MX2007000566A - Sintesis bioquimica de 1,4- butanodiamina. - Google Patents

Sintesis bioquimica de 1,4- butanodiamina.

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Petrus Martinus Matheus Nossin
Susanne Maria Kremer
Leon Jean Renier Marie Raeven
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Abstract

La invencion concierne a un proceso para sintesis bioquimica de 1, 4- butano-diamina en un microorganismo que tenga un nivel creciente de actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa, en donde en el microorganismo tambien esta presente una actividad creciente de formacion de glutamato de N-acetilo con respecto al nivel nativo de actividad de formacion de glutamato de N-acetilo en el microorganismo y en donde la 1, 4- butano-diamina producida en el microorganismo es excretada en un caldo de fermentacion, y es recuperada a partir del caldo de fermentacion. La invencion tambien concierne a vectores, plasmidos y huespedes que portan una actividad ODC creciente y una actividad de formacion de glutamato de N-acetilo creciente correspondientes.

Description

SÍNTESIS BIOQUÍMICA DE 1 , 4- BUTANDIAMINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne a un nuevo proceso para la síntesis bioquímica de 1, 4-butandiamina (número CAS: 110-60-1; un compuesto también mencionado como tetrametilendiamina; en la literatura de bioquímica es también mencionada como putrescina) en un microorganismo que tenga un nivel creciente de una actividad ornitina descarboxilasa con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La ornitina descarboxilasa en lo sucesivo también será mencionada como "ODC", un "nivel creciente de actividad ornitina descarboxilasa" será en lo sucesivo mencionado como "actividad ODC creciente". Generalmente, los microorganismos que tienen actividad ODS son conocidos por ser capaces de producir poliaminas tales como espermidina y espermina, los cuales son los nombres comunes respectivamente para los productos N- (3-aminopropil) - 1, 4- butandiamina y N, N' - bis- (3-aminopropil) - 1, 4- butandiamina. Dichos compuestos, así como también varias diaminas lineales cortas por sí mismas, tales como por ejemplo, 1, 4- butandiamina y 1, 5- pentadiamina (también mencionada como cadaverina) , son a menudo mencionadas en estudios bioquímicos como poliaminas, aunque a partir de una definición estrictamente química de poliaminas se esperaría un número mayor de grupos amino. Para los propósitos de la presente solicitud de patente, no obstante, el término poliaminas está siendo usado en su significado bioquímico y por consiguiente incluye 1, 4- butandiamina. El compuesto 1, 4- butan diamina es un material crudo importante para la producción de alguno de los principales plásticos de ingeniería: poliamida- 4, 6, ya sea en la forma de un homopolímero, o copolimerizado, por ejemplo, con aproximadamente 5 % en peso del monómero poliamida-6 (caprolactama). El homopolímero poliamida- 4, 6 (nylon-4,6) fue descrito desde 1938 (US- A- 2, 130,948, Carothers) . Es el producto de policondensación de los monómeros 1, 4- butandiamina y ácido adípico. Actualmente, especialmente compuestos de poliamida, 4- 6 están siendo producidos y comercializados por DSM en los Países Bajos bajo el nombre comercial de STANYL®. Para la síntesis de 1, 4- butandiamina se conocen numerosas rutas químicas. Todas estas rutas químicas adolecen de la desventaja de que los materiales iniciales han sido obtenidos desde fuentes que son consideradas no renovables. Sin embargo, existe una necesidad para proporcionar rutas nuevas y factibles para la síntesis de 1, 4- butandiamina iniciando a partir de fuentes de carbono renovables y usando procesos bioquímicos (también mencionados como "biotransformación") en células vivientes. En general, las poliaminas son consideradas tóxicas para cualquier célula o microorganismo usado en producción bioquímica. Por consiguiente, hasta ahora dichas nuevas rutas por síntesis bioquímica, no obstante, no se creyeron atractivas. Esto puede por ejemplo, verse de las referencias siguientes: Fukuchi y colaboradores, J. Biol. Chem., Vol. 270 (1995), páginas 18831-18835, y Suzuki y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 91 (1994), páginas 8930-8934. Fukuchi describe claramente la disminución en la viabilidad celular (y de síntesis de casi todas las clases de proteínas) debida a la acumulación de espermidina en células de E. coli deficientes en espermidina acetiltransferasa (es decir, en células carentes de la SpeG de acetiltransferasa) . La espermidina es un producto que está siendo producido en células a partir de 1, 4- butandiamina como un intermediario. Por consiguiente, la biosíntesis de 1, 4- butandiamina inevitablemente también conduce a la formación de espermidina. Suzuki por un lado también demostró (en células de ratones) , que la sobre producción de ODC da como resultado la acumulación de poliaminas, especialmente de espermidina, y que -a partir de la adición de cantidades pequeñas de espermidina- se observó aún muerte celular en células que no son deficientes en speG. Se ha indicado que Limsuwum y colaboradores ( J. Bacteriol. Vol. 182 (2000) páginas 5373-5390) han mostrado que a bajas temperaturas dichos problemas pueden ser superados por sobre expresión del gen speG dedicado. Suzuki y colaboradores (citado anteriormente) sugirieron que la viabilidad celular decreciente es debida a una inhibición por reacción insuficiente de ODC por medio de anti-enzimas y puede ser superada por sobreproducción de una anti-enzima adecuada. Dicha sobreproducción de antienzimas entonces también abatiría la producción de poliaminas en las células y por consiguiente no es factible para la producción de DAB. Adicionalmente como describieron Kashiwagi y colaboradores en J. Bacteriol. Vol. 170 (1988), páginas 3131-3135, los contenidos de poliaminas en E. coli pueden ser ajustados por sobre expresión del gen que codifica a una ornitina descarboxilasa (ODC) , en particular del speC expresado constitutivamente. Para sus experimentos se usaron en la clonación, el plásmido pODC como lo produjeron Boyle y colaboradores (Methods in Enzymology, Vol. 94 (1983), páginas 117-121. Como expuso Kashiwagi y colaboradores, igualmente una sobre producción de 70 veces SpeC de ornitina descarboxilasa bajo el control translacional y/o transcripcional nativo (es decir usando los elementos genéticos nativos que consisten de sitio de enlace ribosó ico y promotor) solamente condujo a ligeros niveles crecientes de la suma del contenido de 1, 4-butandiamina intra- y extracelular. Como puede verse en la referencia de Kashiwagi citada, los autores mencionados fueron incapaces de alcanzar niveles de producción más altos de 1, 4- butandiamina que aproximadamente 25 mg/l (sin alimentación de ornitina) . Además, ellos mostraron que la sobreproducción de ODC en las células condujo a un fuerte decremento en el contenido de ornitina en las células (desde aproximadamente 65 µmoles/l hasta menos de 1 µmol/l y concluyeron que las células s e volvieron deficientes en ornitina cuando se sobre produjo ODC. Kasiwagi y colaboradores trataron de eliminar la limitación observada en el contenido de ornitina por medio de alimentación externa de ornitina, pero - aunque se alcanzo una ligera mejora - los niveles de producción de 1, 4- butandiamina no fueron más altos que 30 mg/l. Debido a la restricción descrita del suministro de precursor por medio de la sobreproducción de ODC y porque, además, se esperaría que niveles más altos de proteínas como ODC causarían efectos crecientes de toxicidad en las células debido a la presencia de cantidades más altas de poliaminas, el experto, en vista de las referencias anteriores, podría suponer que sería imposible proporcionar procesos de síntesis bioquímica para la producción de 1, 4- butandiamina a niveles significativamente más altos que 30 mg/l. EP-A-0726240 hasta ahora, es una de las muy pocas referencias de patentes que se relacionan con la síntesis bioquímica de poliaminas, incluyendo 1, 4- butandiamina. Sin embargo, se describe la producción de, inter alia, 1 , 4- butandiamina por fermentación de productos naturales que contengan proteínas como un componente importante . En dichos procesos, los productos naturales son tratados primero sometiéndolos a degradación total o parcial, y cualquiera de los compuestos indeseables (por ejemplo, Hg, Cr, As, Cd, Se y Pb) , inhibidores del crecimiento celular, pesticidas, antibióticos, detergentes, jabones, grasas, aceites, cianuros y fenoles son entonces retirados antes de la etapa de fermentación. La putrescina y otras diaminas producidas de una manera tal están siendo (re-) usadas como fertilizantes y abonos, pero contienen gran número de otras substancias que son inadecuadas como un material crudo para la producción de, por ejemplo, poliamida- 4, 6. Por consiguiente, persiste una necesidad por una ruta biosintética eficiente para la síntesis de 1, 4-butandiamina a títulos significativamente más altos que aproximadamente de 30 mg/ml, preferiblemente aún sin la necesidad de alimentación externa de ornitina (costosa) . Esta necesidad por disponibilidad mejorada de 1, 4-butandiamina está basada en su uso previsto como .material inicial, por ejemplo, para la producción de poliamida, 4, 6. En general, las rutas para 1, 4- butandiamina como son conocidas hasta la fecha son muy laboriosas y problemáticas, y pueden conducir a una calidad de dicho producto que - sin purificación adicional- es difícil que sea usado en la producción de nylons . Las rutas químicas conocidas para 1, 4- butandiamina requieren materiales iniciales y reactivos relativamente costosos (incluyendo reactivos que son difíciles de manejar) , y condiciones de reacción relativamente severas de temperatura y de presión en un diseño de reactor múltiple y de etapas múltiples, así como también el uso de sistemas catalizadores costosos. Por consiguiente, persiste una necesidad por rutas alternativas a 1, 4- butandiamina, preferiblemente a partir de materiales crudos mucho menos costosos y que eviten problemas de manejo de reactantes como ácido cianhídrico. Es bien sabido que creciendo naturalmente, y por consiguiente renovables, los materiales de producción agrícola son la base para fuentes de carbono tales como glucosa (u otras fuentes de carbón apropiadas y mezclas de las mismas) que pueden ser usadas en fermentación. Dichos materiales renovables son relativamente baratos y disponibles abundantemente. En general, se considera que es muy ventajoso si pueden usarse materiales renovables como materiales iniciales, para toda clase de materiales químicos. Es así un objetivo de la presente invención proporcionar posibilidades mejoradas para producción industrial a gran escala de 1, 4- butandiamina por medio de biotransformación.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente sorprendentemente encontraron que este objetivo se logró con un nuevo proceso para la síntesis bioquímica de 1, 4- butandiamina en un microorganismo que tenga un nivel creciente de una actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) con respecto al nivel nativo de actividad ornitina descarboxilasa, en donde la actividad ornitina descarboxilasa creciente es obtenida por medio de la sobre expresión de un gen que codifica a ornitina descarboxilasa con eficiencia transcripcional y translacional creciente, y la 1, 4- butandiamina producida en dichos microorganismos por biotransformación es excretada en un caldo de fermentación, y es recuperada del caldo de fermentación. De conformidad con la presente invención, se proporciona así un proceso bioquímico mejorado para la síntesis de 1, 4- butandiamina, y la 1, 4- butandiamina resultante es excelentemente adecuada como material crudo, por ejemplo, para la producción de poliamida-4, 6.
Como se previo en la presente solicitud de patente, el término "síntesis bioquímica" (un término que en el contexto de esta solicitud de patente, alternativamente, es mencionado como "biotransformación") incluye no solamente procesos que involucran, junto a un número de etapas de reacción puramente químicas- una o más reacciones biocatalíticas usando células enteras de cepas de producción adecuadas, sino también procesos puramente bioquímicos usando células enteras de cepas de producción adecuadas. Dichos procesos puramente bioquímicos, respectivamente, son mencionados como fermentaciones en caso de que la síntesis bioquímica comience desde una fuente de carbono adecuada, o son mencionadas como fermentaciones precursoras en caso de que la biosíntesis comience desde un producto intermediario que tengan ya un esqueleto de carbono a partir del cual pueda obtenerse la molécula objetivo a ser sintetizada. Los procesos pueden ser. llevados a cabo ya sea bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas . Las reacciones biocatalíticas en la síntesis bioquímica de la presente invención pueden ser llevadas a cabo in vivo o in vitro. Generalmente, los proceso in vivo son procesos llevados a cabo cuando se usan células vivientes (el término "células vivientes" también incluye las denominadas células en reposo) ; los procesos in vitro, por otro lado, son usualmente llevados a cabo usando lisados celulares o enzimas purificadas (parcialmente) . Las síntesis bioquímicas de acuerdo a la presente invención se llevan a cabo en un microorganismo.
Esto puede hacerse usando células enteras de cepas de producción adecuadas, pero también pueden llevarse a cabo usando células permeabilizadas; la diferenciación entre in vivo e in vitro, no obstante, no tiene mucho sentido para procesos que se llevan a cabo con células permeabilizadas o células huéspedes inmovilizadas. Será evidente, no obstante, que etapas biocatalíticas individuales a partir del proceso de la invención, cuando se llevan a cabo, por ejemplo, usando, enzimas inmovilizadas, etc. se consideran equivalentes a dichas etapas en la síntesis bioquímica como se quiere decir en el contexto de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las ornitina descarboxilasas (es decir, enzimas que tienen actividad de descarboxilación de ornitina, u ODCs) , son enzimas clasificadas en la clase E. C. 4. 1. 1. 17. El nivel de actividad de una ornitina descarboxilasa, si es sobre producida, puede fácilmente ser comparada con el nivel nativo (es decir no sobre producida) de actividad ornitina descarboxilasa bajo condiciones estándares (a 37 °C en la presencia de ornitina y PLP) en extractos libres de células usando el equipo para la detección de dióxido de carbono Sigma Diagnostic (Sigma) ; el ensayo descrito en Osterman, A. L. y colaboradores, 1994, Biochemistry 33, página 13662-13667. Por consiguiente, el experto, puede establecer fácilmente si la ODC usada tiene un nivel creciente de actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) basada en la eficiencia translacional y transcripcional con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa en el microorganismo usado por determinación del contenido de proteínas, o por determinación del nivel de ARN. Se describen varios procedimientos estándares para la determinación del contenido de proteínas, por ejemplo colorimétricos así como también métodos espectroscópicos, en Lottspeich y Zorbas, Bioanalitik, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 (1998), Capítulos 3, 5, 21, 22 y 24. Métodos para la determinación del nivel de proteínas así como también el nivel de ARN, por ejemplo hibridización Northern, RT-PCR, y muchos otros métodos, se describen en J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, 2a. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989) . Muchos otros procedimientos estándares, sin embargo, son conocidos por el experto en el campo analítico y no necesitan ser mencionados en la presente.
Las ornitinas descarboxilasas adecuadas que pueden ser usadas en el proceso de la invención, son todas enzimas y mutantes de las mismas, que son capaces de descarboxilar ornitina. Cualquiera de dichas enzimas pueden ser usadas en el proceso de la invención, a un nivel creciente de actividad, es decir, en forma sobre producida por medio de la sobre expresión de un gen de ornitina descarboxilasa con eficiencia translacional y/o transcripcional creciente. Además, se indica que el término "nivel creciente de actividad" como se usa en la presente para cualquier actividad enzimática mencionada específicamente está también previsto abarcar situaciones tales donde la actividad de dicha actividad enzimática, por ejemplo una ornitina descarboxilasa, no está presente en todas las fuentes naturales del microorganismo en donde la reacción está teniendo lugar, sino que es introducida en él intencionalmente por modificación genética con eficiencia translacional y transcripcional creciente. Como se mencionó anteriormente, en la síntesis bioquímica de 1, 4- butandiamina cualquier enzima de ODC puede ser usada, cuya actividad de ODC creciente, es obtenida por medio de la sobre expresión de un gen que codifica a ODC con eficiencia translacional y transcripcional creciente. Preferiblemente, la eficiencia translacional y/o transcripcional creciente. Preferiblemente, la eficiencia translacional y/o transcripcional creciente es obtenida por medio del uso de un promotor regulado fuerte, preferiblemente por medio del uso de un promotor inducible fuerte. Mayormente se prefiere que la eficiencia translacional y/o transcripcional creciente sea obtenida por medio del uso de un promotor fuerte inducible por isopropil-ß-D- tiogalactopiranosida (IPTG) . Se describen los promotores fuertes adecuados en J. Sambrook, E. F. Fritsh y T. Maniatis, Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, 2a. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-97069-309-6 (1989) . En particular, la eficiencia translacional y/o transcripcional creciente es obtenida por medio del uso de un promotor seleccionado del grupo que consiste de los promotores T7, T5, ptac, y plac. Será obvio para el experto en la materia, que la selección óptima del promotor será dependiente del huésped a ser usado y las condiciones de reacción a ser aplicadas. En una modalidad muy preferida de la invención, el gen que codifica a ornitina descarboxilasa tiene un Sitio de Enlace Ribosómico (RBS, Ribosomal Binding Site) , localizado desde la extremo 3' hacia el 5' del mARN de la región codificadora de dicho gen cuyo RBS es adaptado para lograr mejor reconocimiento del modelo de ARN por medio de los ribosomas. La adaptación del RBS puede hacerse por medio de cualquier método conocido por los expertos, y tendrá en cuenta propiedades específicas del huésped usado, etc. Mayormente se prefiere que el gen que codifica a ornitina descarboxilasa sobre expresada, sea un gen speF o speC de ornitina descarboxilasa (cada uno de los cuales pertenecientes a E.C.4.1.1.17). Hasta ahora SpeC ha sido investigado en la literatura mucho más que SpeF. Más sorprendentemente, no obstante, y más preferiblemente, se lograron mejores resultados de acuerdo a la presente invención cuando es un gen speF de ornitina descarboxilasa . Se prefiere particularmente que el gen que codifica a ornitina descarboxilasa sobre expresado usado en el proceso de acuerdo a la invención sea un gen speF o speC de ornitina descarboxilasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia , Shigella , Salmonella, Yersinia , y Shewanella . El speF de ornitina descarboxilasa es una ornitina descarboxilasa inducible; speC de ornitina descarboxilasa es una ornitina descarboxilasa constitutiva . Más preferiblemente, el gen que codifica a ornitina descarboxilasa sobre expresado es un gen de ornitina descarboxilasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Shigella flexneri , Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, y Shewanella oneidensis . Mayormente se prefiere que, el gen que codifica a ornitina descarboxilasa sobre expresado sea speF originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Salmonella typhimurium, y Shewanella oneidensis . Con respecto a los resultados con sobre expresión del gen speC que codifica a ornitina descarboxilasa constitutivo, los mejores resultados de acuerdo a la presente invención se cree que se lograron cuando se usó speF. De acuerdo a la presente invención todas las ornitinas descarboxilasas que tengan suficiente, es decir, al menos 30 %, más preferiblemente al menos 45 %, y más preferiblemente al menos 65 % de identidad con la ODC a partir de la enzima de referencia de E. coli pueden ser usadas, y son capaces de catalizar la reacción de descarboxilación de ornitina. Se conocen muchas ODCs que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con la enzima de referencia de E. coli . Conforme a la presente invención, en particular, puede usarse toda ornitina descarboxilasa que tenga suficiente, es decir al menos 30 %, más preferiblemente al menos 45 %, y más preferiblemente al menos 65 % de identidad con la ODC desde la enzima de referencia de E. coli, y son capaces de catalizar la reacción de descarboxilación de ornitina. Se conocen muchas ODCs que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con la enzima de referencia de E. coli. La determinación de los porcentajes de identidad con enzimas de referencia puede efectuarse por medio de métodos conocidos por los expertos , por ejemplo usando la secuencia de proteína de la enzima de referencia como una "secuencia de consulta" para efectuar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros elementos de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden ser efectuadas usando programas BLAST (versión 2.2) usando los parámetros faltantes del programa respectivo. Ver http : //www. nebí . nlm. nih . gov. De acuerdo a la presente invención, así se proporciona un proceso bioquímico mejorado para la síntesis de 1, 4- butandiamina y la 1, 4- butandiamina es excelentemente adecuada como material crudo para la producción de poliamida 4,6 y/o otras poliamidas. Es claro que, en el contexto de la presente invención, cualquier gen que sea homólogo con cualquiera de los genes que codifican para la ornitina descarboxilasa anteriormente mencionada y que codifica para enzimas que tengan actividad ornitina descarboxilasa suficientemente comparable a la ornitina descarboxilasa mostrada, se considera un equivalente de éste y adecuado en el proceso de la invención. Dichos genes equivalentes pueden obtenerse adecuadamente por medio de cualquier estrategia de clonación apropiada conocida para el experto, por ejemplo, por medio de los métodos descritos en la parte experimental de la presente. Alternativamente, dichos genes de ornitina descarboxilasa equivalentes pueden también obtenerse por construcción expresa. En una modalidad preferida de la presente invención, el proceso para la síntesis bioquímica de 1,4-butandiamina se lleva a cabo en un microorganismo en el cual, adicionalmente a la actividad ODC creciente, también se obtiene una actividad enzimática creciente para al menos dos enzimas diferentes por medio de sobre expresión ya sea de (i) un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa (perteneciente a E. C.4.1.1.19) y un gen speB que codifica a agmatinasa (perteneciente a E.C.3.5.3.11; también mencionado como gen que codifica a agmatina ureahidrolasa) ; o (ii) un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa (perteneciente a E.C.4.1.1.19), y un gen agu? que codifica a agmatina iminohidrolasa (perteneciente a E.C.3.5.3.12, también mencionado como gen que codifica a agmatina desiminasa) , y un gen aguB que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa (perteneciente a E. C. 3.5.1.53), y opcionalmente también un gen speB que codifica a agmatinasa (perteneciente a E.C.3.5.3.11) . La sobre expresión como se quiere decir en la presente para estas actividades enzimáticas incrementadas adicionalmente, puede ser lograda por medio de cualquier método conocido por el experto, por ejemplo por incremento de la eficiencia translacional y/o transcripcional del gen respectivo, pero también por cualquiera de otros métodos conocidos tales como incrementando el número de copias genéticas, o incrementando la estructura o la actividad endógena de las enzimas por medio de mutaciones, o usando enzimas desreguladas. Como se quiere decir en la parte (i) de la modalidad preferida adicional mencionada anteriormente en la presente, la combinación de SpeA y SpeB está prevista para representar cualquier combinación funcional (ya sea en una proteína de fusión combinada, o como actividades enzimáticas separadas) de SpeA y SpeB. De hecho, esta combinación también puede ser designada como SpeAB. La parte (ii) de la presente representa, que en dichas combinaciones de SpeA y SpeB, la parte SpeB por sí misma puede ser reemplazada por cualquier combinación funcional (ya sea en una proteína de fusión combinada, o como actividades enzimáticas separadas) de AguA y AguB . Janowitz y colaboradores, FEBS Letters 544 (2003) , 258-261, han descrito que AguA de agmatina desaminasa está involucrado en la trayectoria de arginina descarboxilasa en vegetales superiores. Adicionalmente es sabido, de Nakada y colaboradores, Microbiology, 149 (2003) , 707-714, que las conversiones catalizadas por SpeB también pueden ser catalizadas por enzimas que se encuentran en vegetales, es decir por la acción combinada de AguA de agmatina desaminasa y de AguB de N-carbamoilputrescin amidohidrolasa. Por consiguiente, en vez de, o igualmente en combinación con, SpeB en el contexto de la presente invención también AguR y AguB pueden ser usadas. Las fuentes para dichos genes aguA y aguB podrían ser arabidopsis thaliana y Lycopersicon esculentum, pero pueden encontrarse genes comparables en mutantes de Pseudomonas aeroginosa . Es claro que, en el contexto de la presente invención, cualquier gen que sea homólogo con cualquiera de los genes que codifican para las arginina descarboxilasas anteriormente mencionadas, respectivamente agmatinasas, o agmatina iminohidrolasas o N-carbamoilputrescin amidohidrolasas, y que codifiquen para dichas enzimas respectivas que tengan actividad arginina descarboxilasa (respectivamente agmatinasa, agmatina iminohidrolasa o N-carbamoilputrescin amidohidrolasa) suficientemente comparable a las enzimas respectivas - como puede ser el caso - se considera un equivalente de éstos y adecuado en esta modalidad preferida del proceso de la invención, es adecuado en esta modalidad preferida del proceso de la invención. Dichos genes equivalentes pueden ser obtenidos adecuadamente por medio de cualquier estrategia de clonación adecuada conocida por el experto, por ejemplo, por medio de los métodos descritos en la parte experimental de la presente. Alternativamente, dichos genes equivalentes también pueden ser obtenidos por medio de construcción expresa. Por consiguiente, en la modalidad preferida del proceso de la presente invención también están siendo usadas combinaciones adicionales de genes sobre expresados, es decir genes que codifican para (i) arginina descarboxilasa y agmatinasa, o (ii) arginina descarboxilasa y agmatina iminohidrolasa y N-carbamoil putrescin amidohidrolasa, y opcionalmente agmatinasa. En esta modalidad preferida adicional de la invención, el gen que codifica a arginina descarboxilasa sobre expresado es preferiblemente un gen speA de arginina descarboxilasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia , Shigella , Salmonella, Yersinia , Pasteurella , y Neisseria . Más preferiblemente, el gen que codifica a arginina descarboxilasa sobre expresado es un gen speA de arginina descarboxilasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Shigella flexneri, Salmonella entérica , Yersinia pestis, Pasteurella multocida, y Neisseria meningitidis. De acuerdo a la presente invención, en particular, pueden ser usadas todas las argininas descarboxilasas que tengan suficiente, es decir, al menos 30 %, más preferiblemente al menos 45 %, y más preferiblemente al menos 65 % de identidad con la arginina descarboxilasa de la enzima de referencia de E. coli, y que sean capaces de catalizar la reacción de arginina descarboxilasa. Se conocen muchas argininas descarboxilasas que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con la enzima de referencia de E. coli. En esta modalidad preferida adicional de la invención, el gen que codifica a agmatinasa sobre expresado es un gen speB de agmatinasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio y Neisseria . Más preferiblemente, el gen que codifica a agmatinasa sobre expresado es un gen speB de agmatinasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Salmonella entérica , Proteus mirabilis, Photorhabdus luminiscens , Vibrio Cholerae, y Neisseria meningitidis . De acuerdo a la presente invención, en particular, pueden ser usadas todas las agmatinasas que tengan suficiente, es decir al menos 30 %, más preferiblemente al menos 45 %, y más preferiblemente al menos 60 % de identidad con la agmatinasa de la enzima de referencia de E. coli, y sean capaces de catalizar la reacción de agmatinasa. Se conocen muchas agmatinasas que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con la enzima de referencia de E. coli. . En esta modalidad preferida adicional de la invención, además el gen que codifica a agmatina iminohidrolasa sobre expresado y/o el gen que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa sobre expresado es preferiblemente un gen ag/uA de agmatina iminohidrolasa y/o un gen aguB de N-carbamoilputrescin amidohidrolasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Pseudomonas , Streptococcus , Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis , Novosphingobium, y Bacillus. Más preferiblemente, el gen que codifica a agmatina iminohidrolasa sobre expresado y/o el gen que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa es un gen aguA de agmatina iminohidrolasa y/o un gen aguB de N-carbamoilputrescin amidohidrolasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus mutans, Streptococcus avermitilis, Azotobacter vinelandii , Arabidopsis thaliana , Novosphingobium aromaticivorans, y Bacillus cereus. De acuerdo a la presente invención, en particular, pueden usarse todas las agmatina iminohidrolasas y/o N-carbamoilputrescin amidohidrolasas, que tengan suficiente, es decir al menos 30 %, y más preferiblemente al menos 40 % de identidad con la agmatina iminohidrolasa y/o N-carbamoilputrescin amidohidrolasa de la enzima de referencia de Pseudomona, y sean capaces de catalizar la reacción de agmatina aminohidrolasa, de N-carbamoilputrescin amidohidrolasa, respectivamente. Se conocen muchas agmatina iminohidrolasas y/o las N-carbamoilputrescin amidohidrolasa que tienen dicho nivel relativamente alto de identidad con la enzima de referencia de Pseudomona . Se prefiere que el proceso conforme a la invención sea llevado a cabo mientras que se asegure un nivel intracelular creciente de ornitina. Esto puede, por ejemplo, lograrse por alimentación externamente de ornitina. El proceso de la invención puede ser llevado a cabo en cualquier organismo huésped. Los huéspedes pueden ser seleccionados de los grupos de organismos de producción (o células) , generalmente conocidos por el experto en biosíntesis. Dichos organismos pueden ser de origen eucariótico, o - como se prefiere más - de origen procariótico. Las células eucarióticas, por ejemplo, pueden ser células de vegetales y de hongos, y de varios otros grupos, dichos otros grupos colectivamente son mencionados como "Protista" . Se prefiere particularmente, que el proceso de acuerdo a la invención se lleve a cabo en un organismo huésped seleccionado del grupo que consiste de Saccharomyces sp. , Bacillus sp. , Corynebacterium sp. , Escherichia coli sp. , y Pichia sp. En el proceso de la invención, se prefiere especialmente que el microorganismo a ser usado como un huésped sea capaz de producir los aminoácidos ornitina y/o arginina. Para la mayoría de los microorganismos naturales este requerimiento es satisfecho porque usualmente dicha capacidad está disponible en todas las cepas de tipo salvaje, ya que arginina representa un aminoácido esencial. De estas especies, se prefieren Escherichia sp . porque son fáciles de manejar por manipulación genética a fin de proporcionar cepas con las actividades enzimáticas sobre expresadas deseadas. Además, Escherichia sp. ya en la naturaleza contiene casi cada una de las actividades enzimáticas anteriormente mencionadas (es decir, aparte de los genes agu a partir de vegetales) , de modo que la mayoría e los genes sobre expresados pueden ser usados como genes homólogos. También Corynebacterium sp. (se piensa que carece de una ornitina descarboxilasa natural) es particularmente preferida porque es una cepa de producción de glutamato adecuada que puede ser manejada fácilmente en procesos de fermentación. En el proceso de la presente invención el glutamato es un precursor muy adecuado. Por consiguiente, es preferible que el proceso sea llevado a cabo en una cepa huésped capaz de formación de glutamato (por ejemplo, Corynebacterium glutamicum) . Mejores resultados se han logrado cuando el proceso conforme a la invención se lleva a cabo en un organismo huésped del grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp. y Escherichia sp. En donde, aparte de la actividad de una ornitina descarboxilasa, arginina descarboxilasa, al menos están presentes las actividades enzimáticas de agmatinasa o agmatina iminohidrolasa y N-carbamoil putrescin amidohidrolasa en el microorganismo huésped, a un nivel de actividad creciente con respecto al nivel nativo de dicha actividad enzimática que es homologa en el organismo huésped. Será claro que el proceso de la invención es preferiblemente llevado a cabo bajo condiciones de reacción que son también usuales como condiciones de fermentación. Por consiguiente, el proceso puede ser llevado a cabo de manera discontinua pero también, si así se desea, de alimentación discontinua. Puede ser conveniente asegurar que el organismo usado como organismo huésped tiene, o está provisto de un sistema exportador adecuado para la 1, 4- diaminobutano formado. Preferiblemente dicho sistema exportador es uno nativo. La presente invención, por supuesto, también abarca a todos los vectores, plásmidos y huéspedes portadores de un nivel creciente de una o más de las otras actividades enzimáticas anteriormente mencionadas de conformidad con las reivindicaciones anexas. La invención será elucidada ahora por medio de algunos resultados experimentales, por medio de los cuales no se pretende limitar el alcance de la invención. PARTE EXPERIMENTAL Procedimientos Generales Se aplicaron procedimientos estándares para todas las manipulaciones de ADN (Sambrook, J. y colaboradores (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) . Se amplificó el ADN a partir del ADN cromosómico de LJ110 de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores (2000), J. Bacteriol. 182, 4443-4452), si no se indica de otra manera. Se efectuó la amplificación por PCR usando las enzimas de lectura de prueba SAWADY Pwo-ADN-polimerasa (Peqlab Biotechnologie GmnH, Erlangen, Alemania) o Platinum Pfx ADN polimerasa (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) siguiendo el protocolo de fabricación, mientras que la verificación de las cepas construidas se llevó a cabo por PCR de colonias utilizando la Taq polimerasa READYMIX (Sigma, Taufkirchen, Alemania) . Los sitios de restricción para clonación subsecuente así como también mutaciones adicionales fueron introducidos con oligonucleótidos adquiridos de MWG-Biotech (Ebersberg, Alemania) . Los fragmentos de ADN fueron purificados con el Equipo MinElute Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La preparación del ADN plásmido se logró por medio de la utilización del Equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemania) . La verificación de los plásmidos construidos se llevó a cabo por medio de análisis de restricción y subsecuente secuenciación (Agowa, Berlín, Alemania) . Construcción de plásmidos (i) Construcción del plásmido pDAB3 (pJF119EH- = eCnRBS ) El gen speC que codifica a ornitina descarboxilasa (constitutiva, biosintética) de LJ110 de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) fue clonado en el vector de expresión pJF119EH (Fürste, J. P. y colaboradores (1986), Gene 48, 119-131), que permite una expresión genética fuerte basada en el control transcripcional bajo el promotor de tac inducible por Isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (IPTG) ' y el sistema represor de lac (laclQ) . Por consiguiente, el gen codificador speC fue clonado con RBS, codón de inicio y de detención originales . El fragmento de ADN que contiene speCnRBs de 2235 pb fue amplificado a partir de ADN cromosómico de LJ110 de E. coli (número de acceso AE000379; nucleótidos 2650-4867) usando los siguientes oligonucleótidos: 5' -GAG CTC TAG ACC AGT TTG ACC CAT ATC T-3' [SEC ID NO: 1] (Mutaciones en negrillas, sitio de restricción de Xpal en cursivas) y 5' -TTT TGC ATG CTT ACT TCA AC CAT AAC CGT AC-3' [SEC ID NO: 2] (Mutaciones en negrillas, sitio de restricción de Sphl en cursivas) Después de modificación terminal con las endonucleasas Xjbal y SpM, el producto de PCR fue ligado en el plásmido pJF119EH, el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , se seleccionaron transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB3 /pJF119EH-speCnRB?, 7491 pb) obtenido, por análisis de restricción y subsecuente secuenciación. (ii) Construcción del plásmido pDAB4 (pJFH9EH-speCaRBs) El gen speC de LJ110 de E. coli que codifica a ornitina descarboxilasa (constitutiva, biosintética) (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) fue clonado en el vector de expresión pJF119EH (Fürste, J. P. y colaboradores 1986), Gene 48, 119-131), que permite una expresión genética fuerte basada en el control transcripcional bajo el promotor de tac inducible por Isopropil-ß-D-Tiogalactopiranosida (IPTG) y el sistema represor de lac (laclQ).Por consiguiente, el gen codificador fue clonado con el codón de inicio y de detención originales. Puesto que, no conservó el sitio de enlace ribosómico (RBS) podría ser determinado por speC utilizando estudios in silico, se introdujo el RBS optimizado de 7 pb desde el extremo 5 ' hacia el extremo 3 ' en el sentido de la hebra de ADN dupleto del codón de inicio de speC fue adaptado a la secuencia concensus de E. coli por mutagénesis específica puntual. El fragmento de ADN que contenía speCaRBs de 2235 pb fue amplificado a partir del ADN cromosómico de LJllO de E. coli (número de acceso AE000379; nucleótidos 2650-4867) usando los siguientes oligonucleótidos: 5' -GAG CTC TAG ACC AGT TTG AGG AAT ATC T-3' [SEC ID NO: 3] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de Xbal en cursivas) y 5' -TTT TGC ATG CTT ACT TCA AC CAT AAC CGT AC-3' [SEC ID NO: 2] ('Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de Sphl en cursivas) . Después de modificación terminal con las endonucleasas XJbal y Sphl, el producto de PCR fue ligado en el plásmido pJF119EH, el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB4 (pJF119EH-speC, 7491 pb) obtenido por análisis de restricción y subsecuente secuenciación . (iii) Construcción del plásmido pDAB2 (pJF119EH-speF) El gen speF de LJllO de E. coli que codifica a ornitina descarboxilasa (inducible, biodegradable) (Zeppenfeld y colaboradores, ver procedimientos generales) fue clonado en el vector de expresión pJF119EH (Fürste, J. P. y colaboradores (1986), Gene 48, 119-131). Este vector permite una producción de proteínas de alto nivel con base en el control transcripcional de genes clonados bajo el promotor de tac inducible por Isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (IPTG) y el sistema represor de lac ( laclQ) . Para la construcción del plásmido de expresión pDAB2 (pj F119EH-speF) el gen codificador speF fue clonado con RBS (sitio de enlace ribosómico) , codón de inicio y de detención originales. El fragmento de ADN que contenía speF de 2247 pb fue amplificado a partir de ADN cromosómico de LJllO de E. coli (número de acceso AE000172; nucleótidos 10242-12468) usando los siguientes oligonucleótidos: 5' -GAC CTG CTG GTA CCT AAA ATA AAG AGA TGA AA-3' [SEC ID NO: 4] (Mutaciones en negrilla, sitios de restricción de Kpnl en cursivas ) y 5' -TCG ATC TAG ACT GAC TCA TAA TTT TTC CCC-3' [SEC ID NO: 5] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de X¿>al en cursivas) El fragmento fue modificado terminalmente con las endonucleasas de restricción .Kp.nl y KbaL y ligadas en el vector de expresión pJF119EH, el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , se seleccionaron transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Después de preparación, el plásmido pDAB2 (pJF119EH-speF, de 7502 pb) obtenido, fue verificado por análisis de restricción y subsecuente secuenciación. (iv) Construcción del plásmido pDAB7 (pJF119EH-speAB) El gen speA que codifica a arginina descarboxilasa así como también speB que codifica para la agmatinasa de LJllO de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) fueron clonados en el vector de expresión pJF119EH (Fürste, J. P. y colaboradores 1986), Gene 48, 119-131, que permite una producción de proteínas de nivel alto basada en el control transcripcional de genes clonados bajo el promotor tac inducible por isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (IPTG) y el sistema represor de lac (lacIQ) . De esta manera se mantuvieron la estructura del operón original de los genes así co o también RBS, el codón, de inició y de detención. El fragmento de ADN que contenía speAB de 3079 pb fue amplificado a partir del ADN cromosómico de LJllO de E. coli (número de acceso AE000377; nucleótidos 1190 -4247) usando los siguientes oligonucleótidos: 5' -AC CTT TCT AGA ATA ATT TGA GGT TCG CTA TG-3' [SEC ID NO: 6] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de Xbal en cursivas) y 5' -CAT GGC ATG CGG TGC TTA CTC G-3' [SEC ID NO: 7] (Mutaciones en negrilla, sitio de restricción de Sphl en cursivas) . Después de modificación terminal con las endonucleasas de restricción Xjbal y Spiíl, el fragmento de ADN fue ligado en el plásmido de expresión pJFH9EH, el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB7 (pJF119EH-speAB, 8339 pb) obtenido, por análisis de restricción y subsecuente secuenciación. (v) Construcción del plásmido pDAB8 (pJF119EH-speF-speAB) A fin de permitir la producción en paralelo del speF de ornitina descarboxilasa, el speA de arginina descarboxilasa y los genes speB, speAB de agmatinasa de LJllO de E. coli (Zeppenfeld y colaboradores, ver procedimientos generales) fueron clonados en el vector de expresión de speF en pDAB2 (ver (iii) ) . Por digestión del plásmido pDAB7 (ver (iv) ) con las endonucleasas de restricción X-bal y Spnl los 3067 pb que comprenden el operon del gen speAB fueron separados y ligados en el plásmido pDAB2 que contiene speF (ver (iii) ) , el cual fue cortado de la misma manera. Después de transformación en células DH5a de E. coli (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) , fueron seleccionados transformantes sobre placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Después de preparación, se llevó a cabo la verificación del plásmido pDAB8 obtenido (pJF119EH-speAB, 10547 pb) que permite la producción de speFAB en paralelo por análisis de restricción. Ejemplo 1: Mejoramiento de la producción de DAB por sobre expresión de genes que codifican a ornitina descarboxilasa con eficiencia translacional y/o transcripcional creciente. Ejemplo 1.1. Producción de 1, 4- butandiamina vía la - sobreproducción de ornitina descarboxilasas (matraz vibrador) La influencia de la sobre expresión de los genes speF o speC que codifican a ornitina descarboxilasa con eficiencia translacional y/o transcripcional creciente sobre la producción de DAB fue investigada en la cepa huésped LJllO de E. coli (Zeppenfeld, y colaboradores, ver procedimientos generales) que porta el plásmido pDAB2 (ver (iii)), o pDAB3 (ver (i)), o pDAB4 (ii) . Estas cepas fueron probada en experimentos con matraz vibrador utilizando medio salino mínimo que consiste de MgS04.7H20 (300 mg/l), CaCl2.2H20 (15 mg/l), KH2P04 (3 g/1), K2HP0 (12 g/1), NaCl (100 mg/l), (NH4)2S04 (5 g/1), citrato de Na.3H20 (1 g/1), FeS04.7H20 (75 mg/l), Clorhidrato de tiamina (vitamina Bx) (5 mg/l) así como también los elementos en huellas Al2 (S0 ) 3.18H20 (3 mg/l), CoCl2.6H20 (1.05 mg/l), CuS04.5H20 (3.75 mg/l), H3B03 (0.75 mg/l), MnCl2.4H20 (30 mg/l), Na2Mo04.2H20 (4.5 mg/l), NiS04.6H20 (3 mg/l) y ZnS04.7H20 (22.5 mg/l). Una solución madre de glucosa (500 g/1) fue autoclaveado separadamente y añadido al medio esterilizado hasta una concentración final de 10 g/1. Un pre-cultivo de medio salino mínimo que contenía 100 mg/l de ampicilina fue inoculado con 1 -5 µl/ml de solución madre e incubado a 33 °C, 180 rpm por 16 horas hasta un OÜ62o de 2. 5 ml de este cultivo fue subsecuentemente usado para inoculación del cultivo principal que consiste de 50 ml del mismo medio, el cual fue incubado por 24 horas a 33 °C y 180 rpm. Ya que las células alcanzaron un OD620nm de 1.5 (después de ~ 7 horas) , la expresión genética fue inducida por la adición de 10 µM de IPTG. A fin de observar la producción de DAB dependiente del tiempo, se tomaron muestras a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo. Después de separación de las células utilizando centrifugación, se analizó el sobrenadante diluido por HPLC. En este punto, se detectaron las aminas contenidas como derivados de orto-ftaldialdehido (OPA) a 230 nm en una instrumento Hewlett-Packard Series 1100, usando una columna en fase invertida C18 (Nucleosil 120-5 C18, Macherey & Nagel, Duren, Alemania) equilibrado a 50 % de regulador B (regulador A, acetato de sodio 0.1 M pH de 7.2; regulador B metanol). Para separación, se aplicó el siguiente gradiente: 1 - 7 min de gradiente lineal a partir de 50 % a 75 % de regulador B con un gasto de 0.5 ml/min, 7-13 min de 75 % a 85 % de regulador B con un gasto de 0.5 ml/min, 13 - 14.5 min de 85 % a 50 % de regulador B con un gasto de 1 ml/min, 14.5 - 17 min de 50 % de regulador B con un gasto de 1 ml/min y 17 - 20 min al 50 % de regulador B con un gasto de 0.5 ml/min. Por medio de la utilización de substancias estándares para calibración, podrían ser determinadas las siguientes concentraciones de DAB (ver la Tabla 1) y fueron verificadas por espectroscopia de NMR. Tabla 1. Formación de DAB utilizando sobreproducción de ODC en E. coli Ejemplo 1.2. Producción de 1, 4-butandiamina vía la sobre producción de ornitina descarboxilasa en cultivos de alimentación discontinua Se investigó el potencial de producción de DAB fermentativa bajo condiciones de alimentación discontinua por la utilización de la cepa LJllO pDAB2 productora de DAB de alto nivel en un reactor biológico de Labfors (Infors, Einsbach, Alemania) . Puesto que, la cepa que produce DAB no es dependiente de aminoácido para su crecimiento, se aplicó un protocolo desarrollado para cultivos limitados en fosfato a fin de restringir el crecimiento celular. Por consiguiente, se usó un medio salino mínimo limitado en fosfato, que consiste de MgS04.7H20 (3 g/1), CaCl2.2H20 (15 mg/l), KH2P04 (400 mg/l), NaCl (1 g/1), (NH4)2S04 (5 g/1), así como también los elementos en huellas Al2 (S04) 3.18H20 (3 mg/l), CoCl2.6H20 (1.05 mg/l), CuS04.5H20 (3.75 mg/l), H3B03 (0.75 mg/l), MnCl2.4H20 (30 mg/l), Na2Mo04.2H20 (4.5 mg/l), NiS04.6H20 (3 mg/l) y ZnS04.7H20 (22.5 mg/l). Después de autoclavear, se añadieron citrato de Na.3H20 (1.5 g/1), FeS04.7H20 (112.5 mg/l), HCl de tiamina (vitamina Bl) (7.5 mg/l; ampicilina (100 mg/l) y glucosa (10 g/1) bajo condiciones estériles en el reactor biológico. Un pre-cultivo de medio salino mínimo (ver 1.1) que contenía 100 mg/l de ampicilina fue inoculado con 1 -5 µl/ml de solución madre e incubado a 33 °C, 180 rpm por 16 horas hasta una densidad óptica de 620 nm de 2. Después este cultivo fue subsecuentemente usado para inoculación 1:10 del cultivo principal que consiste de 2 litros de medio salino mínimo limitado en fosfato. Durante el cultivo, la temperatura se conservó constante a 33 °C y el pH fue controlado a 6.8 ± 0.1 por medio de la adición de KOH 5N. Durante el crecimiento, se usó una velocidad de agitación de 1500 rpm. A fin de evitar la limitación de oxígeno, el flujo de gas en el recipiente fue aumentado de 2.5 - 10 l/min durante el cultivo. Se añadió en antiespumante Dehysan cuando fue necesario. Las células fueron inducidas con 50 µM de IPTG a una ODd2o de 5 seguido por una alimentación combinada de glucosa (500 g/1) sulfato de amoníaco (200 g/1, mientras que la velocidad de alimentación fue adaptada a fin de recibir concentraciones estables de 10 g/1 de glucosa y 1.5 g/1 de amoníaco. Dos horas después de inducción, se inició la alimentación de fosfato consistió de 18 g/1 de KH2P04 con una velocidad de alimentación de 7 ml/h por 8 horas. De esta manera, el crecimiento celular podía ser restringido a una OD620 de ~ 50. A fin de observar la producción de DAB dependiente del tiempo, se tomaron muestras a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo. Después de separación de las células utilizando centrifugación, se analizó el sobrenadante por HPLC (ver 1.1) y se determinó una cantidad de DAB de 5.1 g/1 (0.403 g/g de BDW; BDW significa Peso seco de biomasa (Biomass Dry Weight) y se verificó por espectroscopia de RMN. Ejemplo 2. Producción de 1, 4- butandiamina en forma discontinua comenzando desde ornitina así como también arginina (matraz vibratorio) Para demostrar el mejoramiento adicional de la formación de DAB comenzando desde ornitina así como también arginina, se investigó la influencia de la sobre producción combinada del SpeF de ornitina descarboxilasa (con eficiencia transcripcional creciente) , el SpeA de arginina descarboxilasa y el SpeB de agmatinasa. Por consiguiente, de llevaron a cabo cultivos en matraz vibratorio en medio salino mínimo (ver 1.1) por medio de la utilización de la cepa huésped de E. coli LJllO (Zeppenfeld, y colaboradores, ver los procedimientos generales) que porta el plásmido pDAB8 (ver (v) ) . Por consiguiente se inoculó un pre-cultivo de medio salino mínimo que contenía 100 mg/l de ampicilina con solución madre de 1 - 5 µl/ml y se incubó a 33 °C, 180 rpm por 16 horas a una densidad óptica a 620 nm de 2. 5 ml de este cultivo se usaron subsecuentemente para inoculación del cultivo principal que consiste de 50 ml del mismo medio, el cual fue incubado por 24 horas a 33 °C y 180 rpm. Después de que las células alcanzaron una OD62on de 1.5 (después de ~ 7 horas), se indujo la expresión genética por medio de la adición de 10 µM de IPTG. A fin de observar la producción de DAB dependiente del tiempo, se tomaron muestras a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo. Después de separación de las células utilizando centrifugación, se analizó el sobrenadante por HPLC (ver 1.1). Por medio de la utilización de substancias estándares para calibración, pudieron determinarse las siguientes concentraciones de DAB (ver la Tabla 3) . Tabla 3. Formación de DAB comenzando desde ornitina asi como también arginina en E . coli

Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Proceso para síntesis bioquímica de 1, 4-butandiamina en un microorganismo que tenga un nivel creciente de una actividad ornitina descarboxilasa (actividad ODC creciente) con respecto al nivel nativo de la actividad ornitina descarboxilasa, caracterizado la actividad ornitina descarboxilasa creciente es obtenida por medio de la sobre expresión de un gen que codifica a ornitina descarboxilasa con eficiencia translacional y transcripcional creciente, y porque la 1,4- butandiamina producida en el microorganismo es excretada en un caldo de fermentación, y es recuperada a partir del caldo de fermentación .
2. Proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la eficiencia transcripcional y/o translacional creciente es obtenida por medio del uso de un promotor regulado, fuerte, preferiblemente por medio del uso de un promotor inducible fuerte.
3. Proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la eficiencia translacional y/o transcripcional creciente es obtenida por medio del uso de un promotor fuerte inducible por isopropil-ß-D-tiogalactosida (IPTG) .
4. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la eficiencia transcripcional y/o translacional creciente es obtenida por medio del uso de un promotor seleccionado del grupo que consiste de los promotores T7, T5, ptac y plac.
5. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el gen que codifica a ornitina descarboxilasa tiene un Sitio de Enlace Ribosómico (RBS) localizado desde el extremo 3' a 5' del mARN de la región codificadora de dicho gen en el cual RBS está adaptada para lograr mejor reconocimiento del modelo de ARN por los ribosomas.
6. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el gen que codifica a ornitina descarboxilasa sobre expresado es un gen speF o speC de ornitina descarboxilasa (cada uno perteneciente a E.C. 4.1.1.17).
7. Proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el gen que codifica a ornitina descarboxilasa sobre expresado es un gen speF de ornitina descarboxilasa .
8. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado porque el gen que codifica a ornitina descarboxilasa sobre expresado es un gen speF o speC de ornitina descarboxilasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia, Shigella , Salmonella, Yersinia , y Shewanella .
9. Proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el gen que codifica a ornitina descarboxilasa sobre expresado es un gen de ornitina descarboxilasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Shígella flexneri , Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, y Shewanella oneidensis.
10. Proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el gen que codifica a ornitina descarboxilasa sobre expresado es speF originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Salmonella typhimurium, y Shewanella oneidensis.
11. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque adicionalmente a la actividad ODC creciente también se obtuvo actividad enzimática creciente por al menos dos enzimas diferentes por medio de la sobre expresión de ya sea (i) un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa (perteneciente a E.C. .1.1.19) y un gen speB que codifica a agmatinasa (perteneciente a E.C.3.5.3.11; también mencionado como gen que codifica a agmatina ureahidrolasa) ; o (ii) un gen speA que codifica a arginina descarboxilasa (perteneciente a E.C.4.1.1.19), y un gen aguA que codifica a agmatina iminohidrolasa (perteneciente a E.C.3.5.3.12; también mencionado como gen que codifica a agmatina desiminasa) , y un gen aguB que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa (perteneciente a E.C.3.5.1.53), y opcionalmente también un gen speB que codifica a agmatinasa (perteneciente a E.C. 3.5.3.11) .
12. Proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el gen que codifica a arginina descarboxilasa sobre expresado es un gen speA de arginina descarboxilasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichía , Shigella , Salmonella , Yersinia , Pasteurella , y Neisseria .
13. Proceso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el gen que codifica a arqinina descarboxilasa sobre expresado es un gen de speA de arginina descarboxilasa originario de la especie seleccionada del grupo que consiste de Escherichía coli , Shigella flexneri , Salmonella entérica , Yersinia pestis, Pateurella multocida , y Neisseria meníngitidis .
14. Proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el gen que codifica a agmatinasa sobre ' expresado es un gen speB de agmatinasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Escherichia , Salmonella , Proteus, Photorhabdus , Vibrio, y Neisseria .
15. Proceso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el gen que codifica a agmatinasa sobre expresado es un gen speB de agmatinasa originario de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli , Salmonella entérica , Proteus mirabilis, Photorhabdus luminiscens, Vibrio cholerae, y Neisseria meningitidís .
16. Proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el gen que codifica a agmatina iminohidrolasa sobre expresado y/o el gen que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa sobre expresado es un gen aguA de agmatina iminohidrolasa y/o un gen aguB de N-carbamoilputrescin amidohidrolasa originario de uno de los géneros seleccionados del grupo que consiste de Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium, y Bacillus .
17. Proceso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el gen que codifica a agmatina iminohidrólasa sobre expresado y/o el gen que codifica a N-carbamoilputrescin amidohidrolasa sobre expresado es un gen aguA de agmatina iminohidrolasa y/o gen aguB de N-carbamoilputrescin amidohidrolasa originario de las especies seleccionadas del grupo que consiste de Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans, y Bacillus cereus.
18. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el proceso se lleva a cabo mientras que se asegura un nivel intracelular creciente de ornitina.
19. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el proceso es llevado a cabo en un organismo huésped seleccionado del grupo que consiste de Saccharomyces sp. , Bacillus sp. , Corynebacterium sp. , Escherichia sp . , y Pichia sp.
20. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el proceso es llevado a cabo en un organismo huésped seleccionado del grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp. y Escherichia sp . y porque aparte del nivel creciente de actividad de una ornitina descarboxilasa al menos también el nivel de actividad de una arginina descarboxilasa en combinación con una agmatinasa y/o una agmatina iminohidrolasa y una N-carbamoilputrescin amidohidrolasa es creciente.
21. Vectores, plásmidos y huéspedes caracterizados porque portan a un nivel creciente de actividad, una o más de las actividades enzimáticas de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1-20.
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