CN102741400B - O-磷酸丝氨酸巯解酶突变体以及利用其生产半胱氨酸的方法 - Google Patents

O-磷酸丝氨酸巯解酶突变体以及利用其生产半胱氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有源自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的对应于SEQ ID NO：1氨基酸序列的O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)突变体，其缺失三至七个C-末端氨基酸残基。此外，本发明还公开了编码OPSS突变体的核酸分子、含有该核酸分子的表达载体，以及用该表达载体转化得到的转化体。此外，本发明提供一种生产半胱氨酸的方法，其中在OPSS突变体存在下，使O-磷酰-L-丝氨酸(OPS)与硫化物发生反应。OPSS突变体具有改善的酶活性，可通过简单的酶转化反应进行L-半胱氨酸的环保生产。

Description

O-磷酸丝氨酸巯解酶突变体以及利用其生产半胱氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种具有源自耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis）的对应于SEQ ID NO：1氨基酸序列的O-磷酸丝氨酸巯解酶（又称“OPSS”）突变体，其缺失三至七个C-末端氨基酸残基。本发明还涉及编码该OPSS突变体的核酸分子、含有该核酸分子的表达载体以及利用该表达载体转化得到的转化体。此外，本发明涉及一种在OPSS突变体存在下，通过O-磷酰-L-丝氨酸（OPS）与硫化物发生反应生产半胱氨酸的方法。
背景技术
半胱氨酸是一种在所有生物体中的硫代谢过程中起重要作用的氨基酸。它用于蛋白，如发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代谢产物的生物合成，以及作为辅酶A的前体。此外，已知半胱氨酸的生物合成与其它氨基酸，包括L-丝氨酸、L-甘氨酸和L-蛋氨酸的生物合成密切相关。工业上，L-半胱氨酸及其衍生物被应用于多种领域包括制药业（用于治疗支气管疾病）、化妆品行业（洗发水、烫发用组合物等），以及食品行业（抗氧化剂、调味剂、面团助剂（doughaids）等）。
传统上，L-半胱氨酸在工业上是通过酸水解人类头发或动物羽毛而获得（Ko Aida编，氨基酸生产的生物技术（Biotechnology of theAmino Acids Production）,p 217-223，1986）。然而，不仅由头发或羽毛生产的半胱氨酸确实产量低至7-8%，而且使用盐酸或硫酸产生了大量的环境污染物。此外，消费者可能对从头发或羽毛提取具有强烈的反感。这些问题对于开发环保的L-半胱氨酸生产方法形成推动，导致了利用微生物发酵生产L-半胱氨酸。
微生物生产L-半胱氨酸中的代表是利用微生物进行生物转化D,L-ATC（Ryu OH,Ju JY，和Shin CS,生物化学方法（ProcessBiochem.）,32:201-209,1997）。然而，由于D，L-ATC前体的低溶解度，该转换方法难以适用于工业。另一种L-半胱氨酸的生产方法是用大肠杆菌直接发酵（专利号EP 0885962B；Wada M和Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006）。微生物中L-半胱氨酸的过度积累产生胞内毒性，导致高浓度L-半胱氨酸的生产受限。为了克服这一缺陷，使用了L-半胱氨酸转运蛋白，然而产量没有出现显著改善。
关于L-半胱氨酸在细菌和植物中的生物合成途径，O-乙酰丝氨酸（OAS）作为中间体前体提供L-半胱氨酸的碳骨架（Kredich NM和Tomkins GM,J.Biol.Chem.,241:4955-4965,1966）。酶O-乙酰丝氨酸巯解酶（OASS），用硫化氢作为硫供体，催化O-乙酰丝氨酸向硫胱氨酸的转化，最后生成半胱氨酸，释放乙酸。或者，SO4可被还原成硫代硫酸盐用作半胱氨酸生产中的硫供体（Nakamura T,Kon Y，IwahashiH,和Eguchi Y，J.Bacteriol.,156:656-662,1983）。经由OAS的半胱氨酸生物合成途径使用两种酶，催化丝氨酸向OAS转化的丝氨酸乙酰转移酶（CysE），催化OAS向半胱氨酸转化的半胱氨酸合酶（CysK）。值得注意的是，其中丝氨酸乙酰转移酶（CysE）对终产物半胱氨酸的反馈抑制高度敏感（Wada M和Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006）。因此，需要对反馈抑制不敏感的改变的酶，但是其很难开发。
发明内容
技术问题
为了克服现有技术中遇到的问题，本发明人对高产L-半胱氨酸进行了深入和彻底的研究，结果发现在超嗜热古菌（Aeropyrum pernix）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）中存在着采用O-磷酰-L-丝氨酸（OPS）特异性途径而非OAS-特异性途径来合成L-半胱氨酸的O-磷酸丝氨酸巯解酶（OPSS）（Mino K和Ishikawa K,FEBS letters,551:133-138,2003;Burns KE,Baumgart S,Dorrestein PC,Zhai H,McLafferty FW，和Begley TP，J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005;Westrop GD,Goodall G，Mottram JC,和Coombs GH,J.Biol.Chem.,281:25062-25075,2006），结核分枝杆菌的OPSS与额外的酶mec+和cysO一起催化OPS向半胱氨酸的转化，当其被去除五个C-末端氨基酸残基时，即使额外的酶不存在时也可利用Na2S作为硫供体使OPS转化成半胱氨酸（Agren D,Schnell R和Schneider G，FEBS letters,583:330-336,2009），从而实现本发明。
技术方案
因此，本发明的目的是提供一种具有源自耻垢分枝杆菌的对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的O-磷酸丝氨酸巯解酶（又称“OPSS”）突变，其缺失三至七个C-末端氨基酸残基。
本发明另一个目的是提供编码该OPSS突变体的核酸分子。
本发明又一个目的是提供含有该核酸分子的表达载体。
本发明还一个目的是提供用该表达载体转化得到的转化体。
本发明又一个目的是提供一种在OPSS突变体存在下，用硫化物使O-磷酰-L-丝氨酸转化成半胱氨酸的方法。
有益效果
如上所述，酶活性提高的OPSS突变体对于由O-磷酸丝氨酸向L-半胱氨酸的酶转化是必不可少的，其可用于以简单的方式大规模由OPS高产L-半胱氨酸。
附图说明
图1所示为根据温度的OPSS活性。
图2所示为OPSS对pH的敏感性的组图。
图3所示为通过SDS PAGE分析的pET系统和pCL-Pcj1系统中酶的表达水平的照片。
图4所示为将纯化的OPS发酵培养液转化成半胱氨酸的OPSS的酶活性。
图5所示为将OPS发酵培养液转化成半胱氨酸的OPSS的酶活性。
图6所示为1L发酵罐中以OPS作为底物，通过OPSS转化的OPS和半胱氨酸的生产。
图7为含有编码OPSS突变体的基因的pCL-Pcj1表达载体的示意图。
最佳实施方式
按照其中一个方面，本发明提供一种源自耻垢分枝杆菌的具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的OPSS突变体，其较野生型O-磷酸丝氨酸巯解酶氨基酸序列缺少3~7个C-末端氨基酸残基。
在本发明的一个实施方案中，本发明的OPSS突变体可具有SEQID NOS:2、3和4中的一个氨基酸序列。具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的OPSS突变体可被进一步修饰成77位脯氨酸残基（Pro）被丝氨酸残基（Ser）取代。此外，具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的OPSS突变体可被进一步修饰成131位苏氨酸残基（Thr）被丙氨酸残基（Ala）取代，137位赖氨酸残基（Lys）被天冬酰胺残基（Asp）取代，以及238位苏氨酸残基（Thr）被丝氨酸残基（Ser）取代。此外，与上述突变体的氨基酸序列同源性至少为50%，优选60%、70%、75%和80%，更优选85%、90%和95%，最优选97%至99%的氨基酸序列落入本发明的范围内。
术语“耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatics）”是指放线菌门中的杆状菌株，其为细长的、直的或稍弯的，有不规则的分支，可被碱性染料苯胺染色。在本发明中，发现当其氨基酸序列被修饰时，来自该菌株的O-磷酸丝氨酸巯解酶能够催化L-半胱氨酸以提高的产量生物合成。
如本文所使用，术语“O-磷酸丝氨酸巯解酶（OPSS）”是指催化OPS转换成半胱氨酸的酶。该酶首次发现于超嗜热古菌(Aeropyrumpernix)中并被命名（Mino K和Ishikawa K,FEBS letters,551:133-138,2003,SEQ ID NO:6）。
可使用各种众所周知的方法获得OPSS。这些方法的示例包括但不限于，基于密码子优化的基因合成技术，通过该技术能获得高产的目的酶，以及根据微生物遗传信息的大量储存，利用生物信息学方法筛选有用的酶资源。在本发明的一个实施方案中，利用OPS作为底物合成半胱氨酸的OPSS酶是从各种微生物中筛选到的。为此，使用合适的培养基及本领域已知的培养条件获得细胞沉淀（经裂解），然后通过对含酶上清液的纯化来提供OPSS酶。
如本文所使用，术语“突变体”是指表型显示出遗传或非遗传稳定改变的培养物或个体。当与OPSS（O-磷酸丝氨酸巯解酶）结合使用时，术语“突变体”是指发生遗传改变，从而与野生型相比，活性得到有效提高的OPSS酶。
基于甚至在额外的酶不存在的情况下，缺失五个C-末端氨基酸残基的源自结核分枝杆菌H37Rv的OPSS突变体对含S2-基团的硫源显示出增加的亲和力的报道，OPSS突变体可通过缺失耻垢分枝杆菌OPSS的五个C-末端氨基酸残基来制备。本发明的OPSS突变体可具有源自耻垢分枝杆菌的对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其缺失三至七个，优选五个C-末端氨基酸残基。
在本发明的一个实施方案中，观察到具有SEQ ID NO：2氨基酸序列突变被用于转化OPS为半胱氨酸后，显示出一小时内100%的转化率（表5）。
氨基酸替换可进一步提高本发明OPSS突变体酶的活性。只要是本领域已知的，任何方法均可可用于改进酶。优选地，在本发明中，采用随机突变提高OPSS突变体酶的活性。具体地，OPSS进行随机突变后，本发明人利用基于HTS（高通量筛选）开发出的筛选系统筛选出酶活性提高的突变体。结果是，通过对Msm-T基因进行HTS筛选获得具有酶活性提高的OPSS突变体、Msm-T HA2和Msm-T-EP3。Msm-THA2是具有与SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列的OPSS突变体，除了77位的脯氨酸残基（Pro）被丝氨酸残基（Ser）取代。Msm-T-EP3是具有与SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列的OPSS突变体，除了以下位置发生突变：131位苏氨酸被丙氨酸残基（Ala）取代，137位天冬酰胺残基（Asp）被赖氨酸残基（Lys）取代，以及238位苏氨酸残基（Thr）被丝氨酸残基（Ser）取代。优选地，OPSS突变体Msm-T HA2和Msm-TEP3分别具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，发现Msm-T HA2和Msm-T EP3比具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的Msm-T显示出更高的酶活性（表5和6）。具体地，测出OPSS突变体Msm-T HA2和Msm-T EP3相比对照Msm-T，在转化反应早期显示出提高5倍和1.2倍的转化率。此外，甚至当Msm-T HA2突变体的半胱氨酸合成活性比Msm-T酶高4倍，且其用量是Msm-T的40%时，半胱氨酸的终转化率是相似的。
如本文所使用，术语“同源性”是指两个多肽之间的相同百分数。一条序列与另一条序列之间的相关性可采用本领域已知的技术确定。例如，同源性的确定可通过序列信息的比对和使用现成的计算机程序，直接比较两条多肽分子之间的序列信息。或者，同源性的确定可通过在使同源区之间形成稳定双链的条件下进行多核苷酸杂交，然后用特异性单链核酸酶消化并测定酶切片段的大小。
如本文所使用，所有语法形式和拼写变化形式的术语“同源的”，是指具有共同进化起源”的蛋白之间关系，包括超家族蛋白（如免疫球蛋白超家族）和来自不同物种的同源蛋白（例如，肌球蛋白轻链等）。这些蛋白（及它们的编码基因）具有如由它们的序列相似性反映出的序列同源性。然而，在常见的用法和本发明的应用中，术语“同源的”在被副词如“高度地”修饰时，可以指序列的相似性，其可能会或可能不会涉及到共同的进化起源。
如本文所使用，所有语法形式的术语“序列相似性”，是指可能会或可能不会拥有共同的进化起源的核酸或蛋白的氨基酸序列之间的同一性或相关性。在一个具体实施方案中，当至少21%（优选至少约50%，更优选约75%、90%、95%、96%、97%或99%）的氨基酸与氨基酸序列的确定长度匹配时，两个氨基酸序列是“大体同源”或“大体相似”的。大体同源的序列可利用标准软件通过在序列数据库中比较序列，或在例如为该特定系统定义的严格条件下进行Southern杂交实验来确定。定义的杂交条件在本领域范围内（如Sambrook等人，1989，见下）。
本发明的OPSS突变体可催化巯基（SH基团）转移至OPS上以生产半胱氨酸。优选地，所述条件允许本发明的OPSS突变体发挥它们的最佳活性，包括：i）存在0-2mM PLP（5’-磷酸吡哆醛）或0-100mMDTT（二硫苏糖醇）作为辅因子，ii）25~60℃的反应温度，以及iii）pH6.0~10.0，但不仅限于此。
通过将巯基基团转移到OPS底物上从而催化半胱氨酸合成的酶活性的测定与Ape-OPSS（O-磷酸丝氨酸巯解酶）的命名一起被公开。特别是，由于Ape-OPSS具有通过转移巯基基团使OAS转化成半胱氨酸的活性，该检测是基于对大肠杆菌半胱氨酸合成酶的测定（OASS，O-乙酰丝氨酸巯解酶，EC 4.2.99.8))(Mino K和Ishikawa K,FEBSletters,551:133-138,2003）。
在本发明的一个实施方案的试验中，PLP为OAS（O-乙酰丝氨酸）或OPS提供巯基基团，其在半胱氨酸转化中作为OASS或OPSS的辅因子，添加浓度为0.2mM。此外，由于其还原能力，加入DTT不仅可以防止暴露于空气的半胱氨酸的半胱氨酸氧化，而且还可以定量已经氧化的半胱氨酸的量。优选地，当加入25mM DTT或0.2mM PLP时，半胱氨酸的转化率增加2.3倍。也就是说，PLP和DTT对OPS转化成半胱氨酸具有正面的影响。
如之前报道的，酶Ape-OPSS、Mtb-OPSS和Mtb-T的最佳反应温度是60℃或37℃，最适pH为7.4（Mino K和Ishikawa K,FEBS letters,551:133-138,2003;Agren D,Schnell R和Schneider G，FEBS letters,583:330-336,2009）。基于该报道，具有提高的酶活性的OPSS突变体的转化反应条件可以得到优化。
在本发明的一个实施方案中，OPSS突变体可在37℃~80℃下催化转化。具体地，可在高温下生长的来自古细菌（Archea spp.）的Ape-OPSS酶，在60℃下比在37℃下显示出更高的酶活性。此外，酶本身的高热稳定性使得最佳温度为60℃。另一方面，Msm-T在37℃下显示出最佳酶活性，且不能耐受60℃下的热处理。据发现OPSS酶在pH值6.0~10.0下保持转化活性。检测到Ape-OPSS在pH7.4显示出最佳酶活性，Msm-T在pH8.0~9.0显示出最佳酶活性。因此，Msm-T比Ape-OPSS具有更广泛的pH稳定范围。
根据其另一个方面，本发明提供一种编码OPSS突变体的核酸分子。
如本文所使用，术语“核酸分子”旨在包含DNA和RNA分子。构成核酸分子结构单元的核苷酸，不仅包括天然存在的核苷酸，而且包括糖部分或碱性部分修饰的类似物（Scheit,核苷酸类似物（Nucleotide Analogs）,John Wiley,纽约（New York）(1980);Uhlman和Peyman,化学综述（Chemical Reviews）,90:543-584(1990)）。
根据其又一个方面，本发明提供含有所述核酸分子的表达载体。
“载体”是指任何用于克隆核酸和/或将核酸转移到宿主细胞中的载体。载体可以是连有另一个DNA片段的复制子，从而使所连接的片段得到复制。“复制子”是指任何能够在体内具有DNA复制自主单元功能，即能够在自身控制下进行复制的遗传元件（如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒）。术语“载体”包括用于将核酸在体外、胞外或体内引入宿主细胞中的病毒和非病毒性的载体。术语“载体”，也可包括微环DNA。例如，载体可以是不含细菌DNA序列的质粒。已证明富含CpG区的细菌DNA序列的去除可降低转基因表达沉默，并形成质粒DNA载体的持续表达（见例如，Ehrhardt,A.等，(2003)HumGene Ther 10:215-25;Yet,N.S.(2002)MoI Ther 5:731-38;Chen,Z.Y.等，(2004)Gene Ther 11:856-64）。术语“载体”也可包括转座子如睡美人（Sleeping Beauty）（Izsvak等，J.MoI.Biol.302:93-102(2000)），或人工染色体。
作为载体，使用T7启动子的pET系统（Novagen公司）是本领域众所周知的。在本发明中，可毫无限制的使用本领域已知的各种表达系统。
在本发明的一个实施方案中，由本发明人开发的使用CJ1启动子的表达系统用于表达外源基因（见韩国专利公开号No.10-2006-0068505，图7）。
在本发明的一个实施方案中，在相同条件下比较含T7启动子的pET系统和含CJ1启动子的CJ1系统之间OPSS的表达水平。结果是，CJ1系统比pET系统显示出更高的OPSS表达水平（图3）。此外，在pET系统中过表达OPSS需要低温（18℃）和较长时间，而在CJ1系统中需要高温（37℃）和较短时间。因此，优选使用CJ1启动子来有效获得OPSS，但本发明不限于此。
根据其进一步的方面，本发明提供用所述表达载体转化的转化体。
如本文所使用，所有语法形式和拼写变化形式的术语“转化”是指由向宿主细胞中引入外源基因，使所引入的基因能够自主复制或作为整合至染色体中的因子所带来的人工遗传改变。
可采用本领域已知的合适的标准技术将本发明的载体导入宿主细胞，实例包括但不限于电穿孔。磷酸钙共沉淀法、逆转录病毒感染、显微注射、DEAE-葡聚糖和阳离子脂质体钙法。
如本文所使用，术语“用重组载体转化的宿主细胞”是指在宿主细胞中含有携带目的基因的重组载体的宿主细胞。适用于本发明的宿主细胞可能是原核或真核细胞。实例包括肠杆菌和棒形细菌，优选大肠埃希氏菌属、沙雷菌属，最优选大肠杆菌(E.coli)。
根据其另一个方面，本发明提供一种生产半胱氨酸的方法，包括在本发明的OPSS突变体存在下，用硫化物转化OPS。
本发明的突变适用于大规模生产半胱氨酸。当使用表达所述突变体的转化体时，大规模生产半胱氨酸可在本领域众所周知的最佳培养条件下完成。因此，大规模生产半胱氨酸方法包括在本领域众所周知的最佳培养条件下培养所述转化体。
为用作为底物，OPS可以是纯化形式，或含OPS的发酵培养物形式。纯OPS可市售获得，如Sigma-Aldrich公司的产品编号No.P0878或Wako公司的CAS407-41-0所指明的产品。然而，经微生物发酵获得的含OPS的培养物，比市售的纯OPS更具经济优势，因为含OPS的培养物可无需额外的纯化直接使用，且转化所必需的辅因子PLP可以在发酵培养液中获得。
只要可转换成巯基（SH），任何硫化合物均可用于本发明。优选的，可使用Na2S、H2S或S2O3的液体或气体形式。
在本发明的一个实施方案中，是用Na2S作为硫源。Na2S可以酶转化中使用的OPS的0.1至3倍的摩尔浓度添加。具体地，Msm-T-HA2，其半胱氨酸转化率为80%，与Msm-T相当，在以下反应条件下，其使用浓度为50μg/mL，包括：50mM OPS发酵培养液或60mM纯OPS发酵培养液，100mM或120mM Na2S，以及0.2mM PLP。
对本领域熟练的技术人员是显而易见和易于理解的是，酶转化过程可以进行优化并用高活性酶放大反应规模，在一个实施方案中，在50mg Msm-T-HA2存在下，培养19.317g/L OPS发酵培养液，产生的半胱氨酸浓度高达9.075g/L。在1L发酵罐中，在所述突变体存在下，OPS转化成半胱氨酸的转化率为71.83%（图6）。
缩写和术语
为了更好地解释本发明，并指导本领域的技术人员来实现本发明，需要对下面的词语和方法进行说明。除非本文另有明确要求，说明书和权利要求书通篇中，术语“包括（comprise），”“包括（comprising），”等应解释为包含性的意义，与排除或用尽的意义相对，也就是说，指“包括但不限于”的含义。单数术语“a，”“an，”和“the”包括复数引用，除非本文另有清楚地说明。例如，术语“包括细胞”是指“包括一个细胞或多个这种细胞，但不限于此。”
当用来说明两个或两个以上的项目时，单词“或”涵盖了该词的所有以下解释：列表中的任何项目，列表中的所有项目，列表中所有项目的任意组合。
除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学术语与本领域熟练的技术人员所知具有相同的含义。以下公开了相关方法和材料，但在本发明的实际操作或实验中，可使用类似或等同的方法和材料。下面给出的材料、方法和实例是为了说明而非限制本发明。本发明的其它特征和优势将通过下面的描述和所附权利要求书变得显而易见。
缺失：其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被分别从核酸分子或蛋白中去除的突变。
具体实施方式
可通过下面的实施例更好地理解本发明，这些实施例用来解释说明，但不应视为对本发明的限制。
实施例1：OPSS的开发
据报道超嗜热古菌、结核分枝杆菌和阴道毛滴虫具有利用OPS的酶OPSS，而非在大肠杆菌中那样以OAS作为半胱氨酸合成的底物（Mino K和Ishikawa K,FEBS letters,551:133-138,2003;Burns KE,Baumgart S,Dorrestein PC,Zhai H,McLafferty FW，和Begley TP，J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005;Westrop GD,Goodall G，Mottram JC,和Coombs GH,J.Biol.Chem.,281:25062-25075,2006）。基于该报道，本发明人发现两种类型的使OPS转化成半胱氨酸的OPSS，它们来自超嗜热古菌和结核分枝杆菌H37Rv。其中，来自结核分枝杆菌H37Rv的OPSS酶用于筛选同源氨基酸。结果是，分别从耻垢分枝杆菌str.MC2 155、红球菌（Rhodococcus jostii）RHA1和皮疽诺卡氏菌（Nocardia farcinica）IFM10152中获得三种OPSS突变体Msm-OPSS、Rjo OPSS和Nfa-OPSS。
为了从各菌株中获得OPSS，构建了通常用于酶表达的pET28a载体系统（Novagen）。用于克隆五种不同的OPS巯解酶的各模板和引物及由此产生的重组质粒列于下表1中。如表1所示的合适的模板和引物组合，用于PCR反应以扩增各OPSS基因。用NdeI和HindIII消化PCR产物和pET28a载体（37℃3小时）。将各基因片段连接到消化的pET28a载体（Novagen）上。基于测序，确定带有各OPSS的基因的表达载体的构建。将酶表达载体引入大肠杆菌（DE3）中，生产能够表达五种OPSS酶的菌株。酶的名称列于下表1。
表1
酶 载体 模板 引物
Ape-OPSS pET28a-Ape-OPSS 合成DNA SEQ ID NOS:7和8
Mtb-OPSS pET28a-Mtb-OPSS Mtb基因组DNA SEQ ID NOS:9和10
Msm-OPSS pET28a-Msm-OPSS Msm基因组DNA SEQ ID NOS:11和12
Rjo-OPSS pET28a-Rjo-OPSS Rjo基因组DNA SEQ ID NOS:13和14
Nfa-OPSS pET28a-Nfa-OPSS Nfa基因组DNA SEQ ID NOS:15和16
根据pET系统制造商（Novagen）的教导进行酶的表达。将LB平板上各菌的单克隆接种到5mL LB培养液中于37℃，以200rpm振荡培养16小时。将培养物转移到25mL新鲜LB培养液（250毫升烧瓶中）中，在相同条件下培养至OD600值0.5~0.6（2~3小时），然后立即向培养基中加入1mM IPTG，在18℃、120rpm振荡培养18小时以诱导酶表达。用Ni-NTA柱辅以Spin Trap（GE Healthcare）纯化带有His-标签的酶。五种分离的OPSS酶中，发现有四种为可溶性形式，根据14%SDS-PAGE电泳分析，一种（Rjo-OPSS）为包涵体(inclusion body)。
实施例2：OPSS合成半胱氨酸活性的测定
测定从各微生物菌株中获得的四种OPSS酶催化OPS向半胱氨酸转化的能力。关于试验条件和方法（cysM酶检测），有关测定条件和方法（cysM酶测定），参考之前的报道（Mino K和Ishikawa K,FEBSletters,551:133-138,2003;Burns KE,Baumgart S,Dorrestein PC,ZhaiH,McLafferty FW，和Begley TP，J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005;Westrop GD,Goodall G，Mottram JC和Coombs GH,J.Biol.Chem.,281:25062-25075,200）。所用底物的量以单位mL表示。酶活检测条件列于下表2中。
表2
母液 终浓度 空白 OPS巯解酶
6×his-酶- 40(50mg)
1M HEPES(pH7.4) 100mM HEPES 100 100
0.5M  Na2S 10mM  Na2S 20 20
10mM PLP 0.2mM PLP 20 20
100mM  OPS 5mM OPS 0 50
DW 790 750
总计 1000 1000
将除了酶的反应液在37℃孵育5分钟，然后向反应液中加入50mg纯化的OPSS。在37℃预定的时间内孵育，取100mL酶反应液与33.2%TCA 100mL混合终止酶反应。根据Gaitonde的方法，通过测定OD560下的吸光度来定量分析酶反应的半胱氨酸浓度。四种不同OPSS巯解酶的半胱氨酸合成活性总结于下表3中。OPSS酶的半胱氨酸合成滴度以半胱氨酸随反应时间的转化率表征。
表3
从表3中可见，确定来自超嗜热古菌和结核分枝杆菌H37Rv的OPSS酶具有利用OPS作为底物合成半胱氨酸的活性。首次发现了来自耻垢分枝杆菌str.MC2155的新型OPSS的半胱氨酸合成活性，其是通过筛选与Mtb-OPSS酶具有同源性的氨基酸而获得的。另一方面，通过同源筛选而获得的来自皮疽诺卡氏菌IFM 10152（Nocardiafarcinica IFM 10152）的新型OPSS，显示出使O-磷酸丝氨酸转化为半胱氨酸的不完全的活性。
从表3中可见，Ape-OPSS使OPS转化为半胱氨酸的转化率在一小时内接近100%。
基于之前报道的来自结核分枝杆菌H37Rv的OPSS，通过酶筛选新筛选到的Msm-OPSS酶的最终转化率是43.7%，是Mtb-OPSS的4.3倍。
实施例3：缺失Mtb-OPSS和Msm-OPSS上5个氨基酸残基的Mtb-T和Msm-T突变体的制备
来自结核分枝杆菌H37Rv的OPSS（Mtb-OPSS），其在额外酶med+和cysO的辅助下，催化OPS向半胱氨酸的转化，当缺失五个氨基酸残基时，即使不存在额外酶时，它也能够利用含S2-的硫源OPSS（结核分枝杆菌的OPSS）使OPS转化为半胱氨酸。基于这一事实，获得了能够在没有S2-硫源的情况下迅速转化OPS的Mtb-T（SEQ ID NO：24）。根据与Mtb-OPSS有较高氨基酸同源性的Msm-OPSS，通过缺失5个C-末端氨基酸残基还获得了Msm-T。构建了带有两种酶突变体的表达载体。为此，在SEQ ID NOS：17和18以及SEQ ID NOS：19和20的每对引物存在的条件下，对结核分枝杆菌H37Rv和耻垢分枝杆菌str.MC2155的基因组DNA进行pfu PCR。如此获得的OPSS基因片段经NdeI和HindIII处理，并克隆至用相同的限制酶消化的pET28a载体中，以构建重组表达载体，分别命名为pET28a-Mtb-T和pET28a-Msm-T。将重组表达载体导入大肠杆菌（DE3）中。与实施例1相同的条件下获得的两种OPSS突变体的表达，通过14%SDS-PAGE确定。结果是，获得了Mtb-T（SEQ ID NO：5）和Msm-T（SEQ ID NO：2）。
实施例4：Mtb-T和Msm-T的半胱氨酸合成活性的测定
通过测定最终半胱氨酸转化率，评价以上获得的Mtb-T和Msm-T的酶活性。以与实施例2相同的方式测定酶活性。用Gaitonde方法对转化的半胱氨酸进行定量分析，结果总结于下表4中。
表4
由表4可见，Msm-T突变体在一个小时内以100%的转化率将底物转换成半胱氨酸。
实施例5：来自Msm-T的突变体Msm-T-HA2和Msm-T-EP3的半胱氨酸合成活性测定
基于Msm-T，其能够以100%的转化率使OPS转化为半胱氨酸，采用酶进化方法，获得了两种酶活性提高的酶突变体，并命名为Msm-T-HA2（SEQ ID NO：25）和Msm-T-EP3（SEQ ID NO：26）。使用羟胺处理和易错PCR试剂盒（Clontech，多样性PCR随机突变试剂盒）将随机突变导入Msm-T中，以构建Msm-T突变体库，然后筛选得到酶活性提高的OPSS突变体。
通过对Msm-T基因进行HTS筛选获得的OPSS突变体Msm-T-HA2和Msm-T-EP3，进行碱基测序分析，发现它们分别具有SEQ ID NOS：3和4的氨基酸序列。
测定突变体Msm-T-HA2和Msm-T-EP3及对照Mam-T的酶活性，结果总结于表5和表6中。以与实施例2同样的方式进行酶活性测定。
表5
表6
从表5和表6中可见，通过酶进化方法获得的OPSS突变体Msm-T-HA2和Msm-T-EP3，在反应开始后10分钟内，与对照Msm-T相比，分别表现出增加5倍和1.2倍的转化率。此外，对它们的特异活性方面进行了比较（产物浓度/时间/酶量），这在酶活性测定中是广泛采用的。Msm-HA2的特异活性与对照Msm-T相比提高了三倍，表明OPSS突变体的酶活性得到提高，单位时间内每单位酶具有合成更多半胱氨酸的能力。
实施例6：OPSS活性所需的辅因子
为了确定辅因子对OPSS的半胱氨酸转化的影响，在PLP和DTT存在或不存在的条件下测定Msm-T的半胱氨酸转化率。为此，在25mM DTT或0.2mM PLP存在下，使底物50mM OPS培养液和100mMNa2S在37℃反应30分钟。使用Gaitonde方法对由此产生的半胱氨酸进行定量分析。结果总结于下表7中。
表7
Msm-T 半胱氨酸转化率(%)
(-)PLP，(-)DTT 23.62
(+)PLP，(-)DTT 33.21
(-)PLP，(+)DTT 40.08
(+)PLP，(+)DTT 54.65
从表7中可见，在PLP和DTT的存在下，半胱氨酸的转化率是没有PLP和DTT情况下的2.3倍。因此，观察到PLP和DTT均对转化率具有积极影响。
实施例7：温度对OPSS活性的影响
测定Ape-OPSS和Msm-T根据温度的半胱氨酸转化率。反应2、5、10、30和60分钟后，在37℃和60℃测定酶活性。反应在100mM HEPES（pH7.4）、5mM OPS、10mM Na2S、0.2mM PLP和CysM 50μg/mL的条件下进行。使用Gaitonde方法测定产生的半胱氨酸量。结果显示于图1中。
如图1所示，在缓冲液的情况下，Ape-OPSS相比Msm-T，在37℃下显示出更快的起始反应速率，并在60℃下显示更高的酶活。
实施例8：OPSS的热稳定性
对Ape-OPSS和Msm-T的热稳定性进行了分析。将每种酶在OPS培养液中稀释至2mg/mL的浓度，并在37℃和60℃下热处理10、30、60、120和240分钟，然后在5mM OPS、10mM Na2S、0.2mM PLP和100mM HEPES（pH 7.4）的条件下，在37℃反应30分钟。10μg/mLApe-OPSS和50μg/mL Msm-T用于该反应。使用Gaitonde方法测定生产的半胱氨酸量，并总结于下表8中。
表8
如表8所示，尽管在60℃热处理4小时，观察到Ape-OPSS保留其活性不变，而Msm-T的活性在37℃下得以保持，但60℃热处理30分钟后活性下降50%。
测定在37℃下保留的酶活性，Msm-T的使用量为50μg/mL，这是OPS培养液中的实际浓度。在没有Na2S的情况下，在37℃将50μg/mLMsm-T连同50mM OPS培养液和0.2mM PLP处理0.5、1、2、4和6小时，然后添加Na2S以诱导酶反应。反应30min后，测定Msm-T活性。使用Gaitonde方法测定生产的半胱氨酸的量，并列于下表9中。
表9
时间 (-) 30min 60min 120min 240min 360min
半胱氨酸转化率(%) 100 88 73 47 11 3
从表9中可见，在37℃OPS培养液中反应2小时后Msm-T的活性降至50%以下。
实施例9：OPSS的pH敏感性
测定Ape-OPSS和Msm-T随pH值变化的半胱氨酸的转化率。在100mM缓冲液中，使浓度各为50μg/mL的Ape-OPSS和Msm-T在37℃反应10分钟。为此，使用pH值6.4/7.0/7.4/8.0的磷酸钾（K-磷酸盐）缓冲液，pH值7.0/7.4/8.0/8.5/8.8的Tris-HCl缓液，以及pH值8.0/8.5/9.0/10.0的碳酸钠（Na-碳酸盐）缓冲液。使用Gaitonde方法对产生的半胱氨酸进行定量分析。结果列于图2。
如图2所示，无论何种缓冲液，Msm-T在pH8.0-9.0显示出最高的活性。至于Ape-OPSS，在K-磷酸盐（pH7.4）检测到其最高活性，最佳pH值根据不同的缓冲液而有所不同。
实施例10：离子对OPSS活性的影响
离子对OPSS酶活性的影响按如下进行测定。在含有5mM OPS、10mM Na2S、0.2mM PLP和100mM HEPES（pH7.4）的反应混合物中，在(NH4)2SO4[1、3、5、10、20g/L],KH2PO4[0.5、1、2、4、8g/L]或NH4Cl[0.2、0.5、1、2g/L]存在下，使酶在37℃反应30分钟。Ape-OPSS和Msm-T的使用浓度分别为10μg/mL和50μg/mL。使用Gaitonde方法测定产生的半胱氨酸的量并列于下表10中。
表10
当向反应混合物中加入(NH4)2SO4或KH2PO4时，没有检测到半胱氨酸转化率的变化。另一方面，由表10中可见，半胱氨酸的转化率随NH4Cl浓度的增加而降低。特别是，当加入2g/L NH4时，最大酶活性下降了70%以上。因此，观察到NH4Cl和NH4对OPSS的转化活性产生负面影响。
实施例11：硫源对OPSS半胱氨酸合成活性的影响
进行实验以测定硫源对每种酶的半胱氨酸合成活性的影响。在含有5mM OPS、0.2mM PLP和100mM HEPES的反应混合物中，各酶（50μg/mL Ape-OPSS,50μg/mL Msm-T）在10mM Na2S、NaSH,或Na2S2O3存在下，在37℃反应1小时。使用Gaitonde方法测定产生的半胱氨酸的量。观察到Ape-OPSS偏好Na2S2O3作为硫源，而Msm-T偏好Na2S。结果列于下表11中。
表11
实施例12：带有OPSS的表达载体（pCL-Pcj1系统）的构建和酶表达
使用SEQ ID NOS：21和22的引物，以pET28a-Msm-T载体为模板进行PCR扩增。由此获得的PCR产物用EcoRV和HindIII处理，克隆并构建重组载体，命名为pCL-P（CJ1）Msm-T（pCJ1-MsmT CysM，图7）。为了检测Msm-tc在pET系统和pCL-Pcj1系统之间表达水平的差异，制备了用于表达该酶的菌株。pET系统被被导入Rosetta（DE3），而pCL-Pcj1系统采用K12G菌株。从LB平板挑取单菌落接种到5mLLB培养液中于37℃、200rpm培养16小时。将培养物转移至含卡那霉素或大观霉素以及0.2%葡萄糖的25mL新鲜的LB培养液中（于250mL烧瓶中），培养至OD600值0.5~0.6，随后立即向培养基中加入1mMIPTG，诱导酶表达。培养在37℃、200rpm振荡下进行，在不同的培养时间（8、16、24小时）测定酶的表达水平。两个系统的酶表达水平用14%SDS-PAGE分析，结果如图3所示。
在相同条件下，从图3中可见，pCL-Pcj1系统比pET系统确保了更高的酶表达水平。此外，温度高达37℃，培养条件得到改善，IPTG浓度低达0.1mM可使系统表达该酶。因此，pCL-Pcj1系统可完全替代pET系统的功能。
实施例13：使用纯化的OPS发酵培养液为底物的OPSS的半胱氨酸合成
测定了Msm-T和Ape-OPSS使纯化的OPS转化为半胱氨酸的转化率。在75μg/mL每种酶和0.2mM PLP存在下，从OPS发酵培养液中获得的纯化的60mM OPS与120mM Na2S在37℃或70℃下反应30、60、90和120min。Msm-T只在37℃下进行反应，而Ape-OPSS在37℃和70℃下都能反应。使用Gaitonde方法测定产生的半胱氨酸的量。结果显示于图4中。
由图4可见，纯化的OPS发酵培养液可很好地作为酶转化为半胱氨酸的底物。特别是，在70℃下使用纯化的OPS发酵培养液时，Ape-OPSS的半胱氨酸转化率增加。
实施例14：以OPS发酵培养液为底物的OPSS的半胱氨酸合成
当使用OPS发酵培养液作为底物时，根据酶的浓度测定Msm-T和Ape-OPSS的半胱氨酸转化率。在Msm-T和Ape-OPSS各5μg/mL或50μg/mL以及0.2mM PLP存在下，50mM OPS发酵培养液与100mMNa2S在37℃下反应。使用Gaitonde方法测定产生的半胱氨酸的量。结果显示于图5中。
由图5可见，测得转化率最高的是50μg/mL Msm-T。此外，使用OPS发酵培养液作为底物，Msm-T的活性高于Ape-OPSS。
实施例15：随OPSS浓度变化的半胱氨酸转化率
向含浓度为9.76g/L OPS的OPS培养液中加入两倍OPS摩尔量的Na2S，随后在37℃孵育5分钟。此后，加入纯化的Msm-T 50mg，而纯化的Msm-T-HA2的用量为5μg、10μg、20μg和50μg。在37℃下孵育预定的时间，取酶反应混合物100mL和与33.2%TCA混合以终止酶反应。根据Gaitonde方法，通过测定OD560下的吸光度，对酶反应生成的半胱氨酸浓度进行定量分析。根据酶浓度的OPSS酶的半胱氨酸合成活性总结于下表12中。
表12
半胱氨酸转化率（%）
时间 0min 10min 20min 30min 60min
Msm-T     50μg 0.00 20.69 48.45 62.68 59.82
Msm-T-HA2 5μg 0.00 0.00 4.77 10.66 27.23
Msm-T-HA2 10μg 0.00 10.46 24.78 37.43 57.32
Msm-T-HA2 20μg 0.00 14.90 31.31 48.09 59.94
Msm-T-HA2 50μg 2.33 44.02 56.72 62.17 63.52
由表12中可见，即使Msm-T-HA2突变体的半胱氨酸合成活性提高，且用量相当于Msm-T用量的40%，最终的半胱氨酸转化率（%）相似。此外，当等量使用时，与Msm-T相比，Msm-T-HA2突变体显示出更快的初始反应活性。
实施例16：随OPS浓度变化的半胱氨酸转化率
为了测定OPS浓度对Msm-T和Msm-T-HA2的转化率的影响，向OPS发酵培养液中加入预定量的纯化的OPS以诱导转化反应。酶的用量为Msm-T 50μg和Msm-T-HA220μg。使用Gaitonde方法测定反应液中半胱氨酸的量。结果总结于表13~15中。
表13
半胱氨酸转化率（测定的OPS为10.65g/l）
时间 0min 10min 30min 60min 120min 180min
Msm-T    50μg 0 23.03 65.38 65.70 61.95 55.35
Msm-T-HA220μg 0 13.70 43.82 61.32 63.77 53.74
表14
半胱氨酸转化率（测定的OPS为36.09g/l）
时间 0min 10min 30min 60min 120min 180min
Msm-T    50μg 0 1.15 10.23 28.07 97.84 100.34
Msm-T-HA2 20ug 0 2.33 12.04 27.57 77.65 80.01
表15
半胱氨酸转化率（测定的OPS为55.6g/l）
时间 0min 10min 30min 60min 120min 180min
Msm-T    50μg 0 0 2.36 7.41 42.69 66.67
Msm-T-HA2 20μg 0 0.32 4.76 12.15 50.16 62.46
当OPS浓度约30g/L时，如表13~15所示，测得Msm-T的最高转化率是100%，Msm-T-HA2的最高转化率是80%。当OPS的浓度超过50g/L时，发现转化率和转化百分数均下降。
表13~15中的数据用来筛选在采用高浓度OPS的转化过程中，OPS和Msm-T-HA2之间的最佳浓度比，以缩短与Msm-T相比的Msm-T-HA2的反应时间。
实施例17：随Na2S浓度变化的半胱氨酸转化率
为了测定作为硫源的Na2S的量对半胱氨酸转化率的影响，在20μg Msm-T-HA2的存在下，Na2S浓度分别为160mM、320mM和480mM时，对应于等量的、两倍量的和三倍量的OPS摩尔量，进行OPS转化反应。所得的半胱氨酸转化率总结于下表16中。
表16
半胱氨酸转化率（OPS 29.76g/l）
时间 0min 10min 30min 60min 120min 180min
160mM Na2S 0 0 0 0 0 0
320mM Na2S 0 13.43 34.58 78.78 67.76 74.95
480mM Na2S 0 14.90 25.99 54.42 51.24 58.25
由表16可见，当使用的Na2S的摩尔量是OPS的两倍时，半胱氨酸的转化率达到峰值。从结果来看，了解到设定的最佳条件是Na2S：OPS的摩尔比率为2。
实施例18：随pH值变化的半胱氨酸转化率
为了测定pH值对OPS转化成半胱氨酸的酶转化的影响，在不同pH值下，在20μg Msm-T-HA2存在下进行转化反应。结果列于下表17中。
表17
半胱氨酸转化率（%）
时间 0min 10min 30min 60min 120min
pH 8.5(OPS 35.02g/l) 0.24 4.74 20.74 40.19 69.13
pH 9(OPS 34.59g/l) 0.19 6.00 24.03 43.86 63.88
pH 9.5(OPS 35.34g/l) 0.26 9.85 28.48 44.82 64.68
pH 10(OPS 34.59g/l) 0.25 10.97 28.54 40.19 58.14
可以看出，测得的转化反应的最佳pH值为8.5~9.5。
实施例19：1L发酵罐规模的转化过程
将OPS培养液转化为半胱氨酸的反应放大到1L发酵罐规模。基于OPSS的特点和1mL试管条件下转化反应的数据，建立Msm-T-HA2的转化反应过程。
在进行1L发酵罐的转化反应前，离心由1L发酵罐中获得的OPS发酵培养液（10,000rpm，10min，4℃），上清液过膜（0.45μm）以去除细胞。向过滤的OPS培养液（19.317g/L）中加入72g Na2S，然后通过Whatman滤纸（6μm）过滤掉沉淀。加入10mM PLP后，反应混合物在37℃、200rpm振荡下孵育5分钟。最后，1L发酵罐中的转化反应在是在50mg Msm-T-HA2存在下进行的。37℃孵育0、10、30、60、120和180min后，取100μL酶反应物，并与100μL 33.2%的TCA混合以终止酶反应。取样品用0.1N盐酸稀释，采用LC法分析半胱氨酸和胱氨酸含量。此外，Gaitonde方法用来确定半胱氨酸的量。转化反应中使用的底物和酶的浓度总结于下表18中。所用底物的量以单位mL表示。
表18
通过Gaitonde方法和LC法定量分析在表18条件下进行的转化反应所获得的反应混合物中的半胱氨酸的浓度，结果如图6所示。
由图6可见，在50mg Msm-T-HA2存在下，19.317g/L OPS培养液孵育2小时，产生的半胱氨酸或胱氨酸的量达到峰值，为9.075g/L，表明1L发酵规模的酶转化加工中，可以71.83%的产率由OPS产生半胱氨酸和胱氨酸。
表19
半胱氨酸/胱氨酸转化率（%）
表20
半胱氨酸/胱氨酸（g/L）
时间 0min 10min 30min 60min 120min 180min
OPS培养液 1.366 3.548 6.476 8.492 9.075 8.775
工业实用性
如上所述，本发明的OPSS突变体可用于L-半胱氨酸的大规模生产，它和它的衍生物可用于各种领域，包括制药业（用于治疗支气管疾病），化妆品行业（洗发水、烫发用组合物等）以及食品工业（抗氧化剂、调味剂、面团辅料等）。

Claims (12)

1.源自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)突变体，其中野生型OPSS的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述源自耻垢分枝杆菌的O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)突变体缺少野生型OPSS氨基酸序列的5个C-末端氨基酸残基，并且其具有下述取代：(i)77位脯氨酸残基(Pro)被丝氨酸残基(Ser)取代，或(ii)131位苏氨酸残基(Thr)、137位赖氨酸残基(Lys)和238位苏氨酸残基(Thr)分别被丙氨酸残基(Ala)、天冬酰胺残基(Asp)和丝氨酸残基(Ser)取代。
2.根据权利要求1所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其在以下条件下显示出最佳活性，包括：
i)加入0.001～2mM PLP(5’-磷酸吡哆醛)或0.001～100mMDTT(二硫苏糖醇)作为辅因子；
ii)反应温度25～60℃；以及
iii)pH 6.0～10.0。
5.编码权利要求1-4中任一项所述OPSS突变体的核酸分子。
6.含有编码权利要求1-4中任一项所述OPSS突变体的核酸分子的表达载体。
7.用权利要求6所述表达载体转化得到的转化体。
8.一种生产半胱氨酸的方法，其包括在权利要求1-4中任一项所述OPSS突变体存在下，使O-磷酰-L-丝氨酸(OPS)与硫化物发生反应。
9.根据权利要求8所述生产半胱氨酸的方法，其中OPS为纯化形式或含OPS的发酵培养物的形式。
10.根据权利要求8所述生产半胱氨酸的方法，包括选自Na2S、NaSH、(NH4)2SH、H2S和S2O3的硫化物，其全部为气态或液态。
11.根据权利要求8所述生产半胱氨酸的方法，其中硫化物的用量是OPS摩尔浓度的0.1～3倍。
12.权利要求1-4中任一项所述OPSS突变体在由OPS生物合成半胱氨酸中的应用。
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