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DESCRIPCION

Smtesis bioqmmica de 1,4-butanodiamina.

La presente invencion se refiere a un nuevo procedimiento para la smtesis bioqmmica de 1,4-butanodiamina (numero CAS 110-60-1; un compuesto tambien denominado tetrametilendiamina; en la bibliograffa bioqmmica tambien se denomina putrescina) en un microorganismo que tiene un nivel incrementado de una actividad de ornitina descarboxilasa en comparacion con el nivel natural de la actividad de ornitina descarboxilasa. La ornitina descarboxilasa tambien se denominara en la presente ODC. Generalmente, se sabe que tales microorganismos que tienen actividad de ODC son capaces de producir poliaminas tales como espermidina y espermina, que son los nombres comunes, respectivamente, para los productos N-(3-aminopropil)-1,4-butanodiamina y N,N'-bis-(3- aminopropil)-1,4-butanodiamina. Tales compuestos, asf como las propias diversas diaminas cortas tales como, por ejemplo, 1,4-butanodiamina y 1,5-pentanodiamina (tambien denominada cadaverina), a menudo se denominan poliaminas en estudios bioqmmicos, aunque a partir de una definicion estrictamente qmmica de las poliaminas se esperana un numero superior de grupos amino. Sin embargo, para los propositos de la presente solicitud de patente, el termino poliaminas se esta usando en su significado bioqmmico y por lo tanto incluye 1,4-butanodiamina.

El compuesto 1,4-butanodiamina es una importante materia prima para la produccion de algunos de los principales plasticos industriales: poliamida-4,6, bien en la forma de un homopolfmero o bien copolimerizada, por ejemplo, con alrededor de 5% en peso de monomero de poliamida-6 (caprolactama). El homopolfmero poliamida-4,6 (nailon-4,6) se describio tan pronto como en 1938 (documento US-A-2.130.948, Carothers). Es el producto de policondensacion de los monomeros 1,4-butanodiamina y acido adfpico. Actualmente, especialmente compuestos de poliamida-4,6 estan siendo producidos y vendidos por DSM en Holanda bajo el nombre comercial STANYL®.

Se conoce un numero de rutas qmmicas para la smtesis de 1,4-butanodiamina. Todas estas rutas qmmicas tienen las desventajas de que los materiales de partida tienen que ser obtenidos a partir de fuentes que se considera que no son renovables. Sin embargo, existe una necesidad sustancial de proporcionar rutas nuevas y factibles para la smtesis de 1,4-butanodiamina partiendo de fuentes de carbono renovables y usando procedimientos bioqmmicos (tambien denominados "biotransformacion") en celulas vivas. En general, se considera que las poliaminas son toxicas para cualquier celula o microorganismo usados en la produccion bioqmmica. Por lo tanto, sin embargo, hasta ahora se crefa que tales nuevas rutas mediante smtesis bioqmmica no eran atractivas.

Esto se puede observar, por ejemplo, a partir de las siguientes referencias: Fukuchi y cols., J. Biol. Chem., Vol. 270 (1995), paginas 18831-18835; y Suzuki y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91 (1994), paginas 8930-8934.

Fukuchi describe claramente la disminucion en la viabilidad celular (y de smtesis de casi todos los tipos de protemas) debido a la acumulacion de espermidina en celulas de E. coli deficientes en espermidina acetiltransferasa (es decir, en celulas que carecen de la acetiltransferasa SpeG). Se debe apuntar que Limsuwum y cols. (J. Bacteriol. Vol. 182 (2000), paginas 5373-5380) han mostrado que a bajas temperaturas tales problemas se pueden resolver mediante la sobreexpresion de gen speG especializado. La espermidina es un producto que esta siendo producido en las celulas a partir de 1,4-butanodiamina como un producto intermedio. Segun esto, la biosmtesis de 1,4- butanodiamina tambien conduce inevitablemente a la formacion de espermidina.

Suzuki y cols., por otra parte, tambien demuestran (en celulas de raton), que la sobreexpresion de ODC da como resultado una acumulacion de poliaminas, especialmente de espermidina, y que - al anadir pequenas cantidades de espermidina - ya se observa muerte celular incluso en celulas que no son deficientes en speG. Suzuki y cols. sugieren que esta disminucion en la viabilidad celular se debe a una inhibicion de la retroalimentacion insuficiente de ODC por antizimas y se puede vencer mediante la sobreproduccion de una antizima adecuada. A continuacion, tal sobreproduccion de antizimas tambien disminuina la produccion de poliaminas en las celulas y por lo tanto no es factible para la produccion de DAB.

Ademas, como Kashiwagi y cols. describieron en J. Bacteriol. Vol. 170 (1988), paginas 3131-3135, el contenido de poliaminas en E. coli se puede ajustar mediante la sobreexpresion de un gen que codifica ornitina descarboxilasa (ODC), en particular de speC expresado constitutivamente. Para sus experimentos, el plasmido pODC segun se produda por Boyle y cols. (Methods in Enzymology, Vol. 94 (1983), paginas 117-121, se uso en la clonacion. Claramente, tal sobreproduccion de ornitina descarboxilasa no conduda a niveles fuertemente incrementados de contenido de 1,4-butanodiamina en las celulas. Con un nivel de 70 veces de ODC, no se observaba un incremento de mas de 20% de contenido de 1,4-butanodiamina en las celulas, independientemente de la cantidad de ornitina anadida a las celulas. Sin embargo, por otra parte, se observo que las celulas desarrolladas en presencia de ornitina exhibfan un incremento en la excrecion de 1,4-butanodiamina. Al nivel de 70 veces de ODC, se encontro en total una produccion de 1,4-butanodiamina alrededor de 8,5 veces superior (el tttulo de 1,4-butanodiamina producida era aproximadamente 20-25 mg/l, en total para concentraciones internas y externas, es decir una concentracion extremadamente baja). Los autores sugirieron que esta eficacia bastante baja de produccion de 1,4-butanodiamina se podna deber a escasez de ornitina, y trataron de resolver esto mediante alimentacion externa de ornitina, pero

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consiguieron una mejora solo menor. Segun esto, parecena imposible proporcionar procedimientos de smtesis bioqmmica para la produccion de 1,4-butanodiamina con niveles significativamente superiores a 30 mg/l.

Por otra parte, estos estudios mencionados anteriormente no se dirigfan a la smtesis de poliaminas (incluyendo 1,4- butanodiamina) como tales, sino mas bien intentaron obtener mas puntos de vista de las funciones fisiologicas de las poliaminas a nivel molecular. Con niveles superiores de ornitina en las celulas, presumiblemente tambien estana presenta mas arginina en las celulas. Segun la ensenanza de Kashiwagi, tales niveles superiores de arginina deben tener un efecto negativo sustancial sobre la formacion de 1,4-butanodiamina.

El documento EP-A-0726240 es hasta ahora una de las muy pocas referencias de patente relativas a la smtesis bioqmmica de poliaminas, incluyendo 1,4-butanodiamina. Sin embargo, describe la produccion de, entre otras cosas, 1,4-butanodiamina mediante la fermentacion de productos naturales que contienen protemas como un componente principal. En dicho procedimiento, los productos naturales se tratan en primer lugar al someterlos a degradacion parcial o total y cualesquiera compuestos no deseables (p. ej. Hg, Cr, As, Cd, Se y Pb), inhibidores del crecimiento celular, plaguicidas, antibioticos, detergentes, jabones, grasas, aceites, cianuros y fenoles se retiran a continuacion antes de la etapa de fermentacion. La putrescina y otras diaminas producidas de tal modo se estan (re)utilizando como fertilizantes y abonos, pero contienen un numero tan grande de otras sustancias que son inadecuadas como una materia prima para la produccion de, por ejemplo, poliamida-4,6.

Segun esto, sigue habiendo una necesidad de una ruta biosintetica alternativa eficaz para la smtesis de 1,4- butanodiamina con tftulos significativamente superiores a alrededor de 30 mg/l, preferiblemente incluso sin la necesidad de alimentacion externa de ornitina (costosa). Esta necesidad de una disponibilidad mejorada de 1,4- diaminobutano se basa en su uso pretendido como un material de partida, por ejemplo, para la produccion de poliamida-4,6. En general, las rutas hasta 1,4-butanodiamina que son conocidas hasta ahora son bastante laboriosas y engorrosas, y pueden conducir a una calidad de dicho producto que - sin purificacion adicional - es difmil de usar en la produccion de nailones. Las rutas qmmicas conocidas hasta 1,4-butanodiamina requieren materiales de partida y reaccionantes relativamente costosos (incluyendo reaccionantes que son difmiles de manejar), y condiciones de reaccion relativamente rigurosas de temperatura y presion en un diseno de multiples etapas y multiples reactores, asf como el uso de sistemas catalfticos costosos. Segun esto, sigue habiendo una necesidad de rutas alternativas hasta la 1,4-butanodiamina, preferiblemente a partir de materias primas mucho menos costosas y evitando problemas de manejo de reaccionantes como acido cianhudrico. Se sabe bien que los materiales que se desarrollan naturalmente, y son asf renovables, a partir de produccion agncola son la base de fuentes de carbono tales como glucosa (u otras fuentes de carbono apropiadas y mezclas de las mismas) que se pueden usar en la fermentacion. Tales materiales renovables son relativamente economicos y estan disponibles abundantemente. En general, se considera que es ventajoso que se puedan usar materiales renovables como materiales de partida para todos los tipos de materiales qmmicos.

Asf, un objetivo de la presente invencion es proporcionar posibilidades mejoradas para la produccion industrial a gran escala de 1,4-butanodiamina mediante biotransformacion.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que este objetivo se consigue mediante un nuevo procedimiento para la smtesis bioqmmica de 1,4-butanodiamina en un microorganismo que tiene un nivel incrementado de una actividad de ornitina descarboxilasa (actividad de ODC incrementada) en comparacion con el nivel natural de actividad de ornitina descarboxilasa, en donde en el microorganismo tambien esta presente una actividad incrementada de formacion de N-acetilglutamato en comparacion con el nivel natural de actividad de formacion de N-acetilglutamato en el microorganismo y que 1,4-butanodiamina producida en el microorganismo se excreta a un caldo de fermentacion y se recupera del caldo de fermentacion. En el procedimiento segun la invencion, el microorganismo es Escherichia coli (E. coli) que esta sobreexpresando un gen que codifica N-acetilglutamato sintasa perteneciente a E.C. 2.3.1.1 que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de la N-acetilglutamato sintasa ArgA de E. coli y/o un gen que codifica N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetiltransferasa perteneciente a E.C. 2.3.1.35 que tiene al menos 40% de identidad con la secuencia de N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N- acetiltransferasa ArgJ de Bacillus.

Segun se entiende en la presente solicitud de patente, el termino "smtesis bioqmmica" (un termino que, en el contexto de esta solicitud de patente, se denomina alternativamente "biotransformacion") incluye no solo procedimientos que implican - ademas de un numero de etapas de reaccion puramente qmmicas - una o mas reacciones biocatalfticas que usan celulas enteras de cepas de produccion adecuadas, sino tambien procedimientos puramente bioqmmicos que usan celulas enteras de cepas de produccion adecuadas. Tales procedimientos puramente bioqmmicos, respectivamente, se denominan fermentaciones en el caso de que la smtesis bioqmmica empiece a partir de una fuente de carbono adecuada, o se denominan fermentaciones precursoras en el caso de que la biosmtesis empiece a partir de un producto intermedio que ya tiene una cadena principal carbonada a partir de la cual se puede obtener la molecula buscada que se va a sintetizar. Los procedimientos se pueden llevar a cabo bien bajo condiciones aerobicas o bien bajo condiciones anaerobicas.

Las reacciones biocatalfticas en la smtesis bioqmmica de la presente invencion se pueden llevar a cabo bien in vivo o bien in vitro. Generalmente, los procedimientos in vivo son procedimientos llevados a cabo cuando se usan celulas

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vivas (incluyendo tambien de ese modo el termino "celulas vivas" las llamadas celulas en reposo); llevandose a cabo habitualmente los procedimientos in vitro, por otra parte, usando lisados celulares o enzimas (parcialmente) purificadas. La smtesis bioqmmica segun la presente invencion se lleva a cabo en un microorganismo. Esto se puede hacer usando celulas enteras de cepas de produccion adecuadas, pero tambien se puede llevar a cabo usando celulas permeabilizadas; la diferenciacion entre in vivo e in vitro, sin embargo, no tiene mucho sentido para procedimientos que se llevan a cabo con celulas permeabilizadas o celulas hospedadoras inmovilizadas. Sin embargo, sera evidente que las etapas biocataltticas individuales del procedimiento de la invencion, cuando se llevan a cabo, por ejemplo, al usar enzimas inmovilizadas, etc., se consideran equivalentes a tales etapas en la smtesis bioqmmica como se entiende en el contexto de la presente solicitud.

Las ornitina descarboxilasas (es decir enzimas que tienen actividad de descarboxilacion de ornitina, u ODC) son enzimas clasificadas en la clase E.C. 4.1.1.17. El nivel de actividad de una ornitina descarboxilasa, si se sobreproduce, se puede comparar facilmente con el nivel natural (es decir, no sobreproducido) de actividad de ornitina descarboxilasa bajo condiciones estandar (a 37°C en presencia de ornitina y PLP) con extractos libres de celulas usando el estuche de deteccion de dioxido de carbono Sigma Diagnostics (Sigma); ensayo descrito en Osterman, A. L. y cols. 1994, Biochemistry 33, p. 13662-13667. Segun esto, el experto puede establecer facilmente si la ODC usada tiene un nivel incrementado de actividad de ornitina descarboxilasa (incrementa la actividad de ODC) en comparacion con el nivel natural de la actividad de ornitina descarboxilasa en el microorganismo usado mediante la determinacion del contenido de protema, o al determinar el nivel de ARN. Diversos procedimientos estandar para la determinacion del contenido de protema, por ejemplo metodos colorimetricos asf como espectroscopicos, se describen en Lottspeich y Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg / Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 (1998), Capftulos 3, 5, 21, 22 y 24. Metodos para la determinacion del nivel de protema asf como el nivel de ARN, por ejemplo hibridacion "northern", RT-PCR y muchos otros metodos, se describen en J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989). Sin embargo, muchos otros procedimientos estandar son conocidos por el experto en este campo analftico y no se necesitan mencionar en la presente.

Ornitina descarboxilasas adecuadas que se pueden usar en el procedimiento de la invencion son todas las enzimas y mutantes de las mismas que sean capaces de descarboxilar ornitina. Cualquiera de tales enzimas se puede usar en el procedimiento de la invencion, con un nivel de actividad incrementado, es decir en forma sobreproducida. Tal nivel de actividad incrementado se puede conseguir por cualquier medio conocido por el experto, por ejemplo por medio de un incremento del numero de copias del gen, o al incrementar la actividad endogena o la estructura de las enzimas por medio de mutaciones, o al usar enzimas desreguladas. Sin embargo, y lo mas preferiblemente, tambien se puede conseguir por medio de la sobreexpresion de un gen de ornitina descarboxilasa con eficacia incrementada de transcripcion y/o traduccion. Ademas, se ha de apuntar que el termino "nivel de actividad incrementado", segun se usa en la presente para cualquier actividad enzimatica mencionada espedficamente, tambien esta destinado a abarcar situaciones tales en las que la actividad de tal enzima, por ejemplo una ornitina descarboxilasa, no esta presente en absoluto en la fuente natural del microorganismo en el que esta teniendo lugar la reaccion, sino que se introduce en el mismo deliberadamente mediante modificacion genetica.

En el procedimiento segun la invencion, un nivel de actividad incrementado de formacion de N-acetilglutamato (segun se define adicionalmente mas adelante en la presente, cuando se presenta el analisis de las reivindicaciones dependientes relacionadas) necesita estar presente en comparacion con el nivel natural de actividad de formacion de N-acetilglutamato en el microorganismo. La comparacion de los niveles de actividad incrementado y natural de formacion de N-acetilglutamato se puede realizar facilmente, de forma similar a tal determinacion para las ODC, con reacciones de prueba apropiadas bajo condiciones estandar (ensayo descrito en Abadjieva, A., 2001, J. Biol. Chem., 276, p. 42869-42880) dentro de extractores libres de celulas mediante un radioensayo usando L-[14C]glutamato y acetil-CoA como sustratos.

La 1,4-butanodiamina, segun la presente invencion, se produce en el microorganismo con actividad de formacion incrementada de ODC y N-acetilglutamato mediante biotransformacion, y se excreta en el caldo de fermentacion que rodea el microorganismo. La 1,4-butanodiamina se excreta en y se recupera del caldo de fermentacion.

Segun la presente invencion, asf, se proporciona un procedimiento bioqmmico mejorado para la smtesis de 1,4- butanodiamina, y la 1,4-butanodiamina resultante es totalmente adecuada como materia prima, por ejemplo, para la produccion de poliamida-4,6.

La formacion de 1,4-butanodiamina en las altas cantidades que se producen segun la invencion es lo mas sorprendente, debido al hecho de que se esperana que un nivel incrementado de actividad de ODC (junto con la actividad incrementada de formacion de N-acetilglutamato), sin que se tome ninguna medida adicional para evitar los efectos negativos de la formacion de poliaminas sobre la viabilidad de las celulas, diera como resultado la muerte de las celulas.

Segun se menciona anteriormente, se puede usar cualquier enzima ODC, en un nivel de actividad incrementado, es decir en forma sobreproducida, en el procedimiento de la invencion.

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Segun la presente invencion, se pueden usar todas las ornitina descarboxilasas que tengan suficiente, es decir al menos 30%, mas preferiblemente al menos 45% y lo mas preferiblemente al menos 65% de identidad con la ODC procedente de la enzima de referencia de E. coli, y sean capaces de catalizar la reaccion de descarboxilacion de ornitina. Se sabe que muchas ODC tienen tal nivel de identidad relativamente alto con la enzima de referencia de E. coli.

La determinacion de porcentajes de identidad con enzimas de referencia se puede realizar mediante metodos conocidos por el experto, por ejemplo al usar la secuencia protemica de la enzima de referencia como una "secuencia interrogante" para realizar una busqueda frente a bases de datos publicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales busquedas se pueden realizar usando los programas BLAST (version 2.2) usando los parametros por defecto del programa respectivo. Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Preferiblemente, la actividad incrementada de ODC se consigue mediante la sobreexpresion de un gen speF o speC que codifica ornitina descarboxilasa (cada uno perteneciente a E.C. 4.1.1.17) que se origina de uno de los generos seleccionados del grupo que consiste en Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia y Shewanella. La ornitina descarboxilasa speF es una ornitina descarboxilasa inducible; la ornitina descarboxilasa speC es una ornitina descarboxilasa constitutiva.

Mas preferiblemente, el gen que codifica ornitina descarboxilasa se origina de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste en Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimutium, Yersinia pestis y Shewanella oneidensis. Hasta ahora, speC se ha investigado en la bibliograffa mucho mas que speF. Sin embargo, lo mas sorprendentemente, y lo mas preferiblemente, los mejores resultados segun la presente invencion se consiguen cuando el gen que codifica ornitina descarboxilasa es speF, mas particularmente speF que se origina de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste en Escherichia coli, Salmonella typhimutium y Shewanella oneidensis. Cuando se comparan con resultados con sobreexpresion de gen que codifica ornitina descarboxilasa speC constitutivo, con mucho los mejores resultados segun la presente invencion se estan alcanzando en efecto cuando se usa speF.

En el contexto de la presente solicitud, cualquier gen que sea homologo con cualquiera de las susodichas ornitina descarboxilasas y que codifique enzimas que tengan actividad de ornitina descarboxilasa suficientemente comparable con las ornitina descarboxilasas mostradas es adecuado en el procedimiento de la invencion. Tales genes equivalentes se pueden obtener adecuadamente por medio de cualquier estrategia de clonacion apropiada conocida por el experto, por ejemplo, mediante los metodos descritos en la parte experimental de la presente. Alternativamente, tales genes de ornitina descarboxilasa equivalentes se pueden obtener mediante construccion deliberada.

El termino actividad de formacion de N-acetilglutamato representa, en el contexto de la presente solicitud de patente, cualquier actividad enzimatica, ya sea debida a una sola enzima o a una combinacion de enzimas, capaz de conducir a la formacion intracelular de N-acetilglutamato.

Segun la presente invencion, en particular, se pueden usar todas las N-acetilglutamato sintasas que tengan suficiente, es decir al menos 30%, mas preferiblemente al menos 45%, aun mas preferiblemente al menos 60% y lo mas preferiblemente al menos 75% de identidad con la N-acetilglutamato sintasa procedente de la enzima de referencia de E. coli, y sean capaces de catalizar la reaccion de formacion de N-acetilglutamato. Se conocen muchas N-acetilglutamato sintasas que tienen tal nivel de identidad relativamente alto con la enzima de referencia de E. coli.

Preferiblemente, la actividad incrementada de formacion de N-acetilglutamato se alcanza mediante la sobreexpresion bien de un gen argA que codifica N-acetilglutamato sintasa (perteneciente a E.C. 2.3.1.1) y/o bien un gen argJ que codifica N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferasa (perteneciente a E.C. 2.3.1.35). Sera evidente que cualquier gen que codifique una enzima o mutante de la misma que tenga la misma funcionalidad de una de las enzimas que se mencionan en la presente se considerara equivalente a tal enzima en una de las clases E.C. 2.3.1.1 o 2.3.1.35.

En una de las realizaciones preferidas de la presente invencion, la actividad incrementada de formacion de N- acetilglutamato se consigue mediante la sobreexpresion de un gen argA que codifica N-acetilglutamato sintasa (perteneciente a E.C. 2.3.1.1) que se origina a partir de uno de los generos seleccionados del grupo que consiste en Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Photorhabdus y Buchnera. Estas enzimas ArgA requieren la presencia de (o el suministro de) coenzima A para que sean activas en su formacion de N-acetilglutamato.

En esta realizacion, la actividad incrementada de formacion de N-acetilglutamato se consigue mediante la sobreexpresion de un gen argA que codifica N-acetilglutamato sintasa que se origina a partir de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste en Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis, Photorhabdus luminescens y Buchnera aphidicola.

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En otra realizacion preferida de la presente invencion, la actividad incrementada de formacion de N-acetilglutamato se consigue mediante la sobreexpresion de un gen argJ que codifica N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferasa (perteneciente a E.C. 2.3.1.35) que se origina a partir de uno de los generos seleccionados del grupo que consiste en Bacillus, Listeria, Oceanobacillus, Staphylococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Thermobifida, Streptomyces y Bifidobacterium.

N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferasas adecuadas que se pueden usar en el procedimiento segun la invencion son N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferasas que tengan suficiente, es decir al menos 20%, mas preferiblemente al menos 30% y lo mas preferiblemente al menos 40% de identidad con la N2-acetil-L- ornitina:L-glutamato N-acetil transferasa procedente de la especie de referencia Bacillus y sean capaces de catalizar la reaccion de transferencia de N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetilo. Se sabe que muchas de las N2-acetil-L- ornitina:L-glutamato N-acetil transferasas tienen tal nivel de identidad con la enzima de referencia de Bacillus correspondiente.

Al contrario que las enzimas ArgA, las enzimas ArgJ no requieren la presencia (o el suministro de) coenzima A para ser activas en su formacion de N-acetilglutamato. Segun esto, estas enzimas ArgJ son claramente preferidas sobre las enzimas ArgA para el uso en aplicaciones industriales.

En esta otra realizacion preferida de la presente invencion, la actividad incrementada de formacion de N- acetilglutamato se consigue mediante la sobreexpresion de un gen argJ que codifica N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferasa que se que se origina a partir de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste en Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Oceanobacillus iheyensis, Staphylococcus epidermis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis, Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium leprae, Thermobifida fusca, Streptomyces coelicor y Bifidobacterium longum.

En el contexto de la presente solicitud, cualquier gen que sea homologo con cualquiera de las susodichas actividades de formacion de N-acetilglutamato y que codifique enzimas que tienen actividad de formacion de N- acetilglutamato suficientemente comparables a las enzimas de formacion de N-acetilglutamato mostradas es adecuado en el procedimiento de la invencion. Tales genes equivalentes se pueden obtener adecuadamente por medio de cualquier estrategia de clonacion adecuada conocida por el experto, por ejemplo, mediante los metodos descritos en la parte experimental de la presente. Alternativamente, tales genes de formacion de N-acetilglutamato equivalentes tambien se pueden obtener mediante una construccion deliberada.

En una realizacion preferida adicional de la presente invencion, el procedimiento para la smtesis bioqmmica de 1,4- butanodiamina se lleva a cabo en un microorganismo en el que, adicionalmente, tambien se obtiene una actividad enzimatica incrementada para al menos otras dos enzimas por medio de sobreexpresion bien de

(i) un gen speA que codifica arginina descarboxilasa (perteneciente a E.C. 4.1.1.19) y un gen speB que codifica agmatinasa (perteneciente a E.C. 3.5.3.11; tambien denominado gen que codifica agmatina ureahidrolasa); o bien

(ii) un gen speA que codifica arginina descarboxilasa (perteneciente a E.C. 4.1.1.19) y un gen aguA que codifica agmatina iminohidrolasa (perteneciente a E.C. 3.5.3.12; tambien denominado gen de agmatina desiminasa) y un gen aguB que codifica N-carbamoilputrescina amidohidrolasa (perteneciente a E.C. 3.5.1.53) y opcionalmente tambien un gen speB que codifica agmatinasa (perteneciente a E.C. 3.5.3.11).

La ventaja de esta realizacion adicional es que se forma 1,4-diaminobutano en cantidades aun mayores.

La sobreexpresion, segun se entiende en la presente, se puede conseguir mediante cualquier metodo conocido para el experto; por ejemplo al incrementar la eficacia de traduccion y/o transcripcion del gen respectivo, pero tambien mediante cualesquiera otros metodos tales como incrementar el numero de copias del gen, o al incrementar la actividad endogena o la estructura de las enzimas por medio de mutaciones, o al usar enzimas desreguladas. Segun se entiende en la parte (i) de la realizacion preferida adicional mencionada en la presente anteriormente, la combinacion de SpeA y SpeB de la misma esta destinada a representar cualquier combinacion funcional (ya sea en una protema de fusion combinada o como actividades enzimaticas separadas) de SpeA y SpeB. De hecho, esta combinacion tambien se podna denominar SpeAB. La parte (ii) de la misma representa que, en tales combinaciones de SpeA y SpeB, la propia parte SpeB se puede reemplazar por cualquier combinacion funcional (ya sea en una protema de fusion combinada o como actividades enzimaticas separadas) de AguA y AguB.

Janowitz y cols., FEBS Letters 544 (2003), 258-261, han descrito que la agmatina desiminasa AguA esta implicada en la ruta de arginina descarboxilasa en plantas superiores. Se sabe ademas de Nakada y cols., Microbiology, 149 (2003), 707-714, que las conversiones catalizadas por SpeB tambien se pueden catalizar por enzimas que estan presentes en plantas, a saber, mediante la accion combinada de agmatina desiminasa AguA y W-carbamoil- putrescina amidohidrolasa AguB. Segun esto, en lugar de, o incluso en combinacion con, SpeB en el contexto de la presente invencion tambien se pueden usar AguA y AguB. Fuentes de tales genes aguA y aguB podnan ser

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Arabidopsis thaliana y Lycopersicon esculentum, pero genes comparables se pueden encontrar en mutantes de Pseudomonas aeruginosa.

En el contexto de la presente solicitud, cualquier gen que sea homologo con cualquiera de las susodichas arginina descarboxilasas, respectivamente agmatinasas o agmatina iminohidrolasas o N-carbamoilputrescina amidohidrolasas, y que codifique tales enzimas respectivas que tienen actividad de arginina descarboxilasa (respectivamente agmatinasa o agmatina iminohidrolasa o N-carbamoilputrescina amidohidrolasa) suficientemente comparable con las enzimas respectivas - segun sea el caso - es adecuado en esta realizacion adicional del procedimiento de la invencion. Tales genes equivalentes se pueden obtener adecuadamente por medio de cualquier estrategia de clonacion conocida por el experto, por ejemplo, mediante los metodos descritos en la parte experimental de la misma. Alternativamente, tales genes equivalentes tambien se pueden obtener mediante construccion deliberada.

Segun esto, en esta realizacion preferida del procedimiento de la presente invencion, tambien se usan combinaciones adicionales de genes sobreexpresados, a saber genes que codifican (i) arginina descarboxilasa y agmatinasa, o (ii) arginina descarboxilasa y agmatina iminohidrolasa y N-carbamoilputrescina amidohidrolasa y opcionalmente agmatinasa.

En esta realizacion preferida del procedimiento segun la presente invencion, en particular, se pueden usar todas las arginina descarboxilasas que tengan suficiente, es decir al menos 30%, mas preferiblemente al menos 45% de identidad y lo mas preferiblemente al menos 65% de identidad con la arginina descarboxilasa procedente de la enzima de referencia de E. coli y sean capaces de catalizar la reaccion de descarboxilacion de arginina. Se conocen muchas arginina descarboxilasas que tienen tal nivel de identidad relativamente alto con la enzima de referencia de E. coli.

Por otra parte, en dicha realizacion, en particular se pueden usar todas las agmatinasas que tengan suficiente, es decir al menos 30%, mas preferiblemente al menos 45% y lo mas preferiblemente al menos 60% de identidad con la agmatinasa procedente de la enzima de referencia de E. coli y sean capaces de catalizar la reaccion de agmatinasa. Se conocen muchas agmatinasas que tienen tal nivel de identidad relativamente alto con la enzima de referencia de E. coli.

Ademas, en dicha realizacion, en particular se pueden usar en el procedimiento todas las agmatina iminohidrolasas y/o N-carbamoilputrescina amidohidrolasas que tengan suficiente, es decir al menos 20%, mas preferiblemente al menos 30% y lo mas preferiblemente al menos 40%, de identidad con la agmatina iminohidrolasa y/o la N- carbamoilputrescina amidohidrolasa procedente de las enzimas de referencia de Pseudomonas y sean capaces de catalizar la reaccion de agmatina iminohidrolasa, respectivamente la N-carbamoilputrescina amidohidrolasa. Se conocen muchas agmatina iminohidrolasas y N-carbamoilputrescina amidohidrolasas que tienen tal nivel de identidad relativamente alto con las enzimas de referencia de Pseudomonas.

El gen que codifica arginina descarboxilasa sobreexpresado en la realizacion preferida anterior de la invencion es preferiblemente un gen speA de arginina descarboxilasa que se origina a partir de uno de los generos seleccionados del grupo que consiste en Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Pasteurella y Neisseria. Mas preferiblemente, el gen que codifica arginina descarboxilasa sobreexpresado es preferiblemente un gen speA de arginina descarboxilasa que se origina a partir de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste en Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis, Pasteurella multocida y Neisseria meningitidis.

Por otra parte, en esta realizacion preferida de la invencion, el gen que codifica agmatinasa sobreexpresado es preferiblemente un gen speB de agmatinasa que se origina a partir de uno de los generos seleccionados del grupo que consiste en Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio y Neisseria. Mas preferiblemente, el gen que codifica agmatinasa sobreexpresado es un gen speB de agmatinasa que se origina a partir de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste en Escherichia coli, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus luminescens, Vibrio cholerae y Neisseria meningitidis.

Ademas, en esta realizacion preferida adicional de la invencion, el gen que codifica agmatina iminohidrolasa sobreexpresado y/o el gen que codifica N-carbamoilputrescina amidohidrolasa sobreexpresado es preferiblemente un gen aguA de agmatina iminohidrolasa y/o un gen aguB de N-carbamoilputrescina amidohidrolasa que se origina a partir de uno de los generos seleccionados del grupo que consiste en Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium y Bacillus. Mas preferiblemente, el gen que codifica agmatina iminohidrolasa sobreexpresado y/o el gen que codifica N-carbamoilputrescina amidohidrolasa sobreexpresado es un gen aguA de agmatina iminohidrolasa y/o un gen aguB de N-carbamoilputrescina que se origina a partir de una de las especies seleccionadas del grupo que consiste en Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans y Bacillus cereus.

El procedimiento de la invencion se puede llevar a cabo en cualquier organismo hospedador adecuado. Los hospedadores se pueden seleccionar de los grupos de organismos (o celulas) de produccion generalmente

5

10

15

20

25

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45

50

55

60

conocidos por el experto en biosmtesis. Tales organismos pueden ser de origen eucariotico o - como se prefiere mas - de origen procariotico. Las celulas eucarioticas, por ejemplo, pueden ser celulas procedentes de plantas y hongos y de otros grupos diversos, otros grupos que se denominan colectivamente "Protistas".

En el procedimiento de la invencion, se prefiere especialmente que el microorganismo que se va a usar como un hospedador sea capaz de producir los aminoacidos ornitina y/o arginina. Para la mayona de los microorganismos naturales este requisito se cumple debido a que habitualmente esta capacidad esta disponible en todas las cepas silvestres, ya que la arginina representa un aminoacido esencial.

De estas especies, se prefieren especies de Escherichia debido a que son faciles de manejar mediante manipulacion genetica a fin de proporcionar cepas con las actividades enzimaticas sobreexpresadas deseadas. Por otra parte, las especies de Escherichia ya en la naturaleza contienen casi todas las susodichas actividades enzimaticas (es decir, aparte de los genes agu de plantas), de modo que la mayona de los genes sobreexpresados se pueden usar como genes homologos.

Los mejores resultados se alcanzan cuando el procedimiento segun la invencion se lleva a cabo en especies de Escherichia en las que, aparte del nivel de actividad incrementado de una ornitina descarboxilasa y de formacion de N-acetil glutamato, al menos tambien se incrementa el nivel de actividad de una arginina descarboxilasa en combinacion con una enzima agmatinasa y/o agmatina iminohidrolasa y N-carbamoilputrescina amidohidrolasa. Segun se entiende en la presente, para cada una de las enzimas mencionadas, el nivel de actividad incrementado se compara con el nivel natural de actividad de dicha actividad enzimatica respectiva en el organismo hospedador.

Estara claro que el procedimiento de la invencion se lleva a cabo preferiblemente bajo condiciones de reaccion que tambien son habituales como condiciones de fermentacion. Por lo tanto, el procedimiento se puede llevar a cabo discontinuamente, pero tambien - si se desea - por lotes alimentados. Puede ser conveniente asegurar que el organismo usado como organismo hospedador tenga, o se provea de, un sistema exportador adecuado para el 1,4- diaminobutano formado: Preferiblemente, tal sistema exportador es uno natural.

La presente invencion, por supuesto, tambien se refiere finalmente a todos los vectores, plasmidos y hospedadores que soporten un nivel incrementado de una actividad de ornitina descarboxilasa (actividad de ODC incrementada) en comparacion con el nivel natural de la actividad de ornitina descarboxilasa y una actividad incrementada de formacion de N-acetilglutamato en comparacion con el nivel natural de actividad de formacion de N-acetilglutamato. En particular, para las realizaciones preferidas, la presente invencion tambien se refiere a todos los vectores, plasmidos y hospedadores que soporten adicionalmente un nivel de actividad incrementado de una o mas de las otras actividades enzimaticas susodichas segun las reivindicaciones adjuntas.

La invencion se elucidara ahora por medio de algunos resultados experimentales, que de ningun modo pretenden limitar el alcance de la invencion.

Parte experimental

Procedimientos generales

Se aplicaron procedimientos estandar para todas las manipulaciones de ADN (Sambrook, J. y cols. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). El ADN se amplifico a partir de ADN cromosomico de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols. (2000), J Bacteriol. 182, 4443-4452), Bacillus subtilis ATCC10783 o Corynebacterium glutamicum ATCC13032 si no se indica otra cosa. La amplificacion por PCR se realizo usando las enzimas de cotejo SAWADY Pwo-DNA-Polymerase (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemania) o Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante, mientras que la verificacion de las cepas construidas se llevo a cabo mediante PCR de colonias utilizando la polimerasa de Taq READYMIX (Sigma, Taufkirchen, Alemania). Centros de restriccion para la clonacion posterior asf como mutaciones adicionales se introdujeron con oligonucleotidos adquiridos de MWG-Biotech (Ebersberg, Alemania). Los fragmentos de ADN se purificaron con el MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La preparacion de ADN plasirndico se efectuo mediante la utilizacion de QIAprep spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La verificacion de los plasmidos construidos se llevo a cabo mediante analisis de restriccion y secuenciacion posterior (Agowa, Berlin, Alemania).

Para una expresion de alto nivel de genes, se uso el vector pJF119EH (Furste, J. P. y cols. (1986), Gene 48, 119131) adecuado para la produccion de protema inducida por IPTG basada en el promotor tac inducible por isopropil- U-D-tiogalactopiranosido (IPTG) y el sistema represor lac (laclQ).

Construccion de plasmidos

(i) Construccion del plasmido pDAB2 (pJF119EH-speF)

El gen speF que codifica ornitina descarboxilasa (inducible, biodegradante) de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) se clono en el vector de expresion pJF119EH (Furste, J. P. y cols. (1986), 5 Gene 48, 119-131). Este vector permite una produccion de alto nivel basada en el control de la transcripcion de genes clonados bajo el promotor tac inducible por isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG) y el sistema represor lac (laclQ). Para la construccion del plasmido de expresion pDAB2 (pJF119EH-speF) el gen codificante se clono con RBS (sitio de union ribosomica, por sus siglas en ingles), codon de inicio y parada originales.

10 El fragmento de ADN que contema speF de 2.247 pb se amplifico a partir de ADN cromosomico de E. coli LJ110 (numero de registro AE000172; nucleotidos 10242 - 12468) usando los siguientes oligonucleotidos:

5'-GAC CTG CTG GTA CCT AAA ATA AAG AGA TGA AA-3' [SEQ ID: N° 1]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion Kpnl en cursiva)

y

15 5'-TCG ATC TAG ACT GAC TCA TAA TTT TTC CCC-3' [SEQ ID: N° 2]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion Xbal en cursiva).

El fragmento se modifico terminalmente con las endonucleasas de restriccion Kpnl y Xbal y se ligo al vector de expresion pJF119EH, que se corto del mismo modo. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 20 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, el plasmido pDAB2 (pJF119EH-speF, 7502 pb) se verifico mediante analisis de restriccion y secuenciacion posterior.

(ii) Construccion del plasmido pDAB4 (pJF119EH-speC)

El gen speC que codifica ornitina descarboxilasa (constitutivo, biosintetico) de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) se clono en el vector de expresion pJF119EH (Furste, J. P. y cols. (1986), 25 vease (i)), permitiendo una fuerte expresion genica basada en el control de la transcripcion bajo el promotor tac inducible por isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG) y el sistema represor lac (lacIQ). Por lo tanto, el gen codificante se clono con el codon de inicio y parada originales. Puesto que no se podfa determinar el sitio de union ribosomica (RBS) conservado para speC utilizando estudios informaticos, se introdujo un RBS optimizado 7 pb aguas arriba del codon de inicio de speC mediante mutagenesis.

30

El fragmento de ADN que contema speC de 2235 pb se amplifico a partir de ADN cromosomico de E. coli LJ110 (numero de registro AE000379; nucleotidos 2650 - 4867) usando los siguientes oligonucleotidos:

5'-GAG CTC TAG ACC AGT TTG AGG AAT ATC T-3' [SEQ ID: N° 3]

(mutaciones en negrita, XbaI en cursiva)

35 y

5'-TTT TGC ATG CTT ACT TCA ACA CAT AAC CGT AC-3' [SEQ ID: N° 4]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion SphI en cursiva).

Despues de la modificacion terminal con las endonucleasas XbaI y SphI, el producto de PCR se ligo en el plasmido pJF119EH, que se corto del mismo modo. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, 40 Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, la verificacion del plasmido pDAB4 (pJF119EH-speC, 7491 pb) obtenido se llevo a cabo mediante analisis de restriccion y secuenciacion posterior.

(iii) Construccion del plasmido pDABI (pJF119EH-argA)

El gen argA de N-acetilglutamato sintasa de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) se clono en el vector de expresion pJF119EH (Furste, J. P. y cols. (1986), vease (i)). El gen se clono con el RBS (sitio de union ribosomica) y el codon de parada originales. Sin embargo, el inicio de la traduccion se altero de GTG 5 a ATG.

El fragmento de ADN que codifica argA de 1365 pb se amplifico a partir de ADN cromosomico de E. coli LJ110 (numero de registro AE000365; nucleotidos 3312 - 4643) usando los siguientes oligonucleotidos:

5'-ATA AGA ATTCAA AGA GGT GTG CCA TGG TAA AG-3' [SEQ ID: N° 5]

10 (mutaciones en negrita, sitio de restriccion EcoRI en cursiva)

y

5'-TTT TGG TAC CTT ACC CTA AAT CCG CCA T-3' [SEQ ID: N° 6]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion Kpnl en cursiva).

El fragmento se modifico terminalmente usando las endonucleasas de restriccion EcoRI y Kpnl y posteriormente se 15 ligo en el plasmido de expresion pJF119EH, que se corto del mismo modo. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, la verificacion del plasmido pDAB1 (pJF119EH-argA, 6627 pb) obtenido se llevo a cabo mediante analisis de restriccion y secuenciacion posterior.

(iv) Construccion del plasmido pDAB5 (pJF119EH-argA-speF)

20 A fin de permitir la produccion en paralelo de la ornitina descarboxilasa SpeF y la N-acetilglutamato sintasa ArgA, el gen que codifica speF de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) se clono en el argA-vector de expresion pDAB1 (vease (iii)).

El fragmento de ADN que contema speF (2225 pb) se corto del plasmido pDAB2 construido (vease A.1) mediante 25 digestion con las endonucleasas KpnI y XbaI y se ligo en el plasmido pDAB1 que contema argA (vease (iii)), cortado del mismo modo. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, el plasmido pDAB5 (pJF119EH-argA-speF, 8841 pb) obtenido para la produccion de SpeF y ArgA en paralelo se verifico mediante analisis de restriccion.

30 (v) Construccion del plasmido pDAB6 (pJF119EH-argA-speC)

A fin de permitir la produccion en paralelo de la ornitina descarboxilasa SpeC y la N-acetilglutamato sintasa ArgA, el gen que codifica speC de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) se clono en el argA-vector de expresion pDAB1 (vease (iii)1).

35 Mediante la digestion del plasmido pDAB4 (vease (ii)) construido con los endonucleotidos XbaI y SphI, se separo el fragmento de ADN de 2225 pb que contema el gen speC con el RBS optimizado. Posteriormente, el fragmento se ligo en el plasmido pDAB1 que contiene argA (vease (i)), que se corto igualmente. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, la verificacion del plasmido pDAB6 40 (pJF119EH-argA-speC, 8830 pb) obtenido que permitfa la expresion en paralelo de speC y argA se llevo a cabo

mediante analisis de restriccion y secuenciacion posterior.

(vi) Construccion del plasmido pDAB7 (pJF119EH-speAB)

El gen speA que codifica arginina descarboxilasa asf como speB que codifica la agmatinasa de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) se clonaron en el vector de expresion pJF119EH (Furste, 45 J. P. y cols. (1986), vease (i)). De este modo, se mantuvieron la estructura de operon original de los genes asf como el RBS, el codon de inicio y de parada.

El fragmento de ADN que contema speAB de 3079 pb se amplifico a partir de ADN cromosomico de E. coli LJ110 (numero de registro AE000377; nucleotidos 1190-4247) usando los siguientes oligonucleotidos:

5'-ACA CTT TCT AGA ATA ATT TGA GGT TCG CTA TG-3' [SEQ ID: N° 7]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion Xbal en cursiva)

5 y

5'-CAT GGC ATG CGG TGC TTA CTC G-3' [SEQ ID: N° 8]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion SphI en cursiva).

Despues de la modificacion terminal con las endonucleasas de restriccion Xbal y SphI, el fragmento de ADN se ligo en el plasmido de expresion pJF119EH, que se corto igualmente. Despues de la transformacion en celulas de E. coli 10 DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, la verificacion del plasmido pDAB7 (pJF119EH-speAB, 8339 pb) obtenido se llevo a cabo mediante analisis de restriccion y secuenciacion posterior.

(vii) Construccion del plasmido pDAB8 (pJF119EH-speF-speAB)

A fin de permitir la produccion en paralelo de la ornitina descarboxilasa SpeF, la arginina descarboxilasa SpeA y la 15 agmatinasa SpeB, los genes speAB de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) se clonaron en el speF-vector de expresion pDAB2 (vease (i)).

Mediante la digestion del plasmido pDAB7 (vease (vi)) con las endonucleasas de restriccion XbaI y SphI, el operon del gen speAB que comprendfa 3067 pb se separo y se ligo en el plasmido pDAB2 que contema speF (vease (i)), 20 que se corto del mismo modo. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, el plasmido pDAB8 (pJH119EH-speFAB, 10547 pb) obtenido que permitfa la produccion en paralelo de SpeFAB se verifico mediante analisis de restriccion.

(viii) Construccion del plasmido pDAB10 (pJF119EH-argA-speF-speAB)

25 A fin de permitir la produccion en paralelo de la ornitina descarboxilasa SpeF, la arginina descarboxilasa SpeA, la agmatinasa SpeB y la N-acetilglutamato sintasa ArgA, los genes speAB de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) se clonaron en el argA-speF-vector de expresion pDAB5 (vease (iv)).

Mediante la digestion del plasmido pDAB7 (vease (vi)) con las endonucleasas de restriccion XbaI y SphI, el operon 30 del gen speAB que comprendfa 3067 pb se separo y se ligo en el plasmido pDAB5 que contema argA-speF (vease (iv)), que se corto del mismo modo. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, el plasmido pDAB10 (pJH119EH-argA-speFAB, 11886 pb) obtenido que permitfa la produccion en paralelo de ArgA y SpeFAB se verifico mediante analisis de restriccion.

35 (ix) Construccion del plasmido pDAB37 (pJF119EH-argJBs-speF)

A fin de permitir la produccion en paralelo de la ornitina descarboxilasa SpeF y el gen ArgJ que codifica N2-acetil-L- ornitina:L-glutamato N-acetil transferasa de Bacillus subtilis ATCC 10783, el gen que codifica argJ de B. subtilis se clono en el speF-vector de expresion pDAB5 (vease (iv)) al reemplazar el gen argA presente. El gen se clono con el RBS y el codon de parada originales.

40

El fragmento de ADN que contema argJ de 1279 pb se amplifico a partir de ADN cromosomico de Bacillus subtilis ATCC 10783 (numero de registro Z99109 (B. subtilis subespecie subtilis cepa 168, genoma completo (seccion 6 de 21)); nucleotidos 184321 - 185600) usando los siguientes oligonucleotidos:

5'-TCA CGC GAA TTC ATC CAT AGA ACG GGA GAG-3' [SEQ ID: N° 9]

45 (mutaciones en negrita, sitio de restriccion EcoRI en cursiva)

y

5'-CTT CAT TTC GGT ACC CTT TAT TAC GTG CGA TAG CTC-3' [SEQ ID: N° 10]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion Kpnl en cursiva). Los oligonucleotidos se construyeron segun la secuencia de argJ que esta presente en el genoma de la cepa B. subtilis subespecie subtilis cepa 168.

5 El fragmento de ADN amplificado y el plasmido pDAB5 se restringieron con las endonucleasas EcoRI y KpnI. En el caso de pDAB5, se obtuvieron dos fragmentos de 1355 pb y 7486 pb. El fragmento de 7486 pb que comprende el vector pJF119EH y el gen speF se aislo y se ligo con fragmento de ADN amplificado. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, la verificacion del plasmido pDAB37 10 (pJF119EH-argJBs-speC, 8749 pb) obtenido se llevo a cabo mediante analisis de restriccion y secuenciacion

posterior. Los analisis de secuencia revelaron que el gen argJ clonado a partir de B. subtilis ATCC 10783 difiere del gen argJ presentado para B. subtilis subespecie subtilis cepa 168. En comparacion con la protema ArgJ de B. subtilis subespecie subtilis cepa 168 (numero de registro CAB12961), la protema ArgJ codificada a partir del gen argJ presente en el plasmido pDAB37 muestra los siguientes intercambios: H72Q, P74A, T75A, L95I, F105L, 15 G110D, H134Q, E142Q, A169T, R181A, T216I, A242G, D255E, N353H, I363L, A380D, D383E.

(x) Construccion del plasmido pDAB38 (pJF119EH-argJCg-speF)

A fin de permitir la produccion en paralelo de la ornitina descarboxilasa SpeF y el gen ArgJ que codifica N2-acetil-L- ornitina:L-glutamato N-acetil transferasa procedente de Corynebacterium glutamicum, el gen que codifica argJ de C. glutamicum ATCC 13032 se clono en el speF-vector de expresion pDAB5 (vease (iv)) al reemplazar el gen argA 20 presente. El gen se clono con el RBS y el codon de parada originales.

El fragmento de ADN que contema argJ de 1219 pb se amplifico a partir de ADN cromosomico de C. glutamicum ATCC 13032 (numero de registro NC 006958 (C. glutamicum ATCC 13032, genoma completo); nucleotidos 1466650 - 1467869) usando los siguientes oligonucleotidos:

25 5'-ACA CAT CGA ATTCAG TAG GAG TTC CAC ATG G-3' [SEQ ID: N° 11]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion EcoRI en cursiva)

y

5'-AGT GCT GGT ACC TTT TAA GAG CTG TAC GC 3' [SEQ ID: N° 12]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion KpnI en cursiva).

30 El fragmento de ADN y el plasmido pDAB5 se restringieron con las endonucleasas EcoRI y KpnI. En el caso de pDAB5, se obtuvieron dos fragmentos de 1355 pb y 7486 pb. El fragmento de 7486 pb que comprendfa el vector pJF119EH y el gen speF se aislo y se ligo con el fragmento de ADN amplificado. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, la verificacion del plasmido pDAB38 35 (pJF119EH-argJCg-speF, 8679 pb) obtenido se llevo a cabo mediante analisis de restriccion y secuenciacion

posterior.

(xi) Construccion del plasmido pDAB3 (pJF119EH-speC„Res)

El gen speC que codifica ornitina descarboxilasa (constitutiva, biosintetica) de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) se clono en el vector de expresion pJF119EH (Furste, J. P. y cols. (1986), 40 Gene 48, 119-131), permitiendo una fuerte expresion genica basada en el control de la transcripcion bajo el promotor tac inducible por isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG) y el sistema represor lac (lacIQ). Por lo tanto, el gen codificante speC se clono con el RBS, el codon de inicio y el de parada originales.

El fragmento de ADN que contiene speCnRBS de 2235 pb se amplifico a partir de ADN cromosomico de E. coli LJ110 45 (numero de registro AE000379; nucleotidos 2650 - 4867) usando los siguientes oligonucleotidos:

5'-GAG CTC TAG ACC AGT TTG ACC CAT ATC T-3' [SEQ ID: N° 13]

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion Xbal en cursiva)

y

5'-TTG TGC ATG CTT ACT TCA ACA CAT AAC CGT AC-3' [SEQ ID: N° 14]

(mutaciones en negrita, sitio de restriccion SphI en cursiva).

Despues de la modificacion terminal con las endonucleasas Xbal y SphI, el producto de PCR se ligo en el plasmido pJFll9EH, que se corto del mismo modo. Despues de la transformacion en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que conteman 100 mg/l de ampicilina. Despues de la preparacion, la verificacion del plasmido pDAB3 (pJF119EH-speC„Res, 7491 pb) obtenido se llevo a cabo mediante analisis de restriccion y secuenciacion posterior.

Experimento comparativo A:

Produccion de 1,4-butanodiamina a traves de la unica sobreexpresion de ornitina descarboxilasa speC, con expresion genica inducida por IPTG (matraz agitado)

La influencia de la sobreexpresion del gen speC que codifica ornitina descarboxilasa sobre la produccion de DAB se investigo con la cepa hospedadora de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) que incluye el plasmido pDAB3 (vease (ix)).

Esta cepa se probo en experimentos en matraz agitado que utilizaban medio salino mmimo que consistfa en MgSO4-7H2O (300 mg/l), CaCh-2H2O (15 mg/l), KH2PO4 (3 g/l), K2HPO4 (12 g/l), NaCl (100 mg/l), (NH4)2SO4 (5 g/l), citrato Na-3H2O (1 g/l), FeSO4-7H2O (75 mg/l), tiamina HCl (vitamina B1) (5 mg/l) asf como los oligoelementos Al2(SO4)a-18H2O (3 mg/l), CoCl2'6H2O (1.05 mg/l), CuSO4'5H2O (3.75 mg/l), H3BO3 (0.75 mg/l), MnCh^O (30 mg/l), Na2MoO4-2H2O (4,5 mg/l), MSO46H2O (3 mg/l) y ZnSO4-7H2O (22,5 mg/l). Una solucion de reserva de glucosa (500 g/l) se trato en autoclave separadamente y se anadio al medio esterilizado hasta una concentracion final de 10 g/l.

Un precultivo de medio salino mmimo que contema 100 mg/l de ampicilina se inoculo con 1 - 5 pl/ml de solucion de reserva y se incubo a 33°C, 180 rpm durante 16 h hasta una OD620 de 2. Posteriormente, se usaron 5 ml de este cultivo para la inoculacion del cultivo principal que consistfa en 50 ml del mismo medio, que se incubo durante 24 h a 33°C y 180 rpm. Desde que las celulas alcanzaban una OD620 nm de 1,5 (despues de ~ 7 h), la expresion genica se indujo mediante la adicion de IPTG 10 pM.

A fin de observar la produccion de DAB dependiente del tiempo, se tomaron muestras en diferentes momentos durante el cultivo. Despues de la separacion de las celulas utilizando centrifugacion, el sobrenadante diluido se analizo mediante HPLC. Aqrn, las aminas contenidas se detectaron como derivados de orfo-ftaldialdel'ndo (OPA) a 230 nm en un instrumento Hewlett-Packard Serie 1100, usando una columna en fase inversa C18 (Nucleosil 120-5 C18, Macherey & Nagel, Duren, Alemania) equilibrada hasta 50% de tampon B (tampon A, acetato sodico 0,1 M, pH 7,2; tampon B metanol). Para la separacion, se aplico el siguiente gradiente: gradiente lineal de 1 - 7 min. desde 50% hasta 75% de tampon B con un caudal de 0,5 ml/min, 7 -13 min. de 75% a 85% de tampon B con un caudal de 0,5 ml/min, 13 - 14,5 min de 85% a 50% de tampon B con un caudal de 1 ml/min, 14,5 -17 min. de 50% de tampon B con un caudal de 1 ml/min y 17 - 20 min a 50% de tampon B con un caudal de 0,5 ml/min.

Mediante la utilizacion de sustancias estandar para la calibracion, se podfan determinar las siguientes concentraciones de DAB (vease la Tabla 1) y se podfan verificar mediante espectroscopfa de NMR.

Cepa usada Gen expresado Concentracion de DAB [mg/l] LJ110 pDAB3 speC 50

Tabla 1: Formacion de DAB utilizando la sobreproduccion de ODC en E. coli

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplos:

Mejora de la produccion de 1,4-butanodiamina mediante un incremento de la actividad de descarboxilacion de ornitina combinado con un incremento de la actividad de formacion de N-acetilglutamato

Ejemplo 1. Produccion de 1,4-butanodiamina utilizando sobreproduccion de ODC asf como ArgA (matraz agitado)

La influencia de la produccion en paralelo de N-acetilglutamato sintasa ArgA, que cataliza la primera etapa en la biosmtesis de ornitina partiendo de glutamato y ornitina descarboxilasas SpeF o SpeC sobre la produccion de DAB se investigo dentro de la cepa hospedadora de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) que incluye el plasmido pDAB5 (vease (iv)) o pDAB6 (vease (v)).

Estas cepas se probaron en experimentos de matraz agitado en medio salino mmimo (vease el Experimento comparativo A). Por lo tanto, un precultivo de medio salino mmimo que contema 100 mg/l de ampicilina se inoculo con 1 - 5 |jl/ml de solucion de reserva y se incubo a 33°C, 180 rpm durante 16 h hasta una densidad optica en 620 nm de 2. Posteriormente, se usaron 5 ml de este cultivo para la inoculacion del cultivo principal que consistfa en 50 ml del mismo medio, que se incubo durante 24 h a 33°C y 180 rpm. Desde que las celulas alcanzaban una OD620 nm de 1,5 (despues de ~ 7 h), la expresion genica se indujo mediante la adicion de IPTG 10 pM.

A fin de observar la produccion de DAB dependiente del tiempo, se tomaron muestras en diferentes momentos durante el cultivo. Despues de la separacion de las celulas utilizando centrifugacion, el sobrenadante se analizo mediante HPLC (vease el Experimento comparativo A). Mediante la utilizacion de sustancias estandar para la calibracion, se podfan determinar las siguientes concentraciones de DAB (vease la Tabla 2).

Tabla 2: Formacion de DAB utilizando sobreproduccion de ArgA y ODC en paralelo en E. coli

Ejemplo 2. Produccion de 1,4-butanodiamina utilizando sobreproduccion de ODC asf como ArgJ (matraz agitado)

La influencia de la produccion en paralelo del gen ArgJ que codifica N2-acetil-L-ornitina:L-glutamato N-acetil transferasa a partir bien de C. glutamicum o bien de B. subtilis, que cataliza la formacion de N-acetilglutamato y ornitina a partir de L-glutamato y N-acetilornitina y ornitina descarboxilasas SpeF o SpeC, sobre la produccion de DAB se investigo dentro de la cepa hospedadora E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) que incluye el plasmido pDAB37 (vease (ix)) o pDAB38 (vease (x)).

Estas cepas se probaron en experimentos en matraz agitado en medio salino mmimo (vease el Experimento comparativo A). Por lo tanto, un precultivo de medio salino mmimo que contema 100 mg/l de ampicilina se inoculo con 1 - 5 pl/ml de solucion de reserva y se incubo a 33°C, 180 rpm durante 16 h hasta una densidad optica a 620 nm de 2. Se usaron 5 ml de este cultivo para la inoculacion del cultivo principal que consistfa en 50 ml del mismo medio, que se incubo durante 24 h a 33°C y 180 rpm. Desde que las celulas alcanzaban una OD620 nm de 1,5 (despues de ~ 7 h), la expresion genica se indujo mediante la adicion de IPTG 50 pM.

A fin de observar la produccion de DAB dependiente del tiempo, se tomaron muestras en diferentes momentos durante el cultivo. Despues de la separacion de las celulas utilizando centrifugacion, el sobrenadante se analizo mediante NMR. Una muestra del sobrenadante de cultivo se ajusto hasta pH 5,8, se liofilizo y se redisolvio en D2O. 1H-NMR a 600 MHz a 323 K mostraba el espectro de resonancia esperado y la adicion de una pequena cantidad de DAB confirmaba la presencia de DAB. Mediante la utilizacion de sustancias estandar para la calibracion, se podfan determinar las siguientes concentraciones de DAB (vease la Tabla 3).

Tabla 3: Formacion de DAB utilizando sobreproduccion de ArgJ y ODC en paralelo en E. coli

Ejemplo 3. Mejora de la produccion de 1,4-butanodiamina dentro del lote partiendo de ornitina asf como arginina (matraz agitado)

Para demostrar la mejora adicional de la formacion de DAB partiendo de ornitina asf como arginina, se investigo la influencia de la sobreproduccion combinada de la ornitina descarboxilasa SpeF, la arginina descarboxilasa SpeA y la 5 agmatinasa SpeB. Ademas, a fin de asegurar un suministro de precursor apropiado, estas investigaciones se combinaron en un experimento adicional con la sobreproduccion de la N-acetilglutamato sintasa ArgA, que cataliza la primera etapa en la biosmtesis de ornitina partiendo de glutamato.

Por lo tanto, se llevaron a cabo cultivos en matraz agitado en medio salino mmimo (vease A.3) mediante la 10 utilizacion de la cepa hospedadora de E. coli LJ110 (Zeppenfeld, y cols., veanse los procedimientos generales) que incluye los plasmidos pDAB8 y pDAB10, respectivamente (veanse 2.2 y 2.3). Por lo tanto, un precultivo de medio salino mmimo que contiene 100 mg/l de ampicilina se inoculo con 1 - 5 pl/ml de solucion de reserva y se incubo a 33°C, 180 rpm durante 16 h hasta una densidad optica a 620 nm de 2. Posteriormente, se usaron 5 ml de este cultivo para la inoculacion del cultivo principal que consiste en 50 ml del mismo medio, que se incubo durante 24 h a 15 33°C y 180 rpm. Desde que las celulas alcanzaban una OD620 nm de 1,5 (despues de ~ 7 h), la expresion genica se

indujo mediante la adicion de IPTG 10 pM.

A fin de observar la produccion de DAB dependiente del tiempo, se tomaron muestras en diferentes momentos durante el cultivo. Despues de la separacion de las celulas utilizando centrifugacion, el sobrenadante se analizo 20 mediante HPLC (vease el Experimento comparativo A). Mediante la utilizacion de sustancias estandar para la calibracion, se podfan determinar las siguientes concentraciones de DAB (vease la Tabla 4).

Tabla 4: Formacion de DAB partiendo de ornitina asf con arginina en E. coli.