BR112016001009B1 - Nova proteína de ornitina descarboxilase modificada e sua utilização - Google Patents

Abstract

NOVA PROTEÍNA DE ORNITINA DESCARBOXILASE MODIFICADA E SUA UTILIZAÇÃO. A invenção proporciona uma nova proteína de ornitina descarboxilase modifi-cada com uma produtividade em putrescina melhorada e sua utilização.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção diz respeito a uma nova proteína de ornitina descarboxilase modificada e à sua utilização.

ANTERIORIDADE

[002] A putrescina (ou 1,4-butanodiamina) é uma importante matéria-prima para a produção de poliamida-4,6 incluindo nylon-4,6 e é principalmente produzida à escala industrial pela hidrogenação de succinonitrilo, que é produzido a partir de acrilonitrilo por meio da adição de cianeto de hidrogênio. A síntese química deste composto requer produtos petroquímicos não renováveis como matérias-primas e uma temperatura e pressão relativamente elevadas em um desenho multi-passos e multi-reatores, bem como a utilização de sistemas de catalisador caros. Além disso, visto que estas matérias-primas são bastante tóxicas e inflamáveis, os processos químicos de síntese conhecidos são desvantajosos em termos ambientais. Assim sendo, como alternativa ao processo químico de produção, é necessário um processo de produção de putrescina a partir de uma fonte de carbono renovável derivada de biomassa. Recentemente, um processo bioquímico para a produção de putrescina através de microrganismos amigos do ambiente recebeu muita atenção. A putrescina é um tipo de poliamina que é encontrada em um espectro alargado de organismos que vão desde bactérias até animais e plantas. Sabe-se que a concentração de putrescina em E. coli é extremamente elevada, tão elevada quanto cerca de 2,8 g/L. Além disso, os microrganismos têm potencialmente uma boa resistência a concentrações elevadas de poliaminas, pelo que são capazes de crescer e de sobreviver na presença de elevadas concentrações destas. Por exemplo, foi descrito que a Corynebacterium glutamicum pode crescer mesmo na presença de mais do que 30 g/L de cadaverina. Assim sendo, têm sido realizados de um modo contínuo sobre a utilização de microrganismos na produção de poliaminas com concentração elevada industrialmente disponíveis. No entanto, os estudos sobre a produção de poliaminas utilizando microrganismos não avançaram ainda o suficiente de modo a que sejam aplicáveis à escala industrial. Assim sendo, existe uma necessidade de desenvolver uma estirpe capaz de produzir poliaminas com elevado rendimento (Qian ZG, et al., Biotechnol Bioeng, 104: 651-662, 2009; Schneider J, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 88: 859-868, 2010).

[003] Entretanto, a ornitina descarboxilase (ODC) é uma enzima encontrada na maior parte dos organismos que converte ornitina em putrescina. A ODC em E. coli forma geralmente um homodímero e são formados locais ativos na interface do dímero. O mecanismo de reação de ODC requer fosfato de piridoxal (PLP) como cofator, e o PLP forma uma base de Schiff em um resíduo lisina do local ativo da enzima, que posteriormente é deslocado através de um substrato ornitina que é submetido à descarboxilação. Quando a putrescina é produzida, a ODC forma novamente uma base de Schiff com PLP.

[004] Quando a ODC é introduzida em uma estirpe produtora de putrescina, do género Corynebacterium, é uma proteína codificada pelo gene speC de E. coli e a sua atividade é descrita como sendo muito reduzida. Assim sendo, para se desenvolver uma estirpe produtora de putrescina com um rendimento elevado, é muito importante à melhoria de ODC, que é uma enzima implicada no passo final da via biossintética de putrescina. Até agora, foram efetuadas pesquisas de mutações apenas na estrutura ou no mecanismo de uma proteína de ODC, não existindo ainda registos no que diz respeito a um aumento da sua atividade.

DESCRIÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[005] As requerentes desenvolveram esforços para melhorar uma proteína de ODC, que desempenha um papel importante na produção de putrescina, mas que apresenta uma atividade reduzida. Assim sendo, descobriram um novo local de mutação e introduziram uma mutação no local para preparar uma proteína de ODC modificada com uma atividade produtora de putrescina melhorada, e concluíram que quando a proteína de ODC modificada é introduzida em um microrganismo produtor de putrescina, o microrganismo é capaz de produzir putrescina com um rendimento elevado, completando assim o presente pedido de patente de invenção.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[006] Constitui um objeto a presente invenção proporcionar uma nova proteína de ornitina descarboxilase (ODC) modificada.

[007] Constitui um outro objeto da presente invenção proporcionar um polinucleotídeo que codifica a proteína de ODC modificada, um vetor que inclui o polinucleotídeo e um transformante transformado com o vetor.

[008] Constitui ainda um outro objeto da presente invenção proporcionar um método para a preparação de putrescina, em que o método compreende o passo de fazer reagir L-ornitina, uma mistura que contém L-ornitina ou um líquido de fermentação de L-ornitina com a proteína de ODC modificada.

[009] Constitui ainda um outro objeto da presente invenção proporcionar um microrganismo recombinante que tenha uma atividade produtora de putrescina melhorada, alterando a proteína de ODC modificada em um microrganismo Corynebacterium sp. com atividade produtora de putrescina.

[010] Constitui ainda um outro objeto da presente invenção proporcionar um método para a produção de putrescina, em que o método compreende os passos que consistem em desenvolver em cultura o microrganismo Corynebacterium sp. que tenha atividade produtora de putrescina melhorada por meio da introdução de proteína de ODC modificada e recuperar a putrescina a partir da cultura obtida no passo anterior.

EFEITOS VANTAJOSOS

[011] Uma proteína de ornitina descarboxilase modificada de acordo com a presente invenção apresenta uma atividade de conversão em putrescina que é 21 vezes superior à da forma nativa. Quando a proteína de ornitina descarboxilase modificada é introduzida em uma estirpe produtora de putrescina, a produtividade em putrescina é notoriamente aumentada. Assim sendo, poderá ser amplamente aplicada para uma produção em massa eficaz de putrescina como alternativa à via de síntese química conhecida.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[012] A FIG. 1 mostra uma comparação da atividade de conversão em putrescina entre uma proteína de ODC derivada de E. coli nativa e a proteína de ODC com uma mutação I163A ou uma mutação E165A. Mais minuciosamente, o pH aumenta quando uma reação de conversão ocorrer, e quando o aumento de pH é examinado com vermelho de fenol, é observado um aumento em observância. A proteína de ODC com a mutação I163A ou a mutação E165A ou ambas mutações apresentou uma atividade de conversão em putrescina superior em comparação com a proteína de ODC nativa.

MELHOR FORMA DE REALIZAÇÃO

[013] De acordo com um aspecto, para se alcançar os objetos anteriores, a presente invenção proporciona uma nova proteína de ODC modificada, em que a proteína de ODC modificada possui uma mutação em um ou em mais resíduos aminoácidos selecionados entre o conjunto constituído por um resíduo aminoácido isoleucina na posição 163 e um resíduo aminoácido ácido glutâmico na posição 165 a partir de um terminal N da ornitina descarboxilase (ODC) com uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1.

[014] Tal como aqui utilizado, o termo “ornitina descarboxilase (ODC)” designa uma enzima que catalisa a seguinte reação, a qual constitui o primeiro passo da síntese de uma poliamida a partir de ornitina e o última passo da via de síntese de putrescina. Na produção de putrescina utilizando L-ornitina como substrato, o fosfato de piridoxal (PLP) atua como um cofator.

ESQUEMA DE REAÇÃO

[015] L-ornitina <=> putrescina + CO2

[016] Na presente invenção, a ornitina descarboxilase (ODC) pode ser especificamente uma ODC derivada de E. coli e, mais especificamente, uma ODC com uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, que é derivada de Escherichia coli.

[017] Na presente invenção, um método para se obter ODC (ornitina descarboxilase) pode ser efetuado por aplicação de diversos métodos conhecidos na especialidade. Por exemplo, a ODC pode ser obtida por tecnologia de síntese de genes, incluindo optimização de códon para se obter a enzima com um rendimento elevado em E. coli, que é geralmente utilizada na expressão da enzima, e um método para a pesquisa de recursos de enzimas úteis através de bioinformática com base em informações do genoma do microrganismo, embora não esteja limitada a estes.

[018] Tal como aqui utilizado, o termo “proteína de ODC modificada” designa uma proteína de ODC, na qual um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos da proteína de ODC são adicionados, suprimidos ou substituídos. Especificamente, a proteína de ODC modificada designa uma proteína na qual a sua atividade é eficazmente aumentada por meio da modificação da proteína de ODC em comparação com aquela de tipo selvagem. Na presente invenção, a modificação pode ser efetuada utilizando qualquer método geral para melhorar enzimas conhecido na especialidade, sem qualquer limitação, e o método é exemplificado por estratégias, tais como concepção racional e evolução dirigida. Por exemplo, uma estratégia de concepção racional pode incluir uma mutação em um aminoácido em um local particular (mutagênese dirigida ao local) e a estratégia de evolução dirigida pode incluir mutagênese aleatória. Além disso, pode ocorrer uma modificação natural ou mais nos resíduos aminoácidos na posição 163 e/ou na posição 165 da SEQ ID NO: 1 sem manipulação externa. Tal como aqui utilizado, os termos “proteína de ODC modificada”, “mutante de ODC” e “mutante de speC” podem ser utilizados de um modo inter-permutável.

[019] Especificamente, a proteína de ODC modificada da presente invenção pode ter uma modificação ou modificações de um resíduo aminoácido isoleucina na posição 163 e/ou de um resíduo aminoácido ácido glutâmico na posição 165 a partir do terminal N de ornitina descarboxilase (ODC), a que derivada de Escherichia coli e tem uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1. Por exemplo, o ácido glutâmico na posição 165 pode ser substituído com alanina, glicina, serina ou valina, ou a isoleucina na posição 163 pode ser substituída com alanina, glicina, serina ou valina. Além disso, a proteína de ODC modificada pode ter uma modificação dupla da isoleucina na posição 163 e do ácido glutâmico na posição 165, em que a isoleucina na posição 163 e o ácido glutâmico na posição 165 podem ser substituídos com um aminoácido selecionado entre o conjunto constituído por alanina, valina, serina e glicina, respectivamente. Especificamente, a isoleucina na posição 163 e o ácido glutâmico na posição 165 podem ser substituídos com alanina-alanina, alanina-valina, serina-valina ou valina-valina, respectivamente.

[020] De acordo com variantes da presente invenção, quando de descobriu que diversas combinações de mutações dos aminoácidos nas posições 163 e 165 da ODC de tipo selvagem proporcionavam um aumento na produtividade em putrescina, estas posições foram sugeridas como sendo muito importantes para a preparação do mutante de ODC com uma produtividade em putrescina melhorada. Em particular, quando os aminoácidos presentes nos locais de mutação importantes foram substituídos com resíduos aminoácido pequenos (alanina, serina, valina ou glicina), a produtividade em putrescina foi aumentada.

[021] Além do mais, a proteína de ODC modificada da presente invenção pode ser constituída por qualquer uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 57 e, especificamente, qualquer uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 57, que é uma sequência de aminoácidos da proteína de ODC modificada na qual a isoleucina ou o ácido glutâmico na posição 163 ou 165, respectivamente, a partir do terminal N é substituída por um resíduo pequeno. A proteína de ODC modificada pode incluir qualquer polipeptídeo que possua uma homologia de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% ou superior com as sequências anteriores, desde que tenha a modificação anterior e uma atividade de conversão em putrescina superior em relação à de tipo selvagem.

[022] Tal como aqui utilizado, o termo “homologia” designa uma percentagem de identidade entre dois resíduos polinucleotídeos ou polipeptídeos. A correspondência de sequências entre um resíduo e outro pode ser determinada através de técnicas conhecidas na especialidade. Por exemplo, a homologia pode ser determinada por alinhamento da informação de sequências de duas moléculas de polinucleotídeos diretamente, utilizando uma aplicação informática que se encontre disponível e que seja capaz de alinhar a informação de sequências. Além do mais, a homologia pode ser determinada por hibridação dos polinucleotídeos sob condições de formação de uma cadeia dupla estável nas regiões homólogas e subsequente digestão da cadeia hibridada por meio de uma nucleasse específica para cadeias individuais para se determinar um tamanho de um fragmento digerido.

[023] Tal como aqui utilizado, o termo “homólogo” designa a correlação entre as proteínas em que todas as formas gramaticas e variações de correção incluem as proteínas derivadas da superfamília e proteínas homólogas derivadas de outras espécies que tenham uma “origem evolucionária comum”. Tais proteínas (e seus genes de codificação) têm uma homologia de sequências refletida por um grau elevado de similaridade entre sequências. No entanto, em uma utilização convencional e na presente invenção, quando o termo “homogenia” é modificado por um adjetivo, tal como “muito elevada”, este designa uma similaridade entre sequências, mas não uma origem evolucionária comum.

[024] Tal como aqui utilizado, o termo “similaridade entre sequências” designa o grau de identidade ou homologia entre as sequências de nucleotídeos ou sequências de aminoácidos das proteínas que podem ou não partilhar uma origem evolucionária comum. De acordo com uma variante específica, quando uma correspondência de polipeptídeos entre duas sequências de aminoácidos é de pelo menos 21% para um comprimento fixo de uma sequência de aminoácidos (especificamente, pelo menos de cerca de 50% e, mais especificamente, de cerca de 75%, 90%, 95%, 96%, 97% ou 99%), essas duas sequências são “substancialmente homólogas” ou “substancialmente similares”. As sequências substancialmente homólogas podem ser identificadas por comparação das sequências utilizando uma aplicação informática convencional utilizando em bancos de dados ou, por exemplo, efetuando uma experiência de hibridação de Southern sob condições de estringência definidas para um determinado sistema. Uma condição definida adequada para hibridação pertence ao âmbito das técnicas convencionais na especialidade (v.g., ver Sambrook et al., 1989, infra).

[025] De acordo com uma variante específica da presente invenção, foi efetuada uma análise estrutural da proteína de ODC derivada de E. coli e, com base na informação estrutural, foi efetuada a mutagênese por meio de uma estratégia de concepção racional. As mutações (V156, D160, I163, E165, Q691) para alargar uma região de entrada de um caminho para a entrada do substrato no local ativo, e as mutações (N153, D309) para estabilizar o PLP, que é um cofator que se liga ao local ativo, foram concebidas e preparadas (exemplos 1 e 2). Mais minuciosamente, quando a isoleucina, enquanto aminoácido na posição 163, e o ácido glutâmico, enquanto aminoácido na posição 165 a partir do terminal N, foram substituídos com alanina através de uma modificação de substituição do resíduo volumoso na região de entrada da via com um resíduo pequeno, alanina, concluiu-se que a atividade da proteína de ODC foi claramente aumentada (exemplo 3). Entretanto, as proteínas de ODC com 6 tipos diferentes de mutantes, V156A, D160A, Q691A, N153D, N153E e, D309E, para estabilização de PLP, apresentaram uma atividade muito reduzida ou nenhuma atividade em comparação com a de tipo selvagem. Assim sendo, é possível verificar que a isoleucina na posição 163 e o ácido glutâmico na posição 165 de uma proteína de ODC derivada de E. coli (SEQ ID NO: 1) são resíduos importantes, que atuam para aumentar a atividade da proteína. As mutações foram efetuadas por mutagênese dirigida ao local utilizando os iniciadores apresentados no quadro 1 e PCR.

[026] Além disso, de acordo com uma variante específica da presente invenção, a isoleucina na posição 163 e o ácido glutâmico na posição 165 foram substituídos com outros resíduos pequenos, serina, valina ou glicina, para além de alanina, para otimizar as modificações dos resíduos correspondentes (exemplo 4 e quadro 4). Os respectivos resíduos aminoácidos nas posições 163 e 165 forma substituídos com glicina (G), serina (S) ou valina (V). Como resultado, quando o resíduo aminoácido na posição 163 foi substituído com serina e o resíduo aminoácido na posição 165 foi substituído com valina, o valor kcat/KM foi aumentado 4,4 vezes e 6,9 vezes, respectivamente, em comparação com o de tipo selvagem (quadro 5). Com base neste resultado, os dois resíduos foram espontaneamente trocados e a atividade de ODC foi examinada. A atividade foi aumentada até um valor 8 vezes superior em comparação com a de tipo selvagem através de uma combinação de I163S e E165V, que apresentou a atividade mais elevada em uma mutação simples. Por outro lado, a atividade foi aumentada até um valor 21,3 vezes superior do que a de tipo selvagem por substituição de ambos os resíduos aminoácidos nas posições 163 e 165 por valina (exemplo 4 e quadro 5).

[027] De um modo global, as atividades aumentadas dos mutantes da enzima ODC são atribuídos a um aumento no valor de kcat/KM devido a um aumento no valor de kcat e não de uma diminuição no valor de KM. Tal implica que a estrutura da enzima ODC é alterada para aumentar a taxa de conversão no produto, putrescina, em vez da afinidade de ligação do substrato para a enzima, ornitina.

[028] Na presente invenção, a atividade da enzima ODC é avaliada por meio da utilização de uma reação que converte ornitina em putrescina. Mais minuciosamente, quando a enzima ODC converte uma molécula de ornitina em putrescina, uma molécula de água é consumida e uma molécula de dióxido de carbono e um ión OH- são produzidos com putrescina. Assim sendo, o pH total é aumentado. Quando o pH aumentado é medido a 559 nm utilizando vermelho de fenol, um indicador de pH, a absorvência é aumentada proporcionalmente em relação ao aumento de pH durante a reação. Esta propriedade é utilizada para medir indiretamente a quantidade de produção de putrescina.

[029] Tal como aqui utilizado, o termo “ornitina” designa um aminoácido básico que desempenha um papel importante no ciclo de ornitina, e, em particular, a L-ornitina é amplamente encontrada em plantas, animais e microrganismos. De um modo geral, a ornitina desempenha um papel importante em conjunto com o ciclo da ureia em um organismo que tenha o ciclo de ornitina. Além disso, a ornitina pode ser inter-convertida em arginina, ácido glutâmico e prolina em um organismo, e transfere grupos amino para o ácido α-keto e o ácido glioxílico. A ornitina é um substrato que produz uma amina (putrescina) por ornitina descarboxilase e uma poliamina é sintetizada a partir desta. Na presente invenção, a ornitina pode ser especificamente L- ornitina, que pode ser utilizada como substrato de ornitina descarboxilase.

[030] Tal como aqui utilizado, o termo “putrescina” designa uma substância produzida por descarboxilação de ornitina ou por hidrólise de agmatina. A putrescina pode ser encontrada na putrefacção, mas é também normalmente encontrada em um componente normal em um organismo. A putrescina é uma poliamina e atua para constituir ribossomas e para promover o crescimento celular ou a síntese de ARN. Industrialmente, a putrescina é uma matéria-prima importante para a produção de poliamida-4,6, incluindo nylon- 4,6, e estudos para a sua produção em massa são procurados continuamente.

[031] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica a proteína de ODC modificada da presente invenção.

[032] Tal como aqui utilizado, o termo “polinucleotídeo” abrange moléculas de ADN e de ARN, e um nucleotídeo como unidade básica do polinucleotídeo inclui um nucleotídeo natural bem como um análogo com um açúcar ou uma base modificados.

[033] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica a proteína de ODC modificada da presente invenção.

[034] Tal como aqui utilizado, o termo “vetor” designa qualquer veículo para a clonagem e/ou transferência de bases para uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicam para permitir a replicação de fragmentos combinados com outros fragmentos de ADN. Um “replicam” designa qualquer unidade genética que atue como unidade auto-replicadora para replicação de ADN in vivo, isto é, replicável por auto-regulação (v.g., plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo e vírus). O termo “vetor” pode incluir veículos virais e não virais para a introdução de nucleotídeos em uma célula hospedeira in vitro, ex vivo ou in vivo, e também pode incluir um ADN mini-esférico. Por exemplo, o vetor pode ser um plasmídeo sem uma sequência de ADN bacteriana. Foi efetuada a remoção de sequências de ADN bacterianas que sejam ricas em área CpG para reduzir o silenciamento da expressão transgénica e promover a expressão contínua de um vetor plasmídeo de ADN. O termo “vetor” também pode incluir um transposão ou um cromossomo artificial.

[035] Na presente invenção, o vetor é um vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica a proteína de ODC modificada da presente invenção, e pode ser, mas não é particularmente limitado a este, um vetor capaz de replicar e/ou expressar o polinucleotídeo em uma célula eucariótica ou procariótica, incluindo uma célula de mamífero (v.g., célula humana, de macaco, de coelho, de rato, de hamster, de murganho, etc.), uma células vegetal, uma célula de levedura, uma célula de inseto ou uma célula bacteriana (v.g., E. coli, etc.). Especificamente, o vetor pode ser um vetor que está funcionalmente ligado a um promotor adequado para permitir a expressão do polinucleotídeo na célula hospedeira, e inclui pelo menos um marcador de seleção. Mais especificamente, o vetor pode estar sob uma forma na qual o polinucleotídeo é introduzido em um vetor de fago, plasmídeo, cosmídeo, mini-cromossomo, vírus ou retroviral.

[036] Um sistema pET utilizando um promotor T7, normalmente utilizado na especialidade, é bem conhecido e é possível utilizar vários sistemas de expressão conhecidos na especialidade, embora não estejam limitados a estes. De um modo específico, na presente invenção, o vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica a proteína de ODC modificada pode ser um vetor pET28a.

[037] De acordo com uma variante específica da presente invenção, o polinucleotídeo que codifica a proteína de ODC modificada dirigida ao local foi inserido no vetor pET28a por PCR. Através deste processo, foram preparados vetores que expressam ODC modificada (speC), pET28a-speC_I163A, pET28a-speC_I163G, pET28a-speC_I163S, pET28a-speC_I163V, pET28a- speC_E165A, pET28a-speC_E165S, pET28a-speC_E165G, pET28a- speC_E165V, pET28a-speC_I163A_E165A, pET28a-speC_I163S_E165V, pET28a-speC_I163A_E165V, e pET28a-speC_I163V_E165V, e as mutações foram confirmadas por análise de sequências.

[038] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um transformante transformado com o vetor.

[039] Na presente invenção, o transformante não é particularmente limitado, desde que a ODC modificada do presente pedido de patente de invenção seja capaz de ser expresso por introdução do vetor. O transformante pode ser células bacterianas, tais como E. coli, Corynebacterium, Streptomyces, Salmonella typhimurium transformadas, etc.; células de levedura; células fúngicas, tais como pichia pastoris, etc.; células de inseto, tais como células Drosophila, Spodoptera Sf9, etc.; células de animais, tais como CHO (células de ovário de hamster chinês), SP2/0 (células de mieloma de murganho), linfoblastóides humanos, COS, NSO (células de mieloma de murganho), 293T, células de melanoma de Bowes, HT-1080, BHK (células de rim de hamster bebé), HEK (células de rim embrionias humanas) ou PERC.6 (células de retina embrionias); ou células de plantas.

[040] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a preparação de putrescina, em que o método inclui o passo que consiste em fazer reagir L-ornitina, uma mistura que contém L-ornitina ou um líquido de fermentação de L-ornitina com a proteína de ODC modificada.

[041] A L-ornitina, proteína de ODC modificada e putrescina possuem os significados definidos antes.

[042] Na presente invenção, a substância que se faz reagir com a proteína de ODC modificada para a preparação de putrescina pode ser L-ornitina, a mistura que contém L-ornitina ou o líquido de fermentação de L-ornitina. A mistura que contém L-ornitina designa uma mistura em que existem, em separado, L-ornitina e outros componentes, e o líquido de fermentação de L- ornitina designa um líquido de fermentação no qual a L-ornitina é produzida ou a sua quantidade é aumentada durante a fermentação, e, assim, está presente L-ornitina suficiente para reação, embora não seja limitada a estas.

[043] Por exemplo, o método para a produção de L-ornitina por fermentação e o líquido de fermentação produzido encontram-se descritos na patente de invenção norte-americana n°. 3668072, a qual se considera aqui incorporada por referência (E. coli, ATCC 21104).

[044] Na presente invenção, a proteína de ODC modificada pode ser uma proteína de ODC modificada purificada ou um líquido de fermentação de um microrganismo que contém a proteína de ODC modificada. De um modo específico, o microrganismo utilizado na preparação do líquido de fermentação de um microrganismo pode ser um microrganismo que expressa a proteína de ODC modificada da presente invenção e, mais especificamente, pode ser um microrganismo transformante transformado com um vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica a proteína de ODC modificada da presente invenção.

[045] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um microrganismo que tem uma produtividade em putrescina melhorada, o qual é preparado por alteração para a proteína de ODC modificada em um microrganismo Corynebacterium sp. que tem uma produtividade em putrescina.

[046] Tal como aqui utilizado, o termo “microrganismo” inclui topos os microrganismos, desde microrganismos de tipo selvagem até microrganismos geneticamente modificados de um modo natural ou artificial, e podem ser microrganismos com um mecanismo particular atenuado ou reforçado devido à inserção de um gene exógeno ou reforço ou atenuação da atividade de um gene endógeno.

[047] Tal como aqui utilizado, o termo “microrganismo Corynebacterium sp. que tem uma produtividade em putrescina” designa um microrganismo Corynebacterium sp. que apresenta produtividade em putrescina de um modo natural ou por meio de uma modificação. Sabe-se já que a putrescina está incluída em uma cultura de um microrganismo Corynebacterium sp.. No entanto, a sua produtividade em putrescina é muito reduzida e os genes e mecanismos envolvidos na produção não foram ainda revelados. Assim sendo, o “microrganismo Corynebacterium sp. que tem uma produtividade em putrescina” na presente invenção designa uma estirpe nativa por ela própria ou um microrganismo Corynebacterium sp. em que seja inserido um gene exógeno envolvido na produção de putrescina ou em que a atividade de um gene endógeno seja reforçada ou enfraquecida de modo que este apresente uma produtividade em putrescina melhorada.

[048] Tal como aqui utilizado, o termo “microrganismo Corynebacterium sp.” pode designar especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum,Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, etc., embora não seja limitado a estes. Mais especificamente, o microrganismo Corynebacterium sp. na presente invenção pode ser Corynebacterium glutamicum no qual o crescimento e a sobrevivência celular são bastante afetadas quando exposto a uma concentração elevada de putrescina. Por exemplo, o microrganismo Corynebacterium sp. pode ser uma estirpe de Corynebacterium glutamicum KCCM11240P (KCCM11138P △NCgl1469), que é modificada de forma a ter a atividade em NCgl1469 enfraquecida comparativamente com sua atividade endógena, apresentando assim uma produtividade em putrescina melhorada, embora não esteja limitado a este. A estirpe KCCM11240P é uma estirpe que sobreexpressa putrescina preparada por supressão de um gene que codifica NCgl1469 para bloquear a via biossintética de N-acetil-putrescina a partir de putrescina, e encontra-se descrita na publicação da patente de invenção internacional n°. WO 2013/105827.

[049] De acordo com uma variante específica da presente invenção, com base no microrganismo Corynebacterium sp. (KCCM11240P (KCCM11138P △NCgl1469)) com uma produtividade em putrescina melhorada por enfraquecimento da atividade de NCgl1469 comparativamente com a sua atividade endógena, preparou-se uma estirpe modificada por alteração do speC de tipo selvagem para um mutante I163S/E165V(speC) de ODC com uma atividade de conversão em putrescina aumentada no cromossomo (exemplo 6). A estirpe modificada foi designada por Corynebacterium glutamicum CC010578, e foi depositada no ‘Korean Culture Center of Microorganisms’ (KCCM) a 10 de Junho de 2013, com o número de adesão KCCM11425P sob o tratado de Budapeste.

[050] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção de putrescina, em que o método compreende os passos que consistem em desenvolver em cultura o microrganismo Corynebacterium sp. que tem uma atividade produtora de putrescina melhorada por alteração para a proteína ODC modificada de acordo com a presente invenção; e recuperar a putrescina a partir de uma cultura obtida no passo anterior.

[051] Especificamente, o microrganismo Corynebacterium sp. pode ser Corynebacterium glutamicum e, mais especificamente, uma estirpe de Corynebacterium glutamicum CC01-0578 (número de adesão: KCCM11425P).

[052] Tal como aqui utilizado, o termo “cultura” designa o desenvolvimento em cultura de um microrganismo sob condições ambientais controladas artificialmente. Na presente invenção, o método para a produção de putrescina utilizando o microrganismo Corynebacterium sp. pode ser conduzido utilizando um método amplamente conhecido na especialidade. Especificamente, como exemplos do método para o desenvolvimento em cultura refere-se um processo de alimentação de lotes ou um processo de alimentação de lotes repetida de um modo contínuo, embora não esteja limitado a estes.

[053] O meio utilizado no desenvolvimento em cultura deverá satisfazer adequadamente os requisitos das estirpes específicas. Os meios de cultura para o microrganismo Corynebacterium sp. encontram-se descritos (v.g., Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). Como fonte de carbono no meio, é possível utilizar açúcares e hidratos de carbono, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose, óleos e gorduras, tais como óleo de soja, óleo de sementes de girassol, óleo de rícino e óleo de coco, ácidos gordos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois, tais como glicerol e etanol, e ácidos orgânicos, tais como ácido acético, etc.. Estas substâncias podem ser utilizadas individualmente ou sob a forma de uma mistura. Como fonte de azoto é possível utilizar peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de molha de milho, pó de farinha de soja e ureia, ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e estas substâncias também podem ser utilizadas individualmente ou sob a forma de uma mistura. Como fonte de fósforo, é possível utilizar di-hidrogeno-fosfato de potássio ou hidrogeno-fosfato de dipotássio ou o sal que contém sódio correspondente. Além disso, o meio de cultura pode incluir um sal de um metal, tal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro que é essencial para o crescimento, e, por último, é possível utilizar substâncias essenciais promotoras do crescimento, tais como aminoácidos e vitaminas, para além das substâncias referidas antes. O precursor adequado pode ser adicionado ao meio de cultura. As substâncias anteriores podem ser adequadamente alimentadas a cultura de um modo descontínuo ou contínuo.

[054] O pH da cultura pode ser ajustado por meio de um composto básico adequado, tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônio, ou de um composto acídico, tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. A formação de espuma pode ser ajustada por meio de um agente anti-formação de espuma, tal como éster poliglicólico de um ácido gordo. A condição aeróbica da cultura pode ser mantida por meio da introdução de oxigênio ou de mistura gasosas que contêm oxigênio (v.g., ar). De um modo geral, a temperatura de cultura pode estar compreendida entre 20°C e 45°C e, em particular, entre 25°C e 40°C. A cultura pode ser continuada até a produção em putrescina atingir o valor máximo desejado e pode normalmente ser alcançado em um período de tempo compreendido entre 10 horas e 160 horas. A putrescina pode ser libertada para o meio de cultura ou pode estar contida na célula.

[055] O método para a produção de putrescina da presente invenção inclui um passo para a recuperação de putrescina a partir da célula ou da cultura. O método para a recuperação de putrescina a partir da célula ou da cultura pode ser efetuado utilizando o método conhecido na especialidade adequado, por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de permuta aniônica, cristalização e HPLC, embora não seja limitado a estes.

FORMA DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[056] Doravante, a presente invenção será descrita mais minuciosamente por referência aos exemplos. No entanto, estes exemplos são apresentados apenas com fins ilustrativos, não se pretendendo que a invenção seja limitada por estes exemplos.

Exemplo 1. Análise estrutural de ODC (ornitina descarboxilase) e concepção de um seu mutante

[057] De um modo geral, sabe-se que a E. coli tem dois tipos de ODC. Uma delas é um ODC indutível (speF), cuja expressão é induzida a um valor de pH acídico, e a outra é uma ODC constitutiva (speC), envolvida na produção de uma diamina, tal como putrescina (Applebaum DM, et al., Biochemistry, 16: 1590-1581, 1977). Entre estas, o spec, que é a ODC constitutiva que está envolvida na produção de putrescina, foi selecionado como gene alvo.

[058] Até agora, as estruturas de ODC de bactérias Vibrio e Lactobacillus foram reveladas. Entre estas, previu-se que a ODC de E. coli ODC (speC) teria uma estrutura semelhante à da ODC de Lactobacillus 30a. Assim sendo, com base na estrutura 3D de ODC de Lactobacillus, efetuou-se o alinhamento da sequência de aminoácidos de ODC de E. coli (speC) utilizando um programa GeneDoc (Momany C, et al., J Mol Biol, 4: 849-854, 1995). Como resultado da comparação das sequências de aminoácidos, a identidade de sequência entre E. coli speC e ODC de Lactobacillus 30a foi de 53% e a similaridade de sequência entre estas foi de 65%, o que indica que as duas enzimas são muito semelhantes entre si. Assim sendo, com base na estrutura de ODC de Lactobacillus 30a (PDB ID: 1ORD) proporcionada pelo banco de dados de proteínas RCSB, efetuou-se uma modelação de homologia da estrutura de E. coli speC. Como resultado, os esqueletos globais das proteínas eram quase idênticos entre si e as sequências de aminoácidos do local ativo envolvido na ligação com PLP (fosfato de piridoxal) também eram quase idênticos entre si.

[059] O resultado da análise das estruturas das duas enzimas mostrou que a ODC existe como um dímero nas células, em que o seu local ativo é formado na interface do dímero e que a região de entrada de uma via para a entrada de substrato no local ativo é estreita. Assim sendo, para se alargar a região de entrada para uma entrada eficaz do substrato no local ativo e uma rápida conversão de um produto, foi concebida uma modificação para substituir os resíduos volumosos na região de entrada por resíduos pequenos (V156, D160, I163, E165, Q691).

[060] Além disso, para a estabilização do cofator PLP que se liga ao local ativo, também foi concebida uma mutação para os resíduos na vizinhança do local ativo (N153, D309).

Exemplo 2. Clonagem e expressão do gene de ODC (speC) de E. coli'

[061] Para expressar o gene speC de E. coli, utilizou-se um sistema de vetor pET28a (Novagen), normalmente utilizado na expressão de enzimas. Em primeiro lugar, ampliou-se o gene speC por PCR utilizando o cromossomo de E. coli W3110 de tipo selvagem com matriz e os iniciadores apresentados no seguinte quadro 1. Tratou-se um fragmento de gene obtido por ampliação por PCR e um vetor pET28a com enzimas de restrição, NdeI e XhoI (37°C, 3 horas), e depois inseriu-se o fragmento do gene speC no vetor pET28a por meio de um método de ligação convencional.[Quadro 1]

[062] A mutação do vetor de expressão de speC (pET28a-speC) assim preparada foi confirmada por análise de sequenciação.

[063] Os resíduos alvo no exemplo 1 foram substituídos por um resíduo pequeno alanina, respectivamente. Para estabilizar o PLP, cada um dos resíduos na vizinhança do local ativo foi modificado de um modo diferente de acordo com a posição de ligação com PLP.

[064] Efetuou-se uma PCR utilizando o vetor pET28a-speC preparado como matriz e os iniciadores apresentados no quadro 1 e no seguinte quadro 2. Em primeiro lugar, para mutar o gene speC, efetuou-se uma PCR primária para as regiões em frente (5’) e para trás (3’) no que diz respeito à região que se pretende mutar e depois efetuou-se uma PCR secundária para a ligação de dois fragmentos de PCR. Por exemplo, no caso de speC V156A, a região para a frente foi ampliada por PCR utilizando speC_start (NdeI)_5 (SEQ ID NO: 2) e speC_V156A_3 (SEQ ID NO: 5) como iniciadores, e a região para trás foi ampliada por PCR utilizando speC_V156A_5 (SEQ ID NO: 4) e speC_stop (XhoI)_3 (SEQ ID NO: 3) como iniciadores. A PCR secundária foi efetuada utilizando os dois fragmentos de PCR obtidos pela PCR primária como matriz e speC_start (NdeI)_5 (SEQ ID NO: 2) e speC_stop (XhoI)_3 (SEQ ID NO: 3) como iniciadores. O gene speC V156A obtido no final foi inserido n vetor pET28a de um modo idêntico ao fragmento do gene speC. Outros fragmentos mutados foram também introduzidos no vetor pET28a por PCR, utilizando os iniciadores apresentados no quadro 2, de um modo semelhante ao descrito antes, respectivamente.

[065] As mutações dos vetores de expressão do mutante speC assim preparadas (pET28a-speC_V156A, pET28a-speC_D160A, pET28a-speC_I163A, pET28a-speC_E165A, pET28a-speC_Q691A, pET28a- speC_N153D, pET28a-speC_N153E, pET28a-speC_D309E) foram confirmadas por análise de sequenciação.[Quadro 2]

Exemplo 3. Medição de uma atividade das enzimas mutantes ODC (speC 3-1. Preparação de enzimas mutantes ODC

[066] Cada um dos vetores pET28a-mutante de speC preparados no exemplo 2 foi transformado em E. coli, com um tipo de gene DE3, para preparar uma estirpe que expresse a enzima ODC.

[067] A expressão do vetor mutante pET28a-speC foi efetuada com referência a um manual do sistema pET (Novagen). Mais minuciosamente, foram selecionadas colónias individuais das estirpes respectivas a partir de meio de placa LB e foram inoculadas em 3 mL de meio líquido LB (+canamicina 50 μg/mL), seguindo-se incubação a 37°C e 200 r.p.m. durante 16 horas. Inoculou-se novamente a cultura em 15 mL de meio LB fresco (+canamicina 50 μg/mL) e manteve-se a incubar sob as mesmas condições até o valor de OD600 atingir cerca de 0.6. Depois, adicionou-se imediatamente IPGT até uma concentração final de 0,5 mM e manteve-se a incubar a 18°C e 180 r.p.m. durante 20 horas para induzir a expressão de enzima.

[068] Após indução da expressão de enzima, as células obtidas foram submetidas a ultrassons e a centrifugação. Utilizou-se o sobrenadante resultante para um primeiro teste de atividade. Adicionalmente, para se caracterizar a enzima, purificou-se a enzima e depois submeteu-se a um segundo teste de atividade. Isolou-se a enzima através de uma coluna de Ni- NTA, utilizando His-tag que se ligou à enzima no vetor pET. Na purificação, utilizou-se um estojo ‘Chelating Excellose spin’ (Bioprogen). As enzimas ODC (de tipo selvagem e speC mutante) assim obtidas foram expressas na forma solúvel através de 8% de SDS PAGE, e assim recuperadas a partir do sobrenadante.

3-2. Medição de uma atividade das enzimas mutantes ODC (speC)

[069] Para se avaliar a atividade de conversão em putrescina por ODC utilizando ornitina como substrato, mediu-se as atividades das enzimas ODC (de tipo selvagem e speC mutante) obtidas no exemplo 3-1. O teste de atividade de ODC para se examinar a atividade de conversão em putrescina foi efetuado com referência ao critério anteriormente descrito (Vienozinskiene J, et al., Anal Biochem, 146: 180-183, 1985).

[070] Isto é, quando uma enzima ODC converte uma molécula de ornitina em putrescina, uma molécula de água é consumida e uma molécula de dióxido de carbono e um íon OH- são produzidos em conjunto com a putrescina. Assim sendo, o pH total é aumentado (esquema 1 de reação). Quando o aumento de pH é medido a 559 nm utilizando vermelho de fenol, um indicador de pH, a absorvência é alterada. A absorvência é aumentada proporcionalmente com o aumento de pH. A quantidade de putrescina foi medida indiretamente utilizando esta propriedade.ESQUEMA 1 DE REAÇÃO L-ornitina + H2O -> putrescina + CO2 + OH-

[071] Para um teste de atividade primário das enzimas ODC, quantificou- se uma quantidade de proteína total nos sobrenadantes antes de purificação e ajustou-se de igual modo as concentrações de sobrenadantes. A solução de reação foi preparada utilizando 30 μg de sobrenadante de enzima, ornitina 10 mM e PLP 1,25 μM PLP, e depois utilizou-se vermelho de fenol 40 μM para monitorizar a alteração de pH.

[072] Como resultado da medição de atividade, a atividade de I163A e de E165A das enzimas mutantes ODC mostrou uma taxa de produção de putrescina superior à de tipo selvagem. A atividade dos 6 tipos restantes de mutantes ODC, V156A, D160A, Q691A, N153D, N153E e D309E, apresentaram poucas alterações na absorvência a 559 nm (ver FIG. 1).

[073] Para caracterizar as duas enzimas mutantes ODC, I163A e E165A, que foram selecionadas na primeira pesquisa, estas foram purificadas com His- tag e foram quantificadas, e depois mediu-se a taxa de conversão em putrescina de acordo com a concentração de ornitina. A enzima ODC foi utilizada em uma concentração de 10 μg e a ornitina foi utilizada em uma concentração de 0,15 mM a 10 mM. Neste intervalo, mediu-se a alteração de pH utilizando vermelho de fenol.Quadro 3

[074] Estes resultados mostram que as enzimas ODC modificadas, I163A e E165A, concebidas através da análise estrutura de ODC apresentaram reduções de 53% e 27% no valor de KM em comparação com o tipo selvagem, respectivamente, o que indica que as suas afinidades de ligação para o substrato ornitina foram aumentadas. Além disso, a atividade das ODC I163A e E165A modificadas mostrou aumentos de 12,5% e 50% no valor de kcat em comparação com WT, respectivamente, o que indica que a aptidão para converter ornitina em putrescina também aumentou. Por último, calculou-se o valor de kcat/KM que mostra a caraterística da atividade de enzima. A I163A e a E165A apresentaram aumentos de 2,4 vezes e de 2 vezes no valor de kcat/KM em comparação com WT, respectivamente (quadro 3).

Exemplo 4. Optimização da mutação de ODC (speC)

[075] Conforme confirmado no exemplo 3, foram efetuadas mutações de vários resíduos aminoácidos pequenos na posição 163 de aminoácido (isoleucina) e na posição 165 de aminoácido (ácido glutâmico), que são resíduos importantes na atividade de ODC. As mutações foram efetuadas de um modo idêntico, tal como descrito no exemplo 1, e os iniciadores aqui utilizados são apresentados no quadro 4 seguinte. Além disso, foram efetuadas mutações individuais nas posições 163 e 165, respectivamente, e depois foram preparados mutantes duplos por introdução em cada posição de uma combinação de mutações que apresenta uma atividade de ODC aumentada, seguindo-se a avaliação. Quadro 4

[076] Os mutantes de ODC preparados por utilização dos iniciadores do quadro 4 foram purificados de acordo com o método dos exemplos 2 e 3 e as taxas de conversão em putrescina foram medidas. Os resultados das medições das taxas de conversão em putrescina para os mutantes de ODC são apresentados no quadro 5 seguinte.Quadro 5

[077] Conforme apresentado no quadro 5, quando os resíduos aminoácidos 163 e 165 foram introduzidos com mutações individuais de glicina (G), serina (S) e valina (V), respectivamente, a substituição do resíduo 163 com serina e a substituição do resíduo 165 com valina mostrou um aumento de 4,4 vezes e de 6,9 vezes no valor de kcat/KM em comparação com o tipo selvagem, respectivamente. Com base neste resultado, foram introduzidas mutações duplas nos dois resíduos, e as suas atividades foram examinadas. De um modo surpreendente, não foi uma mutação dupla da combinação I163S e E165V, cada uma das mutações individuais tinha apresentada a atividade mais elevada, mas uma mutação dupla de substituição de ambos os resíduos 163 e 165 com valina que mostrou um aumento de 21,3 vezes na atividade, em comparação com o tipo selvagem.

[078] Globalmente, as atividades aumentadas dos mutantes da enzima ODC foi atribuído a um aumento no valor de kcat/KM devido a um aumento no valor de kcat, e não em uma diminuição no valor de KM, o que implica que a enzima ODC é mutada de forma a apresentar uma estrutura que aumenta a taxa de conversão em putrescina e não uma estrutura que aumente a afinidade de ligação do substrato ornitina para a enzima.

Exemplo 5. Preparação de uma estirpe que expressa uma enzima mutante ODC utilizando ornitina como substrato e medição da conversão em putrescina

[079] Avaliou-se se as enzimas mutantes ODC, nas quais as mutações são optimizadas no exemplo 4, influenciam na prática a conversão de ornitina em putrescina em um microrganismo.

[080] Mais minuciosamente, para se efetuar a experiência utilizou-se estirpes preparadas por introdução de E. coli com um tipo genético DE3 com os vetores pET28a-mutante de speC preparados. Selecionou-se colónias individuais das estirpes respectivas a partir de meio de placa de LB e inoculou- se em 3 mL de meio líquido LB (+canamicina 50 μg/mL), seguindo-se incubação a 37°C e 200 r.p.m. durante 16 horas. Inoculou-se novamente a cultura em 25 mL de meio LB fresco (+canamicina 50 μg/mL e 0,2% de glicose) e manteve-se a incubar até o valor de OD600 atingir 0,5 a 0,6. Depois, adicionou-se IPTG 0,5 mM para induzir a expressão de ODC (speC) e manteve-se a incubar a 18°C e 200 r.p.m. durante 20 horas. A seguir, submeteu-se a centrifugação para se separar o sobrenadante e para se recolher as células. Colocou-se novamente em suspensão as células obtidas sob a forma de um aglomerado em meio mínimo 1X M9 (Na2HPO4 3,37 mM, KH2PO4 2,2 mM, NaCl 0,86 mM, NH4Cl 0.94 mM) para ajustar o valor de OD600 a 20. Além disso, adicionou-se ornitina 10 mM como substrato e PLP 0,5 μM como cofator até um volume final de 10 mL. Permitiu-se que a reação tivesse lugar sob condições de 25°C e 200 r.p.m. com agitação, tendo-se recolhido amostras ao longo do tempo. Mediu-se a concentração de putrescina convertida através de um método de quantificação de putrescina utilizando TNBS (Ngo TT, et al., Anal Biochem, 160: 290-293, 1987).

[081] No método TNBS, diluiu-se 50 vezes o sobrenadante obtido por centrifugação da amostra de cultura e utilizou-se para se efetuar a análise. Adicionou-se 1 mL de NaOH 4 N a 0,5 mL da amostra diluída, depois acrescentou-se 2 mL de 1-pentanol e misturou-se bem. Submeteu-se a centrifugação a 2000 r.p.m. durante 5 minutos, depois adicionou-se 1 mL do sobrenadante a um novo tubo que continha 1 mL de Na2B4O7 0,1 M (pH 8,0) e mistura bem. Adicionou-se mais 1 mL de TNBS 10 mM, misturou-se bem e depois adicionou-se 2 mL de DMSO e misturou-se. A seguir, submeteu-se a centrifugação e mediu-se a absorvência do sobrenadante resultante a 426 nm. Quadro 6

[082] Mediu-se a conversão em putrescina de ODC de tipo selvagem e de 3 tipos de mutantes de ODC. Como resultado, os mutantes de ODC mostraram um aumento das taxas de conversão de cerca de 32% a 39% de ornitina em putrescina na amostra recolhida decorridas 2 horas em comparação com a de tipo selvagem. Observou-se uma diferença pequena na taxa de conversão entre as mutações de ODC e estas não apresentaram diferença na atividade em que os mutantes de ODC purificados apresentaram uma grande diferença em uma experiência in vitro. No entanto, a ODC de tipo selvagem apresentou uma reação incompleta mesmo após 4 horas, ao passo que os mutantes apresentaram uma reação quase completa decorridas 4 horas. Como resultado, as atividades aumentadas dos mutantes de ODC também foram confirmados nas estirpes de conversão de enzima in vivo.

Exemplo 6. Preparação de estirpe produtora de putrescina com um mutante de ODC e medição da produtividade em putrescina

[083] Para se examinar se a produtividade em putrescina é afetada quando mutantes de ODC com atividade de conversão em putrescina aumentada são introduzidos na prática na estirpe produtora de putrescina, mediu-se a produtividade em putrescina.

6-1. Preparação da estirpe produtora de putrescina que tem um mutante de ODC

[084] Com base no microrganismo Corynebacterium sp. (KCCM11240P), que apresenta uma produtividade em putrescina melhorada por enfraquecimento da atividade de NCgl1469 em comparação com a sua atividade endógena, preparou-se uma estirpe mutante por alteração do speC de tipo selvagem para a ODC (speC) com uma atividade de conversão em putrescina aumentada no cromossomo.

[085] A estirpe de Corynebacterium glutamicum (KCCM11240P) com produtividade em putrescina melhorada é uma estirpe descrita na publicação de patente de invenção internacional n°. WO 2013/105827, e foi preparada utilizando um microrganismo Corynebacterium sp. (KCCM11138P) com uma produtividade em putrescina idêntica à da estirpe progenitora, descrita na publicação de patente de invenção internacional n°. WO 2012/077995. Mais minuciosamente, a estirpe foi preparada por clonagem das regiões do terminal N e do terminal C de NCgl1469 em um vetor pDZ, com base na sequência de bases do gene NCgl1469 da estirpe ATCC13032, introduzindo o vetor em um microrganismo Corynebacterium sp. (KCCM11138P) com produtividade em putrescina, por eletroporação e depois colocando a estirpe em uma placa com um meio que contém canamicina (25 μg/mL), e subsequente seleção. A inserção do cromossómica com sucesso do vetor foi confirmada por seleção de colónias azuis em um meio que contém X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D- galacto-piranósido). A estirpe inserida no cromossomo primária foi desenvolvida em cultura em um meio nutriente, espalhando-se a seguir a estirpe diluída em um meio que contém X-gal e nenhum antibiótico e selecionado as colónias brancas que apareceram em uma proporção relativamente reduzida. Por último, selecionou-se uma estirpe com o gene NCgl1469 suprimido por permutação genética. A estirpe final KCCM11138P △NCgl1469 assim preparada é uma estirpe que sobreexpressa putrescina que tem uma produtividade em putrescina melhorada em comparação com a estirpe progenitora KCCM11138P, em que a estirpe KCCM11138P △NCgl1469 tem uma supressão do gene que codifica NCgl1469, que é uma proteína envolvida em uma via de decomposição de putrescina em N-acetil-putrescina nas células.

[086] Mais minuciosamente, ampliou-se fragmentos de ADN dos mutantes de ODC (speC) preparados nos exemplos 2 e 4 utilizando os iniciadores speC_start (BamHI)_5 e speC_stop (XbaI)_3, apresentados no quadro 7 seguinte. Especificamente, utilizou-se os vetores pET28a-mutante de speC (I163S, I163V, I163S E165V) como matrizes e dois iniciadores de speC_start (BamHI)_5 e speC_stop (XbaI)_3 apresentados no quadro 7 seguinte para se efetuar a PCR.Quadro 7

[087] Tratou-se os fragmentos de gene obtidos por PCR e um vetor pDZ com enzimas de restrição, BamHI e Xbal (37°C, 3 horas), e depois inseriu-se os fragmentos de gene dos mutantes de speC no vetor pDZ através de um método de ligação convencional, respectivamente. Os vetores recombinantes para a inserção cromossómica (pDZ-speC_I163S, pDZ-speC_I163V, pDZ- speC_I163S E165V) assim preparados, foram confirmados por análise de sequenciação.

[088] Para se obter as estirpes em que os mutantes de speC foram inseridos no cromossomo, cada um dos vetores recombinantes pDZ- speC_I163S, pDZ-speC_I163V e pDZ-speC_I163S E165V preparados foi transformado na estirpe KCCM11240P por eletroporação e depois foi espalhado em meio de placa BHIS (37 g/L de infusão de cérebro coração, 91 g/L de sorbitol e 2% de agar por 1 L + 25 μg/mL de canamicina).

[089] A inserção cromossómica com sucesso do vetor foi determinada por exame à aparência das colónias azuis em um meio sólido que contém X-gal (5- bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiran0sido). A estirpe inserida no cromossomo principal foi desenvolvida em cultura em um meio nutriente com agitação (30°C, 8 horas), seguindo-se diluições em série e espalhamento no meio sólido que contém X-gal. A maior parte das colónias era azul, ao passo que as colônias brancas apareceram em uma proporção relativamente reduzida. A partir das colônias selecionadas, foram finalmente obtidas estirpes com mutantes de speC no cromossomo por permuta genética secundária. Estas estirpes foram finalmente identificadas por análise de sequências dos mutantes. As estirpes identificadas foram designadas como KCCM11240P::speC_I163S, KCCM11240P::speC_I163V eKCCM11240P::speC_I163S E165V. Entre estas, a KCCM11240P::speC_I163S E165V foi designada Corynebacterium glutamicum CC01-0578 e foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) a 10 de Junho de 2013, com o número de adesão KCCM11425P, sob o tratado de Budapeste.

6-2. Medição da produtividade em putrescina da estirpe produtora de putrescina que tem um mutante de ODC

[090] Para se examinar o efeito do mutante de ODC (speC) sobre a produtividade em putrescina da estirpe produtora de putrescina, avaliou-se as estirpes preparados no exemplo 6-1 quando á produtividade em putrescina.

[091] Mais minuciosamente, desenvolveu-se em cultura as estirpes preparadas em meio de placa CM que contém arginina 1 mM (1% de glicose, 1% de polopeptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de extrato de carne, 0,25% de NaCl, 0,2% de ureia, 100 μL de NaOH 50%, 2% de agar, pH 6,8 por 1 L) a 30°C durante 16 horas e depois inoculou-se um arco de cultura de células em 25 mL do meio titulado do seguinte quadro 8 e desenvolveu-se em cultura com agitação a 200 rpm e a 30°C durante 24 horas. Todas as estirpes preparadas foram desenvolvidas em cultura com adição de arginina 1 mM ao meio durante a fermentação.Quadro 8

[092] Conforme apresentado no quadro 9, cada estirpe introduzida com o mutante de ODC (speC), que tem uma atividade melhorada, apresentou um aumento de 37% a 105% na produção de putrescina decorridas 24 horas.

[093] Estes resultados mostram que a estirpe produtora de putrescina com o mutante de ODC é capaz de produzir uma concentração elevada de putrescina no que diz respeito ao consumo de açúcar em comparação com a estirpe normal.Quadro 9

[094] Com base na descrição anterior, será evidente para os especialistas na matéria que a presente invenção pode ser implementada em uma forma específica diferente sem alterar o espírito técnico ou as suas características essenciais. Assim sendo, faz-se observar que a variante anterior não é limitativa, mas ilustrativa em todos os aspectos. O âmbito da invenção é definido pelas reivindicações anexas e não pela descrição que as precede, e, assim, todas as alterações e modificações que caiam dentro das metas e limites das reivindicações, ou equivalentes de tais metas e limites, pretende-se que estejam abrangidas pelas reivindicações.

Claims (11)

1. Proteína de ornitina descarboxilase (ODC) modificada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, caracterizada por uma isoleucina na posição 163 de um N-terminal de ODC que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ser substituída por um resíduo de aminoácido menor que isoleucina, e/ou um ácido glutâmico na posição 165 de um N-terminal de ODC que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ser substituído por um resíduo de aminoácido menor que o ácido glutâmico.

2. Proteína de ODC modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o ácido glutâmico na posição 165 ser substituído por alanina, glicina, serina ou valina.

3. Proteína de ODC modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a isoleucina na posição 163 ser substituída por alanina, glicina, serina ou valina.

4. Proteína de ODC modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a isoleucina na posição 163 e o ácido glutâmico na posição 165 serem substituídos por alanina-alanina, alanina-valina, serina-valina ou valina-valina, respectivamente.

5. Proteína de ODC modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ter uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 34 a 57.

6. Método para a preparação de putrescina, caracterizado por o método compreender o passo que consiste em fazer reagir L-ornitina, uma mistura que contém L-ornitina ou um líquido de fermentação de L-ornitina com a proteína de ODC modificada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a proteína de ODC modificada ser uma proteína de ODC modificada purificada ou um líquido de fermentação de microrganismos que compreende a proteína de ODC modificada.

8. Microrganismo recombinante caracterizado por ter uma atividade produtora de putrescina melhorada por alteração da proteína de ODC modificada tal como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em um microrganismo Corynebacterium sp. com atividade produtora de putrescina.

9. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o microrganismo Corynebacterium sp. ser Corynebacterium glutamicum.

10. Método para a produção de putrescina, caracterizado por compreender os passos que consistem em: (a) desenvolver em cultura um microrganismo Corynebacterium sp. que possua uma atividade produtora de putrescina melhorada por alteração da proteína de ODC modificada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, e (b) recuperar a putrescina a partir da cultura obtida no passo (a).

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o microrganismo Corynebacterium sp. ser Corynebacterium glutamicum.

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