KR20120041073A - Ｏ-포스포세린 설피드릴라제 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Mycobacterium smegmatics 유래의 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 O-포스포세린 설피드릴라제 (O-phosphoserine sulfhydrylase ; 이하 “OPSS” 로 지칭함)의 C-말단으로부터 3 내지 7개의 아미노산 잔기가 결실된 OPSS 변이체, 상기 OPSS 변이체를 코딩하는 핵산분자, 상기 OPSS 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 상기 OPS(O-phospho-L-serine), 황화물 및 이의 혼합물에 본 발명의 OPSS 변이체를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 O-phosphoserine sulfhydrase 효소 활성이 개량되어 경제적인 OPSS 변이체를 제공하는바, 간편한 효소 전환 반응을 사용하여 친환경적인 L-시스테인을 생산하는데 있다.

Description

Ｏ-포스포세린 설피드릴라제 변이체{O-phosphoserine sulfhydrylase variants}
본 발명은 Mycobacterium smegmatics 유래의 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 O-포스포세린 설피드릴라제 (O-phosphoserine sulfhydrylase ; 이하 “OPSS” 로 지칭함)의 C-말단으로부터 3 내지 7개의 아미노산 잔기가 결실된 OPSS 변이체, 상기 OPSS 변이체를 코딩하는 핵산분자, 상기 OPSS 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 상기 OPS(O-phospho-L-serine), 황화물 및 이의 혼합물에 본 발명의 OPSS 변이체를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 제조방법에 관한 것이다.
L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임A 생합성의 전구물질로 사용된다. 또한 시스테인 생합성은 L-세린, L-글리신, L-메치오닌 등 다른 아미노산의 생합성과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져있다. 산업적으로, L-시스테인 및 그 유도체는 제약분야(기관지 질환치료), 화장품 분야(헤어샴푸 및 퍼머웨이브로션의 성분) 및 식품분야(항산화제, 풍미증진제 및 반죽보조제)에 사용되고 있다.
지금까지 L-시스테인은 주로 사람의 머리카락이나, 동물의 깃털 등을 원료로 하여 화학적인 산-가수분해공정으로 생산되어왔다 (Biotechnology of the Amino Acids Production edited by Ko Aida, pp 217-223, 1986). 그러나 머리카락으로 부터 추출하는 시스테인의 생성 수율은 7~8%로 매우 낮으며, 추출과정 중 사용하는 염산과 황산의 사용으로 환경오염 폐기물이 과량 생성된다. 또한 원재료로 머리카락을 이용함으로 소비자들에게 혐오감을 불러 일으킬 수 있다. 이러한 문제들로 인해 친환경적 L-시스테인 생산공정의 개발요구가 높아졌으며, 이에 따라, 미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법이 개발되었다.
미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로 1) 우선, D,L-ATC에 미생물을 이용하여 생물학적으로 전환하는 방법이 알려져 있다(Ryu OH, Ju JY and Shin CS, Process Biochem. , 32:201-209, 1997). 하지만 이 방법은 전구체인 D,L-ATC의 용해도가 낮아 산업화에 어려움이 있다. 2) 또 다른 방법은 대장균을 이용한 직접 발효법으로 L-시스테인을 생산하는 방법이 알려져 있다(Patent No. EP0885962B; Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). 이 방법은 미생물 내 L-시스테인이 과량 축적될 경우 세포 내 독성을 나타낼 수 있어, 미생물을 이용하여 높은 농도의 L-시스테인을 생산하는데 한계가 있다. 이를 극복하기 위해서 L-시스테인을 세포 밖으로 배출하는 단백질을 이용하였으나 여전히 생산성이 크게 향상되지 않는 단점이 있다.
미생물 및 식물의 L-시스테인 생합성 경로를 살펴보면, O-아세틸-세린(O-acetyl-serine, OAS)은 L-시스테인의 탄소골격의 중간 전구물질로서 작용한다(Kredich NM and Tomkins GM, J. Biol. Chem. , 241: 4955-4965, 1966). O-acetyl-serine은 sulfur donor로 Hydrogen sulfide를 이용하여 O-아세틸세린 설피드릴레이즈(O-acetylserine sulfhydrylase, OASS)에 의해 S-설포시스테인(S-sulfocysteine)이 되고, 이는 시스테인으로 전환될 수 있다. 또한 황화물 공여체로서 SO4를 환원시켜 티오 황산나트륨(thiosulfate)을 만들고 이를 이용하여 시스테인을 만들 수 있다(Nakamura T, Kon Y, Iwahashi H and Eguchi Y, J. Bacteriol. , 156: 656-662, 1983). 이러한 OAS(O-acetylserine)를 이용한 시스테인 생합성 경로의 경우 세린으로부터 OAS(O-acetylserine)를 전환하는 활성을 가진 효소인 세린 아세틸트렌스퍼레이즈(CysE, serine acetyltrnasferase)와 OAS(O-acetylserine)로부터 시스테인을 전환하는 활성을 가진 효소인 시스테인 신세이즈(CysK, cysteine synthase)를 이용하게 되는데 이들 효소 중 특히 세린 아세틸트렌스퍼레이즈 (CysE)는 최종 산물인 시스테인에 대해 강한 피드백을 가지고 있다고 알려져 있어(Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem. , 73:48-54, 2006) 시스테인에 대한 피드백이 해제된 변이체 효소의 개발이 필수적으로 어려움이 따른다.
본 발명자들은 이러한 단점을 극복하고, 고수율의 L-시스테인을 제조하는 방법을 개발하기 위해 여러가지 방법을 모색하던 중, Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, Trichomonas vaginalis 에서는 기존에 알려진 경로와 달리 시스테인 합성에 OAS(O-acetylserine)를 이용하지 않고 O-phospho-L-serine(OPS)을 이용하여 L-시스테인을 합성하는 효소(O-phosphoserine sulfhydrylase(OPSS))가 존재한다는 사실을 알게 되었다 (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW and Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006). 특히, M. tuberculosis 의 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase)는 보조효소인 mec+, cysO의 도움을 받아 OPS를 시스테인으로 전환시키는데 C-말단의 5개 아미노산을 제거할 경우 이러한 보조효소들의 도움 없이, 황화물 공여체인 Na2S를 이용하여 OPS를 시스테인으로 전환시킬 수 있다는 사실을 확인하게 되었으며(Agren D, Schnell R and Schneider G, FEBS letters, 583: 330-336, 2009), 이러한 사실에 근거하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 Mycobacterium smegmatics 유래의 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 O-phosphoserine sulfhydrylase (OPSS) 의 C-말단으로부터 3 내지 7개의 아미노산 잔기가 결실된, OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 OPS(O-phospho-L-serine), 황화물 및 이의 혼합물에 본 발명의 OPSS 변이체를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 Mycobacterium smegmatics 유래의 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 O-포스포세린 설피드릴레이즈(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)의 C-말단으로부터 3 내지 7개의 아미노산 잔기가 결실된, OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "Mycobacterium smegmatics"는 방선균목에 속하는 것으로서 가늘고 꼿꼿하거나 또는 약간 만곡된 간균으로 불규칙한 분지를 나타내며 염기성 시약인 아닐린으로 염색이 가능한 균주이다. 본 발명에서는 상기 균주의 O-포스포세린 설피드릴레이즈(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)의 아미노산을 변형시켜 L-시스테인의 생합성을 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "O-포스포세린 설피드릴레이즈(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 OPS(O-phosphoserine)을 기질로 하여 시스테인을 합성하는 효소를 말하며, Aeropyrum pernix 에서 처음으로 효소의 활성을 확인하며 명명했다(Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003, 서열번호 6).
본 발명에 있어서 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase)를 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용이 가능하다. 그 방법의 예로는 효소 발현에 통상적으로 널리 이용되는 대장균에서 효소를 고효율로 확보할 수 있도록 코돈 최적화가 포함된 유전자 합성 기술 그리고 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원의 스크리닝 방법을 통해 확보할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 OPS를 기질로 하여 시스테인을 합성하는 다양한 미생물 유래의 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 효소를 선별하였으며, 상기의 효소를 확보하기 위한 방법으로 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 획득한 세포 침전물을 통상적으로 이용하는 세포파쇄법으로 효소가 포함된 상등액을 획득하여 정제과정을 거쳐 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 효소를 확보하였다.
본 발명에서 용어, "변이체"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻하며, 바람직하게 본 발명에서는 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase)의 유전자 하나 또는 그 이상이 변이되어 그 활성이 야생형과 비교하여 효율적으로 증가될 수 있는 변이체를 의미한다.
본 발명자들은 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래의 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 효소의 5개의 C-말단이 제거된 변이체의 경우 조효소들이 존재하지 않은 조건에서 S2-기를 지닌 황 소스에 대한 기질 친화도가 증가한다는 결과를 바탕으로, Mycobacterium smegmatics 유래의 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase)의 5개의 C-말단이 제거된 변이체를 제조하였다. 본 발명에 따른 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체는 Mycobacterium smegmatics 유래의 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase)의 C-말단으로부터 3 내지 7개의 아미노산 잔기가 결실될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5개의 아미노산 잔기가 결실될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체는 Mycobacterium smegmatics 유래의 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase)의 C-말단으로부터 5개 아미노산 잔기가 결실된 것으로, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이체를 이용하여 OPS 기질로부터 시스테인을 합성하는 경우 시스테인 합성 반응 시간 1시간 만에 100%의 시스테인 전환율을 보였다(표 5).
또한, 본 발명의 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체는 효소 활성을 더욱 증가시키기 위해 아미노산을 치환하여 제작할 수 있다. 일반적으로 효소를 개량하기 위한 방법으로 당업계의 알려진 공지된 방법들이 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게 본 발명에서는 효소의 활성이 증진된 변이형 효소를 제조하는 방법인 무작위적인 변이를 일으키는 방법(random mutagenesis)을 사용하였다. 구체적으로 본 발명자는 무작위적인 변이를 일으킨 OPS sulfhydrase의 경우, 특성이 개량된 변이 효소를 HTS(High-Throughput-Screening) 할 수 있는 스크리닝 시스템을 개발하였고, 이를 통해 Msm-T 유전자를 주형으로 수행한 HTS 스크리닝을 통해 획득한 Msm-T-HA2, Msm-T-EP3 변이체를 확보하였다. Msm-T-HA2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이체에 추가로 N-말단으로부터 77번째 프롤린(Pro)이 세린(Ser)으로 치환된 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체이고, Msm-T-EP3는 N-말단으로부터 131번째 쓰레오닌(Thr)이 알라닌(Ala)으로, 137번째 라이신(Lys)이 아스파라진(Asp)으로, 238번째 쓰레오닌(Thr)이 세린(Ser)으로 치환된 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체이다. 바람직하게 상기 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체, Msm-T-HA2 및 Msm-T-EP3는 서열번호 3 및 서열번호 4로 개시되는 변이체일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 Msm-T-HA2 및 Msm-T-EP3은 서열번호 2의 Msm-T보다 효소 활성이 더욱 증가한 것을 확인할 수 있었다(표 5 내지 표 6). 구체적으로 대조군인 Msm-T 효소와 Msm-T-HA2 및 Msm-T-EP3 변이체 활성을 비교 분석한 결과 시스테인 전환 반응 초기 시스테인 전환율이 5배, 1.2배 증가하면서 활성이 개량됨을 알 수 있었다. 또한, Msm-T 효소 대비 시스테인 합성 효소 활성이 4배 증가한 Msm-T-HA2 변이체는 시스테인 전환 반응 공정시 투입되는 효소량을 Msm-T의 40%를 사용하여도 최종 시스테인 전환율이 동등한 결과를 얻었다.
본 발명의 변이체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase)의 C-말단으로부터 3 내지 7개의 아미노산 잔기가 결실된 변이체, 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 갖는 변이체, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이체에 추가로 N-말단으로부터 77번째 프롤린(Pro)이 세린(Ser)으로 치환된 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이체에 N-말단으로부터 131번째 쓰레오닌(Thr)이 알라닌(Ala)으로, 137번째 라이신(Lys)이 아스파라진(Asp)으로, 238번째 쓰레오닌(Thr)이 세린(Ser)으로 치환된 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 변이체, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 변이체와 비교하여 50% 이상의 유전적 상동성을 가지며, 바람직하게는 60%, 70%, 75%, 80%의 유전적 상동성을 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 85%, 90%, 95%의 상동성을 가질 수 있고, 가장 바람직하게는 97% 또는 99%의 상동성을 가지는 폴리펩티드 모이티를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상응성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 또한, 상동성은 상동 영역간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "상동"은 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태는 슈퍼패밀리 유래 단백질(예, 면역글로불린 슈퍼패밀리) 및 다른 종 유래의 상동 단백질(예, 미오신 경쇄 등)을 포함하며, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 발명에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용상에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 염기 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다. 하나의 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열이 아미노산 서열의 소정의 길이에 대해 폴리펩티드 매치가 적어도 21%(바람직하게 적어도 약 50%, 가장 바람직하게 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이다(예. Sambrook et al., 1989, infra 참고).
본 발명의 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체는 OPS(O-phospho-L-serine)에 황화물의 티올그룹(thiol, group, SH기)을 제공함으로써, 상기 OPS를 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매한다.
본 발명의 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체가 최적의 활성을 나타낼 수 있는 조건은 i) 보조인자 (cofactor)로 0 내지 2 mM의 PLP (pyridoxal-5 -phosphate) 또는 0 내지 100 mM의 DTT (dithiothreitol)가 첨가되고; ii) 온도는 25 내지 60oC이며; iii) pH는 6.0 내지 10.0 인 경우이다.
OPS 기질에 티올그룹을 제공하여 시스테인으로 전환하는 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 효소 활성 측정 방법은 Ape-OPSS(Ape-O-phosphoserine sulfhydrylase) 효소가 명명되면서 함께 밝혀졌다. 특이적으로 Ape-OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 효소의 경우, OAS(O-acetylserine) 기질에 티올그룹을 제공하여 시스테인으로 전환하는 효소 활성도 가지고 있어 대장균 시스테인 합성효소(OASS, O-acetylserine sulphydrylase, EC 4.2.99.8))의 활성 측정 방법에 기반을 두고 있다(Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003). OAS(O-acetylserine) 혹은 OPS에 티올그룹을 제공하여 시스테인 전환반응 시 OASS 또는 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 효소의 보조인자로 작용하는 PLP를 0.2mM 농도로 첨가하며, 공기 중에 노출되어 생성된 시스테인이 시스틴으로 산화를 방지하고 이미 시스틴으로 산화된 시스테인의 양을 정확히 파악하고자 DTT를 첨가하여 환원력을 부여하였다. 서열번호 2을 가지는 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 변이체 효소를 이용하여 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase) 효소 활성 시 보조인자로 작용하는 PLP와 환원력을 제공하는 DTT의 첨가 유무에 대한 효과를 확인하였다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 대조군 대비 25mM DTT 또는 0.2mM PLP가 첨가된 실험군에서의 시스테인 전환율이 2.3배 증가함을 확인할 수 있었다. 즉, 시스테인 전환 시 PLP와 DTT가 반응에 긍정적으로 작용함을 확인하였다.
또한, Ape-OPSS(Ape-O-phosphoserine sulfhydrylase) 혹은 Mtb-OPSS, Mtb-T 효소의 최적 전환 반응 온도는 60℃ 혹은 37℃이고 최적 pH 7.4임은 기존 문헌을 통해 당업계에 공지되어 있다(Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Agren D, Schnell R and Schneider G, FEBS letters, 583: 330-336, 2009). 따라서 상기 문헌의 보고에 전환 반응 조건을 바탕으로 하여 효소 활성이 개량된 OPSS 변이체 효소를 이용한 시스테인 전환 반응 조건을 최적화할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기의 OPSS 변이체 효소를 이용하는 경우 효소 전환 반응 온도 37℃에서 80℃까지 가능하며, 구체적으로 고온에서도 생장이 가능한 Archea에 속하는 Ape-OPSS 효소의 경우, 37℃에 비해 60℃ 온도에서 효소 활성이 증가했으며 효소 자체의 열 안정성도 뛰어나 최적 효소 반응 온도는 60℃였다. 반면 Msm-T의 경우, 37℃ 온도에서 최적의 활성을 보였으며, 60℃ 열처리에 민감성을 나타냈다. 또한, 효소 전환 반응 pH 6.0~10.0 범위까지 OPSS 효소이 활성을 보였으며 특히 Ape-OPSS는 pH 7.4에서 최적의 활성을 보였고, Msm-T의 경우 바람직하게는 pH8.0 내지 9.0에서 최적 활성을 보이며 Ape-OPSS 대비 좀 더 넓은 범위의 pH에서 안정성을 나타냈다.
또한, 본 발명은 본 발명의 OPSS 변이체를 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "핵산분자"는 DNA 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
또한, 본 발명은 상기 OPSS 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다 (예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64) 참조. 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다.
당업계에서 통상적으로 사용되는 T7 프로모터를 이용하는 pET 시스템(novagen)은 잘 알려져 있으며, 당업계에 공지된 다양한 발현 시스템을 이용할 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 하지만, 본 발명에서는 상용되는 효소 발현 시스템을 사용하지 않고 자체적으로 효소 발현 시스템을 개발하고자 노력하여 CJ1 프로모터를 이용한 외래 유전자 발현 시스템을(CJ1 system, KR공개 10-2006-0068505) 사용하였다.
구체적으로 T7 프로모터를 사용하는 pET 시스템과 CJ1 프로모터를 사용하는 발현 시스템을 이용하여 동일 배양조건에서 OPSS 발현량을 확인하였다. 그 결과, pET 시스템 대비 CJ1 시스템 발현 조건에서 OPSS 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 또한 pET 시스템을 이용하여 OPSS 효소를 획득하는 경우, 효소를 과발현하기 위해 저온(18℃)으로 장시간 배양 단계를 필요로 하는 반면, CJ1 프로모터를 이용한 외래 유전자 발현 시스템을 이용하는 경우에는 고온(37℃)에서 단시간 배양으로 경제적인 OPSS의 확보가 가능하였다. 바람직하게 본 발명에서는 CJ1 프로모터를 이용하여 OPSS 효소를 효율적으로 확보하는 시스템을 사용하였다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "형질전환" 은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 안으로 이동하여 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 것을 말한다.
상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터로 형질감염된 세포를 말하며, 숙주 세포로는 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하며, 바람직하게는 엔테로박테리아과 미생물 또는 코리네형 미생물 등, 더욱 바람직하게는 에스케리키아속 미생물, 세라티아속 미생물 등을 들 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균일 수 있다.
또한, 본 발명은 OPS(O-phospho-L-serin) 및 황화물의 혼합물에 상기 기술된 OPSS 변이체를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는 시스테인 또는 이의 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
상기 OPS는 정제된 OPS 또는 OPS가 포함되는 미생물 발효액 중의 OPS가 이용될 수 있으며, 상기 정제된 OPS는 Sigma-Aldrich 사의 P0878 제품번호 또는 Wako사의 CAS407-41-0 제품번호로 구매할 수 있다. 발효를 통해서 제조된 OPS 발효액을 기질로 사용했을 때는 정제된 상용 OPS를 기질로 사용했을 때에 비해 OPS의 정제단계가 단축되어 경제적이며 전환반응에 필요한 보조인자인 PLP를 미생물 발효액에서도 획득할 수 있다는 장점을 가지게 된다.
상기 황화물은 당해 기술분야에서 통상적으로 티올그룹(thiol group, SH기)으로 전환될 수 있는 모든 황화물이면 이용 가능하다. 바람직하게는 액체 또는 기체 형태의 티올 그룹을 제공하는 Na2S, H2S 및 S2O3를 이용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Na2S을 황 소스로 사용하였다. 당해 황화물은 전환 반응 시 투입되는 OPS 몰농도 대비 1~3배의 몰농도까지 이용 가능하다.
구체적으로 50mM OPS 발효액 혹은 60mM OPS 발효 정제액, 100mM Na2S 혹은 120mM Na2S, 0.2mM PLP 반응 조건에서 50 ㎍/㎖ 농도로 사용하여 Msm-T 효소 대비 동등한 80%의 시스테인 전환율을 보이는 Msm-T-HA2 효소를 사용하는 것이다. 본 기술 분야의 당업자라면 효소 활성이 높은 효소를 이용한 효소 전환 공법을 최적화하고 scale-up하는 것이 자명한 일로 누구나 쉽게 이해할 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 19. 317g/L OPS 발효액을 이용하여 50mg Msm-T-HA2를 투입하여 2시간 효소 반응하였을 때, 최대 시스테인이 9. 075g/L 생성되는 것을 확인하였으며(표 20), 1L 반응 조에서 효소 전환 공정을 통해 OPS 기질로 하여 71.83% 시스테인을 생산할 수 있음을 확인하였다(표 19).
상기 형질전환체를 이용하여 시스테인을 대량 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 상기 변이체 및 형질전환체로부터 발현된 변이체를 이용하여 시스테인을 대량 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 효소 활성 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
약어 및 용어
본 발명에 대해 잘 설명하기 위해, 그리고 당업자들이 본 발명을 실시하는 것을 안내하기 위해 하기의 용어 및 방법들에 대한 설명이 제공된다. 하기에서 명확하게 달리 규정하지 않는 이상, "포함하는(comprising)" 은 "포함하는(including)"을 의미하고, 단수형인 "하나(a)" 또는 "하나(an)" 또는 "상기(the)"는 복수형을 포함한다. 예를 들면, "하나의 세포를 포함하는(comprising a cell)"은 그러한 세포들의 하나 또는 다수를 포함하는 것을 의미한다.
"또는(or)"은 명확하게 달리 규정하지 않는 이상, 열거된 대안적 요소의 하나의 단일 요소를 의미하거나 둘 이상의 요소들의 하나의 조합을 의미한다.
달리 설명되지 않는다면, 본 발명에 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명의 기술이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미와 같은 의미를 가진다. 비록 하기 개시된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 실험에 이용될 수 있더라도, 적절한 방법 및 물질이 하기에 개시된다. 물질,방법 및 실시예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니고 설명을 위한 것이다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백할 것이다.
결실(Deletion): 함께 결합되어 있는 어느 한쪽 영역에서, 핵산 분자로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 제거 또는 단백질로부터 하나 이상의 아미노산의 제거를 의미한다.
본 발명은 O-포스포세린을 기질로 하여 L-시스테인을 효소 전환으로 생산하는데에 필수적인 O-phosphoserine sulfhydrase 효소 활성이 개량된 OPSS 변이체를 제공하는바, 이를 이용하면 간편한 방법으로 고수율로 O-포스포세린을 기질로 하여 친환경적인 L-시스테인을 용이하게 생산할 수 있다는 이점이 있다.
도 1은 OPS sulfhydrase 효소의 온도별 활성도를 측정한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 OPS sulfhydrase 효소의 pH 민감성을 나타내는 도이다.
도 3은 동일 배양조건에서 pET 시스템 대비 pCL-Pcj1 시스템을 이용한 효소 발현량의 증가를 나타내는 도이다.
도 4는 온도에 따른 OPS 발효 정제액을 기질로 OPS sulfhydrase 효소를 이용한 시스테인 전환반응의 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 OPS 발효액을 기질로 OPS sulfhydrase 효소를 이용한 시스테인 전환 반응을 나타내는 도이다.
도 6은 1L jar scale 반응 조에서 OPS를 기질로 하여 효소 전환 공정을 통한 시스테인과 시스틴의 생성을 나타내는 도이다.
도7은 pCL-Pcj1 system을 이용한 OPSS 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: OPS sulfhydrase ( OPSS ) 효소 확보
Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis , Trichomonas vaginalis 에서는 기존에 대장균에서 알려진 경로와 달리 시스테인 합성에 OAS(O-acetylserine)를 이용하지 않고 O-phospho-L-serine(OPS)을 이용하여 L-cysteine을 합성하는 효소인 O-phosphoserine sulfhydrylase (OPSS)가 존재한다고 보고되었다 (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW and Begley TP, J. Am. Chem. Soc. , 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol. Chem. , 281: 25062-25075, 2006). 상기의 문헌 보고를 바탕으로 OPS을 기질로 하여 시스테인을 합성하는 총 2종의 OPSS 효소, Ape-OPSS 및 Mtb-OPSS를 Aeropyrum pernix , Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래로부터 확보하였다. 상기의 2종의 효소 중 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래 OPSS 효소를 기반으로 하여 아미노산 상동성 검색을 통해 Mycobacterium smegmatics str . MC2 155, Rhodococcus jostii RHA1 , Nocardia farcinica IFM 10152 유래 3종의 OPSS 효소, Msm-OPSS, Rjo-OPSS, 및 Nfa-OPSS를 선별하였다.
각각의 균주로부터 OPSS 효소를 획득하기 위하여, 통상적으로 효소 발현을 위해 이용되는 pET28a (novagen) 벡터 시스템을 제작하였다. 총 5종의 OPSS 효소 발현 벡터명과 벡터를 제작하기 위해 사용한 각각의 주형 및 프라이머는 하기 [표 1]와 같다. 주형과 프라이머 조합을 맞추어 PCR기법을 통해 각각의 OPSS 유전자를 증폭하여 얻은 유전자 단편과 벡터 pET28a을 NdeI과 HindIII 제한효소를 처리(37℃, 3시간 반응)하였다. 이후 통상적인 라이게이션 기법을 사용하여 pET28a (novagen) 벡터에 각각의 유전자 단편을 삽입하였다. 각각의 효소 발현 벡터 제작 유무 및 유전자 서열은 시퀀싱 기법으로 모두 확인하였다. 상기 제작된 효소 발현 벡터를 DE3 유전자형을 가진 대장균에 도입하여 총 5종의 OPSS 효소를 획득할 수 있는 균주를 제작하였다. 효소명은 하기 [표 1]와 같다.
효소명 벡터명 사용한 주형 사용한 프라이머
Ape-OPSS pET28a-Ape-OPSS 합성 DNA 서열번호7, 서열번호8
Mtb-OPSS pET28a-Mtb-OPSS Mtb genomic DNA 서열번호9, 서열번호10
Msm-OPSS pET28a-Msm-OPSS Msm genomic DNA 서열번호11, 서열번호12
Rjo-OPSS pET28a-Rjo-OPSS Rjo genomic DNA 서열번호13, 서열번호 14
Nfa-OPSS pET28a-Nfa-OPSS Nfa genomic DNA 서열번호15, 서열번호 16
효소를 발현하기 위한 방법은 pET system 매뉴얼 (novagen)을 참조하였다. 평판 LB 배지에서 각각의 균주의 단일 콜로니를 선별하여 5ml LB 액체배지에 접종하여 37℃, 200rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 25ml LB 액체배지(250ml 용량의 플라스크)에 250ml 재접종하여 OD600 이 0.5~0.6 되도록(2~3시간) 동일 배양 조건에서 키운 직후, 1mM IPTG을 배지에 첨가하여 18℃, 120rpm, 18 시간 배양하여 효소 발현을 유도하였다. 효소의 정제를 위한 방법은 his-tag을 이용하여 Ni-NTA columns으로 분리하였다. 정제 방법은 His spintrap(GE healthcare)을 인용하였다. 상기의 과정으로 획득한 총 5종의 OPSS효소는 14% SDS PAGE을 통해 각각 확인한 결과, 응집체(inclusion body) 형태로 발현되는 Rjo-OPSS 효소를 제외한 총4종의 가용성의 OPSS 효소를 확보하였다.
실시예 2: OPSS 효소의 시스테인 합성 활성 평가
O-포스포세린(OPS)을 기질로 한 시스테인의 합성 여부를 파악하기 위해 다양한 미생물 유래로부터 확보한 총 6종의 OPSS의 효소 활성을 측정하였다. 시스테인 합성 활성 평가 (cysM enzyme assay) 조건 및 방법은 문헌 보고(Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW and Begley TP, J. Am.Chem. Soc. , 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol.Chem., 281: 25062-25075, 2006)를 인용하였다. 기질의 첨가 단위는 ml 이며, 효소 활성을 측정하기 위한 조건은 하기 [표 2]와 같다.
Stock sol'n Final Conc. Blank OPS sulfhydrase
6xhis-enzyme - 40 (50mg)
1 M HEPES(pH7. 4) 100 mM HEPES 100 100
0.5 M Na2S 10 mM Na2S 20 20
10 mM PLP 0.2 mM PLP 20 20
100mM OPS 5mM OPS 0 50
DW 790 750
Total 1000 1000
효소를 제외한 반응액을 37℃에서 5분간 배양시킨 후, 정제된 OPS sulfhydrase 효소 50mg을 첨가하여 37℃ 반응하여 시간별로 효소 반응액 100ml 취하여 33. 2% TCA 100ml 와 혼합하여 반응을 중지시켰다. 효소 반응액 내의 시스테인의 농도는 Gaitonde 방법으로 OD560 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 하기 [표 3]에서는 총 4종의 OPS sulfhydrase 효소들의 시스테인 합성 활성을 보여주며, 반응 시간별 시스테인 전환율을 비교하여 OPSS 효소들의 시스테인 합성 역가를 평가하였다.
시스테인 전환율(%)
10min 30min 60min
Ape-OPSS 63.4 89.7 97.4
Mtb-OPSS 1.7 4.8 10.1
Msm-OPSS 12.8 25 43.7
Nfa-OPSS 0.1 0.1 0.2
상기의 결과로부터, Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래의 OPS sulfhydrase의 경우 OPS을 기질로 하여 시스테인을 합성하는 활성을 가지고 있음을 검증하였으며, Mtb-OPSS 효소 기반으로 아미노산 상동성 탐색을 통해 확보한 신규 Mycobacterium smegmatis str . MC2 155 유래 OPS sulfhydrase(Msm-OPSS)의 시스테인 합성(서열번호 23) 활성을 처음으로 확인하였다. 하지만 상동성 탐색을 통해 확보한 신규 Nocardia farcinica IFM 10152 유래 OPS sulfhydrase의 경우 O-포스포세린을 기질로 한 시스테인 합성 효소 활성이 미미하였다.
또한 상기 결과에서, 동일 효소 반응시간 1시간에 OPS을 기질로 하여 시스테인을 합성하는 전환율 100% 혹은 100%에 가까운 Ape-OPSS 효소를 확보하였다.
또한, 기존에 문헌을 통해 보고된 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래 OPSS 효소를 기반으로 효소 스크리닝 기법을 통해 새로이 선별된 Msm-OPSS 효소의 최종 시스테인 전환율은 43.7%로 Mtb-OPSS 효소 대비 효소 활성이 4.3배 증가되었음을 확인하였다.
실시예 3: Mtb - OPSS , Msm - OPSS 기반 C말단으로부터 5개의 아미노산이 결손된 Mtb -T, Msm -T 변이체 확보
Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래 OPSS 효소는(Mtb-OPSS) 보조효소인 mec+, cysO의 도움을 받아 OPS를 시스테인으로 전환시키는데, C-말단의 5개 아미노산을 제거할 경우 이러한 보조효소들의 도움 없이 S2-기를 지닌 황 소스를 이용하여 OPS를 시스테인으로 전환시키므로, S2-기를 지닌 황 소스를 이용하여 OPS을 빠르게 시스테인으로 전환하는 Mtb-T(서열번호 24)를 확보하였다. 또한 Mtb-OPSS 효소와 높은 아미노산 상동성을 보이는 Msm-OPSS 효소를 기반으로 하여 C-말단의 5개 아미노산이 결실된 Msm-T 효소를 추가 확보하였다. 2종의 변이체 효소 발현 벡터를 제작하기 위해 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 및 Mycobacterium smegmatics str . MC2 155 의 genomic DNA를 주형으로 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19, 서열번호 20의 각각의 프라이머 쌍을 이용하였으며, pfu PCR을 수행하였다. 각각의 OPSS 유전자 단편은 NdeI, HindIII로 제한 효소 처리하여, NdeI, HindIII로 절단된 pET28a 벡터에 클로닝 하여, pET28a-Mtb-T 및 pET28a-Msm-T 벡터를 제작하였다. 위의 제작된 효소 발현 벡터를 DE3 유전자형을 가진 대장균에 도입하였다. 효소 발현 및 정제는 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 수행하여 얻어진 2종의 변이체 OPSS 효소는 14% SDS PAGE을 통해 효소 발현을 확인하였으며, 그 결과 Mtb-T(서열번호 5), Msm-T(서열번호 2) 효소를 확보하였다.
실시예 4: Mtb -T, Msm -T 변이체의 시스테인 합성 활성 평가
상기 실시예에서 수득한 Mtb-T, Msm-T 효소의 최종 시스테인 전환율을 실시예 2와 동일하게 측정하여 효소 활성을 평가하였으며, 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다.
시스테인 전환율(%)
10min 30min 60min
Mtb-T 9.5 18.6 37.1
Msm-T 20.3 54.6 100
그 결과, Msm-T 변이체의 경우, 시스테인 합성 반응시간 1시간에 100%의 시스테인 전환율을 보였다.
실시예 5: Msm -T 효소 개량을 통해 확보한 Msm -T- HA2 , Msm -T- EP3 변이체의 시스테인 합성 활성 평가
OPS 기질로 100% 시스테인 전환율을 보이는 Msm-T를 기반으로 하여 효소 진화방법을 통해 활성이 증가한 Msm-T-HA2(서열번호 25)와 Msm-T-EP3(서열번호 26) 2종의 효소를 획득하였다. 일반적으로 효소의 활성이 증진된 변이형 효소를 제조하는 방법인 하이드록시아민 트리트먼트(Hydroxyamine treatment) 와 error-prone PCR (Clontech. Diversity PCR random mutagenesis kit) 키트를 이용한 무작위 돌연변이법(random mutagenesis)으로 Msm-T의 변이형 라이브러리를 제작하여 효소 활성이 개량된 OPSS 변이체를 스크리닝 하고자 하였다.
상기의 스크리닝 시스템을 이용하여 Msm-T 유전자를 주형으로 수행한 HTS 스크리닝을 통해 획득한 Msm-T-HA2, Msm-T-EP3 변이체의 염기서열을 분석한 결과, 각각 서열번호 3의 아미노산 서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 기재되는 것을 확인하였다.
상기 Msm-T-HA2, Msm-T-EP3 변이체와 대조군인 Msm-T을 사용하여 OPS을 기질로 하여 시스테인 효소 활성을 비교 분석하였다. 효소 활성 평가는 앞서 기술한 실시예 2와 동일한 방법을 사용하였다.
시스테인 전환율(%)
10min 30min 60min
Msm-T 20.3 54.6 100
Msm-T-HA2 101.6 101.2 97.5
Msm-T-EP3 24 65.7 100.7
Msm-T Msm-T-HA2 Msm-T-EP3
Specific activity
(Cystein (umole) / min / mg)		 14.96 44.82 16.72
상기 표의 결과에서 보듯이, 대조군인 Msm-T 대비 효소 진화법으로 획득한 Msm-T-HA2, Msm-T-EP3의 효소 활성을 비교하였을 때, 효소 반응 조건 초기 10분에서 시스테인 전환율이 5배, 1. 2배 증가하여 OPS을 기질로 하여 시스테인을 합성하는 효소 활성이 개량되었음을 확인하였다. 또한 효소의 활성을 확인할 때 범용적인 수치로 나타내는 specific activity (생성물농도/시간/효소량)을 비교하였다. 구체적으로 대조군인 Msm-T 대비 Msm-HA2의 specific activity의 수치가 3배 증가하여, OPS을 기질로 하여 단위시간 및 단위효소량 비에 대조군 대비 빠르게 시스테인을 합성할 수 있는 효소 활성이 개량된 변이체임을 입증하였다.
실시예 6: OPS sulfhydrase 효소의 보조인자( cofactor ) 요구성
시스테인 전환반응에 있어 조효소의 요구성을 확인하기 위해 Msm-T로 PLP와 DTT 의 유무에 따른 시스테인 전환율을 확인하였다. 50 mM OPS broth, 100 mM Na2S를 기질로 25 mM DTT 또는 0.2 mM PLP 조건에서 37℃에서 30분간 반응하였고 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 하기 [표7] 결과에서 보듯이 PLP와 DTT가 첨가되지 않은 대조군 대비 PLP와 DTT가 첨가된 실험군에서의 시스테인 전환율이 2.3배 가량 증가하였다. 즉, 시스테인 전환 시 PLP와 DTT가 반응에 긍정적으로 작용함을 확인하였다.
Msm-T 시스테인 전환율 (%)
(-) PLP, (-) DTT 23.62
(+) PLP, (-) DTT 33.21
(-) PLP, (+) DTT 40.08
(+) PLP, (+) DTT 54.65
실시예 7: OPSS 효소의 온도별 활성도
Ape-OPSS와 Msm-T의 온도별 시스테인 전환율을 확인하였다. 37℃, 60℃별 활성도를 2, 5, 10, 30, 60분 간격으로 측정하였고, 반응은 100 mM HEPES (pH 7. 4), 5 mM OPS, 10 mM Na2S, 0.2 mM PLP, CysM 0.5 ㎍/ml의 조건에서 수행하였으며, 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 1의 결과에서 알 수 있듯이, 버퍼가 있는 37℃ 조건에서 Ape-OPSS가 Msm-T보다 초기 효소 반응속도가 빠를 뿐 아니라 60℃에서는 보다 빠른 활성을 있음을 확인하였다.
실시예 8: OPSS 효소의 열 안전성
Ape-OPSS와 Msm-T의 열 안전성을 확인하였다. 두 효소 각각 OPS 발효액으로 2 mg/ml 희석하여 37℃와 60℃조건에서 10, 30, 60, 120, 240분간 열처리하였다. 그 후, 5 mM OPS, 10 mM Na2S, 0.2 mM PLP, 100 mM HEPES (pH 7. 4) 조건에서 37℃, 30분간 반응하였다. 이때 사용한 효소의 양은 Ape-OPSS 10㎍/ml와 Msm-T 50㎍/ml 사용하여 반응하였고 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 그 결과 Ape-OPSS는 60℃, 4시간 동안 열 처리하였지만 활성을 그대로 가지고 있는 반면, Msm-T은 37℃에서 그대로 활성을 유지했지만, 60℃, 30분 동안 열처리하면서 50%의 활성을 잃어버렸다. 결과는 하기 표 8 와 같다.
Relative activity (%)
Heating time (min) (-) 10
min		 30
min		 60
min		 120
min		 240
min
Ape-OPSS 100 102 107 100 107 101
Msm-T 100 82 50 32 19 8
또한 실제 OPS 발효액에서 반응 농도인 50 ug/ml Msm-T의 경우, 37℃에서 얼마나 활성을 유지하고 있는지 확인하였다. Na2S가 없는 조건에서 50 mM OPS broth, 0.2 mM PLP, 50 ug/ml Msm-T의 샘플을 37℃ 0.5, 1, 2, 4, 6시간 처리 후, Na2S를 넣고 30분간 반응하여 Msm-T의 잔존 활성을 측정하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 그 결과 OPS 발효액 조건에서 Msm-T의 활성이 37℃, 2시간 이후에는 50% 이하의 활성만 가지고 있음을 확인하였다.
Time (-) 30 min 60 min 120 min 240 min 360 min
시스테인 전환율(%) 100 88 73 47 11 3
실시예 9: OPSS 효소의 pH 민감성
Ape-OPSS와 Msm-T의 pH별 시스테인 전환율을 확인하였다. 100 mM 버퍼 조건에서 Ape-OPSS와 Msm-T는 50 ㎍/ml 사용하여 37℃, 10분간 반응하였다. K-phosphate buffer pH 6.4 / 7.0 / 7.4 / 8.0, Tris-HCl buffer pH 7.0 / 7.4 / 8. 0 / 8.5 / 8.8, Na-carbonate buffer 8.0 / 8.5 / 9.0 / 10.0을 사용하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 2의 결과로 볼 때, Msm-T의 경우 버퍼에 상관없이 pH 8.0~9.0 사이에서 가장 높은 활성을 보였다. 또한 Ape-OPSS 의 경우, 가장 높은 활성을 보인 조건은 K-Phosphate (pH7.4)이며 버퍼별로 최적 pH는 다르다.
실시예 10: OPSS 효소의 이온 영향성
각 효소들의 이온들에 대한 영향을 파악하기 위해 실험하였다. 실험 조건은 다음과 같다. 5 mM OPS, 10 mM Na2S, 0.2 mM PLP, 100 mM HEPES (pH 7.4) 반응혼합액에 (NH4)2SO4 [1, 3, 5, 10, 20 g/L], KH2PO4 [0.5, 1, 2, 4, 8 g/L], NH4Cl [0.2, 0.5, 1, 2 g/L] 를 각각 첨가하여 37℃, 30분간 반응하였다. 이때 사용한 효소의 양은 Ape-OPSS 10㎍/ml와 Msm-T 50㎍/ml를 사용하였으며, 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다.
실험 측정결과 (NH4)2SO4 와 KH2PO4를 넣은 혼합액의 시스테인 전환율은 변화가 없었다. 반면 하기 [표 10]의 결과에서 보듯이 NH4Cl를 넣고 반응하였을 경우 NH4Cl 농도에 비례하여 시스테인 전환율이 감소하였다. 특히 2g/L NH4이 첨가된 혼합액의 경우 최대 효소 활성이 최대 70% 감소하였다. 즉, OPS sulfhydrase 효소의 경우, NH4Cl 및 NH4은 시스테인 전환 활성에 부정적인 영향을 끼치는 것을 확인하였다.
Relative activity (%)
NH4Cl Ape-OPSS Msm-T
0 100.00 100.00
0.2 86.26 91.49
0.5 73.35 91.30
1 49.11 67.11
2 27.72 47.12
실시예 11: OPS sulfhydrase 효소의 황 소스 따른 시스테인 합성
각 효소들의 황 소스에 따른 시스테인 합성 영향성을 확인하는 실험을 수행하였다. 각 효소량 ([Ape-OPSS, Msm-T] 50㎍/ml), OPS 5mM, Na2S 혹은 NaSH 혹은 Na2S2O3 10mM, PLP 0.2mM, HEPES 100mM 의 반응 혼합액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. Ape-OPSS는 Na2S2O3를 황 소스로 더 선호하는 것으로 보였으나 Msm-T 효소는 Na2S를 더 선호하는 것으로 보여진다. 결과는 하기 [표 11]와 같다.
Relative activity (%)
효소명 Na2S NaSH Na2S2O3
Ape-OPSS 100.0 95.2 142.3
Msm-T 106.7 98.3 66.2
실시예 12: OPS sulfhydrase 효소 발현 벡터 제작( pCL - Pcj1 시스템) 및 효소 발현
앞서 제작한 pET28a-Msm-T를 주형으로 하여 서열번호 21와 22 프라이머를 이용하여 PCR기법으로 유전자 단편을 증폭한 후, EcoRV와 HindIII 제한효소를 처리하였다. 이후 통상적인 클로닝 방법을 이용하여 pCL-P(CJ1)-Msm-T 벡터를 제작하였다. pET 시스템과 pCL-Pcj1 시스템의 Msm-tc 발현량 차이 여부를 확인하고자 효소 발현을 위한 균주를 제작하였다. pET 시스템은 Rosetta (DE3)에 도입하였고, pCL-Pcj1 시스템은 K12G 균주를 사용하였다. 효소 발현을 위해 평판 LB 배지에서 각각의 균주의 단일 콜로니를 선별하여 5ml LB 액체배지에 접종하여 37℃, 200rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 25ml LB + Kanamycine 또는 spectinomycine + 0.2% glucose 액체배지(250ml 용량의 플라스크)에 250ml 재 접종하여 OD600 이 0.5~0.6 되도록 배양하였다. 이후 0.1 mM IPTG로 발현을 유도하였으며, 37℃, 200rpm, 배양 시간 별로(8, 16, 24시간) 발현량을 확인하였다. 두 system간의 효소 발현량은 14% SDS PAGE 상에서 확인하였다. 도 3은 동일 배양 조건에서 pET 시스템 대비 pCL-Pcj1 시스템을 이용한 효소 발현량이 증가함을 확인하였다. 또한 고온인 37℃, 저 농도인 0.1mM IPTG 발현유도가 가능하여 배양 조건의 향상이 있었다. 즉, pCL-Pcj1 시스템으로 pET 시스템을 이용한 효소 발현을 충분히 대체할 수 있음을 확인하였다.
실시예 13: OPS 발효 정제액을 기질로 OPS sulfhydrase 효소를 이용한 시스테인 전환 반응
정제된 OPS에서의 Msm-T과 Ape-OPSS의 시스테인 전환율을 확인하였다. OPS 발효액으로부터 정제한 60 mM 정제 OPS, 120 mM Na2S, 0.2 mM PLP 가 있는 조건에서 효소농도는 75 ㎍/ml로 37℃ 30, 60, 90, 120분간 반응하였다. 이때 Msm-T은 37℃에서만, Ape-OPSS의 경우 37℃와 70℃에서 반응을 진행하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 4의 결과로부터 OPS 발효 정제액을 이용한 시스테인 전환반응 가능성을 확인하였으며, 특히 정제 OPS, 70℃ 조건에서 Ape의 시스테인 전환율이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 14: OPS 발효액을 기질로 OPS sulfhydrase 효소를 이용한 시스테인 전환 반응
OPS 발효액을 기질로 Msm-T와 Ape-OPSS의 농도별 시스테인 전환율을 확인하였다. 50 mM OPS 발효액, 100 mM Na2S, 0.2 mM PLP조건에서 Msm-T와 Ape-OPSS 농도를 5 ㎍/ml 또는 50 ㎍/ml 조건으로 37℃에서 시스테인 전환 반응을 수행하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 5에서 보는 바와 같이 상기 전환 반응 조건에서, 50 ㎍/ml Msm-T를 사용하였을 때 가장 높은 전환율을 보였다. 또한 OPS 발효액을 기질로 하였을 때 Msm-T의 활성이 Ape-OPSS보다 높음을 확인하였다.
실시예 15: OPS sulfhydrase 효소 농도별 시스테인 전환 반응
OPS 9.76g/l 가 함유된 OPS 발효액에 Na2S를 OPS mole 수의 2배를 첨가하여 37℃에서 5분간 배양시킨 후, 정제된 Msm-T 50mg 및 정제된 Msm-T-HA2 효소를 각각 5ug, 10ug, 20ug, 50ug을 첨가하여 37℃ 반응시킨 후 시간별로 효소 반응액 100ml 취하여 33.2% TCA 100ml 와 혼합하여 반응을 중지시켰다. 효소 반응액 내의 시스테인의 농도는 Gaitonde 방법으로 OD560 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 하기 표에서는 각 효소의 농도에 따른 반응 시간별 시스테인 전환율을 비교하였다.
시스테인 전환률(%)
Time 0 min 10 min 20 min 30 min 60 min
Msm-T 50ug 0.00 20.69 48.45 62.68 59.82
Msm-T-HA2 5ug 0.00 0.00 4.77 10.66 27.23
Msm-T-HA2 10ug 0.00 10.46 24.78 37.43 57.32
Msm-T-HA2 20ug 0.00 14.90 31.31 48.09 59.94
Msm-T-HA2 50ug 2.33 44.02 56.72 62.17 63.52
상기 [표 12]의 결과에서 알 수 있듯이 효소 활성이 개량된 Msm-T-HA2의 효소량을 Msm-T의 효소량 보다 40% 가량 적게 사용하여도 시스테인 몰 전환률(%)은 유사한 수준을 보였다. 또한 같은 양의 효소를 사용하였을 시 초기 반응 속도가 더 빠름을 알 수 있다.
실시예 16: OPS 농도별 시스테인 전환 반응
Msm-T 와 Msm-T-HA2의 OPS 농도에 따른 전환률을 측정하기 위해 각각 OPS 발효액에 일정량의 정제된 OPS를 첨가하여 전환 반응을 수행하였다. 효소량은 Msm-T의 경우 50ug, Msm-T-HA2의 경우 20ug을 사용하였고 효소 반응액 내의 시스테인 농도는 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 그 결과 OPS의 농도가 약 30g/l 일 때 전환률이 Msm-T는 100%, Msm-T-HA2는 80%로 가장 높게 나타났다. 또한 OPS의 농도가 50g/l 이상이 되면 효소 전환 속도 및 전환율이 감소하는 양상을 확인하였다.
시스테인 전환률 (OPS 측정량 10.65g/l)
Time 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min
Msm-T 50ug 0 23.03 65.38 65.70 61.95 55.35
Msm-T-HA2 20ug 0 13.70 43.82 61.32 63.77 53.74
시스테인 전환률 (OPS 측정량 36.09g/l)
Time 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min
Msm-T 50ug 0 1.15 10.23 28.07 97.84 100.34
Msm-T-HA2 20ug 0 2.33 12.04 27.57 77.65 80.01
시스테인 전환률 (OPS 측정량 55.6g/l)
Time 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min
Msm-T 50ug 0 0 2.36 7.41 42.69 66.67
Msm-T-HA2 20ug 0 0.32 4.76 12.15 50.16 62.46
상기 표의 결과로부터 이후 고농도의 OPS을 이용한 전환반응 공정 시 Msm-T-HA2의 최적 효소량 비를 선별하고 Msm-T 대비 반응 시간을 단축하고자 한다.
실시예 17: Na 2 S 농도별 시스테인 전환 반응
OPS 전환반응의 황 소스로 사용되는 Na2S의 첨가량에 따른 시스테인 전환률을 알아 보기 위해 각각 OPS mole 수의 1배, 2배, 3배의 양인 160mM, 320mM, 480mM의 Na2S를 첨가하여 전환 반응을 수행하였다. 하기 표에서 알 수 있듯이, 약 OPS mole 수의 약 2배 가량 Na2S를 넣어준 조건에서 시스테인 전환률이 가장 높았다. 위의 결과를 통해 OPS을 기질로 하는 시스테인 전환 반응 공정 시 OPS mole수의 2배의 Na2S mole수를 첨가하는 것이 최적의 농도임을 확인하였다. 하기 전환 반응에서 사용한 효소는 20 ug Msm-T-HA2으로 하였다.
시스테인 전환률 (OPS 29.76g/l)
Time 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min
160mM Na2S 0 0 0 0 0 0
320mM Na2S 0 13.43 34.58 78.78 67.76 74.95
480mM Na2S 0 14.90 25.99 54.42 51.24 58.25
실시예 18: pH 에 따른 시스테인 전환 반응
OPS을 기질로 한 시스테인 전환에 영향을 주는 요소들 중 pH에 따른 효과를 검증하기 위해 pH별로 전환 반응을 수행하였다. 그 결과 전환반응의 최적 pH 범위는 8.5~9.5인 것으로 나타났다. 결과는 하기 표와 같으며, 사용한 효소는 하기 전환 반응에서 사용한 효소는 20 ug Msm-T-HA2으로 하였다.
시스테인 전환률 (%)
Time 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min
pH 8.5 (OPS 35.02g/l) 0.24 4.74 20.74 40.19 69.13
pH 9 (OPS 34.59g/l) 0.19 6.00 24.03 43.86 63.88
pH 9.5 (OPS 35.34g/l) 0.26 9.85 28.48 44.82 64.68
pH 10 (OPS 34.59g/l) 0.25 10.97 28.54 40.19 58.14
실시예 19: 1L jar scale 에서의 시스테인 전환 반응 공정
OPS 발효액을 기질로 하여 1L jar scale에서 시스테인 전환 반응을 수행하였다. 상기의 small scale인 1ml tube 조건에서의 각각의 OPS sulfhydrase의 특성 및 전환 반응 데이터를 바탕으로 최종 Msm-T-HA2을 선정하여 전환 반응 공정을 수립하였다. 전환 반응 공정 시 첨가되는 기질 및 효소의 농도는 하기 표와 같다. 기질의 첨가 단위는 ml 이다.
OPS 발효액 Na2S 투입 후 - pH 9.01, Filtration 후 pH 9.16
Final volume
Final OPS concentration 101.47mM
Msm-T-HA2 (2.59 ㎍/㎕) 50 ug 19
Na2S (72g) 300 mM 0
10 mM PLP 0.1 mM 10
OPS Broth (19.317g/l) 104.42 mM 1000
D. W 0
Total 1029
상기 표와 같은 조건에 수행한 전환 반응 공정은 하기 방법과 같으며, 전환 반응액의 시스테인 농도는 Gaitonde 방법 및 LC 분석으로 정량하였다. 또한 시스테인이 산화되어 생성된 시스틴은 LC분석으로 정량하였다. 1L jar scale에서의 전환 반응에 앞서, 1L jar scale 발효를 통해 획득한 OPS 발효액의 원심분리(10000rpm, 10min, 4℃)를 수행하여 상등액을 취하여 막투과(0.45㎛)하여 세포를 제거하였다. 상기로부터 얻은 OPS 발효액 (19. 317g/L)에 72g Na2S을 투입하고 이로부터 생기는 침전물은 whatman filter paper (6㎛)을 이용하여 제거하였다. 이후 10mM PLP을 투입하고, 37℃, 200rpm, 5분간 pre-incubation 하고 최종적으로 50 mg Msm-T-HA2을 첨가하여 1L jar scale에서 전환 반응을 수행하였다. 효소 전환 반응액으로부터 0, 10, 30, 60, 120, 180분에 각각 시간별로 반응액을 100ul씩 취하여 33 2% TCA 100ul 와 섞어서 반응을 중지시켰다. 상기의 샘플은 0.1N HCl에 희석하여 LC 분석을 통해 시스테인과 시스틴을 분석하였다. 또한 Gaitonde 방법을 통해서 시스테인을 정량하였다. 도 6의 결과에서 보는 바와 같이 19.317g/L OPS 발효액을 이용하여 50 mg Msm-T-HA2으로 2시간 효소 반응하였을 때, 최대로 시스테인 혹은 시스틴이 9.075g/L 생성되는 것을 확인하였다. 이는 1L jar scale 반응 조에서 효소 전환 공정을 통해 OPS 기질로 하여 71.83% 시스테인과 시스틴을 생성할 수 있음을 보여준다.
시스테인/시스틴 전환률 (%)
Time 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min
OPS broth 10.81 28.08 51.26 67.21 71.83 69.45
시스테인/시스틴 (g/L)
Time 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min
OPS broth 1.366 3.548 6.476 8.492 9.075 8.775
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> O-phosphoserine sulfhydrylase variants <130> PA100564KR <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Msm-OPSS from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 1 Met Thr Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gln Ala Leu Gly Asn Thr Pro Leu 1 5 10 15 Val Gly Leu Gln Asn Leu Ser Pro Arg Trp Asp Asp Glu Asp Gly Lys 20 25 30 Pro His Val Arg Leu Trp Ala Lys Leu Glu Asp Arg Asn Pro Thr Gly 35 40 45 Ser Ile Lys Asp Arg Pro Ala Leu Arg Met Ile Glu Gln Ala Glu Arg 50 55 60 Asp Gly Leu Leu Gln Pro Gly Ala Thr Ile Leu Glu Pro Thr Ser Gly 65 70 75 80 Asn Thr Gly Ile Ser Leu Ala Met Ala Ala Leu Leu Lys Gly Tyr Asn 85 90 95 Met Ile Cys Val Met Pro Glu Asn Thr Ser Ile Glu Arg Arg Gln Ile 100 105 110 Leu Glu Leu Tyr Gly Ala Arg Ile Ile Phe Ser Pro Ala Glu Gly Gly 115 120 125 Ser Asn Thr Ala Val Ala Thr Ala Lys Glu Leu Ala Ala Gln Asn Pro 130 135 140 Ser Trp Val Met Leu Tyr Gln Tyr Gly Asn Pro Ala Asn Ser Asp Ala 145 150 155 160 His Tyr Phe Gly Thr Gly Pro Glu Leu Leu Ala Asp Leu Pro Glu Ile 165 170 175 Thr His Phe Val Ala Gly Leu Gly Thr Thr Gly Thr Leu Met Gly Thr 180 185 190 Gly Arg Phe Leu Arg Glu His Val Pro Gly Val Gln Ile Val Ala Ala 195 200 205 Glu Pro Arg Tyr Gly Glu Gly Val Tyr Ala Leu Arg Asn Ile Asp Glu 210 215 220 Gly Phe Ile Pro Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Val Leu Thr Thr Arg Phe 225 230 235 240 Ser Val Gly Ser Phe Asp Ala Val Arg Arg Thr Arg Glu Leu Val Thr 245 250 255 Arg Glu Gly Ile Phe Ala Gly Ile Ser Thr Gly Ala Val Leu His Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Met Ala Ala Lys Ala Val Lys Ala Gly Glu Arg Ala Asp 275 280 285 Ile Ala Phe Val Val Ala Asp Ala Gly Trp Lys Tyr Leu Ser Thr Gly 290 295 300 Ala Tyr Ala Gly Ser Leu Asp Asp Ala Glu Asp Ala Leu Glu Gly Gln 305 310 315 320 Leu Trp Ala <210> 2 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Msm-T from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 2 Met Thr Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gln Ala Leu Gly Asn Thr Pro Leu 1 5 10 15 Val Gly Leu Gln Asn Leu Ser Pro Arg Trp Asp Asp Glu Asp Gly Lys 20 25 30 Pro His Val Arg Leu Trp Ala Lys Leu Glu Asp Arg Asn Pro Thr Gly 35 40 45 Ser Ile Lys Asp Arg Pro Ala Leu Arg Met Ile Glu Gln Ala Glu Arg 50 55 60 Asp Gly Leu Leu Gln Pro Gly Ala Thr Ile Leu Glu Pro Thr Ser Gly 65 70 75 80 Asn Thr Gly Ile Ser Leu Ala Met Ala Ala Leu Leu Lys Gly Tyr Asn 85 90 95 Met Ile Cys Val Met Pro Glu Asn Thr Ser Ile Glu Arg Arg Gln Ile 100 105 110 Leu Glu Leu Tyr Gly Ala Arg Ile Ile Phe Ser Pro Ala Glu Gly Gly 115 120 125 Ser Asn Thr Ala Val Ala Thr Ala Lys Glu Leu Ala Ala Gln Asn Pro 130 135 140 Ser Trp Val Met Leu Tyr Gln Tyr Gly Asn Pro Ala Asn Ser Asp Ala 145 150 155 160 His Tyr Phe Gly Thr Gly Pro Glu Leu Leu Ala Asp Leu Pro Glu Ile 165 170 175 Thr His Phe Val Ala Gly Leu Gly Thr Thr Gly Thr Leu Met Gly Thr 180 185 190 Gly Arg Phe Leu Arg Glu His Val Pro Gly Val Gln Ile Val Ala Ala 195 200 205 Glu Pro Arg Tyr Gly Glu Gly Val Tyr Ala Leu Arg Asn Ile Asp Glu 210 215 220 Gly Phe Ile Pro Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Val Leu Thr Thr Arg Phe 225 230 235 240 Ser Val Gly Ser Phe Asp Ala Val Arg Arg Thr Arg Glu Leu Val Thr 245 250 255 Arg Glu Gly Ile Phe Ala Gly Ile Ser Thr Gly Ala Val Leu His Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Met Ala Ala Lys Ala Val Lys Ala Gly Glu Arg Ala Asp 275 280 285 Ile Ala Phe Val Val Ala Asp Ala Gly Trp Lys Tyr Leu Ser Thr Gly 290 295 300 Ala Tyr Ala Gly Ser Leu Asp Asp Ala Glu Asp Ala Leu Glu 305 310 315 <210> 3 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Msm-T-HA2 from Mycobacterium smegmatics CC1 <400> 3 Met Thr Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gln Ala Leu Gly Asn Thr Pro Leu 1 5 10 15 Val Gly Leu Gln Asn Leu Ser Pro Arg Trp Asp Asp Glu Asp Gly Lys 20 25 30 Pro His Val Arg Leu Trp Ala Lys Leu Glu Asp Arg Asn Pro Thr Gly 35 40 45 Ser Ile Lys Asp Arg Pro Ala Leu Arg Met Ile Glu Gln Ala Glu Arg 50 55 60 Asp Gly Leu Leu Gln Pro Gly Ala Thr Ile Leu Glu Ser Thr Ser Gly 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285 Ile Ala Phe Val Val Ala Asp Ala Gly Trp Lys Tyr Leu Ser Thr Gly 290 295 300 Ala Tyr Ala Gly Ser Leu Asp Asp Ala Glu Asp Ala Leu Glu 305 310 315 <210> 4 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Msm-T-EP3 from Mycobacterium smegmatics CC2 <400> 4 Met Thr Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gln Ala Leu Gly Asn Thr Pro Leu 1 5 10 15 Val Gly Leu Gln Asn Leu Ser Pro Arg Trp Asp Asp Glu Asp Gly Lys 20 25 30 Pro His Val Arg Leu Trp Ala Lys Leu Glu Asp Arg Asn Pro Thr Gly 35 40 45 Ser Ile Lys Asp Arg Pro Ala Leu Arg Met Ile Glu Gln Ala Glu Arg 50 55 60 Asp Gly Leu Leu Gln Pro Gly Ala Thr Ile Leu Glu Pro Thr Ser Gly 65 70 75 80 Asn Thr Gly Ile Ser Leu Ala Met Ala Ala Leu Leu Lys Gly Tyr Asn 85 90 95 Met Ile Cys Val Met Pro Glu Asn Thr Ser Ile Glu Arg Arg Gln Ile 100 105 110 Leu Glu Leu Tyr Gly Ala Arg Ile Ile Phe Ser Pro Ala Glu Gly Gly 115 120 125 Ser Asn Ala Ala Val Ala Thr Ala Asp Glu Leu Ala Ala Gln Asn Pro 130 135 140 Ser Trp Val Met Leu Tyr Gln Tyr Gly Asn Pro Ala Asn Ser Asp Ala 145 150 155 160 His Tyr Phe Gly Thr Gly Pro Glu Leu Leu Ala Asp Leu Pro Glu Ile 165 170 175 Thr His Phe Val Ala Gly Leu Gly Thr Thr Gly Thr Leu Met Gly Thr 180 185 190 Gly Arg Phe Leu Arg Glu His Val Pro Gly Val Gln Ile Val Ala Ala 195 200 205 Glu Pro Arg Tyr Gly Glu Gly Val Tyr Ala Leu Arg Asn Ile Asp Glu 210 215 220 Gly Phe Ile Pro Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Val Leu Thr Ser Arg Phe 225 230 235 240 Ser Val Gly Ser Phe Asp Ala Val Arg Arg Thr Arg Glu Leu Val Thr 245 250 255 Arg Glu Gly Ile Phe Ala Gly Ile Ser Thr Gly Ala Val Leu His Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Met Ala Ala Lys Ala Val Lys Ala Gly Glu Arg Ala Asp 275 280 285 Ile Ala Phe Val Val Ala Asp Ala Gly Trp Lys Tyr Leu Ser Thr Gly 290 295 300 Ala Tyr Ala Gly Ser Leu Asp Asp Ala Glu Asp Ala Leu Glu 305 310 315 <210> 5 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mtb-T from Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 5 Met Thr Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gln Ala Leu Gly Asn Thr Pro Leu 1 5 10 15 Val Gly Leu Gln Arg Leu Ser Pro Arg Trp Asp Asp Gly Arg Asp Gly 20 25 30 Pro His Val Arg Leu Trp Ala Lys Leu Glu Asp Arg Asn Pro Thr Gly 35 40 45 Ser Ile Lys Asp Arg Pro Ala Val Arg Met Ile Glu Gln Ala Glu Ala 50 55 60 Asp Gly Leu Leu Arg Pro Gly Ala Thr Ile Leu Glu Pro Thr Ser Gly 65 70 75 80 Asn Thr Gly Ile Ser Leu Ala Met Ala Ala Arg Leu Lys Gly Tyr Arg 85 90 95 Leu Ile Cys Val Met Pro Glu Asn Thr Ser Val Glu Arg Arg Gln Leu 100 105 110 Leu Glu Leu Tyr Gly Ala Gln Ile Ile Phe Ser Ala Ala Glu Gly Gly 115 120 125 Ser Asn Thr Ala Val Ala Thr Ala Lys Glu Leu Ala Ala Thr Asn Pro 130 135 140 Ser Trp Val Met Leu Tyr Gln Tyr Gly Asn Pro Ala Asn Thr Asp Ser 145 150 155 160 His Tyr Cys Gly Thr Gly Pro Glu Leu Leu Ala Asp Leu Pro Glu Ile 165 170 175 Thr His Phe Val Ala Gly Leu Gly Thr Thr Gly Thr Leu Met Gly Thr 180 185 190 Gly Arg Phe Leu Arg Glu His Val Ala Asn Val Lys Ile Val Ala Ala 195 200 205 Glu Pro Arg Tyr Gly Glu Gly Val Tyr Ala Leu Arg Asn Met Asp Glu 210 215 220 Gly Phe Val Pro Glu Leu Tyr Asp Pro Glu Ile Leu Thr Ala 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Pro Asn Gly Val Arg Val 100 105 110 Trp Leu Lys Leu Glu Trp Tyr Asn Pro Phe Ser Leu Ser Val Lys Asp 115 120 125 Arg Pro Ala Val Glu Ile Ile Ser Arg Leu Ser Arg Arg Val Glu Lys 130 135 140 Gly Ser Leu Val Ala Asp Ala Thr Ser Ser Asn Phe Gly Val Ala Leu 145 150 155 160 Ser Ala Val Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Arg Ala Arg Val Tyr Leu Pro 165 170 175 Gly Ala Ala Glu Glu Phe Gly Lys Leu Leu Pro Arg Leu Leu Gly Ala 180 185 190 Gln Val Ile Val Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val His Leu Leu Pro 195 200 205 Arg Val Met Lys Asp Ser Lys Asn Glu Gly Phe Val His Val Asn Gln 210 215 220 Phe Tyr Asn Asp Ala Asn Phe Glu Ala His Met Arg Gly Thr Ala Arg 225 230 235 240 Glu Ile Phe Val Gln Ser Arg Arg Gly Gly Leu Ala Leu Arg Gly Val 245 250 255 Ala Gly Ser Leu Gly Thr Ser Gly His Met Ser Ala Ala Ala Phe Tyr 260 265 270 Leu Gln Ser Val Asp Pro Ser Ile Arg Ala Val Leu Val Gln Pro Ala 275 280 285 Gln Gly Asp Ser Ile Pro Gly Ile Arg Arg Val Glu Thr Gly Met Leu 290 295 300 Trp Ile Asn Met Leu Asp Ile Ser Tyr Thr Leu Ala Glu Val Thr Leu 305 310 315 320 Glu Glu Ala Met Glu Ala Val Val Glu Val Ala Arg Ser Asp Gly Leu 325 330 335 Val Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ala Ala Val Lys Ala Leu Ala Lys Lys 340 345 350 Ala Ala Glu Gly Asp Leu Glu Pro Gly Asp Tyr Val Val Val Val Pro 355 360 365 Asp Thr Gly Phe Lys Tyr Leu Ser Leu Val Gln Asn Ala Leu Glu Gly 370 375 380 Ala Gly Asp Ser Val 385 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Ape-OPSS from Aeropyrum pernix (Synthetic DNA) <400> 7 gtcatatgat ggctctggct gacatctct 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Ape-OPSS from Aeropyrum pernix (Synthetic DNA) <400> 8 gtaagctttt aaacagagtc accagcacc 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Mtb-OPSS Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 9 gtcatatgat gacacgatac gactcgctg 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Mtb-OPSS from Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 10 gtaagctttc atgcccatag ttgcccttc 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Msm-OPSS from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 11 ataagctttc atgcccatag ctgcccttc 29 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Msm-OPSS from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 12 ataagctttc attccagcgc gtcctcggc 29 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Rjo-OPSS from Synthetic DNA <400> 13 gtcatatgat ggcgcggttc gattcgctg 29 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Rjo-OPSS from Synthetic DNA <400> 14 tagcggccgc tcatgcccac aactgccctt c 31 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Nfa-OPSS from Synthetic DNA <400> 15 gtcatatgat ggcacgctac gaatcgctg 29 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Nfa-OPSS from Synthetic DNA <400> 16 gtaagctttc aggcccagag ctggcctt 28 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Mtb-T from Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 17 gtcatatgat gacacgatac gactcgctg 29 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Mtb-T from Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 18 gtaagctttc attccagagc ggtctcggc 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Msm-T, Msm-HA2, Msm-EP3 from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 19 gtcatatgat gacgcgctac gactccctg 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Msm-T, Msm-HA2, Msm-EP3 from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 20 ataagctttc attccagcgc gtcctcggc 29 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of pCL-P(CJ1)-Msm-T from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 21 gatatcgcag cagccatcat c 21 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of pCL-P(CJ1)-Msm-T from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 22 cccaagcttt cattccagcg cgtcctcg 28 <210> 23 <211> 972 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Msm-OPSS from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 23 atgacgcgct acgactccct gctgcaggcc ctgggcaaca ccccgctggt gggcctgcag 60 aacctgtcgc cccggtggga cgacgaggac gggaaacccc acgtgcggct gtgggccaag 120 ctcgaggacc gcaacccgac cggttccatc aaggaccgcc ccgcgctgcg gatgatcgaa 180 caggccgagc gcgacgggct gctgcagccc ggcgccacga tcctggaacc caccagcggc 240 aacaccggca tctcgctggc catggcggcc ctgctcaagg gctacaacat gatctgcgtg 300 atgccggaga acacgtcgat cgaacggcgc cagatcctcg agctctacgg cgcgcgcatc 360 atcttcagcc ccgccgaggg cggctccaac accgcggtcg cgaccgcgaa agagcttgcc 420 gcgcagaacc cgtcgtgggt catgctgtat cagtacggca acccggccaa cagcgatgcg 480 cactacttcg gcaccggccc cgaactgctc gcggacctgc ccgagatcac ccacttcgtc 540 gcggggctcg gcaccaccgg gaccctgatg ggcaccggac gtttcctgcg cgagcacgtt 600 cccggcgtgc agatcgtggc ggccgaaccg cgttacggcg agggcgtgta cgcactgcgc 660 aacatcgacg agggcttcat ccccgagttg tacgacgccg acgtgctcac cacccggttc 720 tcggtgggct cgttcgacgc cgtgcgccgc acccgtgaac tcgtcacgcg cgagggcata 780 ttcgcgggca tctcgaccgg cgcggtgttg cacgccgcgc tggggatggc cgccaaggcc 840 gtcaaggccg gtgagcgtgc cgacatcgcg ttcgtcgtcg ccgacgccgg atggaagtat 900 ctgtcgaccg gcgcgtacgc cggtagcctg gatgacgccg aggacgcgct ggaagggcag 960 ctatgggcat ga 972 <210> 24 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Msm-T from Mycobacterium smegmatics str. MC2 155 <400> 24 atgacgcgct acgactccct gctgcaggcc ctgggcaaca ccccgctggt gggcctgcag 60 aacctgtcgc cccggtggga cgacgaggac gggaaacccc acgtgcggct gtgggccaag 120 ctcgaggacc gcaacccgac cggttccatc aaggaccgcc ccgcgctgcg gatgatcgaa 180 caggccgagc gcgacgggct gctgcagccc ggcgccacga tcctggaacc caccagcggc 240 aacaccggca tctcgctggc catggcggcc ctgctcaagg gctacaacat gatctgcgtg 300 atgccggaga acacgtcgat cgaacggcgc cagatcctcg agctctacgg cgcgcgcatc 360 atcttcagcc ccgccgaggg cggctccaac accgcggtcg cgaccgcgaa agagcttgcc 420 gcgcagaacc cgtcgtgggt catgctgtat cagtacggca acccggccaa cagcgatgcg 480 cactacttcg gcaccggccc cgaactgctc gcggacctgc ccgagatcac ccacttcgtc 540 gcggggctcg gcaccaccgg gaccctgatg ggcaccggac gtttcctgcg cgagcacgtt 600 cccggcgtgc agatcgtggc ggccgaaccg cgttacggcg agggcgtgta cgcactgcgc 660 aacatcgacg agggcttcat ccccgagttg tacgacgccg acgtgctcac cacccggttc 720 tcggtgggct cgttcgacgc cgtgcgccgc acccgtgaac tcgtcacgcg cgagggcata 780 ttcgcgggca tctcgaccgg cgcggtgttg cacgccgcgc tggggatggc cgccaaggcc 840 gtcaaggccg gtgagcgtgc cgacatcgcg ttcgtcgtcg ccgacgccgg atggaagtat 900 ctgtcgaccg gcgcgtacgc cggtagcctg gatgacgccg aggacgcgct ggaa 954 <210> 25 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Msm-T-HA2 from Mycobacterium smegmatics CC1 <400> 25 atgacgcgct acgactccct gctgcaggcc ctgggcaaca ccccgctggt gggcctgcag 60 aacctgtcgc cccggtggga cgacgaggac gggaaacccc acgtgcggct gtgggccaag 120 ctcgaggacc gcaacccgac cggttccatc aaggaccgcc ccgcgctgcg gatgatcgaa 180 caggccgagc gcgacgggct gctgcagccc ggcgccacga tcctggaatc caccagcggc 240 aacaccggca tctcgctggc catggcggcc ctgctcaagg gctacaacat gatctgcgtg 300 atgccggaga acacgtcgat cgaacggcgc cagatcctcg agctctacgg cgcgcgcatc 360 atcttcagcc ccgccgaggg cggctccaac accgcggtcg cgaccgcgaa agagcttgcc 420 gcgcagaacc cgtcgtgggt catgctgtat cagtacggca acccggccaa cagcgatgcg 480 cactacttcg gcaccggccc cgaactgctc gcggacctgc ccgagatcac ccacttcgtc 540 gcggggctcg gcaccaccgg gaccctgatg ggcaccggac gtttcctgcg cgagcacgtt 600 cccggcgtgc agatcgtggc ggccgaaccg cgttacggcg agggcgtgta cgcactgcgc 660 aacatcgacg agggcttcat ccccgagttg tacgacgccg acgtgctcac cacccggttc 720 tcggtgggct cgttcgacgc cgtgcgccgc acccgtgaac tcgtcacgcg cgagggcata 780 ttcgcgggca tctcgaccgg cgcggtgttg cacgccgcgc tggggatggc cgccaaggcc 840 gtcaaggccg gtgagcgtgc cgacatcgcg ttcgtcgtcg ccgacgccgg atggaagtat 900 ctgtcgaccg gcgcgtacgc cggtagcctg gatgacgccg aggacgcgct ggaa 954 <210> 26 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Msm-T-EP3 from Mycobacterium smegmatics CC2 <400> 26 atgacgcgct acgactccct gctgcaggcc ctgggcaaca ccccgctggt gggcctgcag 60 aacctgtcgc cccggtggga cgacgaggac gggaaacccc acgtgcggct gtgggccaag 120 ctcgaggacc gcaacccgac cggttccatc aaggaccgcc ccgcgctgcg gatgatcgaa 180 caggccgagc gcgacgggct gctgcagccc ggcgccacga tcctggaacc caccagcggc 240 aacaccggca tctcgctggc catggcggcc ctgctcaagg gctacaacat gatctgcgtg 300 atgccggaga acacgtcgat cgaacggcgc cagatcctcg agctctacgg cgcgcgcatc 360 atcttcagcc ccgccgaggg cggctccaac gccgcggtcg cgaccgcgaa tgagcttgcc 420 gcgcagaacc cgtcgtgggt catgctgtat cagtacggca acccggccaa cagcgatgcg 480 cactacttcg gcaccggccc cgaactgctc gcggacctgc ccgagatcac ccacttcgtc 540 gcggggctcg gcaccaccgg gaccctgatg ggcaccggac gtttcctgcg cgagcacgtt 600 cccggcgtgc agatcgtggc ggccgaaccg cgttacggcg agggcgtgta cgcactgcgc 660 aacatcgacg agggcttcat ccccgagttg tacgacgccg acgtgctcac ctcccggttc 720 tcggtgggct cgttcgacgc cgtgcgccgc acccgtgaac tcgtcacgcg cgagggcata 780 ttcgcgggca tctcgaccgg cgcggtgttg cacgccgcgc tggggatggc cgccaaggcc 840 gtcaaggccg gtgagcgtgc cgacatcgcg ttcgtcgtcg ccgacgccgg atggaagtat 900 ctgtcgaccg gcgcgtacgc cggtagcctg gatgacgccg aggacgcgct ggaa 954

Claims (15)

  1. 마이코박테리움 스메그마틱스(Mycobacterium smegmatics) 유래의 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는, O-포스포세린 설피드릴라제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)의 C-말단으로부터 3 내지 7개의 아미노산 잔기가 결실된, OPSS 변이체.
  2. 제1항에 있어서, C-말단으로부터 5개의 아미노산 잔기가 결실된, OPSS 변이체.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 갖는, OPSS 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이체의 N-말단으로부터 77번째 프롤린(Pro)이 세린(Ser)으로 치환된, OPSS 변이체.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 갖는, OPSS 변이체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 변이체의 N-말단으로부터 131번째 쓰레오닌(Thr)이 알라닌(Ala)으로, 137번째 라이신(Lys)이 아스파라진(Asp)으로, 238번째 쓰레오닌(Thr)이 세린(Ser)으로 치환된, OPSS 변이체.
  7. 제6항에 있어서, 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열을 갖는, OPSS 변이체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 OPSS 변이체가 최적활성을 갖는 조건은
    i) 보조인자(cofactor)로서 0 내지 2 mM의 PLP (pyridoxal-5'-phosphate) 또는 0 내지 100 mM의 DTT (dithiothreitol)를 첨가;
    ii) 온도는 25 내지 60oC; 및
    iii) pH는 6.0 내지 10.0 인 OPSS 변이체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 OPSS 변이체를 코딩하는 핵산분자.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 OPSS 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터.
  11. 제10항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
  12. O-포스포-L-세린(O-phospho-L-serine, OPS); 황화물; 또는 이의 혼합물에 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 OPSS 변이체를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 OPS는 정제된 OPS 또는 OPS가 포함되는 미생물 발효액인, 시스테인 제조방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 황화물은 액체 또는 기체 상태인 Na2S, H2S 및 S2O3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 시스테인 제조방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 황화물은 OPS 몰농도의 0.1 내지 3배인, 시스테인 제조방법.
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