CN101063144A

CN101063144A - 乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用

Info

Publication number: CN101063144A
Application number: CNA2007100222223A
Authority: CN
Inventors: 陆兆新; 林谦; 吕凤霞; 别小妹; 焦阳; 王煜; 邹晓葵
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2007-05-10
Filing date: 2007-05-10
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2027-05-10
Also published as: CN101063144B

Abstract

本发明涉及一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用，属于食品工业生物技术领域。该基因来自唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)，长1380bp。通过PCR从基因组DNA中扩增获得，在该基因两端分别加上NcoI和EcoRI限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pET－DsbA连接并转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，实现了在大肠杆菌中的重组表达，表达产物谷氨酸脱羧酶分子量为52.4kDa。重组酶可将L－谷氨酸脱羧转化为γ－氨基丁酸。该基因的表达为γ－氨基丁酸的酶法合成提供大量的、高活力的粗酶，降低酶法合成γ－氨基丁酸的成本。这种γ－氨基丁酸的合成方法属于生物合成法，反应条件温和，作用专一，无副产物，在食品、医药、饲料等行业中均有应用价值。

Description

乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用

一、技术领域

本发明涉及一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用，属于食品工业生物技术领域。

二、背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)，又叫氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能，如降低血压、利尿、镇痛安神、改善脑机能、增进脑活力、促进长期记忆、营养神经细胞、改善更年期综合症等。当大脑长期缺乏GABA将会导致癫痫、帕金森等疾病。同时GABA还与脑衰老有关，其缺乏将导致老年人“耳不聪、目不明”。另外，GABA能促进精子的穿卵能力，提高受精率，以及可以提高饲料利用率和日增重。γ-氨基丁酸正被广泛应用于医药、食品保健、化工及农业等行业。GABA的生产可以通过化学合成和生物合成。由于化学合成反应条件剧烈，化学原料和溶剂具有毒性或腐蚀性，副产物多，缺乏安全性，主要应用于化工行业，不适宜作为食品添加剂和医药。生物合成条件温和、专一性强、副产物少、安全性高，因此以生物合成法生产食品或医药级GABA是一条较理想的途径。

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)是生物体内催化谷氨酸发生α-脱羧生成GABA的唯一的酶。谷氨酸脱羧酶是一种依赖于5’-磷酸吡哆醛的脱羧酶，将L-谷氨酸的α-羧基脱去，反应产物为CO₂和γ-氨基丁酸，其催化反应如下图。

HOOC-CH₂-CH₂-CH(NH₂)-COOH→CO₂+HOOC-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂

目前已在多种微生物中发现了GAD的存在，利用微生物中的GAD催化谷氨酸生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。通过检索，查到下列利用不同微生物生产γ-氨基丁酸的文献：【文摘】用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1％谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA，间歇反应5小时转化率达到了100％；连续搅拌式反应在三角瓶反应器中进行，以6ml/h的流速输入底物溶液和输出反应液，转化率达85％；在连续柱式反应器中反应，控制流速12ml/h，转化率达95％。赵景联等，生物工程学报，1989，5(2)：124-128。【文摘】用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA，GABA含量达到了98.94％，收率为49.65％。章汝平等，长沙电力学院学报(自然科学版)，1998，13(4)：433-435。【文摘】介绍了对Koji制作中GABA的变化，GABA含量达到了120μg/g。Kono I等，Biosci.Biotechnol.Bioenchem.，2000，64(3)：617-619。【文摘】利用Monascus purpuresuNTU601进行固体发酵，GABA含量达到了5004mg/kg。Wang JJ等，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，2003，30：669-676。【文摘】报道了采用Monascus purpureus CCRC31615进行固体发酵，GABA含量达到了1200mg/kg。Su YC等，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，2003，30(1)：41-46。【文摘】介绍了从生产奶酪的菌株中分离到一株Lactococcus lactis 01-7，用于奶酪生产，奶酪的GABA含量达到了250mg/100ml。许建军，博士学位论文，江南大学，2004年2月。【文摘】也对高产GABA乳酸菌筛选和发酵条件进行了报道，发酵液中的GABA达到3.1g/l。刘清等，氨基酸和生物资源，2004，26(1)：40-43。【文摘】报道了利用Lactobacillus brevisIFO12005对酒糟进行发酵，GABA含量达到了10.18mM，通过离心、絮凝、脱色和脱臭处理获得了较好的GABA溶液，可用于食品强化GABA。Yokoyama S等，J.Biosci.Bioeng.，2002，93(1)：95-97。【文摘】采用Lactobacillus plantarum利用含有米糠抽提液的培养基发酵生产GABA，在干粉中含量达到了5％。爱宕世高等，食品科学，2001，No.8，81-85。【文摘】从韩国传统食品Kimchi中分离的Lactobacillus brevis OPK-3合成GABA的能力为84.292mg/L/h。将其谷氨酸脱羧酶基因克隆并在大肠杆菌UT481中表达，表达产物分子量为53.4kDa，GAD的活力显著提高。Park K.B.，Oh S.H.，Biores.Technol.，2007，98：312-319。【文摘】将Lactobacillus brevis的谷氨酸脱羧羧酶基因与大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pLip连接后转化枯草杆菌168，得到的重组芽孢杆菌合成GABA的能力明显高于对照。将重组芽孢杆菌接入韩国传统食品Chungkukjang后，也提高了食品中GABA的含量。Park K.B.，OhS.H.，Biotechnol.Lett.，2006，28：1459-1463。

本发明课题组专利“利用唾液链球菌嗜热亚种生产γ-氨基丁酸的方法”，公开号：CN1710088，公开日：2005.12.21，该专利公开了以唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcusthermophilus)为菌种，作用于谷氨酸、谷氨酸盐、含谷氨酸或谷氨酸盐的物质，使谷氨酸的α-羧基发生脱羧作用，从而生成γ-氨基丁酸，该法属于生物合成法。本发明涉及的谷氨酶脱羧酶基因即来自该菌株。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因、表达产物及其用途。来自于唾液链球菌嗜热亚种谷氨酸脱羧酶基因的表达产物重组谷氨酸脱羧酶，用于生产γ-氨基丁酸。

技术方案

一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶全长基因，其序列为SEQ ID NO.1，来自唾液链球菌嗜热亚种Streptococcus thermophilus，长1380bp。该基因是一个以前没有人发现过的DNA序列，其碱基组成为

碱基数目百分比

A 401 29.06

C 229 16.59

G 350 25.36

T 400 28.99

G+C 579 41.96

该基因编码的推导氨基酸序列为SEQ ID NO.2。其表达产物重组谷氨酸脱羧酶，分子量为52.4kDa。重组谷氨酸脱羧酶在生产γ-氨基丁酸方面的应用，可高效地将谷氨酸转变为γ-氨基丁酸，其最佳反应温度为55℃，最佳反应pH为5.0。

有益效果

目前谷氨酸脱羧酶基因已公布的乳酸菌有Lactobacillus brevis，Lactobacillus reuteri，Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis，本发明人克隆的唾液链球菌嗜热亚种谷氨酸脱羧酶基因为国际上首次报道。

本发明人在前期工作中分离到一株具有高活力谷氨酸脱羧酶的唾液链球菌嗜热亚种，在分析数种细菌谷氨酸脱羧酶蛋白质序列后，发现一些高度保守的氨基酸序列。通过简并PCR以及SiteFinding PCR技术，克隆出嗜热链球菌的谷氨酸脱羧酶全长基因。

在该基因两端分别加上NcoI和EcoRI限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pET-DsbA连接并转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，实现了异源表达。

利用本发明基因，实现在大肠杆菌中的重组表达，克服了厌氧发酵的乳酸菌细胞产量低的缺点，可为人们提供大量的乳酸菌谷氨酸脱羧酶，也为以后构建安全的谷氨酸脱羧酶基因工程菌奠定了基础。而且该基因的表达产物最适反应温度为55℃，明显高于其他乳酸菌的谷氨酸脱羧酶，与现有技术中的谷氨酸脱羧酶相比，反应时不易污染杂菌，在工业应用上具有优势。

四、具体实施方式

实施例1：唾液链球菌嗜热亚种谷氨酸脱羧酶基因的克隆

将唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)(见参考文献：谷氨酸脱羧酶活力测定中GABA比色定量方法研究，食品科学，2006，27：205-209)接入100ml MRS培养基，40℃静置培养12小时。离心收集菌体，用上海赛百盛公司基因组DNA提取试剂盒提取唾液链球菌嗜热亚种的基因组DNA。

从NCBI网站中搜索几种细菌谷氨酸脱羧酶，进行生物信息学分析，用CODEHOP程序(Timothy M.R.，Emily R.S.，Jorja G.H.et al.Consensus-degenerate hybrid oligonucleotideprimers for amplification of distantly related sequences.Nucleic Acids Res.，1998，26：1628～1635.)设计出两个简并引物：

引物15’GGTACATCTACAATTGGTTCTTCTGARGCNTGYATG 3’

引物25’AAACCACCAGAAGCAGCRTCNACRTGNAT 3’

在100μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，唾液链球菌嗜热亚种基因组DNA10ng，4U Taq DNA聚合酶。扩增程序为94℃ 3min；30×(94℃ 30s，59℃ 50s，72℃40s)；72℃ 10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用天为时代试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRa公司pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序。

根据获得的谷氨酸脱羧酶基因部分序列，设计以下引物，进行SiteFinding PCR(TanG.，Gao Y.，Shi M.，et al.SiteFinding-PCR：a simple and efficient PCR method for chromosomewalking.Nucleic Acids Res.，2005，33：e122.)，以获得全长序列。

Finder1 5’CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCAAGCGGC

CGCNNNNNNGCCT 3’

Finder2 5’CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCAAGCGGC

CGCNNNNNNATGC 3’

SFP1 5’CACGACACGCTACTCAACAC 3’

SFP2 5’ACTCAACACACCACCTCGCACAGC 3’

gspF1 5’CGCCGATGGCAAGAAAAACGTAAAGC 3’

gspF2 5’ATGAGCTCGGCAGTTCAAGTTTGTTGG 3’

gspF3 5’GGTGTGGTTGCCATCATGGGTGTG 3’

gspR1 5’GGATCCCATCCAAAACTTTAGCAATCTTGTC 3’

gspR2 5’CACACCCATGATGGCAACCACACC 3’

gspR3 5’GCCATCGGCGTTTCAAAGCCAAACCACC 3’

SiteFinding PCR：

扩增上游部分扩增下游部分

10×PCR buffer 2μl 2μl

25mM MgCl₂ 1.2μl 1.2μl

10μM Finder1 1μl Finder2 1μl

2.5mM dNTPs 2μl 2μl

唾液链球菌嗜热亚种基因组DNA 5ng 5ng

ddH₂O up to 20μl up to 20μl

Taq DNA聚合酶(1U/μl) 0.5μl 0.5μl

将上述混合液短暂离心，置于MJ Research PCR热循环仪PTC-100中，PCR程序如下：92℃ 2min；95℃ 1min；25℃ 1min；Slope+43℃，0.2/sec；68℃ 10min。

反应结束后，置于冰上，往反应液中加入：

20μM SFP1 2.5μl 2.5μl

10μM gspR1 1μl gspF1 1μl

25mM MgCl₂ 0.3μl 0.3μl

10×PCR buffer 0.5μl 0.5μl

ddH₂O 0.7μl 0.7μl

将上述混合液短暂离心，置于MJ Research PCR热循环仪PTC-100中，PCR程序如下：94℃ 1min；30×(95℃ 10s；68℃ 6min)；72℃ 10min。反应结束后，从PCR产物中各取1μl，加入99μl ddH₂O，分别作为以下PCR扩增的模板。

10×PCR buffer 5μl 5μl 5μl 5μl

10μM gsp primer 5μl gspR2 5μl gspR3 5μl gspF2 5μl gspF3

10μM SFP 25μl 5μl 5μl 5μl

2.5mM dNTPs 4μl 4μl 4μl 4μl

25mM MgCl₂ 3μl 3μl 3μl 3μl

模板 2μl 2μl 2μl 2μl

ddH₂O 25μl 25μl 25μl 25μl

Taq DNA聚合酶(1U/μl) 1μl 1μl 1μl 1μl

短暂离心，置于MJ Research PCR热循环仪PTC-100中，PCR程序如下：94℃ 1min；30×(95℃ 10s；68℃ 6min)；72℃10min。PCR结束后各取5μl反应液走琼脂糖凝胶电泳，确定有特异性条带出现。

将PCR产物纯化后与TaKaRa公司的pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序。

用计算机分析测序结果，发现一个长1380bp的ORF，即唾液链球菌嗜热亚种谷氨酸脱羧酶基因gad，编码一个由459个氨基酸组成的蛋白质。

实施例2：谷氨酸脱羧酶基因原核表达载体构建

根据获得的谷氨酸脱羧酶基因序列，设计两个引物，上游引物加上NcoI识别序列(为了加上NcoI识别序列CCATGG，在谷氨酸脱羧酶基因起始密码子ATG与第二个密码子AAT之间插入了一个密码子GGC，以使NcoI从该位点切割，重组谷氨酸脱羧酶氨基酸序列也相应地比天然酶的序列多了一个甘氨酸)，下游引物加上EcoRI识别序列(下划线部分为限制酶识别序列)：

上游引物5’CGA CCATGGGCAATGAGAAGCTATTCAGAG 3’

下游引物5’GAC GAATTCTTAATGATGGAAGCCACTGCG 3’

按照下列PCR体系加入各成分，扩增谷氨酸脱羧酶基因：

10×Pfu PCR buffer 10μl

10μM上游引物 10μl

10μM下游引物 10μl

2.5mM dNTPs 8μl

嗜热链球菌基因组DNA 10ng

ddH₂O up to 100μl

Pfu DNA聚合酶 5U

PCR程序为94℃ 2min；30×(94℃ 45s；58℃ 50s；72℃ 4min)；72℃ 10min。

用天为时代PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加NcoI、EcoRI双酶切，灭活，乙醇沉淀，ddH₂O重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-DsbA(购自深圳勤宝升公司)连接，转化大肠杆菌DH5α。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。

实施例3：嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶在大肠杆菌中的表达

将含有唾液链球菌嗜热亚种谷氨酸脱羧酶基因的表达质粒pET-gad转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS(购自深圳勤宝升公司)，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，按照1∶40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基，35℃ 180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导。1.5小时后离心收集菌体。破碎菌体，按照《酶工程》(郭勇主编，中国轻工业出版社，2000年)所述方法提取谷氨酸脱羧酶，将酶液与含谷氨酸或谷氨酸盐的物质混合(也可以不破碎菌体，直接利用菌体与谷氨酸或谷氨酸盐溶液反应)，在pH3.2～8.0，20～80℃下反应，得到含γ-氨基丁酸的转化液，其最佳反应温度为55℃，最佳反应pH为5.0。

序列表

<110>南京农业大学

<120>乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用

<130>说明书

<140>00

<141>2007-05-09

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1380

<212>DNA

<213>Streptococcus thermophilus(嗜热链球菌)

<220>

<221>嗜热链球菌谷氨酶脱羧酶基因

<222>(1)..(1380)

<223>

<400>1

atgaatgaga agctattcag agagattatg gagattaatc caatctatgc tcgccccgga 60

gaaaacactg aggcaccaag gtttaaaatg ccaacagatg cgatgttacc agagactgct 120

taccaaattg ttcatgacga atcaatgatg gatggtaatg cccgtttgaa tttggcaaca 180

tttgtttcca cttggatgga tgaacgagca gataaattgt atcgggaagc ttttgacaaa 240

aatgctattg ataaagacga gtatccagag actgctcgta tcgagaccta ttgttggaca 300

atgttggctg atttgtggca tgcaccgaaa ccaaaagaaa ctatcggctg ttctaccact 360

ggttcttcag aagcgtgtat gttaggtggt ttggctttga aacgccgatg gcaagaaaaa 420

cgtaaagcag aaggtaagcc tattgacaag ccaaatttgg taatgagctc ggcagttcaa 480

gtttgttgga aaaagttttg caattatttc gatgtggagc cacgttatgt accaatcagt 540

ttagaacaca aagttttaga tggatatgaa ttagaaaaat acgtggatga gaataccatt 600

ggtgtggttg ccatcatggg tgtgacttac actgggatgt atgaaccggt agacaagatt 660

gctaaagttt tggatgggat ccaagaaaaa actggactgg atatccaaat ccatgtggat 720

gctgcttccg gtggaatgat cgcacctttt ttacaaccgg ataatgtatg ggattttcgt 780

ttagaacgcg tagcttctat caatacttca ggtcataagt atgggttggt ttatcctgga 840

ttaggctggg tagtgtggcg tgattgtcag tcactgcctg acagtttgat ttttaaagta 900

agttatctgg gaggaacgat gccgacgttc gctttgaatt tctcacgtcc gggggcgcag 960

attctgttgc aatattgggc gtttttgcgt tacggttttg aaggttataa aaaagtacaa 1020

ggtgccacaa gtgatgtggc gcgttatttg gctaatgaga ttaaaaagat tggccccttt 1080

gagttgtgga atgatgcttc ggatattccg gtgtttgctt ggatgatgaa aaaagatcaa 1140

aaacacaatt gggggcttta tgatctatct gatcggttac ggatgaaagg ctggttgata 1200

ccagcgtatc cgatgccaac caatttaaca gatttgactg ttcaacgaat cgttgtgcga 1260

aacggtttgg ggatggatct agcggatcaa ttgattaacg atatgaaaac cgaagtcgct 1320

tatcttgaaa aattggatca gccactaccg gaaaatcatc gcagtggctt ccatcattaa 1380

<210>2

<211>459

<212>PRT

<213>Streptococcus thermophilus(嗜热链球菌)

<220>

<221>嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶

<222>(1)..(459)

<223>

<400>2

Met Asn Glu Lys Leu Phe Arg Glu Ile Met Glu Ile Asn Pro Ile Tyr

1 5 10 15

Ala Arg Pro Gly Glu Asn Thr Glu Ala Pro Arg Phe Lys Met Pro Thr

20 25 30

Asp Ala Met Leu Pro Glu Thr Ala Tyr Gln Ile Val His Asp Glu Ser

35 40 45

Met Met Asp Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu Ala Thr Phe Val Ser Thr

50 55 60

Trp Met Asp Glu Arg Ala Asp Lys Leu Tyr Arg Glu Ala Phe Asp Lys

65 70 75 80

Asn Ala Ile Asp Lys Asp Glu Tyr Pro Glu Thr Ala Arg Ile Glu Thr

85 90 95

Tyr Cys Trp Thr Met Leu Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Lys Pro Lys

100 105 110

Glu Thr Ile Gly Cys Ser Thr Thr Gly Ser Ser Glu Ala Cys Met Leu

115 120 125

Gly Gly Leu Ala Leu Lys Arg Arg Trp Gln Glu Lys Arg Lys Ala Glu

130 135 140

Gly Lys Pro Ile Asp Lys Pro Asn Leu Val Met Ser Ser Ala Val Gln

145 150 155 160

Val Cys Trp Lys Lys Phe Cys Asn Tyr Phe Asp Val Glu Pro Arg Tyr

165 170 175

Val Pro Ile Ser Leu Glu His Lys Val Leu Asp Gly Tyr Glu Leu Glu

180 185 190

Lys Tyr Val Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Ala Ile Met Gly Val

195 200 205

Thr Tyr Thr Gly Met Tyr Glu Pro Val Asp Lys Ile Ala Lys Val Leu

210 215 220

Asp Gly Ile Gln Glu Lys Thr Gly Leu Asp Ile Gln Ile His Val Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Gly Gly Met Ile Ala Pro Phe Leu Gln Pro Asp Asn Val

245 250 255

Trp Asp Phe Arg Leu Glu Arg Val Ala Ser Ile Asn Thr Ser Gly His

260 265 270

Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Leu Gly Trp Val Val Trp Arg Asp

275 280 285

Cys Gln Ser Leu Pro Asp Ser Leu Ile Phe Lys Val Ser Tyr Leu Gly

290 295 300

Gly Thr Met Pro Thr Phe Ala Leu Asn Phe Ser Arg Pro Gly Ala Gln

305 310 315 320

Ile Leu Leu Gln Tyr Trp Ala Phe Leu Arg Tyr Gly Phe Glu Gly Tyr

325 330 335

Lys Lys Val Gln Gly Ala Thr Ser Asp Val Ala Arg Tyr Leu Ala Asn

340 345 350

Glu Ile Lys Lys Ile Gly Pro Phe Glu Leu Trp Asn Asp Ala Ser Asp

355 360 365

Ile Pro Val Phe Ala Trp Met Met Lys Lys Asp Gln Lys His Asn Trp

370 375 380

Gly Leu Tyr Asp Leu Ser Asp Arg Leu Arg Met Lys Gly Trp Leu Ile

385 390 395 400

Pro Ala Tyr Pro Met Pro Thr Asn Leu Thr Asp Leu Thr Val Gln Arg

405 410 415

Ile Val Val Arg Asn Gly Leu Gly Met Asp Leu Ala Asp Gln Leu Ile

420 425 430

Asn Asp Met Lys Thr Glu Val Ala Tyr Leu Glu Lys Leu Asp Gln Pro

435 440 445

Leu Pro Glu Asn His Arg Ser Gly Phe His His

450 455

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>嗜热链球菌谷氨酶脱羧酶基因上游引物

<222>(1)..(30)

<223>

<400>3

cgaccatggg caatgagaag ctattcagag 30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>嗜热链球菌谷氨酶脱羧酶基因下游引物

<222>(1)..(30)

<223>

<400>4

gacgaattct taatgatgga agccactgcg 30

Claims

1、一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因，其序列为SEQ ID NO.1，来自唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)，长1380bp。

2、权利要求1所述基因编码的推导氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3、权利要求2所述谷氨酸脱羧酶基因的表达产物重组谷氨酸脱羧酶，分子量为52.4kDa。

4、根据权利要求3所述的重组谷氨酸脱羧酶在生产γ-氨基丁酸方面的应用。