BRPI0513343B1 - microrganismo transformado selecionado a partir da espécie escherichia coli (e.coli) e processo para síntese bioquímica de 1,4-butanodiamina a partir do referido microrganismo - Google Patents

Abstract

SÍNTESE BIOQUÍMICA DE 1,4-BUTANODIAMINA. A invenção é relacionada a um processo de síntese bioquímica de 1,4-butanodiamina em um microrganismo que apresenta um elevado nível de atividade de ornitina decarboxilase (atividade ODC aumentada) quando comparada aos níveis nativos de atividade ornitina decarboxilase, que ainda no microrganismo também uma atividade elevada na formação de N-acetilglutamato é presente como comparado aos níveis nativos de atividade de formação de N-acetilglutamato e ainda que a 1,4-butanodiamina produzida no microrganismo é excretada num caldo de fermentação, e é envolto do mesmo. A invenção também se relaciona aos vetores, plasmídeos e hospedeiros que apresentam um aumento correspondente de atividade ODC e um aumento na atividade de formação de N-acetilglutamato.

Description

A presente invenção divulga um novo processo de sintese bioquímica de 1,4-butanodiamina (número CAS 11 0- 60-1; um composto também conhecido como tetrametilenodiamina; na literatura bioquímica também vem sendo referido como putrescina) num microrganismo apresentando elevado nivel de atividade ornitina decarboxilase quando comparado aos niveis nativos de atividade ornitina decarboxilase. Ornitina decarboxilase aqui também será referida como ODC. Normalmente tais microrganismos apresentando atividade ODC são conhecidos por serem capazes de produzir poliaminas como espermidina e espermina, que são os nomes comuns para respectivamente os produtos N-(3-aminopropil)-1,4-butanodiamina e N,N'-bis-(3- aminopropil)-1,4-butanodiamina. Tais compostos, assim como diversas diaminas pequenas e lineares tais como, por exemplo, 1,4-butanodiamina e 1,5-pentanediamina (também referido como cadaverina), são comumente referidas em estudos bioquímicos como poliaminas, mesmo sendo poliaminas uma definição estritamente quimica, um número maior de grupos amino deveria ser esperado. Na intenção da presente aplicação a patente, no entanto, o termo poliaminas tem sido usado no seu significado bioquímico e por isso inclui 1,4-butanodiamina.

O composto 1,4-butanodiamina é uma importante matéria prima para a produção de alguns dos principais plásticos: poliamina-4,6, tanto na forma de homopolimero, ou copolimerisada, por exemplo, com cerca de 5% em peso de monômero de poliamida-6 (caprolactama). O homopolimero poliamida-4,6 (nylon-4,6) foi descrito desde 1938 (US-A- 2,130,948, Carothers). É o produto de policondensação dos monômeros 1,4-butanodiamina e ácido adipico. Atualmente, principalmente compostos de poliamida-4,6 estão sendo produzidos e vendidos pela DSM na Holanda sob a marca STANYLB.

Para a sintese de 1,4-butanodiamina várias vias bioquímicas são conhecidas. Todas estas vias bioquímicas sofrem a desvantagem de que materiais de iniciação devem ser obtidos de fontes que são consideradas não-renováveis. Existe, no entanto, uma necessidade substancial de providenciar novas e acessíveis vias para a sintese de 1,4- butanodiamina iniciando de fontes de carbono renováveis e usando processos bioquímicos (também referido como "biotransformação") em células vivas. Em geral, poliaminas são consideradas tóxicas para qualquer célula ou microrganismo usado em produção bioquímica. Desta forma, até o presente momento, tais novas vias para sintese bioquímica, no entanto, não eram consideradas atraentes.

Esta pode ser, por exemplo, observada nas seguintes referências: Fukuchi eta/., J. Biol. Chem., Vol.270 (1 995), páginas 18831-1 8835; e Suzuki et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol.91 (1994), páginas 8930-8934.

Fukuchi claramente descreve uma diminuição na viabilidade celular (e na sintese de quase todos os tipos de proteínas) devido ao acúmulo de espermidina em células de E. coli deficientes em espermidina acetiltransferase (exemplo, em células que não apresentam acetiltransferase SpeG) . Deve ser notado que Limsuwum et al. (J. Bacteriol. Vol.182 (2000), páginas 5373-5380) demonstraram que em baixas temperaturas tal problema poderia ser solucionado pela super expressão do gene speG. Espermidina é um produto que vem sendo produzido em células a partir de 1,4- butanodiamina como um intermediário. De acordo com isso, a biosintese de 1,4-butanodiamina inevitavelmente também leva a formação de espermidina.

Suzuki et al. da mesma forma também demonstraram (em células de camundongo), que a super expressão de ODC resulta num acúmulo de poliaminas, especialmente de espermidina, e que, sob adição de pequenas quantidades de espermidina, já observa-se morte celular mesmo em células que não são deficientes em speG. Suzuki et al. sugerem que esta baixa viabilidade celular é devida a regulação insuficiente da inibição de ODC por antizimas e pode ser solucionada pela super produção de antizimas corretas. Tal super produção de antizimas iria então também diminuir a produção de poliaminas nas células e é então não favorável a produção de DAB.

Além disso, como Kashiwagi et al. descreveram em J. Bacteriol. Vol.170 (1 988), páginas 31 31-31 35, o conteúdo das poliaminas em E. coli pode ser ajustado pela super expressão do gene que codifica para ornitina decarboxilase (ODC), em particular , da speGconstitutivamente expressa. Para os experimentos, o plasmideo pODC como produzido por Boyle eta/. (Methods in Enzymology, Vol.94 (1983), páginas 117-121, foi usado na clonagem. Claramente, tal super produção de ornitina decarboxilase não leva a um forte aumento nos niveis de 1,4-butanodiamina nas células. Com nível 70 vezes de ODC, não mais que 20% de aumento do conteúdo de 1,4-butanodiamina nas células foi observado, independente da quantidade de ornitina adicionada às células. Por outro lado, no entanto, células crescidas em presença de ornitina exibiam excreção aumentada de 1,4- butanodiamina. Com nível de 70 vezes de ODC um total cerca de 8,5 vezes de produção aumentada de 1,4-butanodiamina (o título de 1,4-butanodiamina produzida era aproximadamente 20-25 mg/1, no total de concentrações interna e externas, exemplo, numa concentração extremamente baixa) foi observada. Os autores sugerem que tal baixa eficiência na produção de 1,4-butanodiamina pode ser devida a baixa meia- vida da ornitina, e tentam resolver a questão através do cultivo de ornitina externo, mas apenas obtiveram o mínimo de aproveitamento. Desta forma, pareceria impossível prover processos de síntese bioquímica para a produção de 1,4- butanodiamina em níveis significativamente maiores que 30 mg/1.

Estes estudos mencionados acima, além disso, não eram direcionados a síntese de poliaminas (incluindo 1,4- butanodiamina) como o presente, mas principalmente tentavam obter mais informações nas funções fisiológicas de poliaminas ao nível molecular. Em altas concentrações de ornitina nas células, presumidamente também deveria ter mais arginina presente nas células. De acordo com os ensinamentos de Kashiwagi, tal aumento na quantidade de arginina deveria ter um substancial efeito negativo na formação de 1,4-butanodiamina.

EP-A-0726240 até agora, é uma das poucas referências de patente relacionada a síntese bioquímica de poliaminas, incluindo 1,4-butanodiamina. No entanto, é descrito a produção de inter alia, 1,4-butanodiamina por fermentação de produtos naturais contendo proteínas como principal componente. Em processos conhecidos, produtos naturais são primeiro tratados levando-os a degradação parcial ou total, e qualquer composto indesejável (exemplo Hg, Cr, As, Cd, Se e Pb), inibidores de crescimento celular, pesticidas, antibióticos, detergentes, sopas, gorduras, óleos, cianetos e fenol são então removidos antes da etapa de fermentação. A putrescina e outras diaminas produzidas de tal forma estão sendo (re-) utilizadas como fertilizantes e adubo, mas contém grande quantidade de outras substâncias que os torna não próprio como matéria prima para a produção de, por exemplo, poliamida-4,6.

Desta forma, ainda permanece a necessidade de uma eficiente alternativa de via biosintética para a sintese de 1,4-butanodiamina com títulos significativamente maiores que cerca de 30 mg/1, preferencialmente ainda sem a necessidade de cultivo externo de ornitina (caro). Esta necessidade de obtenção melhorada de 1,4-diaminobutano é baseada no seu uso como material de iniciação, por exemplo, para a produção de poliamida- 4,6. Em geral, as vias para 1,4-butanodiamina como são conhecidas até o presente momento são muito trabalhosas e problemáticas, e podem levar a uma qualidade destes produtos que, sem posterior purificação, podem ser de difícil uso na produção de nylons. As conhecidas vias químicas de 1,4-butanodiamina requer relativamente matéria prima cara e reagentes (incluindo reagentes de difícil manuseio), e relativamente graves condições de reação de temperatura e pressão em um desenho de multi- etapas e multi- reatores, assim como o uso de sistemas catalíticos caros. Dessa forma, permanece a necessidade de vias alternativas para 1,4-butanodiamina, preferencialmente de matéria prima muito menos caras e evitando problemas de reagentes manuais como ácido hidrocianico. É bem conhecido que em crescimento natural, desta forma renovável, o material de produção agricultora são a base de fontes de carbono como glucose (ou outra fonte de carbono apropriada e misturas) que podem ser usadas em fermentação. Tais matérias renováveis são relativamente baratas e de disponibilidade abundante. Em geral, é considerado muito proveitoso se materiais renováveis podem ser usados como materiais de iniciação para todos os tipos de material quimico.

É então o objetivo da presente invenção providenciar melhores possibilidades para produção industrial em larga- escala de 1,4-butanodiamina por biotransformação.

A presente invenção surpreendentemente demonstra que este objetivo é alcançado com um novo processo de sintese de 1,4-butanodiamina num microrganismo apresentando nivel elevado de atividade ornitina decarboxilase (atividade ODC aumentada) como comparado com nivel nativo de atividade ornitina decarboxilase, e ainda é presente no microrganismo uma atividade aumentada de formação de N-acetilglutamato quando comparada ao nivel nativo de formação de N- acetilglutamato e que a 1,4-butanodiamina produzida no microrganismo é excretada num caldo de fermentação, e é recoberta deste caldo.

Como mencionado na presente aplicação a patente, o termo "sintese bioquímica" (um termo que, no contexto da presente aplicação, alternativamente é referido como "biotransformação") inclui não apenas processos que envolvem- embora um número puramente de etapas de reações quimicas- uma ou mais reações biocataliticas usando células inteiras de cepas produtoras, mas também processos puramente bioquímicos usando células inteiras de cepas produtoras. Tais processos puramente bioquímicos, respectivamente são referidos como fermentação no caso da sintese bioquímica começar de uma fonte de carbono correta, ou são referidos como fermentações precursoras no caso da biosintese começar de um produto intermediário já apresentando esqueleto de carbono de onde a molécula alvo a ser sintetizada pode ser obtida. Os processos podem ser mantidos tanto em condições aeróbias como anaeróbias.

As reações biocataliticas na sintese bioquímica da presente invenção podem ser mantidas tanto in vivo como in vitro.Normalmente, processos in vivo são processos mantidos quando usando células vivas (o termo "células vivas" também inclui as chamadas células remanescentes); processos in vitro,por outro lado, usualmente são mantidos usando lisados celulares ou (parte) enzimas purificadas. A sintese bioquímica de acordo com a presente invenção é mantida num microrganismo. Isto pode ser feito usando células inteiras de cepas de produção corretas, mas também pode ser mantida usando células permeabilizadas; a diferença entre in vivoe in vitro,no entanto, não faz muito sentido para processos mantidos em células permeabilizadas ou células hospedeiras imobilizadas. Será evidente, entretanto, que etapas biocataliticas individuais do processo da invenção, quando realizadas, usando, por exemplo, enzimas imobilizadas, etc. são consideradas equivalentes a tais etapas na sintese bioquímica como mencionado no contexto do presente pedido.

Ornitina decarboxilase (exemplo: enzimas contendo atividade ornitina decarboxilase, ou ODCs) são enzimas classificadas na classe E.C. 4.1.1.17. O nivel de atividade de uma ornitina decarboxilase, se super produzido, pode ser facilmente comparado com o nivel nativo (exemplo: não- super produzido) de atividade ornitina decarboxilase sob condições padrão (37°C na presença de ornitina e PLP) em extratos livres de células usando "Sigma Diagnostics carbon dioxide detection kit" (Sigma); experimento descrito em Osterman, A. L. et a/. 1994, Biochemistry 33, p. 13662-1 3667. O profissional capacitado, pode facilmente estabelecer se o ODC usado tem nivel aumentado de atividade ornitina decarboxilase (atividade ODC aumenta) quando comparado com nivel nativo de atividade ornitina decarboxilase no microrganismo usado para determinação do conteúdo de proteína, ou pela determinação do nivel de RNA. Vários procedimentos padrão para determinação do conteúdo protéico, assim como colorimétricos como métodos espectroscópicos, são descritos em Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg / Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 (1998), Chapters 3, 5, 21, 22 e 24. Métodos para determinação do nivel protéico assim como nivel de RNA, assim como hibridização "Northernblot", RT-PCR, e vários outros métodos são descritos em J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2"Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989). Vários outros procedimentos padrão, no entanto, são conhecidos pelo profissional capacitado no seu campo analítico e não precisa ser mencionado aqui.

Ornitina decarboxilases adequada que podem ser usadas neste processo da invenção são todas as enzimas e mutantes que são capazes de decarboxilar ornitina. Qualquer uma destas enzimas pode ser usada no processo da presente invenção, num nivel aumentado de atividade, exemplo: forma super produzida. Tal nivel aumentado de atividade pode ser alcançado por qualquer meio conhecido pelo profissional capacitado, através do aumento de cópias gênicas ou por aumento da atividade endógena ou estrutura das enzimas por meios de mutações, ou usando enzimas inibidoras. No entanto, e mais preferencialmente, também pode ser alcançada pela super expressão de um gene de ornitina decarboxilase com eficiência transcricional e/ou traducional aumentadas. Além disso, deve- se notar que o termo "aumento no nivel de atividade" como aqui usado para qualquer atividade de dada enzima é também intencional para resolver situações nas quais a atividade de tal atividade enzimática, como a ornitina decarboxilase, não está presente nas fontes naturais de microrganismo onde a reação esta ocorrendo, mas é introduzido por modificação genética.

No processo de acordo com a invenção, um nivel aumentado da atividade de formação de N-acetilglutamato (posteriormente definido, quando a discussão das reivindicações pertinentes é apresentada) deve estar presente quando comparadas aos niveis nativos de atividade de formação N-acetilglutamato no microrganismo. Uma comparação entre os niveis de atividade aumentada e nativa da formação de N-acetilglutamato pode ser feita facilmente, de forma semelhante a determinação para ODCs, com reações teste apropriadas sob condições padronizadas (ensaio demonstrado em Abadjieva, A., 2001, J. Biol. Chem., 276, p. 42869-42880) com extratos livres de células através de um radio ensaio usando L-[14C] glutamato e acetil-CoA como substratos. 1,4-Butanodiamina é, de acordo com a presente invenção, produzida em microrganismos com atividades ODC e de formação de N-acetilglutamato aumentadas por biotransformação, e é excretada em caldo de fermentação envolvendo o microrganismo. A 1,4-butanodiamina é excretada em e recoberta do caldo de fermentação.

De acordo com a presente invenção, desta forma, um processo bioquímico melhorado para a sintese de 1,4- butanodiamina é realizado, e a 1,4-butanodiamina resultante é excelentemente perfeita como matéria prima, por exemplo, para a produção de poliamida-4,6.

A formação de 1,4-butanodiamina em altas concentrações como produzido de acordo com a invenção é surpreendente, pelo fato de que seguindo os niveis aumentados da atividade ODC (junto com atividade aumentada de formação de N- acetilglutamto), sem nenhuma medida adicional tomada para evitar os efeitos negativos da formação de poliaminas na viabilidade das células, deveria ser esperada a morte das células.

Como acima mencionado, qualquer enzima ODC pode ser usada, com nivel aumentando de atividade, sob forma super produzida, no processo da invenção.

De acordo com a presente invenção toda ornitina decarboxilase pode ser usada se tiver suficiente, pelo menos 30%, mais preferencialmente 45%, e ainda principalmente preferencialmente com 65% de identidade com a ODC da enzima de referências E. coli, e são capazes de catalisar a reação de decarboxilação de ornitina. Muitas das ODCs são conhecidas por apresentarem tal alto nivel relativo de identidade com a enzima de referência de E. coli.

A determinação do percentual de identidade com enzimas de referência pode ser realizada por métodos conhecidos pelo profissional capacitado, como usando a seqüência de proteínas da enzima de referência como uma seqüência "pergunta" para realizar uma busca em banco de dados públicos para, como por exemplo, identificar outros membros da familia ou seqüências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando programas como o BLAST (versão 2.2) usando os parâmetros padrão do respectivo programa. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Preferencialmente, o aumento da atividade ODC é alcançado pela super expressão dos genes speF ou speC que codificam para ornitina decarboxilase (ambos pertencem ao E.C. 4.1.1.17) originado de um dos gêneros selecionados do grupo consistido de Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, e Shewanella. A ornitina decarboxilase speF é uma indutora de ornitina decarboxilase; ornitina decarboxilase speC é uma ornitina decarboxilase constitutiva.

Mais preferencialmente, o gene codificante para ornitina decarboxilase é originado de uma das espécies selecionadas do grupo consistindo de Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimutium, Yersinia pestis, e She wanella oneidensis. Até o momento speG tem sido investigada na literatura muito mais que speF. Surpreendentemente, no entanto, e preferencialmente, na presente invenção melhores resultados foram obtidos quando o gene codificante para ornitina decarboxilase speF, particularmente speF originado de espécies selecionadas do grupo consistindo de Escherichia coli, Salmonella typhimutium, e Shewanella oneidensis. Quando comparadas com resultados de super expressão de genes speG codificantes para ornitina decarboxilase constitutivos, de longe os melhores resultados de acordo com a presente invenção são obtidos quando usado speF.

No contexto da presente aplicação, qualquer gene homólogo aos acima descritos para ornitina decarboxilase e que codificam para enzimas apresentando atividade ornitina decarboxilase suficientemente comparável as ornitina decarboxilases mostradas, são utilizáveis no processo da invenção. Tais genes equivalentes poderiam ser obtidos através de qualquer estratégia de clonagem apropriada conhecida pelo profissional capacitado, como por exemplo, pelos métodos aqui descritos na parte experimental. Alternativamente, tais genes ornitina decarboxilase equivalentespodem também ser obtidos por construção proposta.

O termo atividade de formação de N-acetilglutamato representa, no contexto da presente aplicação a patente, qualquer atividade, tanto devido a uma enzima simples ou a uma combinação de enzimas, capazes de levar a formação intracelular de N-acetilglutamato.

De acordo com a presente invenção, em particular, toda N-acetilglutamato sintase pode ser usada se tiver suficiente, exemplo ao menos 30%, preferencialmente 45% e mais preferencialmente 60% e ainda mais preferencialmente 75% de identidade com a N-acetilglutamato sintase da enzima de referência de E. coli, e forem capazes de catalisar a reação de formação de N-acetilglutamato. Muitas N- acetilglutamato sintases são conhecidas por apresentarem tais altos niveis de identidade com a enzima de referência de E. coli.

Preferencialmente, atividade aumentada de formação de N-acetilglutamato é alcançada pela super expressão de genes argA (pertencente a E.C. 2.3.1.1) codificantes para N2- acetilglutamato sintase e/ ou um gene argj codificante para N-acetil-L-ornitina: L-glutamato N-acetil transferase (pertencente a E.C. 2.3.1.35). Será evidente que, qualquer gene codificante para uma enzima ou mutante apresentando a mesma função de umas das enzimas mencionadas aqui, será considerado ser equivalente com tal enzima numa das classes E.C. 2.3.1.1 ou 2.3.1.35.

Num dos representantes preferidos da presente invenção, o aumento da atividade de formação de N- acetilglutamato é alcançado pelo super expressão de um gene argA que codifica para N-acetilglutamato sintase (pertencente E.C. 2.3.1.1) originado de um dos gêneros selecionados do grupo consistindo de Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Photorhabdus, e Buchnera. Estas enzimas ArgA requerem a presença de (ou suprimento de) co- enzima A para serem ativos na formação de N- acetilglutamato.

Neste representante, a atividade aumentada da formação de N-acetilglutamato é alcançada pela super expressão de genes argA que codificam para N-acetilglutamato sintase originando de uma das espécies do grupo consistindo de Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis, Photorhabdus luminescens e Buchnera aphidicola.

Em outro representante preferido da presente invenção, o aumento da atividade de formação de N-acetilglutamato é alcançado pela super expressão do gene argj que codifica para N~-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferase (pertencente a E.C. 2.3.1.35) originado de um dos gêneros selecionados do grupo consistindo de Bacillus, Listeria, Oceanobacillus, Staphylococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Thermobifida, Streptomyces, e Bifidobacterium.

N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferase correto que pode ser usado no processo de acordo com a invenção são N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferases que apresentam suficiente, como por exemplo ao menos 20%, mais preferencialmente 30% e mais preferencialmente ainda 40% de identidade de N2-acetil-L- ornitina:L-glutamato N^-acetil transferase com a espécie de Bacillus de referência, e forem capazes de catalisar a reação de transferência de N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil. Vários N'- acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferase são conhecidos por apresentarem tal nivel de identidade correspondente com a enzima do Bacillus de referência.

Ao contrário das enzimas ArgA, as enzimas ArgJ não requerem a presença de (ou suprimento de) co-enzima A para serem ativas na formação de N-acetilglutamato. Da mesma forma, estas enzimas ArgJ são claramente preferenciais acima das enzimas ArgA para o uso em aplicação industrial.

Desta forma, num representante preferido da presente invenção, o aumento da atividade de formação de N- acetilglutamato é alcançado pela super expressão de um gene argj que codifica para N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N- acetil transferase originado de uma das espécies selecionadas do grupo consistindo de Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Oceanobacillus iheyensis, Staphylococcus epidermis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis, Corynebacteríum glutamicum, Mycobacterium leprae, Thermobifida fusca, Streptomyces coelicor, e Bifidobacterium longum.

No contexto da presente aplicação, qualquer gene sendo homólogo a uma das acima mencionadas atividades de formação de N-acetilglutamato e codificando enzimas que apresentem atividade de formação de N-acetilglutamato suficientemente comparáveis as enzimas de formação de N-acetilglutamato mostradas, é considerado próprio no processo da presente invenção. Tais genes equivalentes podem ser obtidos através de qualquer estratégia de clonagem conhecida pelo profissional capacitado, e pelos métodos aqui descritos na parte experimental. Alternativamente, tais genes equivalentes para formação de N-acetilglutamato podem também ser obtidos por construção proposta.

Num posterior representante preferido da presente invenção, o processo de sintese bioquímica de 1,4- butanodiamina é mantido num microrganismo e adicionalmente, também um aumento na atividade da enzima é obtida para pelo menos duas outras enzimas através da super expressão de (i) gene speA codificante para arginina decarboxilase (pertencente a E.C. 4.1.1.19) e um gene speB codificante para agmatinase (pertencente a E.C. 3.5.3.11; também referido como gene codificante para agmatina ureahidrolase) ; ou (ii) um gene speA codificante para arginina decarboxilase (pertencente a E.C. 4.1.1.19), e um gene aguA que codifica para agmatina iminohidrolase (pertencente a E.C. 3.5.3.12; também referido como gene codificante para agmatina deiminase) , e um gene aguB codificante para N- carbamilputrescina amidohidrolase (pertencente a E.C.3.5.1.53), e opcionalmente também um gene speB codificante para agmatinase (pertencente a E.C. 3.5.3.11) .

A vantagem deste último representante é que 1,4- diaminobutano é formado em quantidades ainda maiores.

A super expressão como aqui mencionada, pode ser alcançada por qualquer método conhecido pelo profissional capacitado; por exemplo, pelo aumento da eficiência transcricional e/ou traducional do respectivo gene, mas também por qualquer outro método conhecido tal como aumento do número de cópias do gene, ou por aumentar a atividade endógena ou estrutura de enzimas através de mutações, ou usando enzimas inibidoras. Como demonstrado na parte (i) da representante preferida acima mencionado, a combinação de SpeA e SpeB é feita para representar qualquer combinação funcional (podendo ser numa proteína de fusão combinada, ou atividades enzimáticas separadas) de SpeA e SpeB. De fato, esta combinação também pode ser designada como SpeAB. Parte (ii) aqui representa, que em tais combinações de SpeA e SpeB, a parte SpeB por si só pode ser trocada por qualquer combinação funcional (sendo numa proteína de fusão combinada, ou como atividades enzimáticas separadas) de AguA e AguB.

Janowitz et al. , FEBS Letters 544 (2003), 258-261, descreveram que agmatina deiminase AguA está envolvida na via de arginina decarbozxilase em plantas superiores. Posteriormente foi descrito por Nakada et al., Microbiology, 149 (2003), 707- 714, que a conversão catalisada por SpeB também pode ser catalisada por enzimas presentes em plantas, nomeadas pela ação combinada de agmatina deiminase AguA e N-carbamil- putrescina amidohidrolase AguB. Desta maneira, ao invés de, ou ainda, em combinação com, SpeB no contexto da presente invenção também Agu A e AguB podem ser usados. Fontes de genes para aguA e aguB podem ser Arabidopsis thaliana e Lycopersicon esculentum, mas genes comparáveis podem ser encontrados em mutantes de Pseudomonas aeroginosa.

No contexto da presente aplicação, qualquer gene homólogo a qualquer das acima mencionadas arginina decarboxilases, respectivamente agmatinases, ou agmatina iminohidrolases ou N-carbamilputrescina amidohidrolases, e codificando para as respectivas enzimas apresentando atividade arginina decarboxilase (respectivamente agmatinases, ou agmatina iminohidrolases ou N- carbamilputrescina amidohidrolases) suficientemente comparáveis as respectivas enzimas são consideradas perfeitas para o representante do processo da invenção. Cada gene escolhido pode ser obtido através de estratégias de clonagem conhecidas pelo profissional capacitado, como por exemplo, os métodos descritos aqui na parte experimental. Alternativamente, cada gene equivalente também pode ser obtido por construção proposta.

Desta forma, neste representante do processo da presente invenção, combinações adicionais dos genes super expressos também foram usadas, conhecidos genes codificantes para (i) arginina decarboxilase e agmatinase, ou (ii) arginina decarboxilase e agmatina iminohidrolase e N-carbamilputrescina amidohydrolase, e opcionalmente agmatinase.

Neste representante do processo de acordo com a presente invenção, em particular, toda arginina decarboxilase pode ser usado se tiver suficiente, ao menos 30%, preferencialmente 45% de identidade e ainda mais preferencialmente 65% de identidade com a arginina decarboxilase da enzima de referência de E. coli, e forem capazes de catalisar a reação de decarboxilação de arginina. Várias decarboxilases são conhecidas por apresentarem este alto grau de identidade com a enzima de referência de E. coli.

Além do mais, nos ditos representantes, em particular todas as agmatinases podem ser usadas se tiverem suficientes, pelo menos 30%, preferencialmente 45% e mais preferencialmente ainda 60% de identidade com a agmatinase da enzima de referência de E. coli e forem capazes de catalisar as reações de agmatinase. Muitas das agmatinases são conhecidas por apresentarem alto grau de identidade com a enzima de refer6encia de E. coli.

Posteriormente, nos ditos representantes, em particular todas as agmatinas iminohidrolases e/ou N- carbamilputrescina amidohidrolases podem ser usadas no processo que tem suficiente, ao menos 20%, preferencialmente 30% e mais preferencialmente ainda 40% de identidade com a agmatina iminohidrolase e/ou a N- carbamilputrescina amidohidrolase deenzimas de referência de Pseudomonas, e forem capazes de catalizar a agmatina iminohidrolase, respectivamente as reações de N- carbamilputrescina amidohidrolase. Muitas agmatinas iminohidrolases e N-carbamilputrescina amidohidrolases são conhecidas por apresentarem alto grau de identidade com a enzima de referência Pseudomonas.

A superexpressão do gene codificante para arginina decarboxilase no representante acima da invenção é preferencialmente um gene speA arginina decarboxilase originado de um dos gêneros selecionados de grupo consistindo de Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Pasteurella, e Neisseria. Preferencialmente, a super expressão de genes speA codificantes para arginina decarboxilase originados de uma das espécies selecionadas do grupo consistindo de Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis, Pasteurella multocida, e Neisseria meningitidis.

Neste representante da invenção, além do mais, a super expressão de genes que codificam para agmatinase preferencialmente é um gene speB agmatinase originados de uma dos gêneros selecionados do grupo consistindo de Escherichia,Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio, e Neisseria. Preferencialmente, o gene super expresso que codifica para agmatinase é um gene speB originado de uma das espécies selecionadas do grupo consistindo de Escherichia coli, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus luminescens, Vibrio cholerae, e Neisseria meningitidis.

Neste representante da invenção, além do mais, o gene super expresso que codifica para agmatina iminohidrolase é preferencialmente um gene Agu A agmatina iminohidrolase e/ou um gene aguB N-carbamilputrescina amidohidrolase originados de uma dos gêneros selecionados do grupo consistindo de Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium, e Bacillus. Mais preferencialmente, o gene codificante super expresso agmatina iminohidrolase e/ou o gene codificante super expresso N-carbamilputrescina amidohidrolase é urn gene aug A agmatina iminohidrolase e/ou urn gene aguB N- carbamilputrescina amidohidrolase gene aguBoriginado de uma das espécies selecionadas do grupo consistindo de Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans, e Bacillus cereus.

O processo da invenção pode ser mantido em qualquer organismo hospedeiro correto. Os hospedeiros devem ser selecionados dos grupos de organismos de produção (ou células) geralmente conhecidos pelo profissional capacitado em biosintese. Tais organismos devem ser de origem eucariótica, ou- como preferido- de origem procariótica. Células eucarióticas, por exemplo, podem ser células de plantas e fungo, e de vários outros grupos, como os referidos como sendo "Protista".

É particularmente preferido, que o processo de acordo com a invenção seja mantido num organismo hospedeiro selecionado do grupo consistindo Saccharomyces s p., Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp. e Pichia sp.

No processo da invenção, é especialmente preferido que o microrganisma a ser usado como hospedeiro seja capaz de produzir osaminoácidos ornitina e/ arginina. Para a maioria dos microrganismos naturais esta requisição é completa, pois usualmente tal capacidade é disponivel em todas as cepas selvagens, já que a arginina representa um aminoácido essencial.

Destas espécies, Escherichia sp. são preferenciais pois são de fácil manuseio por manipulação gênica de forma a obter cepas com a desejada super expressão de atividade enzimática. Além do mais, Escherichia sp. ainda "in natura" contém quase todas as atividade enzimáticas acima citadas (a parte dos agu genes de plantas) , assim a maioria dos genes super expressos podem ser usados como genes homólogos. Ainda, Corynebacterium sp. (que não apresenta uma ornitina decarboxilase natural) é particularmente preferencial, pois é uma Cepa de produção de glutamato que pode ser facilmente manuseada em processos de fermentação.

Nos processos da presente invenção, glutamato é um precursor muito usado. De acordo, o processo é preferencialmente mantido numa cepa de hospedeiro capaz de formação de glutamato (por exemplo, Corynebacterium glutamícum).

Melhores resultados são obtidos quando o processo de acordo com a invenção é mantido num organismo hospedeiro do grupo consistido de Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp. e Escherichiasp. que, a parte dos níveis aumentados da atividade de ornitina decarboxilase e de formação de N- acetil glutamato, ao menos ao nível de atividade de arginina decarboxilase em combinação com agmatinase e/ou uma agmatina iminohidrolase e uma enzima N- carbamilputrescina amidohidrolase é aumentada. Como demonstrado aqui, para cada uma das enzimas mencionadas o aumento do nível de atividade é comparada com os níveis de atividade nativa de tais enzimas respectivas no organismo hospedeiro.

Será claro que o processo da invenção é preferencialmente mantido em condições de reações que podem também ser usual como condições de fermentação. O processo, ainda pode ser mantido em "batch-wise", mas também - se desejado for - "fed-batch". Pode ser conveniente certificar se o organismo usado como organismo hospedeiro tem, ou é provido com, um sistema exportador de 1,4-diaminobutano formado: Preferencialmente cada sistem exportador é nativo.

A presente invenção, finalmente também relata todos os vetores, plasmídeos e hospedeiros que apresentem níveis aumentados de atividade ornitina carboxilase (atividade ODC aumentada), quando comparada ao nível nativo de atividade ornitina carboxilase e uma atividade aumentada de formação de N-acetilglutamato quando comparada ao nível nativo de atividade de formação de N-acetilglutamato. Em particular, para os representantes, a presente invenção também relata todos os vetores, plasmídeos e hospedeiros adicionalmente apresentando um nível aumentado de atividade de uma ou mais atividades enzimáticas acima mencionadas de acordo com as reivindicações anexadas.

A invenção será elucidada agora através de alguns resultados experimentais, que por hipótese nenhuma pretende limitar o perfil da invenção.

PARTE EXPERIMENTAL Procedimentos gerais

Procedimentos padronizados foram aplicados para toda manipulação de DNA. (Sambrook, J. et a/. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). 0 DNA foi amplificado do DNA cromossomal de E. coli LJI 10 (Zeppenfeld, et a/. (2000), J Bacteriol. 182, 4443-4452), Bacillus subtilis ATCCI 0783, ou Corynebacteríum glutamicum ATCC13032 se não indicado abaixo. Amplificação por PCR foi feita usando as enzimas "proof-reading" SA WADY Pwo-DNA- Polymerase (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany) ou Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) seguindo o protocolo do fabricante, embora a verificação das cepas construtoras foi realizada por PCR em colônia usando a Tag polymerase READYMIX (Sigma, Taufkirchen, Germany). Sitios de restrição para clones subseqüentes assim como mutações posteriores foram introduzidas com oligonucleotideos disponibilizado pela MWG-Biotech (Ebersberg, Germany). Fragmentos de DNA foram purificados com o MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany) seguindo o protocolo do fabricante. A preparação do DNA plasmideal foi desenvolvida pela utilização QlAprep spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Germany). A verificação dos plasmideos construtores foi realizada pela análise de restrição e subsequente seqüenciamento (Agowa, Berlin, Germany).

Para a alta expressão dos genes, o vetor pJFH9EH (Furste, J. 15 P. et al. (1986), Gene 48, 119-131) foi usado para produção de proteína IPTG-induzida baseada no promotor tac Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG) induzido e pelo sistema repressor de lac (laclQ) .

Construção dos plasmídeos (i) Construção do plasmídeo pDAB2 (pJF119EH-speF) O (induzível, biodegradável) gene speF codificante para ornitina decarboxilase de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) foi clonado num vetor de expressão pJF119EH (Fürste, J. P. et al. (1986), Gene 48, 119-131) . Este vetor permite um alto nível de produção de proteína baseado no controle transcricional dos genes clonados sob o promotor tac induzido por isopropil-β-D- tiogalactopiranosida (IPTG) e o sistema repressor de lac (laclQ) . Para a construção do plasmídeo de pDAB2 (pJF119EH- speE) o gene codante foi clonado com RBS original (sítio de ligação ribossomal), códons de iniciação e terminação. O fragmento de DNA de 2247 bp contendo speF foi amplificado do DNA cromossomal de E. coli LJI 10 (numero de acesso AE000172; nucleotideos 10242 - 12468) usando os seguintes nucleotideos: 5’-GAC CTG CTG GTA CCT AAA ATA AAG AGA TGA AA-3' [SEQ ID: No. 1] (mutações em negrito, sítio de restrição Kpnl em itálico) e 5'-TCG ATC TAG ACT GAG TCA TAA TTT TTC CCC-3’ [SEQ ID: No. 2] (mutações em negrito, sítio de restrição Xba em itálico) . O fragmento foi terminantemente modificado com as endonucleases de restrição Kpnl e Xbal e ligado ao vetor de pJF119EHl que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células DH5α de E. coli (Invitrogen, 5 Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, os plasmideos obtidos pDAB2 (pJF119EH-speF, 7502 bp) foram verificados por análise de restrição e subseqüente sequenciamento. (ii) Construção do plasmideo pDAB4 (pJF119EH-speC) Os genes (constitutivos, biosintéticos) que codificam para ornitina decarboxilase de E. coli LJ 110 (Zeppenfeld, et al., see general procedures) foi clonado no vetor de expressão JF1I9EH (Fiirste, J. P. et al. (1986), ver (i)), permitindo uma intensa expressão gênica baseada no controle transcricional do promotor fac induzido por isopropil-β-D- tiogalactopiranosida (IPTG) e o sistema repressor de lac (laclQ) . Ainda, os genes codificantes foram clonados com códons de iniciação e terminação originais. Já que, nenhum sitio de ligação ribossomal conservado (RBS) pode ser determinado por speC utilizando estudos in silico, uma RBS optimizada foi introduzida 7 pb acima do códon de iniciação de speC por mutageneses. Os 2235 pb do fragmento de DNA contendo o speC foi amplificado do DNA cromossomal de DNA of E. coli LJI 10 (numero de acesso AE000379; nucleotídeos 2650 - 4867) usando os seguintes oligonucleotideos: 5’-GAG CTC TAG ACCAGT TTG AGG AAT ATC T-3' [SEQ ID: No. 3] (mutações em negrito, sitio de restrição Xbal em itálico) e 5’-TTT TGC A TG CTT ACT TCA ACA CAT AAC CGT AC-3’ [SEQ ID: No. 4] (mutações em negrito, sítio de restrição Sphl em itálico) . Após as modificações terminais com as endonucleases Xbal e Sphl, o produto de PCR foi ligado ao plasmídeo pJFl 19EH, que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células de E. coli DH5α (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após a preparação, a verificação dos plasmídeos obtidos pDAB4 (pJF119EH-speC, 7491 bp) foi feita pela análise de restrição e por subseqüente seqüenciamento. (iii) Construção do plasmídeo pDABl (pJF119EH-argA) O gene argA que codifica para N-acetilglutamato sintase de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et a/., ver procedimentos gerais) foi clonado no vetor de expressão pJF119EH (Furste, J. P. et a/. (1986) , ver (i) ) . O gene foi clonado com RBS (sítio de ligação ribossomal) e códons de iniciação e terminação originais. No entanto, o início da transcrição foi alterado de GTG para ATG. O fragmento de DNA de 1365 bp que codifica para argA foi amplificado do DNA cromossomal de E. coli LJI 10 (numero de acesso AE000365; nucleotídeos 3312-4643) usando os seguintes nucleotídeos: 5’-ATA AGA ATT CAAAGA GGT GTG CCA TGG TAA AG-3’ [SEQ ID: No . 5 ] (mutações em negrito, sítio de restrição EcoRl em itálico) e 5'-TTT TGG TAC CTT ACC CTA AAT CCG CCA T-3’ [SEQ ID: No.6] (mutações em negrito, sítio de restrição Kpnl em itálico). O fragmento foi terminantemente modificado usando as enzimas de restrição EcoRl e Kpnl, e subsequentemente ligado ao plasmideo de expressão pJFll 9EH, que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação dos plasmideos pDABl obtidos (pJF119EH-argA, 6627 bp) foi feita por análise de restrição e subseqüente sequenciamento. (iv) Construção do plasmideo pDAB5 (pJFl 19EH-argA- speF) Para permitir uma produção paralela do ornitina decarboxilase SpeF e a N-acetilglutamato sintase ArgA, o gene condificante para speF de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et a/., ver procedimentos gerais) foi clonado no vetor de expressão pDABl argA (ver (iii) ) . O fragmento de DNA contendo speF (2225 pb) foi cortado do plasmideo de construção pDAB2 (ver A.l) pela digestão com as endonucleases Kpnl e Xbal e ligadas ao plasmideo pDABl contendo argA (ver (iii)), cortado da mesma forma. Após a transformação em células DH5α de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação dos plasmideos pDAB5 obtidos (p JF119EH-argA-speF, 8841 pb) para em paralelo produção de SpeF e ArgA foi verificada por análise de restrição. (v) Construção do plasmideo pDAB6 (pJFl 19EH-argA- speC) Para permitir a produção paralela de ornitina decarboxilase SpeC e N-acetilglutamato sintase ArgA, o gene codificante speC de E. coli LJI 10 (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) foi clonado no vetor de expressão argA pDABl (ver (iii)l). Através da digestão do plasmideo pDAB4 construído (ver (ii)) com endonucleotídeos Xbal and Sphl, o fragmento de 2225 pb de DNA do gene speC. Com RBS otimizadas foi separado. Subsequentemente, o fragmento foi ligado ao plasmideo pDABl contendo argA(see (i)), que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células DH5α de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transfromados foram selecionados em placas de LB Agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação do plasmideo pDAB6 obtido (pJFl 19E11-argA-speC, 8830 bp) permitindo a expressão em paralelo de speC e argA foi feita por análise de restrição e subseqüente sequenciamento. (vi) Construção do plasmideo pDAB7 (pJF119EH-speAB) O gene speA codificante para arginina decarboxilase assim como speB codificante para agmatinase de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et a/., ver procedimentos gerais) foram clonados no vetor de expressão pJF119EH (Fiirste, J. P. et al. (1986), ver (i)). Desta maneira, a estrutura original do operon dos genes assim como das RBS, os códons de iniciação e terminação foram mantidos. O fragmento de DNA de 307 9 pb contendo speAB foi amplificado do DNA cromossomal de E. coli LJI 10 (numero de acesso AE000377; nucleotideos 1190-4247) usando os seguintes oligonucleotídeos: 5'-ACA CTT TCT AGAATA ATT TGA GGT TCG CTA TG-3’ [SEQ ID: No . 7 ] (mutações em negrito, sítio de restrição Xbal em itálico) . e 5’-CAT GGC ATG CGG TGCTTA CTC G-3' [SEQ ID: No.8] (mutações em negrito, sítio de restrição Sphl em itálico). Após modificação terminal com endonucleases de restrição Xbal e Sphl, o fragmento de DNA foi ligado no plasmídeo de expressão pJFl 19EH, que foi cortado da mesma forma. Após transformação em células DH5α de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação do plasmídeo pDAB7 obtido (pJFl 19EH-SpeAB, 8339 bp) foi feito por análise de restrição e subseqüente seqüenciamento. (vii) Construção do plasmídeo pDAB8 (pJFl 19EH-SpeF- speAB) Para permitir a produção paralela de ornitina decarboxilase SpeF e arginina decarboxilase SpeA, os genes speAB de E. coli LJI 10 (Zeppenfeld, et al. , ver procedimentos gerais) foram clonados no vetor de expressão SpeF pDAB2 (ver (i) ) . Através da digestão do plasmídeo pDAB7 construído (ver (vi) ) com endonucleases de restrição Xbal e Sphl, 3067 pb contendo o gene- operon speAB foi separado e ligado no plasmídeo pDAB2 contendo speF(see (i) ) , que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transfromados foram selecionados em placas de LB Agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação do plasmídeo pDAB8 (pJH119EH-speFAB, 10547 pb) permitindo a expressão em paralelo de SpeFAB foi feita por análise de restrição. (viii) Construção do plasmideo pDABlO (pJFl 19EH-argA- speF-speAB) Para permitir a produção paralela de ornitina decarboxilase SpeF e arginina decarboxilase SpeA, agmatinase SpeB e N-acetilglutamato sintase ArgA, os genes speAB de E. coli LJI 10 (Zeppenfeld, et al. , ver procedimentos gerais) foram clonados no vetor de expressão argA-speF pDAB5 (ver (iv) ) . Através da digestão do plasmideo pDAB7 construído (ver (vi)) com endonucleases de restrição Xbal e Sphl, 3067 pb contendo o gene-operon speAB foi separado e ligado no plasmideo pDAB5 contendo argA-speF(see (iv)), que foi cortado da mesma forma. Após a transformação em células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transfromados foram selecionados em placas de LB Agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação do plasmideo pDABlO (pJH119FH-argAspeFAB, 1886 pb) permitindo a expressão em paralelo de ArgA e SpeFAB foi feita por análise de restrição. (ix) Construção do plasmideo DAB37 (pJF119EH-argJBs- speF) Para permitir a produção paralela de ornitina decarboxilase SpeF e do gene Argjde Bacillus subtilis ATCC 10783, codificante para N2-acetil-L-ornitina:-glutamato N- acetil transferase, o gene ArgJ de B. subtilis foi clonado no vetor de expressão speF pDAB5 (ver (iv)) trocando o presente gene argA. O gene foi clonado com RBS e códon de terminação originais. O fragmento de DNA de 127 9 pb contendo argj foi amplificado do DNA cromossomal de Bacillus subtilis ATCC 10783 (numero de acesso 299109 (B. subtilis subsp. subtilis str. 168, genoma completo (seção 6 de 21)); nucleotideos 184321 - 185600) usando os seguintes oligonucleotideos: 5’-TCA CGC GAA TTC ATC CAT AGA ACG GGA GAG-3'[SEQ ID: No. 9] (mutações em negrito, sitio de restrição EcoRI em itálico). e 5’-CTT CAT TTC GGT ACCCTT TAT TAC GTG CGA TAG CTC-3’ [SEQ ID: No.10] (mutações em negrito, sitio de restrição Kpnl em itálico). Os oligonucleotideos foram construídos de acordo com a sequencia de argj como presente no genoma da cepa B. subtilis subsp. subtilis str. 168. O fragmento de DNA amplificado e o plasmideo pDAB5 foram restritos com as endonucleases EcoRI e Kpnl. No caso de pDAB5, dois fragmentos de 1355 pb e 748 6 pb foram obtidos. O fragmento de 7486 pb contendo o vetor pJFI19EH e o gene speF foi isolado e ligado com fragmento de DNA amplificado. Após a transformação em células DH5a de E. coli cells (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação do plasmideo pDAB37 obtido (pJF119EH-argJBs- spec, 8749 bp) foi feita por análise de restrição e subseqüente sequenciamento. A análise de sequncia revelou, que o gene argj clonado de B. subtilis ATCC 10783 difere de gene argj reportado de B. subtilis subsp. subtilis str. 168. Em comparação com a proteina Argj de B. subtilis subsp. subtilis str. 168 (numero de acesso CAB12961) e a proteina Argj codificada de gene argj presente no plasmídeo pDAB37 mostra as seguintes mudanças: H72Q, P74A, T75A, L951, F105L, GIIOD, H134QI E142Q, A169TI R181A, T2161, A242G, D255E, N353H,1363L, A380D, D383E. (x) Construção do plasmídeo pDAB38 (pJFl 19EH-argJCg- speF} Para permitir a produção paralela de ornitina decarboxilase SpeF e do gene Argj de Corynebacteríum glutamicum, codificante para N2-acetil-L-ornitina:- glutamato N-acetil transferase, o gene Argj de C. glutamicumATCC 13032 foi clonado no vetor de expressão speF pDAB5 (ver (iv)) trocando o presente gene argA. O gene foi clonado com RBS e códon de terminação originais. O fragmento de DNA de 1219 pb contendo argj foi amplificado do DNA cromossomal de C. glutamicum ATCC 13032 (numero de acesso NC 006958 (C. glutamicum ATCC 13032, genoma completo); nucleotídeos 1466650 - 1467869) usando os seguintes oligonucleotídeos: 5 ’ -ACA CAT CGA ATT CAG TAG GAG TTC CAC ATG G-3’ [SEQ ID: No.11] (mutações em negrito, sítio de restrição EcoRI em itálico) . e 5’-AGT GCT GGTACC TTT TAA GAG CTG TAG GC 3’ [SEQ ID: No.12] (mutações em negrito, sítio de restrição Kpnl em itálico). O fragmento de DNA amplificado e o plasmídeo pDAB5 foram restritos com as endonucleases EcoRI e Kpnl. No caso de pDAB5, dois fragmentos de 1355 pb e 748 6 pb foram obtidos. O fragmento de 7486 pb contendo o vetor pJFI19EH e o gene speF foi isolado e ligado com fragmento de DNA amplificado. Após a transformação em células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB Agar contendolOO mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação do plasmideo pDAB38 obtido (pJF119EH-argJCg-speF, 8679 bp) foi feito por análise de restição e subseqüente sequenciamento. (xi) Construção do plasmideo pDAB3 (pJF119E H - speC nP.BS ) O gene speC (constitutivo, biosintético) codificante para ornitina decarboxylase de E. coli LJI 10 (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) foi clonado no vetor de expressão pJF119EH (Fiirste, J. P. et a/. (1986), Gene 48, 1 19-1 31), permitindo uma forte expressão gênica baseada no controle transcricional sob o promotor tac induzido por isopropil-P-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e o sistema repressor de lac (laclQ) . Além disso, o gene codificante speC foi clonado com RBS, códons de iniciação e terminação originais. O fragmento de DNA de 2235 pb contendo speCnRBS foi amplificado do DNA cromossomal de E. coli LJI 10 (numero de acesso AE000379; nucleotídeos 2650-4867) usando os seguintes oligonucleotideos: 5’-GAG CTC TAG ACCAGT TTG ACC CAT ATC T-3' [SEQ ID: No. 13] (mutações em negrito, sitio de restrição Xbal em itálico). e 5'-TTT TGC ATG CTT ACT TCA ACA CAT AAC CGT AC-3’ [SEQ ID: No.14] (mutações em negrito, sitio de restrição Sphl em itálico) . Após as modificações terminais com as endonucleases Xbal e Sphl, o produto de PCR foi ligado ao plasmideo pJF119EH que foi cortado da mesma forma. Após a tranformação em células DH5oc de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), os transformados foram selecionados em placas de LB agar contendo 100 mg/1 de ampicillina. Após o preparo, a verificação do plasmideo pDAB3 obtido (pJFl 19EH-speCnRBs, 7491 pb) foi feito por análise de restrição e subseqüente sequenciamento.

Experimento Comparativo A: A produção de 1,4-butanodiamina via a super expressão de ornitina decarboxilase speC, com a expressão do gene induzida por IPTG (misturar).

A influência da super expressão do gene speC codificante para ornitina decarboxilase na produção de DAB foi investigada com a Cepa hospedeira de E. LJ110 (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) carreando o plasmideo pDAB3 (ver (ix)).

Esta cepa foi testada em frascos de mistura de experimentos utilizando meio com minmo de sal consitindo de MgSO4.7H20 (300 mg/1), CaCl2.2H20 (15 mg/1), KH2PO4 (3 g/1), K2HPO4 (12 g/1), NaCI (100 mg/1), (NH4)2SO4 (5 g/1), Na citrate.3H2O (1 g/1), FeSO4.7H2O (75 mg/1), tiamina-HCl (vitamina Bl) (5 mg/1) assim como os elementos Al2 (SO4) 3.18H2O (3 mg/1), COC12.6H20 (1,05 mg/1), CuSO4.5H2O (3,75 mg/1), H3BO3 (0,75 mg/1), MnCl2.4H20 (30 mg/1), Na2MoO4.2H20 (4,5 mg/1), NiSO4.6H2O (3 mg/1) e ZnSO4.7H2O (22,5 mg/1). Uma solução estoque de glucose (500 g/1) foi autoclavada separadamente e adicionada ao meio estéril para uma concentração final de 10 g/1.

Uma pré-cultura em minimo de sal contendo 100 mg/1 de ampicillina foi inoculada com with 1-5 |il/ml da solução estoque e incubada a 33°C e 180 rpm durante 16 h até uma OD62O de 2,5 ml desta cultura foi subseqüentemente usada para a inoculação da principal cultura consistindo de 50 ml do mesmo meio, que foi incubada por 24 h a 33°C e 180 rpm. Quando as células alcançarem uma ODggonm de 1,5 (após ~7 h) , a expressão do gene foi induzida pela adição de 10 pM de IPTG.

Para se observar a produção tempo-dependente de DAB, as amostras foram coletadas em diferentes pontos durante o cultivo. Após a separação das células utilizando centrifugação, o sobrenadante diluido foi analisado por HPLC. Aqui, as aminas contidas foram detectadas como derivados de orfo-phthaldialdehyde (OPA) a 230 nm num aparelho Hewlett-Packard 1100 Series, usando coluna de fase reversa Cig (Nucleosil 120-5 Cig, Macherey &Nagel, Diiren, Germany) equilibrado com 50% do Tampão B (tampão A, 0,1 M acetato de sódio pH 7,2; Tampão B metanol). Para a separação, o seguinte gradiente foi aplicado: 1-7 min em gradiente linear de 50% a 75% Tampão B com um fluxo suave de 0,5 ml/min, 7-13 min 75% a 85% Tampão B com um fluxo suave de 0,5 ml/min, 13 - 14,5 min 85% a 50% Tampão B com um fluxo suave de 1 ml/min, 14,5 - 17 min 50% Tampão B com um fluxo suave de 1 ml/min e 17 - 20 min a 50% Tampão B com uma taxa suave de 0,5 ml/min.

Através da utilização das substâncias padrões para calibrar, as seguintes concentrações de DAB puderam ser determinadas (ver Tabela I) e verificadas por NMR espectroscopia.

Cepa usada Gene Expresso Concentração de DAB [mg/1] LJ110 pDAB3 speC 50 Tabela 1 : Formação de DAB utilizando super produção ODC em E. coli

Exemplos: Melhora na produção de 1,4-butanodiamina pelo aumento da atividade de decarboxilação de ornitina combinada com aumento da atividade de formação de N-acetilglutamato. Exemplo 1. Produção de 1,4-butanodiamina utilizando ODC assim como super produção de ArnA

A influência da produção paralela de N-acetilglutamato sintase ArgA, catalisando a primeira etapa da biossintese de ornitina começando por glutamato, e ornitina decarboxilases SpeF ou Spec na produção de DAB foi investigada na cepa hospedeira LJ110 de E. coli (Zeppenfeld, et a/., ver procedimentos gerais) carreando o plasmideo pDAB5 (ver (iv)) ou pDAB6 (ver (v)).

Estas Cepas foram testadas em frascos de experimentos em meio com minimo de sal (ver experimento comparativo A). Além disso, a pre-cultura em meio com minimo de sal contendo 100 mg/1 de ampicillina foi inoculado com 1-5 pl/ml da solução estoque e incubada a 33°C, 180 rpm durante 16 h até uma densidade ótica a 620 nm de 2,5 ml desta cultura foi subseqüentemente usada para inocular a principal cultura consistindo de 50 ml do mesmo meio, que foi incubado por 24 h a 33°C e 180 rpm. Quando as células alcançaram uma OD62onm de 1.5 (após ~ 7 h) , a expressão gênica foi induzida pela adição de 10 pM de IPTG.

Para se observar a produção tempo- dependente de DAB, as amostras foram coletadas em diferentes pontos durante o cultivo. Após a separação das células utilizando centrifugação, o sobrenadante foi analisado por HPLC (ver experimento comparativo A). Pela utilização de substâncias padrão para calibração, as seguintes concentrações de DAB puderam ser determinadas (ver Tabela 2).

Tabela 2: Formação de DAB utilizando super produção em paralelo de ArgA e ODC em E. coli

Exemplo 2. Produção de 1,4-butanodiamina utilizando ODC assim como super produção de Argj (frasco de mistura)

A influência da produção paralela do gene Argj o codificante para N -acetil-L-ornitina:-glutamato N-acetil transferase tanto de C. glufamicumcomo de B. subfilis, ccatalisando a formação de N-acetilglutamato e ornitina de L-glutamato e N-acetilornitina, e ornitina decarboxilases SpeF ou Spec na produção de DAB foi investigada em Cepas hospedeiras LJ11O de E. coli (Zeppenfeld, et a/., ver procedimentos gerais) carreando o plasmideo pDAB37 (ver (ix)) ou pDAB38 (ver (x)).

Estas Cepas foram testadas em frascos de experimentos em meio com minimo de sal (ver experimento comparativo A). Além disso, a pre-cultura em meio com minimo de sal contendo 100 mg/1 de ampicillina foi inoculado com 1-5 |il/ml da solução estoque e incubada a 33°C, 180 rpm durante 16 h até uma densidade ótica a 620 nm de 2,5 ml desta cultura foi subseqüentemente usada para inocular a principal cultura consistindo de 50 ml do mesmo meio, que foi incubado por 24 h a 33°C e 180 rpm. Quando as células alcançaram uma OD620nm de 1.5 (após ~ 7 h) , a expressão gênica foi induzida pela adição de 50 pM de IPTG.

Para se observar a produção tempo- dependente de DAB, as amostras foram coletadas em diferentes pontos durante o cultivo. Após a separação das células utilizando centrifugação, o sobrenadante foi analisado por NMR. Uma amostra do sobrenadante da cultura teve o pH ajustado para 5,8, liofilisado e redissolvido em D20. 600 MHz 1H-NMR a 323 K mostrou o espectro de ressonância esperado e pontuais pequenas quantidades de DAB confirmaram a presença de DAB. Através da utilização de substâncias padrão para calibração, as seguintes concentrações de DAB puderam ser determinadas (ver Tabela 3) .

Tabela 3: Formação de DAB utilizando super produção em paralelo de Argj e ODC em E. coli

Exemplo 3. Melhora na produção de 1,4-butanediama com grupo começando por ornitina assim como arainina (frasco de mistura)

Para demonstrar a posterior melhora na fomação de DAB começando por ornitina assim como arginina, a influência da super produção combinada de ornitina decarboxilase SpeF, de arginina decarboxilase SpeA e de agmatinase SpeB foi investigada. Além disso, para se certificar o suprimento necessário correto, estas invetigações foram combinadas num posterior experimento de super produção de N- acetilglutamato sintase ArgA, catalisando a primeira etapa da biosíntese de ornitina começando por glutamato.

Assim, os frascos de cultivo foram mantidos num meio com minimo de sal (ver A.3) pela utilização da cepa hospedeira LJ110 de E. coli (Zeppenfeld, et al., ver procedimentos gerais) carreando plasmideos pDAB8 e pDABlO, respectivamente (ver 2.2 e 2.3). Assim, a pré-cultura em minimo de sal contendo 100 mg/1 de ampicillina foi inoculada com with 1-5 p.l/ml da solução estoque e incubada a 33° C e 180 rpm durante 16 h até uma OD 62 0 de 2,5 ml desta cultura foi subseqüentemente usada para a inoculação da principal cultura consistindo de 50 ml do mesmo meio, que foi incubada por 24 h a 33° C e 180 rpm. Quando as células alcançarem uma OD620nm de 1,5 (após ~ 7 h) , a expressão do gene foi induzida pela adição de 10 |iM de IPTG.

Para se observar a produção tempo-dependente de DAB, as amostras foram coletadas em diferentes pontos durante o cultivo. Após a separação das células utilizando centrifugação, o sobrenadante foi analisado por HPLC (ver experimento comparativo A). Através da utilização das substâncias padrão para calibração, as seguintes concentrações de DAB puderam ser determinadas (ver Tabela 4) .

Claims (4)

1. Microrganismo selecionado a partir da espécie Escherichia coli (E.coli),caracterizadopelo fato de ser transformado pelo vetor pJF119EH compreendendo os genes selecionados a partir do grupo consistindo de SpeF (número de acesso AE000172, nucleotideos 10242-12468), SpeC (número de acesso AE000379, nucleotideos 2650-4867), argA (número de acesso AE000365, nucleotideos 3312-4643), argj (número de acesso Z99109 (B. subtilis subsp. subtilis str. 168, genoma completo (seção 6 de 21)), nucleotideos 184321- 185600), e apresentando um nivel aumentado de atividade ornitina decarboxilase (ODC) quando comparado ao nivel nativo da atividade de ornitina decarboxilase e uma atividade aumentada de formação de N-acetilglutamato quando comparado ao nivel nativo da atividade de formação de N- acetilglutamato, em que a atividade ODC aumentada é alcançada pela superexpressão de genes speF ou speC codificante para ornitina decarboxilase (cada pertencente a E.C. 4.1.1.17) e a atividade aumentada da formação de N- acetilglutamato é alcançada pela superexpressão de pelo menos um de um gene argA codificante para N-acetilglutamato sintase (pertencente a E.C. 2.3.1.1) e um gene argj codificante para N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferase (pertencente a E.C. 2.3.1.35).

2. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que apresenta um nivel aumentado de atividade de uma ou mais atividades de enzimas adicionais selecionadas a partir do grupo consistindo de arginina descarboxilase e agmatinase.

3. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o vetor compreende ainda os genes speA e speB (speAB - número de acesso AE000377, nucleotídeos 1190-4247), em que a atividade enzimática aumentada é obtida pela superexpressão de um gene speA codificante para arginina decarboxilase (pertencente a E.C. 4.1.1.19) e um gene speB codificante para agmatinase (pertencente a E.C. 3.5.3.11; também referido como gene codificante para agmatina ureahidrolase).

4. Processo para síntese bioquímica de 1,4-butanodiamina, caracterizadopelo fato de que compreende: (a) cultura do microrganismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para excretar 1,4- butanodiamina em um caldo de fermentação; e (b) recuperação da dita 1,4-butanodiamina a partir do caldo de fermentação.