KR101835164B1 - 향상된 퓨트레신 생산능을 가지는 변이된 오르니틴 디카복실레이즈 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 향상된 퓨트레신 생산능을 갖는 변이된 오르니틴 디카복실레이즈 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변이된 오르니틴 디카복실라제 단백질은 천연형에 비하여 퓨트레신 전환 활성이 21배까지 증가될 뿐만 아니라, 기존 퓨트레신 생산 균주에 도입시에 퓨트레신 생산 활성을 확연히 증대시키는 바, 기존의 화학합성 경로의 대안으로 보다 효율적인 퓨트레신의 대량 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

향상된 퓨트레신 생산능을 가지는 변이된 오르니틴 디카복실레이즈 단백질 및 이의 용도{Modified Ornithine Decarboxylase protein with an improved producing capability for Putrescine and a Use thereof}
본 발명은 신규한 향상된 퓨트레신 생산능을 갖는 변이된 오르니틴 디카복실레이즈 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
퓨트레신(또는 1,4 부탄다이아민)은 나일론 4, 6을 포함하는 폴리아미드 4, 6의 생산을 위한 중요한 원료물질로서, 수소 시안화물(hydrogen cyanide) 첨가에 의해 아크릴로니트릴(acrylonitrile)로 생산되는 숙시노니트릴(succinonitrile)의 수소화를 통한 방법으로 산업적 규모에서 생산되었다. 이들 화학물질의 합성경로에서는 비 재생적인 석유화학적 산물을 원료 물질로서 필요로 하며, 상대적으로 다중 단계(multi step), 다중 반응기 설계(muti-reactor design) 뿐만 아니라, 값비싼 촉매시스템과 관련한 높은 온도와 압력이 필요하다. 게다가 매우 강한 독성과 가연성이 있는 반응물이기 때문에 기존의 화학합성 경로는 환경적인 측면에서 좋지 않다. 이에, 상기 화학생산공정의 대안으로 재생가능한 바이오매스 유래 탄소원으로부터 퓨트레신의 생산이 요구되고, 최근에는 친환경적인 미생물을 통해 생산하는 바이오화학 공정이 많은 주목을 받고 있다. 퓨트레신은 박테리아에서 동식물에 이르기까지의 전범위 유기체에서 발견되는 폴리아민의 한 종류이다. 대장균에서의 퓨트레신 농도는 약 2.8g/l로 매우 높다고 알려져 왔다. 또한, 미생물들은 고농도의 폴리아민에 잠재적으로 좋은 내성을 가져서, 고농도의 퓨트레신 존재 하에서 생장 또는 생존할 수 있다. 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 30 g/L 이상의 카다베린(cadaverine) 존재 하에서도 성장할 수 있다고 보고된 바 있다. 따라서, 산업적으로 이용 가능한 고농도의 폴리아민(퓨트레신)을 생산하기 위하여 미생물을 이용하려는 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 하지만, 미생물을 통해 퓨트레신을 생산하는 연구는 아직 산업적으로 적용할 정도의 수준에 못 미친 상태이어서 고수율의 퓨트레신 균주 개발은 앞으로도 지속적으로 진행되어야 한다 (Qian ZG, et al., Biotechnol Bioeng, 104: 651-662, 2009; Schneider J, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 88: 859-868, 2010).
한편, 오르니틴 디카복실라제(Ornithine decarboxylase, ODC)는 대부분의 미생물에 존재하는 효소로 오르니틴을 퓨트레신으로 전환하는 폴리아민 (퓨트레신, 스퍼미딘, 스퍼민)을 생산하는 첫 단계의 효소이다. 생성된 폴리아민은 DNA 구조 안정화와 DNA repair pathway에 중요한 물질이기 때문에 세포 생장(cell growth)에 반드시 필요한 물질이다. 대장균에서 ODC는 일반적으로 homodimer 형태를 이루며, dimer의 interface에 active site가 형성된다. ODC의 반응 메커니즘은 cofactor로 PLP(pyridoxal phosphate)를 필요로 하고, PLP가 효소의 활성 부위의 리신 잔기에 Schiff base(시프염기)를 형성하고 있다가 기질(substrate)인 오르니틴이 리신 잔기와 대체된 후, 탈카복실화(decarboxylation) 반응이 일어나게 된다. 퓨트레신이 생성되면 ODC는 다시 PLP와 Schiff base를 형성하게 된다.
기존 퓨트레신 생산 균주 Corynebacterium 속 균주에 도입된 ODC는 대장균의 speC 유전자로 코딩된 단백질로써 활성이 매우 낮게 보고되고 있다. 따라서, 고수율의 퓨트레신 생산 균주 개발하기 위해서는, 퓨트레신 생산 경로에서 마지막 단계 효소인 ODC의 개량은 매우 중요하다고 할 수 있다. 하지만, ODC 단백질의 경우 현재까지 구조나 반응 메커니즘 연구를 위한 변이 도입 등의 실험이 진행되어 왔을 뿐 활성 증가에 관련된 결과는 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 퓨트레신을 생산하는데 중요한 역할을 하나 낮은 활성을 보이는 ODC 단백질을 개량하기 위해 예의 노력한 결과, 신규한 변이 위치를 발굴하여 그 위치에 변이를 도입하여 향상된 퓨트레신 생산 능력을 가진 변이된 ODC 단백질을 제작하였으며, 기존 퓨트레신을 생산하는 미생물에 변이된 ODC 단백질을 도입하여, 퓨트레신을 고수율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 변이체인 변이된 오르니틴 디카복실레이즈(ornithine decarboxylase, ODC) 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이된 ODC 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 L-오르니틴(L-ornithine), L-오르니틴이 포함된 혼합물 또는 L-오르니틴 발효액에 상기 변이된 ODC 단백질을 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 퓨트레신 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물에 상기 변이된 ODC 단백질을 도입한, 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이된 ODC 단백질을 도입하여 향상된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물을 배양하는 단계: 및 상기 단계에서 수득되는 배양물로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 변이체인 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 오르니틴 디카복실레이즈(ornithine decarboxylase, ODC)의 N-말단으로부터 163번째 이소류신(isoleucine) 아미노산 잔기 또는 165번째 글루탐산(Glutamic acid) 아미노산 잔기가 돌연변이된 것인, 변이된 ODC 단백질을 제공한다.
본 발명에서 용어, "오르니틴 디카복실레이즈(ornithine decarboxylase, ODC)"는 폴리 아민을 합성하는데 있어 최초 단계이자 퓨트레신 생산 경로 중 마지막 단계인 하기 반응식을 촉매하는 효소이다. L-오르니틴을 기질로 하여 퓨트레신을 생산하는데, 피리독살인산(Pyridoxal phosphate, PLP)이 co-factor로 작용한다.
[반응식]
L-오르니틴 <=> 퓨트레신 + CO2
본 발명에서 오르니틴 디카복실레이즈(ornithine decarboxylase, ODC)는 바람직하게는 대장균 유래 ODC일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 유래 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 ODC일 수 있다.
본 발명에 있어서, ODC(ornithine decarboxylase)를 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다. 그 방법의 예로는 효소 발현에 통상적으로 널리 이용되는 대장균에서 효소를 고효율로 확보할 수 있도록 코돈 최적화가 포함된 유전자 합성 기술 그리고 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원의 스크리닝 방법을 통해 확보할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "변이된 ODC 단백질"이란 상기 ODC 단백질의 아미노산 서열상 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가, 제거 또는 치환된 ODC 단백질을 의미한다. 본 발명에서는 바람직하게는 ODC 단백질이 변이에 의해서 그 활성이 야생형과 비교하여 효율적으로 증가된 단백질을 의미한다. 본 발명에서 변이는 일반적으로 효소를 개량하기 위한 방법으로 당업계의 알려진 공지된 방법들이 제한없이 사용될 수 있으며, 이에는 합리적 설계 (rational design)와 유도 진화 (directed evolution)등의 전략이 있다. 예를 들어, 합리적 설계 전략에는 특정 위치의 아미노산을 위치-지정 돌연변이도입(site-directed mutagenesis) 등이 있고, 유도 진화 전략에는 무작위적인 변이를 일으키는 방법(random mutagenesis) 등이 있다. 또한, 자연적인 돌연변이에 의해 외부의 조작 없이, 163번째 및/또는 165번째 아미노산 잔기가 돌연변이된 것일 수 있다. 본 발명에서 용어, "변이된 ODC 단백질", "ODC 변이제" 및 "speC 변이체"는 혼용될 수 있다.
본 발명의 변이된 ODC 단백질은 바람직하게는, 대장균(Escherichia coli) 유래 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 오르니틴 디카복실레이즈(ornithine decarboxylase, ODC)의 N-말단으로부터 163번째 이소류신(isoleucine) 아미노산 잔기 또는 165번째 글루탐산(Glutamic acid) 아미노산 잔기가 돌연변이된 것일 수 있으며, 그 예로 상기 165번째 글루탐산이 알라닌(alanine), 글리신(Glycine), 세린(Serine) 또는 발린(Valine)으로 치환된 것이거나, 상기 163번째 이소류신이 알라닌(alanine), 글리신(Glycine), 세린(Serine) 또는 발린(Valine)으로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 163번째 이소류신과 165번째 글루탐산이 동시에 변이된 ODC 단백질로서, 163번째 이소류신과 165번째 글루탐산이 각각 알라닌, 발린, 세린 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된 것일 수 있으며, 대표적인 예로는, 바람직하게는 163번째 이소류신과 165번째 글루탐산이 각각 알라닌-알라닌, 알라닌-발린, 세린-발린 또는 발린-발린으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 다양한 조합의 야생형 ODC의 163, 165번 아미노산에 변이를 도입한 경우, 퓨트레신 생산능이 증가되는 것을 확인하여, 상기 위치가 퓨트레신 생산능이 향상된 ODC 변이체를 제작하는데 가장 중요한 위치임을 확인하였다. 특히, 상기 중요 변이 위치에 존재하는 아미노산을 작은 잔기(small residue) 아미노산(알라닌, 세린, 발린, 또는 글리신)으로 치환하는 변이를 통하여 퓨트레신 생산능이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 변이된 ODC 단백질은 서열번호 34 내지 서열번호 57 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 34 내지 서열번호 42, 서열번호 45, 서열번호 49 및 서열번호 57 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 이는 N 말단으로부터 163번째 이소류신 또는 165번째 글루탐산이 작은 잔기로 변이된 ODC 단백질에 대한 아미노산 서열로, 상기 변이를 포함하고 야생형보다 우수한 퓨트레신 전환 활성을 가지는 이상 상기 서열들과 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드를 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 두 개의 모이티 사이의 상동성이 결정될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "상동"은 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태인 슈퍼 패밀리 유래 단백질 및 다른 종 유래의 상동 단백질을 포함하며, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 발명에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용상에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 염기 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다. 하나의 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열이 아미노산 서열의 소정의 길이에 대해 폴리펩티드 매치가 적어도 21%(바람직하게 적어도 약 50%, 가장 바람직하게 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이다(예. Sambrook et al., 1989, infra 참고).
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 대장균 유래의 ODC 단백질의 구조 분석하여, 구조 정보를 기반으로 합리적 설계 전략을 통한 변이를 유도하였다. 기질이 활성 부위까지 접근하는 통로의 입구 부위(entrance region)를 넓히기 위한 변이(V156, D160, I163, E165, Q691) 및 활성 부위에 결합되는 co-factor인 PLP를 안정화시키기 위한 변이(N153, D309)를 설계 및 제조하였다(실시예 1 및 2). 구체적으로는, 통로의 입구 부위 bulky한 잔기를 작은 잔기(small residue)인 알라닌으로 교환하는 변이를 통하여 N 말단으로부터 163번째 아미노산인 이소류신과 165번째 아미노산인 글루탐산을 알라닌으로 치환하였을 때 ODC 단백질의 활성이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3). 한편, PLP 안정화를 위한 변이를 포함한 나머지 6종의 변이형 V156A, D160A, Q691A, N153D, N153E, D309E로 변이를 도입한 ODC 단백질은 야생형에 비해 활성이 매우 감소하거나 거의 없어지는 결과를 보였다. 이에 따라, 대장균 유래 ODC 단백질(서열번호 1)의 163번째 이소류신과 165번째 글루탐산이 단백질의 활성을 증가시키는데 중요한 잔기임을 확인하였다. 상기 변이의 도입은 표 2에 개시된 프라이머들과 PCR을 이용한 위치-지정 돌연변이를 통하여 이루어졌다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 추가적으로 상기 163번째 이소류신과 165번째 글루탐산을 알라닌으로 치환하는 것 외에 다른 작은 잔기들인 세린(serine), 발린(valine) 또는 글리신(glycine)으로도 치환하여, 해당 잔기에서의 변이를 최적화하고자 하였다(실시예 4 및 표 4). 163, 165 아미노산 잔기를 각각 글리신 (G, glycine), 세린 (S, serine), 발린 (V, valine)으로 단일 변이를 도입한 결과, 163 잔기의 경우에는 세린으로, 165 잔기의 경우에는 발린으로 치환한 경우가 kcat/KM 값이 야생형에 비해 각각 4.4배, 6.9배 증가한 활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 5). 이러한 결과를 바탕으로 두 잔기에 대해 이중 변이를 도입하여 활성을 확인하였다. 단일 변이 도입시 활성이 가장 높은 I163S와 E165V 조합을 모두 도입한 경우 야생형에 비해 8배 증가한 활성을 보인 것에 비해, 163, 165 잔기를 둘 다 발린으로 치환한 경우 야생형에 비해 21.3배 증가한 활성을 보여 가장 높은 활성을 지닌 것으로 확인되었다(실시예 4 및 표 5).
전체적으로, ODC 효소 변이체들의 활성 증가는 KM값의 감소보다는 kcat 값의 증가로 인한 kcat/KM 값의 증가로 나타났다. 이는 변이 도입으로 인해 기질인 오르니틴의 효소에 대한 결합 친화성의 증가보다는 생성물인 퓨트레신으로 전환되는 속도를 증가시키는 방향으로 ODC 효소의 구조가 변한 것을 암시한다.
본 발명에서 오르니틴을 퓨트레신으로 전환하는 ODC 효소의 활성 측정 방법은 ODC 효소가 매개하는 반응을 이용한다. 구체적으로는, ODC 효소가 오르니틴 한 분자를 퓨트레신으로 전환할 때 물 분자 한 개가 소모되고 퓨트레신과 함께 이산화탄소 한 분자와 OH- 이온 한 분자가 생성된다. 이에 따라, 전체적인 pH는 증가하게 되므로, 증가한 pH를 pH 지시약 중 하나인 페놀 레드 (phenol red)로 559 nm에서 측정하면, 반응이 진행되어 pH가 증가한 양에 비례해서 흡광도의 값도 증가하게 된다. 이러한 반응 특성을 이용하여 간접적으로 퓨트레신 생성량을 측정하였다.
본 발명에서 용어, "오르니틴"은 오르니틴 회로에서 중요한 역할을 하는 염기성 아미노산으로, 특히 L-오르니틴은 식물, 동물, 미생물에서 널리 발견된다. 일반적으로 오르니틴 회로를 가진 생체 내에서는 요소 생산과 관계하여 대사상 중요한 역할을 한다. 또한, 생체 내에서 아르기닌, 글루탐산, 프롤린과 서로 변환될 수 있으며, a-케톤산, 글리옥살산과 아미노기 전달을 한다. 오르니틴 디카복실라제에 의해서 아민(퓨트레신)을 생성하는 기질로 이를 통해 폴리아민으로까지 합성된다. 본 발명에서는 특히 오르니틴 디카복실라제의 기질로써 사용될 수 있는 L-오르니틴일 수 있다.
본 발명에서 용어, "퓨트레신"은 오르니틴의 디카복실 반응이나 아그마틴의 가수분해에 의해 생성되는 물질로, 부패물에도 존재하나 생체에 정상적인 성분으로 널리 분포한다. 폴리아민의 일종으로 리보솜을 구성하고, 세포의 생장을 촉진하거나 RNA 합성을 촉진하는 기능을 가진다. 특히, 산업적으로는 나일론 4, 6을 포함하는 폴리아미드 4, 6의 생산을 위한 중요한 원료물질에 해당하며, 대량 생산을 위한 연구의 필요성이 계속되고 있는 물질이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 변이된 ODC 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에서 용어, "핵산분자"는 DNA 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 변이된 ODC 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다. 용어 "벡터"는 또한 트랜스포존, 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 벡터는 본 발명의 변이된 ODC 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 핵산 분자를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
당업계에서 통상적으로 사용되는 T7 프로모터를 이용하는 pET 시스템(novagen)은 잘 알려져 있으며, 당업계에 공지된 다양한 발현 시스템을 이용할 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에서 변이된 ODC 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 pET28a 벡터일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, PCR을 통하여 위치-지정 돌연변이된 ODC 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 pET28a 벡터에 삽입하였다. 이를 통하여, 변이된 ODC(speC) 발현 벡터인, pET28a-speC_I163A, pET28a-speC_I163G, pET28a-speC_I163S, pET28a-speC_I163V, pET28a-speC_E165A, pET28a-speC_E165S, pET28a-speC_E165G, pET28a-speC_E165V, pET28a-speC_I163A_E165A, pET28a-speC_I163S_E165V, pET28a-speC_I163A_E165V, pET28a-speC_I163V_E165V를 제조하였으며, 변이 도입 여부는 서열분석을 통하여 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 벡터가 도입되어 형질전환된 대장균(E. coli), 코리네박테리움 속, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 L-오르니틴(L-ornithine), L-오르니틴이 포함된 혼합물 또는 L-오르니틴 발효액에 상기 변이된 ODC 단백질을 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 퓨트레신 제조방법을 제공한다.
L-오르니틴, 변이된 ODC 단백질 및 퓨트레신 등은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 퓨트레신 제조를 위해 변이된 ODC 단백질과 반응시키는 물질은 L-오르니틴, L-오르니틴이 포함된 혼합물 또는 L-오르니틴 발효액이 될 수 있다. 상기 L-오르니틴이 포함된 혼합물은 별도로 존재하던 L-오르니틴과 다른 성분이 혼합된 혼합물을 의미하며, L-오르니틴 발효액은 발효의 과정을 통하여 L-오르니틴이 생성되거나 함량이 상승하여 반응을 위한 충분한 L-오르니틴을 포함하는 발효액을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들면, 발효의 과정을 통하여 L-오르니틴을 생성하는 방법 및 생성된 발효액에 대하여는, 기존 미국등록 특허출원 제 3668072호 등에 개시된 바 있다(E. coli, ATCC 21104).
본 발명에서, 상기 변이된 ODC 단백질은 정제된 변이된 ODC 단백질 또는 변이된 ODC 단백질이 포함되는 미생물 발효액일 수 있다. 바람직하게는 상기 미생물 발효액을 제조할 때 사용되는 미생물은 본 발명의 변이된 ODC 단백질을 발현하는 미생물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 변이된 ODC 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체 미생물일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물에 상기 변이된 ODC 단백질이 도입된, 퓨트레신 생산능이 향상된 미생물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물일 수 있다.
본 발명에서 용어, "퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp .) 미생물"이란 천연형 또는 변이를 통하여 퓨트레신 생산능을 가지고 있는 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다. 코리네박테리움 속 미생물의 배양물이 퓨트레신을 가지고 있는 것은 이미 알려져 있었다. 다만, 퓨트레신의 생산능이 현저히 낮으며 생산 기작에 작용하는 유전자나 기작 원리가 밝혀지지 않은 상태이다. 따라서, 본 발명에서 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물이란 천연형 균주 자체 또는 외부 퓨트레신 생산 기작과 관련된 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 약화시켜 향상된 퓨트레신 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다.
본 발명에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에서 코리네박테리움 속 미생물은 고농도의 퓨트레신에 노출되더라도 세포 생장과 생존에 영향을 적게 받는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다. 또한, 바람직하게는 NCgl1469 단백질의 활성을 내재적 활성보다 약화시켜 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(KCCM11240P (KCCM11138P △NCgl1469))일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 KCCM-11240P 균주는 세포내에서 퓨트레신이 N-아세틸 퓨트레신으로 합성되는 경로를 차단시키기 위하여 NCgl1469를 코딩하는 유전자를 결실시킨 퓨트레신 과생산 균주이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, NCgl1469 단백질의 활성을 내재적 활성보다 약화시켜 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물(KCCM11240P (KCCM11138P △NCgl1469))을 기초로 하여, 상기 퓨트레신 전환 활성이 증가된 ODC I163S/E165V(speC) 변이체를 염색체 내 야생형 speC에 도입시킨 변이균주를 제작하였다(실시예 6). 상기 변이균주를 Corynebacterium glutamicum CC01-0578로 명명하고, 2013년 6월 10일자로 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 수탁번호 KCCM11425P로 기탁하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 변이된 ODC 단백질을 도입하여 향상된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 단계에서 수득되는 배양물로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Corynebacterium glutamicum CC01-0578(수탁번호 KCCM11425P) 균주일 수 있다.
본 발명에서 용어, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 퓨트레신을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산 암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 퓨트레신의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. 퓨트레신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 퓨트레신을 생산하는 방법은, 세포 또는 배양물로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양물로부터 퓨트레신을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 변이된 오르니틴 디카복실라제 단백질은 천연형에 비하여 퓨트레신 전환 활성이 21배까지 증가될 뿐만 아니라, 기존 퓨트레신 생산 균주에 도입시에 퓨트레신 생산 활성을 확연히 증대시키는 바, 기존의 화학합성 경로의 대안으로 보다 효율적인 퓨트레신의 대량 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 대장균 유래 ODC 단백질에 I163A 또는 E165A 변이를 도입한 단백질과 천연형 단백질의 퓨트레신 전환 활성을 비교측정한 도면이다. 구체적으로는, 전환 반응이 일어남에 따라 pH가 증가하게 되는데 pH 증가를 페놀 레드 확인하여 흡광도의 증가를 확인하였다. 천연형 ODC 단백질에 비하여 I163A 및 E165A 변이 도입된 ODC 단백질의 퓨트레신 전환 활성이 우월한 것을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. ODC ( ornithine decarboxylase ) 구조 분석 및 변이체 설계
일반적으로 대장균은 2 가지 형태의 ODC를 가지고 있다고 알려져 있다. 한가지는 주변 pH가 산성 상태일 때 발현유도되는 inducible ODC (speF)이고, 다른 하나는 퓨트레신과 같은 diamine을 생산하는데 관여하는 constitute ODC (speC)이다(Applebaum DM, et al., Biochemistry, 16: 1590-1581, 1977). 이 중에서 퓨트레신 생산에 관여하는 constitute ODC인 speC를 목적 유전자로 선정하였다.
현재까지 박테리아에서는 비브리오균과 락토바실러스균의 ODC의 구조가 밝혀져 있는데, 이 중 대장균의 ODC (speC)는 락토바실러스 30a ODC와 유사한 구조를 가질 것으로 예측되었다. 따라서, 락토바실러스 ODC 3D 구조를 기반으로 대장균 ODC (speC)의 아미노산 서열을 GeneDoc 프로그램을 이용하여 정렬비교(align)하였다(Momany C, et al., J Mol Biol, 4: 849-854, 1995). 아미노산 서열을 비교한 결과 대장균 speC와 락토바실러스 30a ODC의 서열 동일성은 53%, 유사성은 65 %로 두 효소는 매우 유사한 단백질로 판명되었다. 따라서, RCSB Protein Data Bank에 나와있는 락토바실러스 30a ODC (PDB ID: 1ORD) 구조를 기반으로 대장균 speC 구조를 상동성 모델링(homology modeling)을 진행하였다. 그 결과 단백질의 전체적인 골격이 거의 유사하였고, PLP(pyridoxal phosphate)과 결합하는데 관여하는 활성 부위(active site)의 아미노산 서열도 거의 동일하게 나타났다.
두 효소의 구조 분석결과 ODC의 경우에는 이량체 형태로 세포 내에서 존재하고 이량체의 경계면(interface)에 활성 부위가 형성되는데, 기질이 활성 부위까지 접근하는 통로의 입구 부위(entrance region)가 협소한 것으로 분석되었다. 이에, 기질이 활성 부위까지 효과적으로 들어오고 생성물이 빠르게 전환되도록 하기 위해 입구 부위를 넓혀주기 위하여, 입구 부위에 있는 bulky한 잔기를 대상으로 하여 작은 잔기로 치환하는 변이를 도입하는 변이를 설계하였다(V156, D160, I163, E165, Q691).
추가로 활성 부위에 결합되어 있는 co-factor인 PLP를 안정화시키기 위하여 활성 부위 주변 잔기에 대하여도 변이를 설계하였다(N153, D309).
실시예 2. 대장균 ODC ( speC ) 유전자 클로닝 및 발현
대장균 speC 유전자를 발현시키기 위하여 통상적으로 효소 발현을 위해 이용되는 pET28a (Novagen) 벡터 시스템을 사용하였다. 우선적으로 speC 유전자는 대장균 야생형 균주 W3110의 염색체를 주형으로 하여 하기 표 1에 개시된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 증폭을 통해 얻은 유전자 단편과 벡터 pET28a는 NdeI과 XhoI 제한효소를 처리(37°C, 3시간)한 후, 통상적인 라이게이션 기법을 사용하여 pET28a 벡터에 speC 유전자 단편을 삽입하였다.
프라이머 프라이머 서열
speC_start (NdeI)_5
(서열번호 2)		 5'-cagccatatgaaatcaatga-3'
speC_stop (XhoI)_3
(서열번호 3)		 5'-ggtgctcgagttacttcaac-3'
상기에서 제작된 speC 발현 벡터(pET28a-speC)의 변이 도입 여부는 서열분석으로 확인하였다.
실시예 1에서 대상 잔기에 대해서는 각각 작은 잔기인 알라닌(alanine)으로 치환하는 변이를 도입하였고, PLP 안정화를 위해서는 PLP와 결합하는 위치에 따라서 각각 다른 변이를 도입하였다.
상기에서 제작한 pET28a-speC 벡터를 주형으로 하여 상기 표 1과 하기 표 2에 개시된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 1차로는 speC 유전자 내에 변이를 도입하기 위해 변이를 일으키고자 하는 부위를 중심으로 앞쪽 부분(5')과 뒷쪽 부분(3')에 대하여 각각 PCR을 진행한 다음, 2차로 두 개의 PCR 단편을 합치는 PCR을 수행하였다. 예를 들어, speC V156A의 경우, 앞쪽 부분 speC_start (NdeI)_5 (서열번호 2)과 speC_V156A_3 (서열번호 5) 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하고, 뒤쪽 부분은 speC_V156A_5 (서열번호 4)과 speC_stop (XhoI)_3 (서열번호 3) 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 1차 PCR을 통하여 얻은 두 개의 PCR 단편을 2차 PCR의 주형으로 사용하고, speC_start (NdeI)_5 (서열번호 2)과 speC_stop (XhoI)_3 (서열번호 3) 프라이머를 사용하여 PCR을 진행하였다. 최종적으로 얻어진 speC V156A 유전자는 상기 speC 유전자 단편과 동일한 방식으로 pET28a 벡터에 삽입하였다. 그 외 나머지 변이들도 표 2에 개시된 프라이머들을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 진행하여 pET28a 벡터에 삽입하였다.
상기에서 제작된 speC 변이체 발현 벡터 (pET28a-speC_V156A, pET28a-speC_D160A, pET28a-speC_I163A, pET28a-speC_E165A, pET28a-speC_Q691A, pET28a-speC_N153D, pET28a-speC_N153E, pET28a-speC_D309E)들의 변이 도입 여부는 서열분석을 통하여 확인하였다.
입구 부위 변이
speC_V156A_5
(서열번호 4)		 5'-gctgacgcaaaattgggcgatctgctta-3'
speC_V156A_3
(서열번호 5)		 5'-ccaattttgcgtcagcgttacacatatc-3'
speC_D160A_5
(서열번호 6)		 5'-attgggcgctctgcttattcatgaagga-3'
speC_D160A_3
(서열번호 7)		 5'-aagcagagcgcccaattttacgtcagcg-3'
speC_I163A_5
(서열번호 8)		 5'-ctgcttgctcatgaaggatcggcgaaag-3'
speC_I163A_3
(서열번호 9)		 5'-ttcatgagcaagcagatcgcccaatttt-3'
speC_E165A_5
(서열번호 10)		 5'-attcatgcaggatcggcgaaagatgcgc-3'
speC_E165A_3
(서열번호 11)		 5'-cgatcctgcatgaataagcagatcgccc-3'
speC_Q691A_5
(서열번호 12)		 5'-gagctggcaggtgtttatagcgaaaccg-3'
speC_Q691A_3
(서열번호 13)		 5'-aacacctgccagctccggcgaaaatccc-3'
PLP 안정화 변이
speC_N153D_5
(서열번호 14)		 5'-tatgtgtgacgctgacgtaaaattgggc-3'
speC_N153D_3
(서열번호 15)		 5'-gtcagcgtcacacatatcggcgcgaaag-3'
speC_N153E_5
(서열번호 16)		 5'-tatgtgtgaagctgacgtaaaattgggc-3'
speC_N153E_3
(서열번호 17)		 5'-gtcagcttcacacatatcggcgcgaaag-3'
speC_D309E_5
(서열번호 18)		 5'-ctgtttgaatccgcgtgggtcggttatgaa-3'
speC_D309E_3
(서열번호 19)		 5'-cgcggattcaaacagaatgtaatcacaca-3'
실시예 3. ODC ( speC ) 변이체 효소들의 퓨트레신 합성 활성 측정
3-1. ODC 변이체 효소 수득
상기 실시예 2에서 제조한 pET28a-speC 변이체 벡터들을 DE3 유전자형을 가진 대장균에 도입하여 효소를 획득할 수 있는 균주를 제작하였다.
상기 pET28a-speC 변이체 벡터의 발현은 pET 시스템 메뉴얼 (Novagen)을 참조하였다. 구체적으로는, 평판 LB 배지에서 각각의 균주의 단일 콜로니를 선별하여 3 ml LB 액체배지 (+kanamycin 50 ug/ ml)에 접종하여 37°C, 200 rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 15 ml LB 배지 (+kanamycin 50 ug/ ml)에 재접종하여 OD600 조건에서 0.6 정도가 되도록 동일한 배양 조건에서 키운 직후, 최종 농도가 0.5mM가 되도록 IPTG를 첨가하여 18°C, 180rpm, 20시간 배양하여 효소 발현을 유도하였다.
효소 발현 유도 후 수득한 세포를 초음파 분쇄한 뒤 원심분리하였으며 이로부터 수득한 상층액을 1차 활성 평가를 위해 사용하였다. 추가로 효소의 특성을 파악하기 위하여 정제 후 2차 활성 평가를 진행하였는데, 효소는 pET 벡터를 통해 효소에 결합하여 발현된 his-tag을 이용하여 Ni-NTA column으로 분리하였다. 정제에는 Chelating Excellose spin kit (Bioprogen)을 사용하였다. 상기 과정으로 획득한 ODC (SpeC 야생형과 변이형) 효소들은 8% SDS PAGE을 통해 각각 soluble한 형태로 발현되어 상층액으로부터 수득할 수 있음을 확인하였다.
3-2. ODC ( speC ) 변이체 효소들의 퓨트레신 합성 활성 측정
오르니틴을 기질로 사용하여 ODC에 의한 퓨트레신 합성 여부 정도를 평가하기 위해 상기 실시예 3-1에서 수득한 ODC (SpeC 야생형과 변이형) 효소들의 활성을 측정하였다. 퓨트레신 합성 활성을 파악하기 위한 ODC의 활성 평가 조건은 기존 문헌 보고를 참고하여 진행하였다 (Vienozinskiene J, et al, Anal Biochem, 146: 180-183, 1985).
즉, 오르니틴 한 분자가 ODC 효소에 의해 퓨트레신이 만들어지게 되면 물 분자 한 개가 소모되고 퓨트레신과 함께 이산화탄소 한 분자와 OH- 이온 한 분자가 생성되게 되므로 전체적인 pH는 증가하게 된다(반응식 1). 증가한 pH는 pH 지시약 중 하나인 페놀 레드 (phenol red)에 의해 559nm에서의 흡광도가 변하게 되고, pH가 증가한 양에 비례해서 흡광도의 값도 증가하게 된다. 이러한 반응 특성을 이용하여 간접적으로 퓨트레신 생성양을 측정할 수 있게 되는 특성을 이용하여 퓨트레신 생성양을 측정하였다.
[반응식 1]
L- ornithine + H 2 O -> putrescine + CO 2 + OH -
ODC 효소들의 1차 활성 평가를 위해, 정제전 상층액은 단백질 정량을 하여 농도를 동일하게 맞춰 주었다. 반응 조건은 효소 상층액 30ug, 10mM 오르니틴, 1.25uM PLP이 되도록 반응액을 만든 뒤, 40uM 페놀 레드로 pH 변화량을 모니터링 하였다.
측정해 본 결과, ODC 변이형 효소들 중 야생형보다 퓨트레신 생성 속도가 증가된 것은 I163A와 E165A였다. 나머지 6종의 변이형 V156A, D160A, Q691A, N153D, N153E, D309E로 변이를 도입한 ODC는 559nm에서의 흡광도 변화가 거의 없는 양상을 보였다(도 1 참조).
1차 스크리닝에서 선별된 ODC 변이체 I163A와 E165A 두 효소의 특성을 구체적으로 파악하기 위해 his-tag으로 정제한 된 정량하여 오르니틴 농도별 퓨트레신 합성 속도를 측정하였다. 사용한 ODC 효소 농도는 10ug, 오르니틴 농도는 0.15~10mM 구간에서 상기와 같이 페놀 레드로 pH 변화량을 측정하였다.
ODC 효소 KM(mM) kcat(sec-1) kcat/KM(sec-1M-1) fold(kcat/KM)
WT (야생형) 1.5 1.6 1.1 x 103 1.0
I163A 변이형 0.7 1.8 2.6 x 103 2.4
E165A 변이형 1.1 2.4 2.2 x 103 2.0
상기의 결과로부터, ODC 구조 분석을 통해 설계한 I163A, E165A 변이형 ODC 효소가 야생형에 비해 KM 값이 각각 53%, 27%. 감소하여, 기질인 오르니틴의 결합 친화도(binding affinity)가 증가한 것을 알 수 있었다. 또한, kcat 값은 WT에 비해 I163A 변이형은 12.5%, E165A 변이형은 50% 증가된 값을 보임에 따라 오르니틴을 퓨트레신으로 전환하는 능력도 증가한 것을 알 수 있었다. 최종적으로, 효소 활성의 특징을 나타내는 kcat/KM 값을 계산한 결과, WT에 비하여 I163A 변이형은 2.4배, E165A 변이형은 2배나 증가한 것을 확인할 수 있었다 (표 3).
실시예 4. ODC ( speC ) 변이 최적화
상기 실시예 3에서 확인된 바대로 ODC 활성에 중요한 잔기인 163번째 아미노산(이소류신) 및 165번째 아미노산(글루탐산)에 대해서 다양한 종류의 작은 크기의 아미노산으로 변이를 도입하였다. 변이 도입은 상기 실시예 1에 나와있는 방법과 동일한 방법으로 수행하였으며, 이에 사용된 프라이머는 하기 표 4와 같다. 추가로 163, 165 위치에 각각 단일 변이를 도입한 뒤, 각 위치에 ODC 활성 증가된 변이 조합 도입된 이중 변이체(double mutant)를 제작하여 평가하였다.
프라이머 프라이머 서열
speC_I163G_5
(서열번호 20)		 5'-ctgcttggtcatgaaggatcggcgaaagat-3'
speC_I163G_3
(서열번호 21)		 5'-ttcatgaccaagcagatcgcccaatttt-3'
speC_I163S_5
(서열번호 22)		 5'-ctgctttctcatgaaggatcggcgaaagat-3'
speC_I163S_3
(서열번호 23)		 5'-ttcatgagaaagcagatcgcccaatttt-3'
speC_I163V_5
(서열번호 24)		 5'-ctgcttgttcatgaaggatcggcgaaagat-3'
speC_I163V_3
(서열번호 25)		 5'-ttcatgaacaagcagatcgcccaatttt-3'
speC_E165G_5
(서열번호 26)		 5'-attcatggaggatcggcgaaagatgcgc-3'
speC_E165G_3
(서열번호 27)		 5'-cgatcctccatgaataagcagatcgccc-3'
speC_E165S_5
(서열번호 28)		 5'-attcattcaggatcggcgaaagatgcgc-3'
speC_E165S_3
(서열번호 29)		 5'-cgatcctgaatgaataagcagatcgccc-3'
speC_E165V_5
(서열번호 30)		 5'-attcatgtaggatcggcgaaagatgcgc-3'
speC_E165V_3
(서열번호 31)		 5'-cgatcctacatgaataagcagatcgccc-3'
상기 표 4의 프라이머로 도입된 ODC 변이체들은 실시예 2 및 3에 개시된 방법에 따라 정제되고, 퓨트레신 합성 속도를 측정하였다. 상기 제조된 ODC 변이체들에 대한 퓨트레신 합성 속도 측정 결과는 하기 표 5와 같다.
ODC 효소 KM(mM) kcat (sec-1) kcat/KM(sec-1M-1) fold(kcat/KM)
WT (야생형) 1.5 1.6 1.1 x 103 1.0
I163G 변이형 1.7 4.2 2.5 x 103 2.3
I163S 변이형 1.5 7.4 4.8 x 103 4.4
I163V 변이형 1.3 4.4 3.5 x 103 3.2
E165G 변이형 3.0 5.6 1.9 x 103 1.7
E165S 변이형 1.9 10.1 5.2 x 103 4.7
E165V 변이형 1.4 10.9 7.6 x 103 6.9
I163A E165A
변이형		 1.5 6.4 4.1 x 103 3.7
I163S E165V
변이형		 1.2 10.5 8.8 x 103 8.0
I163A E165V
변이형		 0.9 6.3 6.8 x 103 6.2
I163V E165V
변이형		 1.1 25.7 2.3 x 103 21.3
상기 표 5에 나타난 바와 같이 163, 165 아미노산 잔기를 각각 글리신 (G, glycine), 세린 (S, serine), 발린 (V, valine)으로 단일 변이를 도입한 결과, 163 잔기의 경우에는 세린으로, 165 잔기의 경우에는 발린으로 치환한 경우가 kcat/KM 값이 야생형에 비해 각각 4.4배, 6.9배 증가한 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 바탕으로 두 잔기에 대해 이중 변이를 도입하여 활성을 확인하였다. 놀랍게도, 단일 변이 도입시 가장 높았던 I163S와 E165V 조합의 이중변이로 바꿔준 경우보다 163, 165 잔기를 둘 다 발린으로 치환한 경우가 야생형에 비해 21.3배가 증가한 가장 높은 활성을 나타내었다.
전체적으로, ODC 효소 변이체들의 활성 증가는 KM값의 감소보다는 kcat 값의 증가로 인한 kcat/KM 값의 증가로 나타났다. 이는 변이 도입으로 인해 기질인 오르니틴의 효소에 대한 결합 친화성의 증가보다는 생성물인 퓨트레신으로 전환되는 속도를 증가시키는 방향으로 ODC 효소의 구조가 변한 것을 암시한다.
실시예 5. 오르니틴 기질로 하는 ODC 변이체 효소 발현 균주 제조 및 퓨트레신 전환 측정
상기 실시예 4에서 변이 최적화한 ODC 변이체 효소가 실제 미생물 내에서도 오르니틴을 퓨트레신으로 전환하는데 효과가 있는지 평가해 보았다.
구체적으로는, 상기 제작한 pET28a-speC 변이체 벡터들을 DE3 유전자형을 갖는 대장균에 도입한 균주를 가지고 실험을 진행하였다. 평판 LB 배지에서 각각의 균주의 단일 콜로니를 선별하여 3 ml LB (+kanamycin 50 ug/ ml) 액체배지에 접종하여 37°C, 200 rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 25 ml LB (+kanamycin 50 ug/ ml 및 0.2% glucose) 액체 배지에 재접종하여 OD600 값이 0.5~0.6이 되도록 배양하였다. 이후 0.5 mM IPTG를 첨가하여 ODC (speC)의 발현을 유도하였으며, 18°C, 200rpm 조건으로 20시간 배양한 뒤 원심분리하여 상층액을 제거하여 세포를 수득하였다. 응집체(pellet) 형태로 수득한 세포를 다시 1X M9 최소 배지 (3.37mM Na2HPO4, 2.2mM KH2PO4, 0.86mM NaCl, 0.94mM NH4Cl)에 재현탁하여 OD600 에서의 값이 20이 되도록 조정하고, 추가로 기질인 10mM 오르니틴과 co-factor인 0.5 uM PLP를 첨가하여 최종 반응 부피가 10 ml이 되도록 하였다. 반응 조건은 25°C, 200 rpm 조건으로 shaking하면서 시간별로 sampling하여 TNBS를 이용한 퓨트레신 정량 측정 방법으로 전환된 퓨트레신 농도를 측정하였다 (Ngo TT, et al., Anal Biochem, 160: 290-293, 1987).
TNBS 방법은 상기에서 sampling한 배양액을 원심분리한 뒤 상층액을 50배 희석하여 분석을 진행하였다. 희석한 분석 시료 0.5 ml에 4N NaOH 1 ml 첨가한 뒤 잘 섞어주고, 여기에 1-pentanol 2 ml을 넣고 다시 잘 섞어 주었다. 2000 rpm에서 5 min 동안 원심분리한 뒤 상층액 1 ml을 0.1 M Na2B4O7 (pH 8.0) 1 ml이 들어있는 새 튜브에 넣어주고 잘 섞었다. 다시 10mM TNBS 1 ml을 첨가한 뒤 섞고, DMSO 2 ml을 넣고 섞고난 후, 원심분리한 뒤 상층액을 취해 426nm에서 흡광도를 측정하였다.
0 hr 2 hr 4 hr
put (mM) 전환율 (%) put (mM) 전환율 (%) put (mM) 전환율 (%)
WT 야생형 1.6 16 5.7 57 8.6 86
I163V
변이체		 1.5 15 7.5 75 9.8 98
E165V
변이체		 1.6 16 7.9 79 10.1 100
I163V E165V
변이체		 1.6 16 7.7 77 10.0 100
야생형과 ODC 변이체 3종에 대해 퓨트레신 전환 측정 실험을 진행한 결과, ODC 변이체가 상대적으로 오르니틴을 퓨트레신으로 전환하는 속도가 반응 2시간 sample에서 야생형에 비해 약 32~39% 정도 증가된 결과를 나타내었다. ODC 변이체간의 전환 속도 차이는 거의 없었고 in vitro 실험에서 보였던 정제한 ODC 변이체간에서 보이는 큰 활성 차이는 보이지 않았지만, 야생형의 경우 4시간이 지나도 반응이 완전히 끝나지 않은 결과를 보였지만 변이체는 4시간 이내에서 반응이 거의 끝난 양상을 보였다. 상기 결과로써, in vivo 실험인 효소 전환 균주에서도 ODC 변이체의 증가된 활성 효과를 확인하였다.
실시예 6. ODC 변이체 도입 퓨트레신 생산 균주 제조 및 퓨트레신 생산능 측정
상기 제조된 퓨트레신 전환 활성이 증가한 ODC 변이체를 실제 퓨트레신 생산 균주에 도입하여 퓨트레신 생산성에 어떤 영향을 주는지 퓨트레신 생산능을 측정하였다.
6-1. ODC 변이체 도입 퓨트레신 생산 균주 제작
NCgl1469 단백질의 활성을 내재적 활성보다 약화시켜 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물(KCCM11240P)을 기초로 하여, 상기 퓨트레신 전환 활성이 증가된 ODC (speC) 변이체를 염색체 내 야생형 speC에 도입시킨 변이균주를 제작하였다.
상기 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(KCCM-11240P) 균주는 모균주로 특허출원 (특허공개 제2012-0064046호)에 개시된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물(KCCM11138P)을 기초로 하여 제작하였다. 좀 더 구체적인 균주 제작 방법은 ATCC13032 균주의 유전자 NCgl1469의 염기서열을 바탕으로 NCgl1469의 N-말단 부분와 C-말단 부분을 pDZ 벡터에 클로닝하여 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 (KCCM11138P) 균주에 전기 천공법을 이용하여 도입한 뒤, kanamycine(25 ㎍/㎖)이 함유된 배지에 도말한 뒤 선별 하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 배지에서 푸른색을 나타내는 콜로니를 선별하였으며. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 배양한 뒤 희석하여 X-gal을 포함하고 있는 항생제가 없는 배지에 도말하여 낮은 비율로 나타나는 백색 콜로니을 선별함으로써 교차(cross over)에 의해 최종 NCgl1469 유전자 결실 균주를 선별하였다. 최종적으로 제작된 KCCM11138P △NCgl1469 균주는 세포내에서 퓨트레신 분해 경로 중 하나인 퓨트레신이 N-아세틸 퓨트레신으로 분해되는 경로에 관여하는 단백질인 NCgl1469를 코딩하는 유전자를 결실시켜 모균주인 KCCM11138P 균주보다 퓨트레신 생산능이 향상된 퓨트레신 과생산 균주이다.
구체적으로, 상기 실시예 2 및 4에서 제작한 ODC (speC) 변이체의 DNA를 하기 표 7에 개시한 speC_start (BamHI)_5, speC_stop (XbaI)_3 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 구체적으로는, 상기 제작한 pET28a-speC 변이체 (I163S, I163V, I163S E165V) 벡터들을 주형으로 하고, 하기 표 7에 개시한 speC_start (BamHI)_5, speC_stop (XbaI)_3의 두 개의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
프라이머 프라이머 서열
speC_start (BamHI)_5
(서열번호 32)		 5'-cgcggatccatgaaatcaatgaatattgc-3'
speC_stop (XbaI)_3
(서열번호 33)		 5'-gctctacattacttcaacacataaccgt-3'
PCR 증폭을 통해 얻은 유전자 단편들과 벡터 pDZ를 BamHI과 XbaI 제한효소로 처리(37°C, 3시간)한 후, 통상적인 라이게이션(ligation) 기법을 사용하여 pDZ 벡터에 speC 변이체들의 유전자 단편을 삽입하였다. 제작된 염색체 삽입용 재조합 벡터 (pDZ-speC_I163S, pDZ-speC_I163V, pDZ-speC_I163S E165V)는 서열분석으로 확인하였다.
speC 변이체들이 염색체 내에 삽입된 균주를 얻기 위해, 상기에서 제작된 pDZ-speC_I163S, pDZ-speC_I163V, pDZ-speC_I163S E165V 재조합 벡터 각각을 KCCM11240P 균주에 전기 천공법을 이용하여 형질주입한 뒤 BHIS 평판배지(brain heart infusion 37 g/l, sorbitol 91 g/l, agar 2%, 1L 기준 +kanamycin 25 ug/ml)에 도말하였다.
벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체 배지에서 푸른색을 나타내는가의 여부로 판별하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양배지에서 진탕배양 (30°C, 8시간)한 후, 각각 serial dilution하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 띠는 반면에 낮은 비율로 백색의 콜로니를 선별할 수 있었고, 선별한 콜로니는 2차 교차 (cross over)에 의해 최종 speC 변이체들이 염색체에 도입된 균주를 얻을 수 있었다. 최종적으로 균주는 변이체들의 서열분석에 의해 확인하였다. 확인된 균주를 KCCM11240P::speC_I163S, KCCM11240P::speC_I163V, KCCM11240P::speC_I163S E165V로 명명하였고, 그 중 KCCM11240P::speC_I163S E165V를 Corynebacterium glutamicum CC01-0578로 명명하고, 2013년 6월 10일자로 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 수탁번호 KCCM11425P로 기탁하였다.
6-2. ODC 변이체 도입 퓨트레신 생산 균주의 퓨트레신 생산능 측정
ODC (speC) 변이체 도입으로 인한 퓨트레신 생산 균주의 퓨트레신 생산능의 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 6-1에서 제작한 균주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 상기에서 제작된 균주들을 1mM 아르기닌이 포함된 CM 평판배지 (포도당 1%, polypeptone 1%, 효모추출물 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100ul, agar 2%, pH 6.8, 1L 기준)에서 30°C에서 16시간 배양한 후, 하기 표 8의 조성을 가지는 25 ml 역가배지에 한 백금이 정도 접종한 다음, 이를 30°C에서 200 rpm으로 24시간 동안 진탕배양 하였다. 제작된 모든 균주에 대하여 발효시 배지에 1mM 아르기닌을 첨가하여 배양하였다.
조성 성분 농도/함유량 (1L 기준)
포도당 8 %
대두단백질 0.25 %
옥수수침지고형물 0.5 %
(NH4)2SO4 4 %
요소 0.15 %
KH2PO4 0.1 %
MgSO4-7H2O 0.05 %
바이오틴 100 ug
티아민 염산염 3000 ug
칼슘-판토텐산 3000 ug
니코틴아미드 3000 ug
CaCO3 5 %
그 결과 표 9에서 보는 바와 같이, 활성이 증가된 ODC (speC) 변이체를 도입한 균주에서, 12시간 sample에서의 퓨트레신 생산량이 37~105% 증가된 양상을 보였다.
상기와 같은 결과는 ODC 변이체가 도입됨으로 인해 퓨트레신 생산 균주에서 당 소모 대비 기존보다 높은 농도의 퓨트레신을 생산할 수 있다는 결과를 보여준다.
균주 12 hr
Put (g/L) fold (%)
KCCM11240P 1.3 100
KCCM11240P I163S 변이균주 2.7 205
KCCM11240P E165V 변이균주 2.7 193
KCCM11240P I163S E165V
변이균주		 1.8 137
삭제
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11425P 20130610
<110> CJ CheilJedang Corporation Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Modified Ornithine Decarboxylase protein with an improved producing capability for Putrescine and a Use thereof <130> PA130358KR <160> 57 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 711 <212> PRT <213> E.coli ODC <400> 1 Met Lys Ser Met Asn Ile Ala Ala Ser Ser Glu Leu Val Ser Arg Leu 1 5 10 15 Ser Ser His Arg Arg Val Val Ala Leu Gly Asp Thr Asp Phe Thr Asp 20 25 30 Val Ala Ala Val Val Ile Thr Ala Ala Asp Ser Arg Ser Gly Ile Leu 35 40 45 Ala Leu Leu Lys Arg Thr Gly Phe His Leu Pro Val Phe Leu Tyr Ser 50 55 60 Glu His Ala Val Glu Leu Pro Ala Gly Val Thr Ala Val Ile Asn Gly 65 70 75 80 Asn Glu Gln Gln Trp Leu Glu Leu Glu Ser Ala Ala Cys Gln Tyr Glu 85 90 95 Glu Asn Leu Leu Pro Pro Phe Tyr Asp Thr Leu Thr Gln Tyr Val Glu 100 105 110 Met Gly Asn Ser Thr Phe Ala Cys Pro Gly His Gln His Gly Ala Phe 115 120 125 Phe Lys Lys His Pro Ala Gly Arg His Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Glu 130 135 140 Asn Val Phe Arg Ala Asp Met Cys Asn Ala Asp Val Lys Leu Gly Asp 145 150 155 160 Leu Leu Ile His Glu Gly Ser Ala Lys Asp Ala Gln Lys Phe Ala Ala 165 170 175 Lys Val Phe His Ala Asp Lys Thr Tyr Phe Val Leu Asn Gly Thr Ser 180 185 190 Ala Ala Asn Lys Val Val Thr Asn Ala Leu Leu Thr Arg Gly Asp Leu 195 200 205 Val Leu Phe Asp Arg Asn Asn His Lys Ser Asn His His Gly Ala Leu 210 215 220 Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Val Tyr Leu Glu Ala Ser Arg Asn Pro 225 230 235 240 Phe Gly Phe Ile Gly Gly Ile Asp Ala His Cys Phe Asn Glu Glu Tyr 245 250 255 Leu Arg Gln Gln Ile Arg Asp Val Ala Pro Glu Lys Ala Asp Leu Pro 260 265 270 Arg Pro Tyr Arg Leu Ala Ile Ile Gln Leu Gly Thr Tyr Asp Gly Thr 275 280 285 Val Tyr Asn Ala Arg Gln Val Ile Asp Thr Val Gly His Leu Cys Asp 290 295 300 Tyr Ile Leu Phe Asp Ser Ala Trp Val Gly Tyr Glu Gln Phe Ile Pro 305 310 315 320 Met Met Ala Asp Ser Ser Pro Leu Leu Leu Glu Leu Asn Glu Asn Asp 325 330 335 Pro Gly Ile Phe Val Thr Gln Ser Val His Lys Gln Gln Ala Gly Phe 340 345 350 Ser Gln Thr Ser Gln Ile His 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Pro 565 570 575 Val Arg Tyr Arg Asp Tyr Thr Leu Arg Gln Leu Cys Gln Glu Met His 580 585 590 Asp Leu Tyr Val Ser Phe Asp Val Lys Asp Leu Gln Lys Ala Met Phe 595 600 605 Arg Gln Gln Ser Phe Pro Ser Val Val Met Asn Pro Gln Asp Ala His 610 615 620 Ser Ala Tyr Ile Arg Gly Asp Val Glu Leu Val Arg Ile Arg Asp Ala 625 630 635 640 Glu Gly Arg Ile Ala Ala Glu Gly Ala Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Leu Cys Val Val Pro Gly Glu Val Trp Gly Gly Ala Val Gln Arg Tyr 660 665 670 Phe Leu Ala Leu Glu Glu Gly Val Asn Leu Leu Pro Gly Phe Ser Pro 675 680 685 Glu Leu Gln Gly Val Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Gly Val Lys Arg 690 695 700 Leu Tyr Gly Tyr Val Leu Lys 705 710 <210> 54 <211> 711 <212> PRT <213> ODC I163V E165A <400> 54 Met Lys Ser Met Asn Ile Ala Ala Ser Ser Glu Leu Val Ser Arg Leu 1 5 10 15 Ser Ser His Arg Arg Val Val Ala Leu Gly Asp Thr Asp Phe Thr Asp 20 25 30 Val Ala Ala Val Val Ile Thr Ala Ala Asp Ser Arg Ser Gly Ile Leu 35 40 45 Ala Leu Leu Lys Arg Thr Gly Phe His Leu Pro Val Phe Leu 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260 265 270 Arg Pro Tyr Arg Leu Ala Ile Ile Gln Leu Gly Thr Tyr Asp Gly Thr 275 280 285 Val Tyr Asn Ala Arg Gln Val Ile Asp Thr Val Gly His Leu Cys Asp 290 295 300 Tyr Ile Leu Phe Asp Ser Ala Trp Val Gly Tyr Glu Gln Phe Ile Pro 305 310 315 320 Met Met Ala Asp Ser Ser Pro Leu Leu Leu Glu Leu Asn Glu Asn Asp 325 330 335 Pro Gly Ile Phe Val Thr Gln Ser Val His Lys Gln Gln Ala Gly Phe 340 345 350 Ser Gln Thr Ser Gln Ile His Lys Lys Asp Asn His Ile Arg Gly Gln 355 360 365 Ala Arg Phe Cys Pro His Lys Arg Leu Asn Asn Ala Phe Met Leu His 370 375 380 Ala Ser Thr Ser Pro Phe Tyr Pro Leu Phe Ala Ala Leu Asp Val Asn 385 390 395 400 Ala Lys Ile His Glu Gly Glu Ser Gly Arg Arg Leu Trp Ala Glu Cys 405 410 415 Val Glu Ile Gly Ile Glu Ala Arg Lys Ala Ile Leu Ala Arg Cys Lys 420 425 430 Leu Phe Arg Pro Phe Ile Pro Pro Val Val Asp Gly Lys Leu Trp Gln 435 440 445 Asp Tyr Pro Thr Ser Val Leu Ala Ser Asp Arg Arg Phe Phe Ser Phe 450 455 460 Glu Pro Gly Ala Lys Trp His Gly Phe Glu Gly Tyr Ala Ala Asp Gln 465 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Val Tyr Asn Ala Arg Gln Val Ile Asp Thr Val Gly His Leu Cys Asp 290 295 300 Tyr Ile Leu Phe Asp Ser Ala Trp Val Gly Tyr Glu Gln Phe Ile Pro 305 310 315 320 Met Met Ala Asp Ser Ser Pro Leu Leu Leu Glu Leu Asn Glu Asn Asp 325 330 335 Pro Gly Ile Phe Val Thr Gln Ser Val His Lys Gln Gln Ala Gly Phe 340 345 350 Ser Gln Thr Ser Gln Ile His Lys Lys Asp Asn His Ile Arg Gly Gln 355 360 365 Ala Arg Phe Cys Pro His Lys Arg Leu Asn Asn Ala Phe Met Leu His 370 375 380 Ala Ser Thr Ser Pro Phe Tyr Pro Leu Phe Ala Ala Leu Asp Val Asn 385 390 395 400 Ala Lys Ile His Glu Gly Glu Ser Gly Arg Arg Leu Trp Ala Glu Cys 405 410 415 Val Glu Ile Gly Ile Glu Ala Arg Lys Ala Ile Leu Ala Arg Cys Lys 420 425 430 Leu Phe Arg Pro Phe Ile Pro Pro Val Val Asp Gly Lys Leu Trp Gln 435 440 445 Asp Tyr Pro Thr Ser Val Leu Ala Ser Asp Arg Arg Phe Phe Ser Phe 450 455 460 Glu Pro Gly Ala Lys Trp His Gly Phe Glu Gly Tyr Ala Ala Asp Gln 465 470 475 480 Tyr Phe Val Asp Pro Cys Lys Leu Leu Leu Thr Thr Pro Gly Ile Asp 485 490 495 Ala Glu Thr Gly Glu Tyr Ser Asp Phe Gly Val Pro Ala Thr Ile Leu 500 505 510 Ala His Tyr Leu Arg Glu Asn Gly Ile Val Pro Glu Lys Cys Asp Leu 515 520 525 Asn Ser Ile Leu Phe Leu Leu Thr Pro Ala Glu Ser His Glu Lys Leu 530 535 540 Ala Gln Leu Val Ala Met Leu Ala Gln Phe Glu Gln His Ile Glu Asp 545 550 555 560 Asp Ser Pro Leu Val Glu Val Leu Pro Ser Val Tyr Asn Lys Tyr Pro 565 570 575 Val Arg Tyr Arg Asp Tyr Thr Leu Arg Gln Leu Cys Gln Glu Met His 580 585 590 Asp Leu Tyr Val Ser Phe Asp Val Lys Asp Leu Gln Lys Ala Met Phe 595 600 605 Arg Gln Gln Ser Phe Pro Ser Val Val Met Asn Pro Gln Asp Ala His 610 615 620 Ser Ala Tyr Ile Arg Gly Asp Val Glu Leu Val Arg Ile Arg Asp Ala 625 630 635 640 Glu Gly Arg Ile Ala Ala Glu Gly Ala Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Leu Cys Val Val Pro Gly Glu Val Trp Gly Gly Ala Val Gln Arg Tyr 660 665 670 Phe Leu Ala Leu Glu Glu Gly Val Asn Leu Leu Pro Gly Phe Ser Pro 675 680 685 Glu Leu Gln Gly Val Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Gly Val Lys Arg 690 695 700 Leu Tyr Gly Tyr Val Leu Lys 705 710 <210> 57 <211> 711 <212> PRT <213> ODC I163V E165V <400> 57 Met Lys Ser Met Asn Ile Ala Ala Ser Ser Glu Leu Val Ser Arg Leu 1 5 10 15 Ser Ser His Arg Arg Val Val Ala Leu Gly Asp Thr Asp Phe Thr Asp 20 25 30 Val Ala Ala Val Val Ile Thr Ala Ala Asp Ser Arg Ser Gly Ile Leu 35 40 45 Ala Leu Leu Lys Arg Thr Gly Phe His Leu Pro Val Phe Leu Tyr Ser 50 55 60 Glu His Ala Val Glu Leu Pro Ala Gly Val Thr Ala Val Ile Asn Gly 65 70 75 80 Asn Glu Gln Gln Trp Leu Glu Leu Glu Ser Ala Ala Cys Gln Tyr Glu 85 90 95 Glu Asn Leu Leu Pro Pro Phe Tyr Asp Thr Leu Thr Gln Tyr Val Glu 100 105 110 Met Gly Asn Ser Thr Phe Ala Cys Pro Gly His Gln His Gly Ala Phe 115 120 125 Phe Lys Lys His Pro Ala Gly Arg His Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Glu 130 135 140 Asn Val Phe Arg Ala Asp Met Cys Asn Ala Asp Val Lys Leu Gly Asp 145 150 155 160 Leu Leu Val His Val Gly Ser Ala Lys Asp Ala Gln Lys Phe Ala Ala 165 170 175 Lys Val Phe His Ala Asp Lys Thr Tyr Phe Val Leu Asn Gly Thr Ser 180 185 190 Ala Ala Asn Lys Val Val Thr Asn Ala Leu Leu Thr Arg Gly Asp Leu 195 200 205 Val Leu Phe Asp Arg Asn Asn His Lys Ser Asn His His Gly Ala Leu 210 215 220 Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Val Tyr Leu Glu Ala Ser Arg Asn Pro 225 230 235 240 Phe Gly Phe Ile Gly Gly Ile Asp Ala His Cys Phe Asn Glu Glu Tyr 245 250 255 Leu Arg Gln Gln Ile Arg Asp Val Ala Pro Glu Lys Ala Asp Leu Pro 260 265 270 Arg Pro Tyr Arg Leu Ala Ile Ile Gln Leu Gly Thr Tyr Asp Gly Thr 275 280 285 Val Tyr Asn Ala Arg Gln Val Ile Asp Thr Val Gly His Leu Cys Asp 290 295 300 Tyr Ile Leu Phe Asp Ser Ala Trp Val Gly Tyr Glu Gln Phe Ile Pro 305 310 315 320 Met Met Ala Asp Ser Ser Pro Leu Leu Leu Glu Leu Asn Glu Asn Asp 325 330 335 Pro Gly Ile Phe Val Thr Gln Ser Val His Lys Gln Gln Ala Gly Phe 340 345 350 Ser Gln Thr Ser Gln Ile His Lys Lys Asp Asn His Ile Arg Gly Gln 355 360 365 Ala Arg Phe Cys Pro His Lys Arg Leu Asn Asn Ala Phe Met Leu His 370 375 380 Ala Ser Thr Ser Pro Phe Tyr Pro Leu Phe Ala Ala Leu Asp Val Asn 385 390 395 400 Ala Lys Ile His Glu Gly Glu Ser Gly Arg Arg Leu Trp Ala Glu Cys 405 410 415 Val Glu Ile Gly Ile Glu Ala Arg Lys Ala Ile Leu Ala Arg Cys Lys 420 425 430 Leu Phe Arg Pro Phe Ile Pro Pro Val Val Asp Gly Lys Leu Trp Gln 435 440 445 Asp Tyr Pro Thr Ser Val Leu Ala Ser Asp Arg Arg Phe Phe Ser Phe 450 455 460 Glu Pro Gly Ala Lys Trp His Gly Phe Glu Gly Tyr Ala Ala Asp Gln 465 470 475 480 Tyr Phe Val Asp Pro Cys Lys Leu Leu Leu Thr Thr Pro Gly Ile Asp 485 490 495 Ala Glu Thr Gly Glu Tyr Ser Asp Phe Gly Val Pro Ala Thr Ile Leu 500 505 510 Ala His Tyr Leu Arg Glu Asn Gly Ile Val Pro Glu Lys Cys Asp Leu 515 520 525 Asn Ser Ile Leu Phe Leu Leu Thr Pro Ala Glu Ser His Glu Lys Leu 530 535 540 Ala Gln Leu Val Ala Met Leu Ala Gln Phe Glu Gln His Ile Glu Asp 545 550 555 560 Asp Ser Pro Leu Val Glu Val Leu Pro Ser Val Tyr Asn Lys Tyr Pro 565 570 575 Val Arg Tyr Arg Asp Tyr Thr Leu Arg Gln Leu Cys Gln Glu Met His 580 585 590 Asp Leu Tyr Val Ser Phe Asp Val Lys Asp Leu Gln Lys Ala Met Phe 595 600 605 Arg Gln Gln Ser Phe Pro Ser Val Val Met Asn Pro Gln Asp Ala His 610 615 620 Ser Ala Tyr Ile Arg Gly Asp Val Glu Leu Val Arg Ile Arg Asp Ala 625 630 635 640 Glu Gly Arg Ile Ala Ala Glu Gly Ala Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Leu Cys Val Val Pro Gly Glu Val Trp Gly Gly Ala Val Gln Arg Tyr 660 665 670 Phe Leu Ala Leu Glu Glu Gly Val Asn Leu Leu Pro Gly Phe Ser Pro 675 680 685 Glu Leu Gln Gly Val Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Gly Val Lys Arg 690 695 700 Leu Tyr Gly Tyr Val Leu Lys 705 710

Claims (14)

  1. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 오르니틴 디카복실레이즈(ornithine decarboxylase, ODC)의 N-말단으로부터 163번째 이소류신(isoleucine) 아미노산 잔기가 이소류신보다 부피가 작은 아미노산 잔기로 또는 165번째 글루탐산(Glutamic acid) 아미노산 잔기가 글루탐산보다 부피가 작은 아미노산 잔기로 치환된 것인, 변이된 ODC 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 165번째 글루탐산이 알라닌(alanine), 글리신(Glycine), 세린(Serine) 또는 발린(Valine)으로 치환된 것인, 변이된 ODC 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 163번째 이소류신이 알라닌(alanine), 글리신(Glycine), 세린(Serine) 또는 발린(Valine)으로 치환된 것인, 변이된 ODC 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 163번째 이소류신과 165번째 글루탐산이 동시에 변이된 ODC 단백질로서, 163번째 이소류신과 165번째 글루탐산이 각각 알라닌-알라닌, 알라닌-발린, 세린-발린 또는 발린-발린으로 치환된 것인, 변이된 ODC 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 34 내지 서열번호 57 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 변이된 ODC 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이된 ODC 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이된 ODC 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  8. 제7항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  9. L-오르니틴(L-ornithine), L-오르니틴이 포함된 혼합물 또는 L-오르니틴 발효액에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이된 ODC 단백질을 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 퓨트레신 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 변이된 ODC 단백질은 정제된 변이된 ODC 단백질 또는 변이된 ODC 단백질이 포함되는 미생물 발효액인, 퓨트레신 제조방법.
  11. 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이된 ODC 단백질이 도입된, 퓨트레신 생산능을 가지는 재조합 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 재조합 미생물.
  13. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이된 ODC 단백질이 도입되어 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물을 배양하는 단계: 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득되는 배양물로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 퓨트레신 생산 방법.
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