的方法。
另一个确定中间物向终产物转化的速率是否高于或等于碳底物产生中间物的方法是测定中间物在反应容器内的重量百分率。中间物在反应容器中存在的数量可以通过各种已知的方法来测定，包括但不限于直接的或间接的测量中间物在反应容器中存在的数量。直接的测量可以通过使用已知的鉴定容器中中间物或终产物量的分析方法来定期的分析反应容器中的内容物。另外，直接的测量反应容器中的中间物的量的方法包括本领域已知的即时气、液分析和高效液相色普法。
间接的测量产生的中间物或终产物的水平可以通过使用本领域已知的方法(如测定氧的吸收率和/或二氧化碳的演化率)来测量氧的吸收或二氧化碳的产生，从而得以评估。
底物
本发明的底物是能够被酶转变为中间化合物的以碳为基础的化合物。合适的底物包括但不限于包含能被转变为糖的成分的被加工过的材料(如纤维生物质、糖原、淀粉和它们的各种形式，例如玉米淀粉、小麦淀粉、玉米固体和小麦固体)。在发展本发明时使用玉米淀粉和小麦淀粉获得了良好的结果，但是其它来源，包括来自谷物和块茎的淀粉(如甘薯、马铃薯、大米和木薯淀粉)也发现可用于本发明。各种淀粉都是商业上可获得的。例如玉米淀粉可以从Cerestar、Sigma和Katayama化学工业公司(日本)获得；小麦淀粉可以从Sigma获得；甘薯淀粉可以从Wako Pure化学工业公司(日本)获得；马铃薯淀粉可以从Nakari化学药物公司(日本)获得。特别有用的碳底物是玉米淀粉。在本发明的一些实施方案中，颗粒淀粉被用于淀粉比例占大约20％到大约35％的浆状物中。淀粉的浓度介于约10％到约35％是优选的。在一些特别优选的实施方案中，淀粉百分数的范围是介于30％到32％。除了粗淀粉颗粒，其它一些碳底物来源也发现可用于本发明，包括但不限于生物质、多糖和其它能被酶转变为中间物的以碳为基础的材料。
可发酵糖能够从广泛的各种来源获得，包括木质素纤维素材料。木质素纤维素材料可以从木质素纤维素废产物(如植物残渣和废纸)中获得。合适的植物残渣的例子包括但不限于茎、叶、壳、皮、玉米穗之类，还有玉米秸秆、begasses、木头、木片、木浆和锯末。废纸的例子包括但不限于各种类型的废弃的纸(如影应纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打印机纸之类)，还有报纸、杂志、纸板和纸质包装材料。本领域已知将糖转变为乙醇的条件。通常温度介于约25℃到35℃(如介于25℃到35℃之间，更特别的是在30℃)。转化培养基使用的pH范围是介于约4.0到6.0、4.5到6.0和pH5.5到5.8。但是本发明无意被限于任何特定的温度和/或pH条件，因为这些条件依赖于涉及的底物、酶、中间物和/或终产物。
酶
在本发明的一些优选的实施方案中，底物转化酶(即能首先将碳底物转变为中间物的酶)和中间物转化酶(即能将产生的中间物转变为介入中间物和/或目的终产物的酶)都被发现可用于本发明。在本发明的一些实施方案中，用于将碳底物转变为中间物的酶包括但不限于α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、淀粉水解葡萄糖淀粉酶和支链淀粉酶。用于将中间物转化为终产物的酶很大程度上依赖于具体的目的终产物。例如用于将糖转化为1，3-丙二醇的酶包括但不限于大肠杆菌和其它微生物产生的酶。例如用于将糖转化为乳酸的酶包括但不限于乳杆菌和发酵单胞菌产生的酶。用于将糖转化为乙醇的酶包括但不限于醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。用于将糖转化为抗坏血酸中间物的酶包括但不限于葡萄糖脱氢酶、葡糖酸脱氢酶、2，5-二酮-D-葡糖酸还原酶和各种其它的酶。用于将糖转化为葡糖酸的酶包括但不限于葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。
在一些优选的实施方案中，用于本发明的某些方法的α-淀粉酶通常是具有随机切割淀粉中α-(1-4)葡萄糖苷键效果的酶。在大多数的实施方案中，α-淀粉酶选自具有E.C.编号为E.C.3.2.1.1，特别是编号为E.C.3.2.1.1-3的微生物酶。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶是耐热细菌的α-淀粉酶。在多数特别优选的实施方案中，α-淀粉酶得自或来自芽孢杆菌属。事实上，在本发明的发展过程中，使用来自于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(Genencor)的SPEZYME®α-淀粉酶获得了良好的结果。在另一些实施方案中，用于从未预煮的淀粉(如玉米和木薯)中进行醇发酵的方法(Ueda等人，J.Ferment.Technol.，50：237-242[1980]；和Ueda等人，J.Ferment.Technol.，58：237-242[1980])的black-koji淀粉酶可用于本发明。
作为本领域的共识，本发明方法中使用的α-淀粉酶的量依赖于α-淀粉酶的酶活力和终产物转换器对产生的葡萄糖的转化率。例如，通常0.01到1公斤量的SPEZYME®FRED(Genencor)被加入到一公吨淀粉中。在一些实施方案中，酶的加入量为0.4到0.6公斤，而另一些实施方案中它的加入量为每公吨淀粉0.5到0.6公斤的SPEZYME®FRED。
在本发明优选的实施方案中，葡萄糖淀粉酶是一种从淀粉非还原端连续除去葡萄糖单元的酶。此酶能水解淀粉、直链淀粉和支链淀粉的直链和支链的葡萄糖苷键。在多数实施方案中，用于本发明方法的葡萄糖淀粉酶是微生物酶。在一些优选的实施方案中，葡萄糖淀粉酶是一种耐热的真菌葡萄糖淀粉酶，例如曲霉属葡萄糖淀粉酶。事实上，在本发明的发展过程中，使用来自黑曲霉(Aspergillus niger)的DISTALLASE®葡萄糖淀粉酶(Genencor)获得了良好的结果。从黑曲霉制备的葡萄糖淀粉酶制剂在未经预煮就已被使用(见Ueda等人，Biotechnol.Bioeng.，23：291[1981])。三种从Aspergillus awamori var.kawachi中分离到的葡萄糖淀粉酶已被选来用于水解淀粉(见Hayashida，Agr.Biol.Chem.，39：2093-2099[1973])。未经煮过的甘薯经Endomycopsisfibuligoeu葡萄糖淀粉酶的酒精发酵已被描述了(Saha等人，Biotechnol.Bioeng.，25：1181-1186[1983])。可使用于本发明的另一种酶是葡萄糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，其是一种从非还原末端逐步水解α-1，4-糖苷链的酶。此酶也水解α-1，6-糖苷链。葡萄糖淀粉酶是从曲霉属中分泌，根霉(Rhizopus)和毛霉(Mucor)也可用于本发明的方法中。这些酶被进一步发现可用于葡萄糖的生产以及糖原和淀粉的定量中。从E.fibuligera(IFO 0111)中制备的葡萄糖淀粉酶被用来与甘薯淀粉原料接触，进行醇发酵(见Saha等人，Biotechnol.Bioeng.，25：1181-1186[1983])。这个酶的一个主要应用是从淀粉材料生产乙醇时作为糖化试剂。但是与这里描述的其它葡萄糖淀粉酶一样，此酶也可使用于本发明的方法中。
本发明的方法中所使用的其它葡萄糖淀粉酶，包括从根霉属和腐质霉属获得的酶，其特征是具有特别高的生产力和酶活力。此外，与来自其它生物体的葡萄糖淀粉酶相比，来自根霉的葡萄糖淀粉酶对淀粉具有很强的作用，它的酶学和化学特性包括最适pH特别适合谷类淀粉的糖化。因为这些特点，来自根霉的葡萄糖淀粉酶被认为是最适合利用不煮或低温煮过的淀粉进行醇生产的酶(见U.S.Pat.No.4,514,496和4,092,434)。已引起注意的是，当根霉葡萄糖淀粉酶与玉米淀粉原料孵育并结合使用根霉α-淀粉酶时，会加速葡萄糖淀粉酶对淀粉的降解。尽管本发明无意限于任何特定的机制或理论，但是认为根霉菌葡萄糖淀粉酶比同样含有α-淀粉酶的黑曲霉葡萄糖淀粉酶制品具有更强的降解活力(见Yamamoto等人，DenpunKagaku，37：129-136[1990])。可用于本发明的另一种商业制品是从Shin Nippo Chemical Co.，Ltd.获得的来自于清酒曲(根霉niveus的一系)的葡萄糖淀粉酶制品。可用于本发明的另一种商业制品是从印度班加罗尔的Biocon India获得的商用淀粉水解复合物M1。
作为本领域的共识，本发明方法中使用的葡萄糖淀粉酶的量依赖于葡萄糖淀粉酶的酶活力(例如DISTILLASE®L-400)。通常，0.001到2毫升的葡萄糖淀粉酶溶液被加入到450gm调节到含20-35％干固体的浆状物中，浆状物是糖化过程中液化的糊状物和/或发酵过程中水解的淀粉和糖。在一些实施方案中，葡萄糖淀粉酶加入的量为0.005到1.5ml的这种溶液。在一些优选的实施方案中，此酶加入的量为0.01到1.0ml的这种溶液。
如以上所表明的，支链淀粉酶也可使用于本发明的方法中。这些酶水解α-1，6-糖苷键。因此，在液化淀粉的糖化过程中，支链淀粉酶从淀粉的非还原端连续的除去葡萄糖单元。该酶能够水解淀粉、直链淀粉、支链淀粉的直链和支链糖苷连接。
本发明的方法中所使用的其它酶包括淀粉水解酶(RSH)，包括腐质霉属RSH葡萄糖淀粉酶酶制品(见U.S.Patent No.4,618,579)。这一腐质霉属RSH酶制品在pH5.0到7.0，特别是在5.5到6.0的范围表现出最大的活力。此外，此酶制品在温度范围为50℃到60℃时表现出最大的活力。因此，在使用这一酶的本发明的每一步中，酶对淀粉的溶解最好在这些pH和温度范围内进行。
在一些实施方案中，来自真菌生物体Humicola grisea var.thermoidea菌株的腐质霉属RSH酶制品可使用于本发明的方法中。在一些特别优选的实施方案中，这些腐质霉属RSH酶制品选自ATCC(美国典型培养物保藏中心)16453，NRRL(USDA Northern Regional ResearchLaboratory)15219，NRRL 15220，NRRL 15221，NRRL 15222，NRRL 15223，NRRL 15224和NRRL 15225，和来自于这些酶的遗传改变株系。
另外，可于本发明方法中使用的RSH葡萄糖淀粉酶包括根霉属RSH葡萄糖淀粉酶酶制品。在一些实施方案中，使用了商品名为“CU CONC″”的从Shin Nippo Chemical Co.，Ltd.(日本Ahjyo)获得的来自于清酒曲(根霉niveus的一系)的葡萄糖淀粉酶制品。另一种有用的酶制品来自Amano Pharmaceutical，商品名为“GLUCZYME”，是消化根霉制成的商品(见Takahashi等人，J.Biochem.，98：663-671[1985])。其它的酶包括三种形式的根霉种葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)，即“Gluc1”(MW 74,000)，“Gluc2”(MW 58,600)和“Gluc3”(MW 61,400)。Gluc1被发现效用比Gluc2或Gluc3高出22-25倍。因此，虽然在本发明中可使用Gluc2和Gluc3，由于Gluc1与淀粉紧密结合并具有4.5的最佳pH值，在本发明中Gluc1被特别使用。使用于本发明的另一额外的RSH葡萄糖淀粉酶酶制品包括以名称“M1”出售的酶制品，从BioconIndia，Ltd.Bangalore，India获得(M1是一种多用途的酶组合物或混合物)。
如上所述的，在多数实施方案中，腐质霉属RSH葡萄糖淀粉酶酶制品具有葡萄糖淀粉酶活力，以及溶解淀粉的强化因子。在其它RSH酶制品中强化因子和葡萄糖淀粉酶活力的比例可能有一定的变化。但是本发明中使用的RSH葡萄糖淀粉酶酶制品通常具有与葡萄糖淀粉酶组分一并产生的充足的强化因子。因此，RSH葡萄糖淀粉酶酶制品的活力是以它们的葡萄糖淀粉酶活力来定义的。
除了以上描述的含水解酶的酶组合物的用途以外，本发明还提供将微生物暴露于底物并利用底物生产目的终产物的方法。因此，在一些实施方案中，将底物与生产目的终产物的真菌、细菌或其它微生物相接触，从而将底物或中间物转变成目的中间物或终产物。例如，食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorous)(ATCC 33621)是一种从畜粪富积物中分离到的产生乳酸的细菌(见Nkamura，Int.J.Syst.Bacteriol.，31：56-63[1981])。这一菌株产生一种胞外淀粉酶使它能够将液化的(可溶的)淀粉水解成葡萄糖，再被发酵成乳酸(见Xiaodong等人Biotechnol.Lett.，19：841-843[1997])。大肠杆菌产生1，3-丙二醇和琥珀酸，它们能与葡萄糖接触而产生甘油和1，3-丙二醇。
事实上，本发明的方法中使用的商业可获得的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶具有经济实用的酶浓度。虽然通常使用的发酵条件并不利用最佳温度，但发酵的pH条件却紧密相应于商业获得的糖化酶(即葡萄糖淀粉酶)的最佳pH。在本发明的一些实施方案中，颗粒淀粉的逐渐溶解促进了其完全糖化成葡萄糖。假定酶始终暴露于低浓度的糊精。另外，在发酵过程中不断撤走葡萄糖，保持发酵培养基中的低葡萄糖含量。因此，葡萄糖淀粉酶被暴露于低浓度的葡萄糖。结果，葡萄糖淀粉酶被如此有效的利用，以至本发明的方法适合使用经济有效的葡萄糖淀粉酶(GAU)剂量水平(即葡萄糖淀粉酶的剂量为每克淀粉0.05-10.0GAU，最好为每克淀粉0.2-2.0GAU)。
以上提供的葡萄糖淀粉酶剂量只是发酵液中酶糖化活力的近似有效浓度，糖化活力的其余部分由α-淀粉酶贡献。虽然本发明无意被限于任何特定的机制或理论，但据认为，α-淀粉酶进一步拓宽了葡萄糖淀粉酶在淀粉颗粒上打出的缺口(见Yamamoto等人，上文)。具有代表意义的是，商业上可获得的α-淀粉酶的使用会导致大量的糖的产生，如葡萄糖和麦芽糖。
预计，在酿造工业中会向麦芽汁中加入来自于米曲霉(Aspergillusoryzae)的α-淀粉酶(如CLARASE®L(Genencor InternationalInc.))。这一特殊的酶将糊精糖化为麦芽三糖和麦芽糖。因此，虽然α-淀粉酶的目的是液化淀粉，它的糖化趋向也使α-淀粉酶成为糖化酶成分的一部分。
除此以外，一些商业可获得的葡萄糖淀粉酶包含一些α-淀粉酶活力。因此，可能(虽然通常并不实际)在只有葡萄糖淀粉酶存在的情况下发酵颗粒淀粉。但是，并无意将这类实施方案排除于本发明。
在本发明方法的多数实施方案中，有效数量的α-淀粉酶被加入颗粒淀粉的浆中。本领域技术人员知道除了葡萄糖淀粉酶所提供的不确定量的α-淀粉酶活力以外，α-淀粉酶有效的活力可能与厂商提供的单位活力值十分不同。α-淀粉酶的活力依赖于pH，在选择用来发酵的不同pH范围(即相对于厂商报道单位活力值所使用的测试条件)，其活力可能不同。因此，为了确立最有效的α-淀粉酶剂量，设计一些初始的实验(包括那些在这里没有明确描述，但在本发明的方法中可使用的实验)，有时是必要的。
在一些最优选的实施方案中，α-淀粉酶的剂量范围，就真菌α-淀粉酶而言是每克淀粉0.02SKBU到2.0SKBU(真菌α-淀粉酶单位)，虽然在一些特别优选的实施方案中，此范围是0.05-0.6SKBU/g。本领域已知“SKBU”的定义(见Cerial Chem.，16：712-723[1939])。在多数使用芽孢杆菌α-淀粉酶的实施方案中，其范围是0.01LU/g到0.6LU/g，优选是0.05到0.15LU/g。关于葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶在发酵浆中真正活力的不确定性，预计需要在一些实施方案的实践中引入初始研究。优化考虑包括在葡萄糖淀粉酶恒定的含量下增加α-淀粉酶的剂量，提高发酵速率。另外则是，在α-淀粉酶恒定的含量下增加葡萄糖淀粉酶的剂量，提高发酵速率。控制酶的剂量不变和/或增加发酵浆中的淀粉含量，也能提高发酵速率。事实上，在某些实施方案中，预计最佳α-淀粉酶剂量将大大超过目前推荐的用于液化淀粉的剂量；最佳葡萄糖淀粉酶剂量可能超过推荐的用于糖化糖浆的剂量。然而，酶的剂量不应该与酶的使用相混淆。加入到淀粉浆中的酶有相当部分可以从发酵液中重新获得，并用于新的颗粒淀粉发酵。
在发酵温度下使用酶的另一个考虑是，虽然酶表现出较低的相对活力(如来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶在所处发酵温度中的活力不超过最大活力的25％)，但是低的相对活力被延长的发酵时间(48-120小时)和没有经受更高温度的酶的延长的半衰期所平衡。事实上，经测定，在发酵72小时后酶仍然保持了90％以上的活力。
地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SPEZYME®AA和SPEZYME®FRED enzymes；Genencor International Inc.)的稳定性足以经受短暂的暴露于蒸馏釜温度。因此，循环蒸馏可以作为一种回收α-淀粉酶的方式。但是，从循环蒸馏中回收酶需要小心，以免让发酵液达到乙醇的脱离温度(stripping temperature)，而使酶失效。例如，醇可能从发酵液中真空逃逸，这种回收酶的循环蒸馏适合用于其后的反应。
然而，如先前描述的，一些RSHs葡萄糖淀粉酶(如获得自根霉的酶)可以用于在低于煮沸的温度将淀粉转变为葡萄糖，减少了将酶组合物暴露于蒸馏釜温度的需要。这降低了将碳底物转变为目的终产物的能源成本，因此降低了生产的整个成本。因此，在本发明的方法中可特别使用这些酶。
在本发明优选的实施方案中，一旦碳源被酶转变为中间物，它就会被适当的方法转变为目的终产物。转化由任何适合的方法(如酶或化学的方法)完成。在一个优选的实施方案中，转化是通过将中间物与微生物接触，通过中间物的生物转化来完成。在替换的优选实施方案中，各种底物转化酶和中间物转化酶被置于与底物和/或中间物直接接触。在一些实施方案中，酶以分离的、纯化的或浓缩的制品被提供。
在进一步的实施方案中，底物和/或中间物直接与分泌或代谢各自底物或中间物的微生物(如细菌或真菌)接触。因此本发明提供将底物生物转化为终产物的方法。在一些实施方案中，转化过程中至少产生一种中间化合物。
在一些实施方案中，利用被遗传修饰后表达野生型生物体正常情况下不产生的酶的微生物。在一些特别优选的实施方案中，生物体被修饰来过量表达野生型生物体正常产生的酶。
目的终产物可以是酶将底物转化为终产物可能产生的任何产物。在一些优选的实施方案中，底物首先被转变为至少一种中间物，然后中间物被转变为终产物。例如，己糖可以被生物转变为许多产物，如抗坏血酸中间物、乙醇、1，3-丙二醇和葡糖酸。抗坏血酸中间物包括但不限于2，5-二酮葡糖酸，2 KLG(2-酮-L-葡糖酸)，和5-KDG(5-酮-D-葡糖酸)。通过将葡萄糖与葡萄糖脱氢酶(GDH)接触，可以将葡萄糖转变为葡糖酸。另外，通过将葡糖酸与GDH接触，可以将葡糖酸转变为2-KDG(2-酮-D-葡糖酸)。此外，通过将2-KDG与2-KDGH接触，可以将2-KDG转变为2，5-DKG。通过将葡糖酸与2KR接触也能将葡糖酸转变为2-KDG。通过将葡萄糖与大肠杆菌接触也能将葡萄糖转变为1，3-丙二醇。另外，通过将葡萄糖与大肠杆菌接触能将葡萄糖转变为琥珀酸。本发明也提供这里描述的附加的实施方案。
在一些实施方案中，葡萄糖是一种中间物，它通过与产生乙醇的微生物接触而被转变为乙醇。在中间物与中间物转化酶接触时，计划将分离和/或纯化的酶与中间物接触。而在另一些实施方案中，中间物与生物转变试剂如吸收中间物并产生目的终产物的细菌、真菌或其它生物体相接触。在一些实施方案中，生物体是野生型，而在另一些实施方案中，它是突变型。
优选的产生乙醇的微生物的例子包括表达醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的产生乙醇的细菌，例如能够从运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)得到的细菌(见例如，U.S.Pat.Nos.5,028,539；5,000,000；5,424,202；5,487,989；5,482,846；5,554,520；5,514,583和共同未决申请：1994年12月27日提交的U.S.Ser.No.08/363,868，1995年6月7日提交的U.S.Ser.No.08/475,925和1994年3月28日提交的U.S.Ser.No.08/218,914)。
在附加的实施方案中，产生乙醇的微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶(将木糖转变为木酮糖的酶)。在进一步的实施方案中，木糖异构酶被用来将木糖转变为木酮糖。在附加的实施方案中，产生乙醇的微生物也表达木酮糖激酶，一种催化木酮糖转变为木酮糖-5-磷酸的酶。涉及完成此途径的其它酶包括转醛酶和转酮酶。这些酶能够得自或源于大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和欧文氏菌属物种(见例如U.S.Pat.No.No.5,514,583)。
在一些特别优选的实施方案中，利用了一种能够将戊糖和己糖都发酵成乙醇的微生物。例如在一些实施方案中，天然具有一套酶，并经遗传工程而具有另一套补充的酶的重组生物体被使用了(见例如U.S.Pat.Nos.5,000,000；5,028,539；5,424,202；5,482,846；5,514,583和WO95/13362)。在一些实施方案中，特别优选的微生物包括产酸克雷伯氏菌P2和大肠杆菌KO 11。
在一些实施方案中，补充物被加入到营养培养基(即培养基)，包括但不限于维生素、大量营养素和微量营养素。维生素包括但不限于氯化胆碱、尼克酸、硫胺·HCL，维生素B12、对氨基苯酸、生物素、泛酸钙、叶酸、维生素B6·HCL和核黄素。大量营养素包括但不限于(NH4)2SO4、K2HPO4、NaCl和MgSO4·7H2O。微量营养素包括但不限于FeCl36H2O、ZnCl2·4H2O、CoCl2·6H2O、钼酸(tech)、CuCl3·2H2O、CaCl2·2H2O和H3BO3。
培养基和碳底物
本发明的转化培养基必须含有合适的碳底物，合适的碳底物包括但不限于生物质、单糖(如葡萄糖和果糖)、二糖(如乳糖和蔗糖)、寡聚糖、多糖(如淀粉和纤维素)，还有它们的混合物和来自可回收原料的不纯的混合物，如干酪乳清渗透物、玉米浸泡液、糖用甜菜糖蜜和大麦芽。在附加的实施方案中，碳底物包含具有一个碳的碳底物如二氧化碳或甲醇，它们经代谢转化为关键的生化中间物已经被证明了。
在甲基营养酵母中(见Yamada等人，Agric.Biol.Chem.，53：541-543[1989])和细菌中(见Hunter等人，Biochem.，24：4148-4155[1985])从单碳源(如甲醇、甲醛或甲酸)生产甘油已经被报道了。这些生物体能够吸收单碳化合物(氧化状态从甲烷到甲酸)，并产生甘油。在一些实施方案中，碳的吸收路径是通过核酮糖一磷酸、通过丝氨酸或通过木酮糖一磷酸(见Gottschalk，Bacterial Metabolism，第二版，Springer-Verlag，NewYork[1986])。核酮糖一磷酸路径涉及用核酮糖-5-磷酸与甲酸缩合，形成六碳糖，再变为果糖，最终成为三碳产物——甘油醛-3-磷酸。同样，丝氨酸路径经由亚甲基四氢叶酸将一碳化合物吸收进糖酵解途径。
除了利用一碳和二碳底物外，已知甲基营养生物体还能利用一些其它含碳化合物，如甲胺、葡萄糖胺和各种用于代谢活力的氨基酸。例如，已知甲基营养酵母能够利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，in Murrell等(eds)，7th Microb.Growth C1 Compd.，Int.Symp.，415-32，Intercept，Andover，UK[1993])。相似的，各种假丝酵母代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.，153：485-9[1990])因此，在本发明中利用的碳源包括广泛的含碳底物，其仅仅受到宿主生物体需要的限制。
虽然预计以上提到的所有碳底物及其混合物都可用于本发明的方法中，优选的碳底物包括单糖、二糖、寡糖、多糖和一碳底物。在更特别优选的实施方案中，碳底物选自葡萄糖、果糖、蔗糖和一碳底物，例如甲醇和二氧化碳。在最优选的实施方案中，底物是葡萄糖。
本领域已知，除了合适的碳源以外，发酵培养基必须含有合适的氮源，矿物质、盐、辅助因子、缓冲液和其它一些适合培养物生长并促进生产目的终产物(如甘油)所必需的酶途径的成分。在一些实施方案中，(II)盐和/或维生素B12或它的前体可用于本发明。
培养条件
典型的是细胞生长在接近30℃的适当培养基中。本发明利用的优选的生长培养基包括普通商业制备的培养基，如Luria Bertani(LB)液体培养基、Sabouraud Dextrose(SD)液体培养基或Yeast MaltExtract(YM)液体培养基。然而，其它成分确定的或合成的生长培养基，只要适合，也可能被使用。对于这些培养基的适当的培养条件，在本领域已众所周知。
在一些实施方案中，已知直接或间接调节代谢物阻遏的试剂(如环腺苷2′：3′-单磷酸或环腺苷2′：5′-单磷酸)，被加入到反应培养基中。相似的，也可使用导致甘油产量提高的调节酶活力的试剂(如亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和碱金属)，它们可以与遗传操作连用或作为一种替代的方法。
发酵适合的pH范围介于pH5.0到pH9.0；而pH6.0到pH8.0的范围特别适合反应系统的初始条件。此外，反应可以在好氧、微需氧或厌氧的条件下进行，只要适合所用的生物体。
分批式和连续发酵
在一些优选的实施方案中，本发明使用分批式发酵方法。经典的分批式发酵是一封闭的系统，其中培养基的组成在发酵的一开始即被固定，在发酵过程中不经过人为改变。因此，在发酵的开始时培养基用目的生物体接种。在这种方法中，发酵被允许在不向系统中添加任何成分的情况下进行。典型的分批式发酵根据碳源的加入定义为“分批式”，并常常试图控制pH和氧浓度之类的因素。分批式系统的代谢物和生物质组成随时间恒定变化，直到发酵结束为止。在分批式培养物中，细胞稳健的通过静止的对数阶段到高速生长的对数阶段，最终到达稳定阶段，在此生长速率被减小或停止了。如果不被处理，在稳定阶段的细胞会最终死亡。通常，处于对数阶段的细胞负责终产物或中间物的大量产生。
标准分批式系统的一个改变是“补料分批式发酵”系统，该系统也可用于本发明。在这一对典型分批式系统的改变中，底物的加入随发酵的进行而增加。当代谢物阻遏易于抑制细胞的代谢，以及在培养基中需要有限的底物数量时，补料分批式系统就有用。在补料分批式系统中很难测量实际的底物浓度，因此，以可测量因子的变化为基础进行估计，如pH、溶解氧和废气(如CO2)的分压。在本领域分批式和补料分批式发酵既普通又众所周知。
预计本发明的方法也适用于连续发酵方法。连续发酵是一开放的系统，成分确定的发酵培养基被连续加到一生物反应器中，等量的条件培养基被同时移走，以进行处理。连续发酵通常保持培养物在一恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长阶段。
连续的发酵允许调节影响细胞生长和/或终产物浓度的一种因子和任何数量的因子。例如，在一个实施方案中，限制性营养成分，例如碳源或氮水平，被保持在一固定的比率，所有其它参数允许被调节。在其它系统中，影响生长的一些因素可以被连续改变，而通过培养基混浊度测定的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持生长条件的稳定状态。因此，由于培养基的撤出而导致的细胞丢失必须依靠发酵中细胞的生长速率来平衡。在工业微生物学领域，调节连续发酵过程中营养成分和生长因子的方法，以及最大化产物形成率的技术，已众所周知。
在一些实施方案中，本发明使用分批式过程，而在另一些实施方案中，补料分批式或连续过程，以及任何适合发酵的其它模式被使用了。另外，在一些实施方案中，细胞被固定于底物上作为全细胞催化剂，并处于适合终产物产生的发酵条件之下。
酶途径的改变
在本发明的方法中设计使用各种改变酶途径的方法。一种具有代表性的酶途径涉及从葡萄糖生产1，3-丙二醇。在一些实施方案中，这一途径是通过以下的一系列步骤来完成，这些步骤代表一些本领域技术人员所知道的途径。在这一代表性的路径中，糖酵解途径的酶通过一系列步骤将葡萄糖转变为磷酸二羟丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛(3-PG)。随后可通过将DHAP水解成二羟基丙酮(DHA)再还原，或将DHAP还原成3-磷酸甘油(G3P)再水解，而形成甘油。水解步骤可以被任何数量的具有或不具有底物专一性的细胞磷酸酶催化，或者通过重组将这种酶活力引入宿主。在一些实施方案中，还原步骤被与NAD+(或NADP+)结合的宿主酶催化，或通过重组将这种酶活力引入宿主。值得注意的是dha调节子包含甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)，其催化方程式3的可逆反应。
  (方程式1)
  (方程式2)
  (方程式3)
以上已详细的描述了甘油经中间物3-羟基丙醛(3-HP)被转变为丙二醇。中间物3-HP通过脱水酶而产生自甘油(方程式1)，这种酶可以被宿主编码或通过重组被引入宿主。这一脱水酶可以是甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)，二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)或任何其它能催化这一转变的酶。甘油脱水酶(但不是二醇脱水酶)是由dha调节子编码。在一些实施方案中，1，3-丙二醇通过与NAD+或NADP+结合的宿主酶而产生自3-HP(方程式2)，而在另一些实施方案中，此活力通过重组被引入宿主。在有些实施方案中，产生1，3-丙二醇的最终反应是通过1，3-丙二醇脱氢酶(E.C.1.1.1.202)或其它醇脱氢酶来催化的。值得注意的是，在一些实施方案中，突变和转化影响碳通道(channeling)。在本发明中可使用各种突变的生物体，其包括1，3-丙二醇产生途径的改变。将丙糖磷酸异构酶突变体(tpi-)引入微生物是使用突变体来提高碳通道效果的例子。另外的选择是减少乙醇(adh)或乳酸(Idh)产生的突变体，其增加用于生产1，3-丙二醇的NADH的可获得性。
在3-磷酸甘油醛之后的糖酵解步骤中的其它突变包括1，3-丙二醇产生途径。影响葡萄糖转运效果的突变，如能够阻止PEP丢失的PTS，也可使用于本发明。在本发明也可使用阻断1，3-丙二醇产生途径的中间物的替代途径(如甘油代谢途径(glp))的突变。在一些实施方案中，突变直接针对结构基因，以便削弱或提高酶活性，或直接针对调节基因，以便调节酶活力的表达水平。
在附加的实施方案中，转化与突变相结合，以控制特定的酶活力，增加1，3-丙二醇的产生。因此，在本发明范围内也提供全细胞催化剂的修饰，其增加1，3-丙二醇的产生。
终产物的鉴定和纯化
在本领域已知从发酵培养基中纯化终产物的方法。例如，可以将反应混合物用有机溶剂抽提，再经蒸馏和柱层析(见例如U.S.Pat.No.5,356,812)可以从细胞培养基得到丙二醇。对这一过程特别好的有机溶剂是环己烷(见U.S.Pat.No.5,008,473)。
在一些实施方案中，通过将培养基直接交于高压液相层析(HPLC)分析，而使终产物得以鉴定。本发明的一个方法涉及在分析型离子交换柱上用等度洗脱方式(isocratic fashion)使用0.01N的硫酸作为流动相来分析发酵培养基。
酶的鉴定和纯化
培养基中酶的水平可以通过对酶的分析来测定。例如，在1，3-丙二醇的生产中，蛋白质G3PDH和G3P磷酸酶的表达水平通过酶分析被测量。在DHAP转化为G-3-P的过程中，G3PDH活力分析依赖于共底物NADH的光谱特性。NADH具有内在的UV/vis吸收，它的消耗可以使用340nm的分光光度测定法监控。G3P磷酸酶活力可以通过任何测定反应中释放的无机磷酸盐的方法测定。使用的最普通的测定方法使用了可见分光光度法测定蓝色磷钼酸铵复合体。
因此，虽然本领域已知的方法与本发明的方法有许多表面的相似之处，本发明提供了更为全面的的目的，它们反映在大量详细特征上，这些特征被认为是本发明所独有的，包括明显的酶循环、生物质和淀粉循环。
回收
总的来说，在循环蒸馏中回收酶需要小心，以避免转化培养基达到使酶失活的温度。在一个实施例中，为了使乙醇回收，醇从发酵液中真空脱离之后，进行循环蒸馏，以回收酶。在一些实施方案中，酶被超滤或电渗装置回收，并循环。
方法考虑
如上所表明的，颗粒淀粉的发酵与糖浆的发酵具有完全不同的特点。通常溶液中具有20％的固体被认为是发酵培养基中最大的糖含量，因为更高的浓度会在发酵开始和结束时带来困难。然而，在淀粉浆的发酵中却没有相似的限制存在。浆中的淀粉浓度可以是10-35％，在发酵起始时没有明显的后果。增加淀粉浓度(如酶量恒定)会加速生物转化速率，或降低达到给定的生物转化速率所需的酶量。过量的(即剩余的)颗粒淀粉可以和相当数量的酶一起被回收，并用于新的发酵。因此，控制淀粉浓度是本发明实践的主要方法参数。
在优选的实施方案中，提供了淀粉占10-35％重量的颗粒淀粉浆的生物转化和发酵方法。在一些优选的实施方案中，使用大肠杆菌发酵10-35％的淀粉浆，导致当发酵进行到有机酸或1，3-丙二醇含量达到预设的水平时有剩余淀粉产生。然而，该反应依赖于使用的生物体和生物过程的条件，因此，当剩余的淀粉被再次发酵时，出现了在淀粉颗粒上的酶的再循环。然而，在优选的实施方案中，即使25-35％的淀粉浆被发酵，在淀粉颗粒完全消失之前发酵已经被停止了，颗粒用于下次发酵。因此，回收淀粉是一种回收酶以便再利用的简便方法。
在本发明一个优选的实施方案中，(颗粒)淀粉和微生物被同时撤走(如通过离心或过滤)。被撤走的淀粉和微生物与新的颗粒淀粉混合，必要时还会加入附加的酶，以制成用于另一次发酵运转的发酵装料。
在另一优选的实施方案中，提供了纤维素占10-25％重量的玉米秸秆浆的生物转化和发酵。在一个实施方案中，使用大肠杆菌发酵10-25％的纤维素浆，导致当发酵进行到有机酸或1，3-丙二醇含量达到预设的水平时有剩余的纤维素。该反应依赖于使用的生物体和生物过程的条件。如上，当剩余的玉米秸秆被再次发酵时，出现了在玉米秸秆上的酶的再循环。然而，在优选的实施方案中，即使25-35％的纤维素浆被发酵，在秸秆完全消失之前发酵已经被停止了，用于下次发酵。因此，回收秸秆是一种回收酶以便再利用的简便方法。
然而，在另一个优选的实施方案中，玉米秸秆和微生物被同时撤走(如通过离心或过滤)。被撤走的玉米秸秆和微生物与新的玉米秸秆和所需的酶混合，以制成用于另一次发酵运转的发酵装料。
作为本领域技术人员的共识，为达到最佳的操作细节，折中的工程方案(trade-offs)被设计了。这些折中的方案设计依赖于各特定的情况而变化。虽然如此，这里提供的方法为设计获得最佳过程的折中方案提供了必要的教程。例如，为达到合理的最快的发酵，指出使用高淀粉或纤维素含量，和高的酶剂量。但是，迅速发酵的结果是当回收营养物时减少了发酵液中产生一定水平的营养物，或者使发酵停止于终产物(如醇)处于相对较低的含量时。然而，在相对低的发酵速率可以被接受的情况下，(使用高淀粉含量的浆)酶剂量相对较低，并且营养物的损失保持在迄今为止发酵领域所能接受的水平。在首要目标是获得终产物(如醇)最大产量的情况下，低淀粉含量的浆、适度的α-淀粉酶剂量和高葡萄糖淀粉酶剂量可用于本发明。然而，本发明并无意被限于任何特定的方法设计。
如这里所述的，本发明节省了相当的热能。但是，正如起始底物(如淀粉)从未经受过用于液化的热条件，因此底物未经热灭菌。因此，在一些实施方案中，可预计起始底物(如颗粒淀粉)向发酵培养基中加入了污染微生物。因此，在一些实施方案中，在发酵培养基中接种大量的与回收底物(如淀粉)相关的生产产物的微生物是有利的。通过数量上超过污染物，回收的微生物压倒任何污染微生物，因此主导发酵，导致目的终产物的产生。
在一些实施方案中，最初装入发酵缸或生物反应器的微生物和/或酶的量与以前用于各种产物的发酵和/或转化的现有技术操作相一致。这些数量会发生变化，因为发酵过程中微生物进行繁殖，而用于生物转化的酶将有一有限的半衰期。虽然，在一些实施方案中利用了回收的微生物，在许多实施方案中，并不需要本发明的这一实践。相反，在特别优选的实施方案中，需要回收酶(虽然本发明并无意被限于需要回收酶的方法。)
因此，在一些实施方案中，设计在回收残余淀粉或生物质之前先从残余淀粉或生物质颗粒上除掉微生物。然而，值得再次注意的是，本发明的实践无需起始底物(如淀粉)的热处理。因此，在一些实施方案中，起始底物被热灭菌，而在另一些实施方案中，却没有。因此，在一些实施方案中，发酵或生物转化在相对大比例的微生物存在的条件下进行，以克服任何污染的影响。在选择性的实施方案中，抗菌剂被加入到发酵微生物中以抑制污染微生物的生长。在附加的实施方案中，低温灭菌技术、UV照射、65℃巴氏灭菌法被用来灭菌起始材料(如底物)。然而，考虑到发酵缸或生物反应器的灭菌，生物质并不会带来难题。
如这里所描述的，本发明提供通过向微生物或随后的酶释放可代谢的糖来控制发酵速率的方法。本发明的方法与迄今已有的做法非常不同。先前的技术教导在发酵之前用酶处理固体淀粉和/或在发酵培养基中包含酶以节省能源和/或提高发酵效率。然而，与本发明相比，在本领域中没有教导改变发酵特征以达到接近线性的发酵速率。本发明提供了有效节省能源的方法，特别是与高温淀粉液化相比。
事实上，在优选的实施方案中，更多的热能被节省了。本发明的方法以高发酵效率运转，部分是因为由淀粉凝沉(retrogradation)、不完全糖化和可发酵物的不完全发酵导致的产物损失被降低了。此外，本发明提供的通过控制淀粉或生物质浓度，以及控制酶含量和比例来调节发酵速率的能力，便于使用最小的碳水化合物含量来生产目的终产物。
如以下实施例所进一步指出的，本发明提供使用酶转化淀粉生产葡糖酸的新方法。如所表明的，使用酶转化淀粉成为葡糖酸有助于去除在使用酶从葡萄糖生产葡糖酸的过程中目前所遇到的两个重要障碍。为了与目前葡糖酸的生产方式竞争，需要使用重量比为30-60％的葡萄糖溶液，如此高的浓度部分抑制了葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶系统。目前使用的方法中，如此高浓度的葡萄糖导致这些酶的剂量非常高，因此使这一过程变得不经济。目前使用方法的另一个难题是使用60％的糖溶液底物具有很高的粘度水平，对反应混合物中氧的溶解有不利的影响。氧是第二底物，并且需要等摩尔的氧进行氧化反应。溶液中较低的获氧能力导致葡萄糖到葡糖酸的氧化速率较低，因此需要更好的KLa(氧传递常数)传递反应器。
使用淀粉作为起始材料不仅解决了目前使用方法的以上缺点，而且至少在以下方面另有三点重要的好处：玉米淀粉对D-葡萄糖的原料成本、基于底物或产物的对生物转化中使用酶的抑制的降低和伴随的生产葡糖酸中对高酶剂量需求的明显减少。
总之，本发明提供从粗玉米淀粉生产葡糖酸的新方法。事实上，本发明首先证明了使用体外生物反应器和酶生物转化将淀粉转化为葡糖酸。本发明进一步提供使用低成本可回收原料生产一关键商品，即工业化学葡糖酸的方法。
另外，以下的实施例说明使用Genencor的OPTIMAX®OXYGO®和FERMCOLASE®酶，能够有效的将麦芽糖糊精转变为葡糖酸。它也说明，通过使用优化比例的酶，反应过程中产生的过氧化氢的损害效果可以被规避。另外，以下的实施例表明通过配制所有三种酶的酶剂量，保持将麦芽糖糊精产生的葡萄糖进行氧化的反应所需的必要的溶解氧是可能的。也证明了，通过优化OPTIMAX(α淀粉酶；Genencor)的剂量，有可能控制反应混合物中葡萄糖的释放。
除此以外，以下的实施例说明经由替代的和廉价的碳原料(如淀粉和生物质)的发酵控制，使用以酶为基础的转化，提供了一生产工业化学制品、酶和治疗剂的更廉价有效和可接受的发酵策略。如以下的实施例所指出，葡萄糖的释放速率可以通过加入的酶量来控制。事实上，观察到的使用葡萄糖淀粉酶的淀粉转化速率比最初预测的快100倍。然而，葡萄糖转化为产物的速率依赖于培养基中可获得的葡萄糖浓度，并影响终产物的形成。因此，通过控制加入的葡萄糖淀粉酶量而控制转化中的葡萄糖的释放，提供了一种操纵反应以获得产物形成的最快转化速率。
另外，基于葡萄糖淀粉酶的使用剂量，转化的选择性是可以控制的。如以下实施例所指出的，使用三个单位的酶产生了产物形成的最佳速率。然而，预计本发明的使用者可以修改原来的反应条件，以适合他们的特定需要。事实上，预计每一过程的细节都可以变化，依赖于使用的水解酶的动力学和葡萄糖转化为产物的动力学。另外，外部的反应条件，如pH、温度和培养基配方是同样重要的需考虑的事项。虽然如此，本发明提供了在各种条件下实践本发明所必要的教导。
还可预期，本发明高效转化碳原料的方法将被发现用于各种其他发酵，包括但不限于从纤维素和/或半纤维素高效生产生物产品。还可预期，这里提供的起始引物，将在各种发酵过程中被用作乳糖的替代物。因此，预见本发明将被广泛地用于工业发酵工业。
对于本领域熟练的人来说，在读完此公开内容之后，任何不背离本发明精神和范围的各种其它实施方案和实施例都是显而易见的。所有这类实施例或实施方案被意图包含于附加的权利要求的范围内。这里引用的所有出版物和专利以其整体引入作为参考。
实验
提供以下的实施例是为了说明和进一步解释某些优选的实施方案和本发明的若干方面，不能理解为是对其范围的限制。事实上，预期这些教义将被发现用于这里所描述的方法系统的进一步优化。
在以下的实验公开内容中，使用以下的简写：wt％(重量百分数)；℃(摄氏度)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCI(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；，μl(微克)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；um(微米)；M(体积摩尔浓度)；mM(体积毫摩尔浓度)；uM(体积微摩尔浓度)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；psi(磅每平方英寸)；sec(秒)；min(s)(分)；hr(s)(小时)；Q.S.和q.s.(补足量)；OD(光密度)；OD280(在280nm的光密度)；OD600(在600nm的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；DO(溶解氧)；Di(去离子的)；邻苯二甲酸盐缓冲液(邻苯二甲酸钠水溶液，20mM，pH5.0)；PBS(磷酸盐缓冲溶液[150mM NaCI，10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2])；Cerestar颗粒淀粉(Cargill Foods PFP2200颗粒淀粉)；Cerestar(Cerestar，Inc.，Cargill Inc.，公司，Minneapolis，MN)；AVICELL®(FMC公司)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；w/v(重量比体积)；v/v(体积比体积)；slpm(标准的升/分种)；ATCC(American Type Culture Collection，Rockville，MD)；Difco(Difco Laboratories，Detroit，MI)；GIBCO BRL或GibcoBRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；Genencor(Genencor International，Inc.，Palo Alto，CA)；Shin Nihon(ShinNihon，Japan).
在以下的实施例中，使用了附加的各种本领域人士已知的培养基和缓冲液，包括如下：
乳杆菌MRS Media(用于接种体)：Difco(Ref#288130)：
0.5x改良的乳杆菌MRS培养基w/o葡萄糖+8％颗粒淀粉配方：
酵母提取物(Difco)        15.0g/L
颗粒淀粉(Cerestar)       80.0g/L
MgSO4*7H2O             0.3g/L
KH2PO4                 0.5g/L
K2HPO4                 0.5g/L
醋酸钠                    0.5g/L
FeSO4*7H2O             0.03g/L
MnSO4*1H2O             0.03g/L
Mazu DF204(防泡剂)       1ml
1000x Tiger痕量金属      0.2mls原液
TM2配方(每升发酵培养基)：
K2HPO4 13.6g，KH2PO4 13.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铵铁.3g，(NH4)2SO4 3.2g，酵母提取物5g，1000X Modified TigerTrace Metal Solution 1ml。所有这些成分被加到一起并溶于去离子水。使用氢氧化钾(KOH)将pH调到6.8并补足体积。终产物使用0.22μ(微米)的过滤器过滤灭菌(只是不要使用高压釜)。
MurphyIII培养基(g/l)
KH2PO4(12g)，K2HPO4(4g)，MgSO4.7H2O(2g)，DIFCO Soytone(2g)，柠檬酸钠(0.1g)，果糖(5g)，(NH4)2SO4(1g)，烟酸(0.02g)，0.4g/lFeCl3.6H20(5ml)和Pho盐(5ml)。
1000X Modified Tiger Trace Metal Solution：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg.各成分被逐一溶解于去离子水中，用HCI/NaOH将pH调到3.0，然后补足体积，使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
实施例1
葡萄糖到葡糖酸的转化
在此实施例中，描述了用来将葡萄糖转变为葡糖酸的实验。首先，制成30wt％的葡萄糖溶液(115克葡萄糖溶于275ml 50mM邻苯二甲酸的pH5.12的去离子水溶液)。这一溶液被保持在35℃和0.3巴的背压力下。然后，在1100rpm和水中溶解氧为120％DO(在正常的温度和压力，NTP或ATP)(″DO″)的条件下，向此溶液混入2700U葡萄糖氧化酶和270单位过氧化氢酶。在混合酶时，吸取的DO低于操作条件下反应培养基饱和度的15％，表明使用30％的葡萄糖，氧可能是一限速底物。事实上，当在低于30％的糖溶液测试时，那些酶可能被部分抑制了，当葡萄糖浓度低于20％时加速转化葡萄糖。因此，使用60％的葡萄糖溶液(即本领域利用的最普通的糖原料)导致抑制，和对氧转移的挑战。这些实验的结果显示在图1。
实施例2
淀粉到葡萄糖的转化
在此实施例中，描述了用来将淀粉转变为葡萄糖的实验。首先，制成30％的玉米淀粉浆(100克淀粉[Cerestar]被混入270ml 50mM，pH5.0的邻苯二甲酸缓冲液)，并被保持在45℃。然后在1100rpm和150％DO的条件下混和混合物。然后，250毫克RSH酶(CUCONCTM；日本；187葡萄糖淀粉酶单位/克粉末)被混入溶液。这一混合导致了在pH 5.0和45℃的条件下，淀粉到葡萄糖的16g/l/hr的最初转化。这些结果表明RSH葡萄糖淀粉酶具有用于将淀粉转化为糖的优良动力学(见图2)。然而，预计低剂量的RSH葡萄糖淀粉酶也可用于本发明的方法中，将淀粉转变为葡萄糖。事实上，在一些实施方案中使用了本领域通常使用的2g/L/hr生产方法，其中对于每升30％的淀粉储存液使用100mgRSH葡萄糖淀粉酶的量足以有效的将淀粉转变为葡萄糖。
在附加的评估颗粒淀粉向葡萄糖转化的实验中，实验在一升的橙色盖瓶(orange cap bottle)中进行，使用具有葡萄糖淀粉酶活力的酶，在要求的pH6.7和温度34℃的发酵条件下监控从颗粒淀粉到葡萄糖的形成。
对于这些实验，浆状物形式的颗粒淀粉(葡萄糖最大终浓度为80g/L)被加入到1L的瓶子中(如300ml的具有等价于16％葡萄糖的淀粉的浆与300mL TM2培养基混合；总共48克Cerestar颗粒淀粉被加入到600ml浆中)。使用NH4OH将浆/液pH调节到6.7。混合物在34℃保持30分钟，使淀粉浆中存在的任何污染物萌发，然后用巴氏灭菌法在65℃持续14小时。然后，加入测试酶(30ml灰色腐质霉上清的UltraFilter浓缩液，表现出淀粉水解酶活力(即RSH活力)和0.4mlSPEZYME®FREDα-淀粉酶液化浓缩物(Genencor))，以及30mg奇霉素和1mg维生素B12(奇霉素和维生素B12以0.2微米过滤的去离子水溶液被加入)。在反应的过程中，样品从容器中取出，离心，上清被冷冻以终止酶反应。然后上清经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成检测颗粒淀粉的糖化。结果表明，在3小时内聚集了32.09g/L的葡萄糖。因此，以10g/L-小时速率的颗粒淀粉向葡萄糖的转化有利于34℃和pH6.7的条件下颗粒淀粉向1，3-丙二醇的同时糖化和发酵(SSF)。
实施例3
淀粉向葡糖酸的转化
在此实施例中，描述了用来将淀粉转变为葡糖酸的实验。首先，制成30％的玉米淀粉浆(100克淀粉被混入270ml 50mM，pH5.1的邻苯二甲酸缓冲液)，并被保持在40℃。然后在1100rpm和130DO的条件下，250毫克RSH酶(CUCONCTM；日本；187葡萄糖淀粉酶单位/克粉末)，880μl OXYGO®(葡萄糖氧化酶；Genencor)和880μl FERMCOLASE®(过氧化氢酶；Genencor)(1500U/ml和1000U/ml)被混入溶液。这一混合导致了在pH5.1-5.2和40℃的条件下，淀粉到葡萄糖的17g/l/hr的最初转化。这些结果表明RSH葡萄糖淀粉酶在生物反应器中的这些生物转化条件下，具有用于将淀粉转化为糖的优良动力学(见图3)。
然而，在附加的实施方案中，优化的条件有助于最大化此系统的长期稳定。将葡萄糖转变为葡糖酸所需要的额外的酶，也在这些实验的整个时间过程中在此系统中运行良好，因为没有葡萄糖的聚集发生。因此，这些结果表明在容积生产力为10g/l/hr的情况下，运转此方法所需的RSH酶远低于现有技术使用的方法。
实施例4
通过添加DISTILLASE®进行淀粉向葡糖酸的转化
在此实施例中，描述了在酶混合物中使用DISTALLASE®来进行淀粉向葡糖酸的转变。首先，用10mM醋酸缓冲液(10mM醋酸钠的水溶液，pH5.0)制备30％的玉米淀粉(Cerestar)浆，并加热到40℃。然后，在1100rpm和118DO的条件下，向溶液中加入250mg CUCONCTMRSH葡萄糖淀粉酶，150μl DISTILLASE®-L-400(350 GAU/g；sp 1.15)，1250μl OXYGO®和1500μl FERMCOLASE®。这导致了25g/l/hr的最初葡糖酸产生速率。因此很明显，向反应混合物中加入DISTILLASE®L-400葡萄糖淀粉酶，不仅能提高葡糖酸的原初产生速率，而且总体改善了粗玉米原料向葡糖酸的转化，如图4所表明的。
实施例5
麦芽糖糊精向葡萄糖的转化
为了进一步说明本发明方法的效用，一种替代的底物被利用了。此底物(麦芽糖糊精)，也是一种关键的糖源。
如图5所显示的，使用OXYGO®和FERMCOLASE®酶可以实现麦芽糖糊精到葡萄糖的定量转化。
实施例6
麦芽糖糊精向葡糖酸的转化
另外，麦芽糖糊精向葡糖酸的转化试图使用低酶剂量条件。特别是测试了低剂量的过氧化氢酶。结果表明通过使用三种酶(数据未显示)，麦芽糖糊精能够在单罐反应中被转变为葡糖酸。另外，确定了与这里所描述的其它实施例所测试的CU CONCTM RSH葡萄糖淀粉酶相比，OPTIMAX®(α淀粉酶和支链淀粉酶的混合物；Genencor)酶制品对过氧化氢具有低敏感性。
实施例7
OXYGO®和FERMCOLASE®酶的比例
在进一步的实验中，确定了最小1∶1的活性比是OXYGO®的最大生产力和稳定性所需的。如图6所表明的，在这些条件下展示了葡萄糖到葡糖酸的完全转化。
实施例8
使用重新确立的酶剂量进行麦芽糖糊精向葡糖酸的转化
在这一实验中，从麦芽糖糊精生产葡糖酸，在7g/l/hr的速率下，获得了高于50％的产量。最初的转化速率接近超过25g/l/hr。用于这一实施例的剂量水平是1000单位OXYGO®酶和FERMCOLASE®酶，以及200单位OPTIMAX®酶。这一实施例说明了利用正确类型的酶来完成生物转化的必要。
实施例9
优化酶剂量以提高整个转化效率
在这些实验中，通过进一步的优化OPTIMAX®酶的剂量，从麦芽糖糊精到葡糖酸的生产产量和容积生产力达到了80％以上和8g/l/hr(见图8)。这一实施例使用的剂量水平是1250单位的OXYGO®和1000单位的FERMCOLASE®，以及200单位的OPTIMAX®。这一实施例说明了包含正确的酶类型和剂量水平的优化以获得目的生物转化的必要。
实施例10
玉米淀粉原料和小麦淀粉原料的比较
为了进一步说明本发明方法的效用，一种替代的淀粉来源被检测了。此底物(小麦淀粉原料)也是一种关键的糖源。如图9所示，使用OXYGO®、FERMCOLASE®、DISTILLASE®和CU CONC RSH葡萄糖淀粉酶也能将小麦淀粉有效的转变为葡糖酸。事实上，该结果表明在相似的生物转化时间内比较，小麦淀粉比玉米淀粉更易于生物转化。
实施例11
淀粉向乳酸的转化
这一实验在1L生物反应器内进行，以监控使用具有葡萄糖淀粉酶活力的酶，在要求的发酵pH6.4和温度34℃的条件下，来自颗粒淀粉的乳酸的形成。在这一实验中，浆状物形式的颗粒淀粉(葡萄糖最大终浓度为80g/L)溶于改良的0.5倍乳杆菌培养基发酵培养基中，被巴氏灭菌法灭菌(即混合物在34℃维持30分钟，让存在于淀粉浆中的所有污染物萌发，随后在65℃巴氏灭菌14小时)。这一培养基被加入预灭菌的1L生物反应容器中。使用28％的NH4OH将浆/液的pH调节并控制在6.4。然后，所需的酶(0.4克sumizyme CUCONCTM；Shin Nihon)以0.2微米过滤的去离子水溶液(20ml)的形式被加入。然后，从冻存的小瓶中取出乳酸生产菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(ATCC393)接种体，制备于乳杆菌MRS培养基中(Difco)。当接种体在34℃1L生物反应器中以0.6slpm(标准升/分钟)的流速喷射氮生长到550nm监测OD为2.4时，反应器中的内容物(600ml)被离心，并重新悬浮于45ml的上清液中，转移细胞团(42ml OD22的物质)作为在生物反应器中进行发酵生物转化的接种体。在发酵生物转化过程中，以0.6slpm的速度喷射氮，背压力被保持在5psi，温度被保持在34℃，pH通过碱滴定28％的NH4OH而保持在6.4。
在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清随后经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成和它向乳酸的转化而监控颗粒淀粉的生物转化。在16.3小时内，乳酸的聚集总量达到61.75g/L(图10)。
另外，在温度34℃和pH6.4下颗粒淀粉向乳酸的生物转化水平被证明为3.79g/L-hr。
实施例12
淀粉向琥珀酸的转化
这一实验在1L生物反应器内进行，以监控使用具有葡萄糖淀粉酶活力的酶，在所需的pH6.7和温度34℃的发酵条件下，来自颗粒淀粉的琥珀酸的形成。
对于此实验，浆状物形式的颗粒淀粉(葡萄糖最大终浓度为80g/L)溶于改良的0.5倍TM2发酵培养基中，被巴氏灭菌法灭菌(即混合物在34℃维持30分钟，让存在于淀粉浆中的所有污染物萌发，随后在65℃巴氏灭菌14小时)。这一培养基被加入预灭菌的1L生物反应容器中。使用NH4OH将浆/液的pH调整到6.7，并控制在6.65。然后，所需的酶(0.6克sumizyme CU CONC；Shin Nihon)以0.2微米过滤的去离子水溶液(20ml)的形式被加入。从冻存的小瓶中取出琥珀酸生产菌株361.6ppc E.coli接种体，准备于TM2+10g/L葡萄糖培养基中。当接种体生长到550nm监测OD为0.6时，一600ml的烧瓶被离心，并重新悬浮于80ml的上清液中，转移细胞团(80ml OD14.3的物质)到生物反应器中。在运转3.7小时后，以0.6slpm的速度喷射的空气被切换成同样以0.6slpm的速度喷射的氮。
在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清随后经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成和它向琥珀酸的转化而监控颗粒淀粉的生物转化。在43小时内，琥珀酸的聚集总量达到1.46g/L(图11)。在温度34℃和pH6.7条件下的颗粒淀粉向琥珀酸的发酵生物转化证明了是0.034g/L-小时速率的颗粒淀粉向琥珀酸的生物转化。
实施例13
淀粉向1，3-丙二醇的转化
这一实验在1L生物反应器内进行，以监控使用具有葡萄糖淀粉酶活力的酶，在要求的发酵pH6.7和温度34℃的条件下，来自颗粒淀粉的1，3-丙二醇的形成。
对于此实验，浆状物形式的颗粒淀粉(葡萄糖最大终浓度为80g/L)，溶于改良的0.5倍TM2发酵培养基中，如上所述被巴氏灭菌法灭菌(即混合物在34℃维持30分钟，让存在于淀粉浆中的所有污染物萌发，随后在65℃巴氏灭菌14小时)。这一培养基被加入预灭菌的1L生物反应容器中。使用NH4OH将浆/液的pH调整到6.7，并控制在6.65。然后，所需的酶(30ml灰色腐质霉发酵上清的Ultro Filter浓缩液，表现出淀粉水解酶活力(即RSH活力)和0.4ml具有α-淀粉酶活力的SPEZYME®FRED液化浓缩物[Genencor])，以及1，3-丙二醇生产专门需要的其它物质(30mg奇霉素和2mg维生素B12)以0.2微米过滤的去离子水溶液被加入。
从冻存的小瓶中取出1，3-丙二醇生产型大肠杆菌菌株TTaldABml/p109F1接种体，准备于soytone-酵母提取物-葡萄糖培养基中。当接种体生长到550nm监测OD为0.6时，两个600ml的烧瓶被离心，内容物被重新悬浮于70ml的上清液中，转移细胞团(70ml OD3.1的物质)到生物反应器中。
在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清随后经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成和它向甘油(1，3-丙二醇途径中间物)然后到1，3-丙二醇的转化，从而监控颗粒淀粉的发酵生物转化。在23.5小时内，甘油和1，3-丙二醇的聚集总量分别为7.27和41.93g/L(图12)。
在温度34℃和pH6.7条件下的颗粒淀粉向1，3-丙二醇的发酵生物转化的速率为1.75g/L-小时。
在附加的相似的实验中，颗粒淀粉向甘油的发酵生物转化在温度34℃和pH6.7条件下被测定了。在这些实验中，测定了葡萄糖形成和其向甘油的转化。在9小时内，甘油的聚集量被发现为14.93g/L。颗粒淀粉向甘油的转化速率为1.60g/L-小时，这对于颗粒淀粉的发酵生物转化而言是一良好的速率。同样，以上表明的1.75g/L-小时的速率对于颗粒淀粉向1，3-丙二醇的发酵生物转化而言，也被发现是一良好的速率。
实施例14
通过CU CONC RSH葡萄糖淀粉酶的淀粉向1，3-丙二醇的发酵生物转化
初始实验在一升的橙色盖瓶(orange cap bottle)中进行，使用具有葡萄糖淀粉酶活力的酶，在要求的pH6.7和温度34℃的发酵条件下监控从颗粒淀粉到葡萄糖的形成。
对于这些实验，浆状物形式的颗粒淀粉(葡萄糖最大终浓度为40g/L)被加入到1L的瓶子中(如300ml的具有等价于8％葡萄糖的淀粉的浆)，与300mL TM2培养基混合。使用NH4OH将浆/液pH调节到6.7。混合物在34-35℃保持30分钟，使淀粉浆中存在的任何污染物萌发，然后用巴氏灭菌法在65℃持续14小时。然后，所需的酶(0.6克sumizymeCU；Shin Nihon)和生产1，3-丙二醇所专门需要的物质(30mg奇霉素和1mg维生素B12)以0.2微米过滤的去离子溶液的形式被加入。
在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清随后经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成，而监控颗粒淀粉的生物转化。在此实验中，6小时内积聚了12.86g/L的葡萄糖。在温度35℃和pH6.7条件下的颗粒淀粉向1，3-丙二醇的生物转化速率为2g/L-小时(数据未显示)。
在次级实验中，使用1L生物反应器，使用具有葡萄糖淀粉酶活力的酶，在要求的发酵pH6.7和温度34℃的条件下，监控来自颗粒淀粉的1，3-丙二醇的形成。对于此实验，浆状物形式的颗粒淀粉(葡萄糖最大终浓度为40g/L)，溶于TM2发酵培养基中，如上所述被灭菌和巴氏灭菌法灭菌。这一混合物被加入预灭菌的1L生物反应容器中。使用NH4OH将浆/液的pH调整到6.7，并控制在6.65。混合物在34℃保持30分钟，使淀粉浆中存在的任何污染物萌发，然后用巴氏灭菌法在65℃持续14小时。然后，所需的酶(0.6克Sumizyme CU；Shin Nihon)和生产1，3-丙二醇所专门需要的物质(30mg奇霉素和1mg维生素B12)以0.2微米过滤的去离子溶液的形式被加入。从冻存的小瓶中取出1，3-丙二醇生产型大肠杆菌菌株FMP′m1(1.5gap)/pSYCO106接种体，准备于soytone-酵母提取物-葡萄糖培养基中。当接种体生长到550nm监测OD为1.1时，细胞被离心并转移细胞团到生物反应器中。
在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清随后经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成和它向甘油(1，3-丙二醇途径中间物)然后到1，3-丙二醇的转化，从而监控颗粒淀粉的发酵转化。在5小时内，甘油和1，3-丙二醇的聚集总量分别为2.57和0.59g/L(图13)。
结果表明，在34℃和pH6.7的条件下进行的颗粒淀粉向1，3-丙二醇的发酵生物转化是以0.63g/L-小时这一良好速率进行的。
实施例15
淀粉向甘油的发酵生物转化
这一实验在1L生物反应器内进行，以监控使用具有葡萄糖淀粉酶活力的酶，在要求的发酵pH6.7和温度34℃的条件下，来自颗粒淀粉的1，3-丙二醇的形成。
对于此实验，浆状物形式的颗粒淀粉(Cerestar)(葡萄糖最大终浓度为80g/L)溶于0.5x TM2发酵培养基中，如上所述被巴氏灭菌法灭菌(即混合物在34℃维持30分钟，让存在于淀粉浆中的所有污染物萌发，随后在65℃巴氏灭菌14小时)。这一混合物被加入预灭菌的1L生物反应容器中。使用NH4OH将浆/液的pH调整到6.7，并控制在6.65。然后，所需的酶(30ml灰色腐质霉培养物上清的UltraFilter浓缩液)，表现出淀粉水解酶活力(即RSH活力)；和0.4ml具有α-淀粉酶活力的SPEZYME®FRED液化浓缩物[Genencor])，以及30mg奇霉素以0.2微米过滤的去离子水溶液的形式被加入。将1，3-丙二醇生产型大肠杆菌菌株TTaldABml/p109F1接种体制备于soytone-酵母提取物-葡萄糖培养基中(Difco)。当接种体生长到550nm监测OD为0.6时，两个600ml的烧瓶被离心，内容物被重新悬浮于70ml的上清液中，转移细胞团(70mlOD3.1的物质)到生物反应器中。
在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清随后经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成和它向甘油的转化，从而监控颗粒淀粉的发酵生物转化。在9小时内，甘油的聚集总量达到14.93g/L(图14)。在温度34℃和pH6.7条件下的颗粒淀粉向甘油的发酵生物转化速率为1.60g/L-小时。
实施例16
淀粉向2，5-DKG的转化
在此实施例中，使用已知的微生物柠檬泛菌(Pantoea citrea)以及玉米淀粉和RSH葡萄糖淀粉酶进行生物发酵过程，以维持葡萄糖释放速率，其中该速率足以保证如2，5-二酮-D-葡糖酸(维生素C的前体分子)之类产物的最大生产速率。
在这一研究中使用了Cerestar玉米淀粉原料和M1 Biocon(India)葡萄糖淀粉酶(1786Gau/g)。此实施例使用了柠檬泛菌(一种革兰氏阴性细菌，具有从葡萄糖生产氧化的糖酮酸产物，如2，5-二酮-L-葡糖酸(2，5-DKG)和2-酮-L-葡糖酸2-KLG所需要的周质氧化脱氢酶)。
Murphy-III培养基被用于细胞的过夜生长。改良的Murphy-III培养基(见以下配方)被用于淀粉到葡萄糖再到2，5-DKG的转化。在这些实验中使用了摇瓶和旋转摇床。使用HPLC(Water′s)完成产物分析，葡萄糖的酶分析使用Monarch robotics system(即本领域已知的一种用于自动分析工作的仪器)。
柠檬泛菌被接种于100ml Murphy-III培养基中(在28℃和250rpm过夜)。包含40ml去离子水(DI)和1克玉米淀粉原料(终浓度20g/l))的5摇瓶被以上描述的巴氏灭菌法灭菌(即混合物在34℃维持30分钟，让存在于淀粉浆中的所有污染物萌发，随后在65℃巴氏灭菌14小时)。
为细胞的进一步生长和产物的形成提供培养基的改良Murphy-III培养基被准备了。过滤灭菌的10x培养基(每升)由24克KH2PO4、8克K2HPO4、0.16克MgSO4、1.5克MSG、1克(NH4)2SO4、烟酸、Pho盐(CaCl2，MnCl2，NaCl)、FeCl3、泛酸和20mg/l的四环素组成。使用磷酸钾将培养基的pH调到5.8。然后5ml培养基在无菌条件下被加入含有淀粉和水混合物的摇瓶。在另一摇瓶中，40ml含有1克葡萄糖的水和5ml改良的Murphy-III培养基被无菌加入。然后，5ml过夜生长到550nm OD为21.5的细胞培养物被加入到5个摇瓶中。摇瓶1(GCMK1)因此含有20g/l葡萄糖和5ml在改良的Murphy-III培养基中的柠檬泛菌细胞培养物。摇瓶2(GCMK2)含有1克淀粉、5ml细胞培养物，通过加入10单位的Biocon葡萄糖淀粉酶起始反应。摇瓶3(GCMK3)除了还含有3单位的葡萄糖淀粉酶外，与摇瓶2一样。摇瓶4(GCMK4)具有加入的一个单位的葡萄糖淀粉酶。摇瓶5(GCMK5)是一对照，没有加入葡萄糖淀粉酶。摇瓶6(GCMK6)是另一对照，其中加入了一单位葡萄糖淀粉酶，但是没有加入细胞。在孵育期间的三个时间点(0.3小时、3小时和7小时)，从每个摇瓶中取走1.5ml样品，并离心。然后过滤上清，进行产物分析、pH和葡萄糖测量。结果显示于图15。
结果表明在使用柠檬泛菌细胞和葡萄糖淀粉酶的发酵控制及2，5-DKG的生产上，玉米淀粉是一合适的碳源。含有一单位葡萄糖淀粉酶的摇瓶4和6具有相似的5.6g/l的葡萄糖水平。这一葡萄糖水平表示20g/l/hr的转化速率。因此，具有10单位葡萄糖淀粉酶的摇瓶2在0.3小时具有15g/l的葡萄糖。摇瓶1(具有加入的葡萄糖)的结果与摇瓶2相似。摇瓶3的葡萄糖生产速率与摇瓶2和4很好的相关。与预期的一样，摇瓶5没有葡萄糖。
在3小时的时间点，烧瓶1-4的葡萄糖水平低于1g/l，被转变成了氧化产物葡糖酸、2KDG和2，5-DKG。有趣的是，葡萄糖被控制释放的摇瓶2、3、4表现出更高的目的终产物形成，而具有过量葡萄糖生成的摇瓶1产生了低水平的终产物形成，但是仍然具有更高的中间物浓度。对照摇瓶5和6与预期的一致。
到了7小时的取样时间点，摇瓶1-4的每一个都产生了预期的产物水平。另外，摇瓶1-4的pH下降了，产物(糖酸)形成的趋势与预期的一样。
实施例17
纤维素生物质向葡糖酸的生物转化
如此实施例所指出的，来自生物质如AVICEL®(FMC Corporation)和玉米秸秆的纤维素能够被生物催化系统转变为目的终产物。转变生物质的这一方法克服了生物质向葡萄糖转化过程中的纤维素水解酶的产物抑制。这一过程将纤维素分解的终产物同时转变为目的终产物，以便将纤维素分解酶的抑制降到最小。纤维素终产物如葡萄糖、木糖和纤维二糖被产生，但同时以相同的速率被转变为最终产物，因此这些抑制纤维素分解酶的终产物被允许最小量的聚集。因此，本发明提供了改善目的终产物生产力和产量的方法。
在这些实验中，纤维素(AVICEL®；30g 10wt％)和玉米秸秆(30g，10wt％)被测试于独自的实验中，这些实验在装备有pH、搅拌、温度、泡沫和氧控制装置的1升生物反应器中，在45℃下，270克50mMpH5.0的柠檬酸缓冲液中进行。纤维素的转化起始于10ml(按每克纤维素30mg总蛋白的剂量)SPEZYME®CP(Genencor)的加入，在整个反应过程检测水解程度。在随后的实验中，1.5ml OXYGO®葡萄糖氧化酶(Genencor)和2ml FERMCOLASE®过氧化氢酶(Genencor)与10mlSPEZYME®CP(Genencor)混合后，被加入纤维素和玉米秸秆中。与对照实验的来自纤维素的葡萄糖产生的速率相比，这些酶被发现以一提高的速度将纤维素和玉米秸杆转变为葡糖酸。这允许在反应中葡萄糖稳定状态的浓度处于基本不存在的水平。葡糖酸的浓度被HPLC测定，水解程度被反算出。结果表明，在对照实验中(见图16A和B)，在从AVICEL®产生30g/l葡萄糖的时间内，使用OXYGO®、FERMCOLASE®和SPEZYME®酶的混合物可以使超过50g/l的葡糖酸从AVICEL®产生。在48小时中，60wt％技术(tech)级AVICEL®(Lattice 20)被转变为葡糖酸(图16B)。据观察，通过将纤维素终产物浓度保持在最小，可以在整个反应过程中使纤维素水解酶保持稳定。
实施例18
生物质向1，3-丙二醇的发酵生物转化
此实施例确定了用生物转化从生物质生产1，3-丙二醇的适合性。这些实验在2L三挡板Erylenmeyer烧瓶内进行，以监控使用具有纤维素酶活力的酶，在要求的发酵pH6.7和温度34℃的条件下，来自纤维素(技术级，AVICEL®Lattice 20)的葡萄糖的形成。
对于此实验，浆状物形式的纤维素(葡萄糖最大终浓度为100g/L)，被加入2L烧瓶(如含有20％纤维素的200ml浆状物)，与200ml TM2培养基混合(提供等价于100/L的葡萄糖)。使用NH4OH将浆/液的pH调整到6.7。混合物在121℃灭菌30分钟。然后，所需的酶(13mlSPEZYME®CP；Genencor)和生产1，3-丙二醇所专门需要的物质(20mg奇霉素和1mg维生素B12)以0.2微米过滤的去离子水溶液的形式被加入。在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成而监控生物质(纤维素)的降解。经测定，在98.7小时内葡萄糖的聚集量为12.19g/L。在温度34℃和pH6.7条件下的生物质向1，3-丙二醇的生物中生物质向葡萄糖的转化速率为0.12g/L-小时(数据未显示)。
随后，实验在1L生物反应器内进行，以监控使用具有纤维素酶活力的酶，在要求的发酵pH6.7和温度34℃的条件下，来自纤维素(技术级，AVICEL®)的葡萄糖的形成。在此实验中，溶于TM2发酵培养基的浆状物形式的生物质(纤维素)(葡萄糖最大终浓度为100g/L)，在1L生物反应器内被灭菌。使用NH4OH将浆/液的pH调整到6.7并控制在6.65。混合物在121℃灭菌30分钟。然后，所需的酶(22ml SPEZYME®CP；Genencor)和生产1，3-丙二醇所专门需要的物质(30mg奇霉素和1mg维生素B12)以0.2微米过滤的去离子水溶液的形式被加入。从冻存的小瓶中取出1，3-丙二醇生产型大肠杆菌菌株TTaldABml/p109f1WS#2接种体，准备于soytone-酵母提取物-葡萄糖培养基中(Difco)。当接种体生长到550nm监测OD为1.2时，60ml发酵液被转移到生物反应器中。
在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清随后经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成和它向甘油(1，3-丙二醇途径中间物)然后到1，3-丙二醇的转化，从而监控生物质到1，3-丙二醇的发酵生物转化。在24.4小时内，甘油和1，3-丙二醇的聚集总量分别为1.02和4.73g/L(见图17)。
在温度34℃和pH6.7条件下的生物质向1，3-丙二醇的发酵生物转化过程中生物质向甘油和1，3-丙二醇的转化速率为0.24g/L-小时。
实施例19
生物质向乳酸的发酵生物转化
这一实验在1L生物反应器内进行，以监控使用具有纤维素酶活力的酶，在要求的发酵pH6.4和温度34℃的条件下，来自纤维素(技术级，AVICEL®Lattice 20)的葡萄糖的形成以及使用乳酸生产菌株干酪乳杆菌随后向乳酸的转化。
对于此实验，溶于改良乳杆菌MRS培养基中的浆状物形式的生物质(纤维素)(葡萄糖最大终浓度为100g/L)，在1L生物反应器内被灭菌。使用28％的NH4OH将浆/液的pH调节并控制在6.4。混合物在121℃灭菌30分钟。当冷却到34℃的运转温度之后，所需的酶(22mlSPEZYME®CP；Genencor)以0.2微米过滤的去离子水溶液的形式被加入。从冻存的小瓶中取出乳酸生产菌株干酪乳杆菌(ATCC 393)接种体，准备于乳杆菌MRS培养基中(Difco)。当接种体在34℃1L生物反应器中以0.6slpm的流速喷射氮生长到550nm监测OD为2.7时，反应器中的内容物(600ml)被离心，并重新悬浮于50ml的上清液中，转移细胞团(46ml OD24.2的物质)作为在SDC生物反应器的接种体。
在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清随后经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成和它向乳酸的转化，从而监控生物质向乳酸的发酵生物转化。在48小时内，乳酸的聚集总量达到3.93g/L(图18)。
实施例20
生物质向琥珀酸的发酵生物转化
这一实验在1L生物反应器内进行，以监控使用具有纤维素酶活力的酶，在要求的发酵pH6.4和温度34℃的条件下，来自纤维素(技术级，AVICEL®Lattice 20)的葡萄糖的形成以及使用琥珀酸生产菌株36 1.6ppc(大肠杆菌)随后向琥珀酸的转化。
对于此实验，溶于TM2发酵培养基中的浆状物形式的生物质(纤维素)(葡萄糖最大终浓度为100g/L)，在1L生物反应器内被灭菌。使用NH4OH将浆/液的pH调节到6.7，并控制在6.65。混合物在121℃灭菌30分钟。当冷却到34℃的运转温度之后，所需的酶(22ml SPEZYME®CP；Genencor)以0.2微米过滤的去离子水溶液的形式被加入。从冻存的小瓶中取出琥珀酸生产菌株36 1.6ppc大肠杆菌接种体，准备于TM2+10g/L葡萄糖培养基中。当接种体生长到550nm监测OD为0.85时，一个600ml的烧瓶的内容物被离心，并重新悬浮于60ml的上清液中，转移细胞团(60ml OD 9.3的物质)到生物反应器中。在运行期间，以0.6slpm的速度喷射氮。
在反应过程中，从容器中取出样品并离心，冷冻上清以终止酶反应。上清随后经HPLC分析。这一实验通过测定葡萄糖的形成和它向琥珀酸的转化，从而监控生物质向琥珀酸的发酵生物转化(见图19)。在48小时内，琥珀酸的聚集总量达到2.73g/L。

Claims (29)

1.生产终产物的方法，包括步骤：a)将碳底物与至少一种底物转化酶接触，以产生中间物；和b)将该中间物与至少一种中间物转化酶接触，其中该中间物被该中间物酶基本完全转变为该终产物。
2.权利要求1的方法，其中该中间物转化酶是微生物酶。
3.权利要求2的方法，其中该中间物转化微生物酶是通过微生物与该中间物的接触而分泌的。
4.权利要求1的方法，其中该底物转化酶是微生物酶。
5.权利要求4的方法，其中该底物转化微生物酶是通过微生物与该底物的接触而分泌的。
6.权利要求1的方法，其中该中间物转化酶和该底物转化酶是由同种微生物产生的。
7.权利要求1的方法，其中该中间物转化酶和该底物转化酶是由不同种微生物产生的。
8.权利要求1的方法，其中该中间物的浓度水平保持在低于引发对该中间物向该终产物转化的代谢物阻遏效果的水平。
9.权利要求1的方法，其中该中间物的浓度水平保持在低于引发对该中间物向该终产物转化的酶抑制效果的水平。
10.权利要求1的方法，其中该中间物以足以保持该中间物浓度低于0.25％的速率被转变成该终产物。
11.权利要求1的方法，其中所述底物选自生物质和淀粉。
12.权利要求1的方法，其中所述中间物选自己糖和戊糖。
13.权利要求12的方法，其中该己糖是葡萄糖。
14.权利要求1的方法，其中该终产物选自1，3-丙二醇、葡糖酸、甘油、琥珀酸、乳酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、葡糖酸盐、葡萄糖、醇和抗坏血酸中间物。
15.权利要求1的方法，其中所述将该底物与底物转化酶的接触进一步包括生物转变该底物以产生该中间物。
16.生产终产物的方法，包括步骤：a)将碳底物与至少一种底物转化酶接触，以产生中间物；和b)将该中间物与至少一种中间物转化酶接触，其中该中间物被该中间物酶基本完全转变为该终产物，并且其中该终产物的存在并不抑制该终产物的进一步产生。
17.权利要求16的方法，其中该中间物转化酶是微生物酶。
18.权利要求16的方法，其中该中间物转化微生物酶是通过微生物与该中间物的接触而分泌的。
19.权利要求16的方法，其中该底物转化酶是微生物酶。
20.权利要求16的方法，其中该底物转化微生物酶是通过微生物与该底物的接触而分泌的。
21.权利要求16的方法，其中该中间物转化酶和该底物转化酶是由同种微生物产生的。
22.权利要求16的方法，其中该中间物转化酶和该底物转化酶是由不同种微生物产生的。
23.生产终产物的方法，包括步骤：a)将碳底物与至少一种底物转化酶接触，以产生中间物；和b)将该中间物与至少一种中间物转化酶接触，其中该中间物被该中间物酶基本完全转变为该终产物，并且其中该底物的存在并不抑制该终产物的进一步产生。
24.权利要求23的方法，其中该中间物转化酶是微生物酶。
25.权利要求23的方法，其中该中间物转化微生物酶是通过微生物与该中间物的接触而分泌的。
26.权利要求23的方法，其中该底物转化酶是微生物酶。
27.权利要求23的方法，其中该底物转化微生物酶是通过微生物与该底物的接触而分泌的。
28.权利要求23的方法，其中该中间物转化酶和该底物转化酶是由同种微生物产生的。
29.权利要求23的方法，其中该中间物转化酶和该底物转化酶是由不同种微生物产生的。
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